Pomiar wpływu przeciwciał na funkcję komórkową izolowanych kardiomiocytów

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wykrycie przeciwciał sercowo-tropowych w osoczu pacjentów z kardiomiopatią rozstrzeniową lub innymi chorobami serca o podłożu autoimmunologicznym. Osiąga się to poprzez początkową mini absorpcję immunologiczną osocza pacjenta na kolumnach sferologicznych anty IgG w celu oczyszczenia immunoglobuliny G jako drugiego etapu. Kardiomiocyty komorowe są izolowane od dorosłych szczurów rasy wistar, zapewniając bazę komórkową dla tego testu biologicznego.

Następnie kardiomiocyty umieszcza się w komorze na szkiełkach nakrywkowych i barwi URA o godzinie 2:00 w celu umożliwienia obserwacji wewnątrzkomórkowego przejściowego stężenia wapnia podczas skurczów, a następnie bada się IgG pacjenta w celu zaobserwowania jego wpływu na kurczliwość kardiomiocytów. Wyniki pokazują, czy IgG pacjenta zawiera przeciwciała tropiczne w oparciu o zmiany kurczliwości i przejściowego wapnia w izolowanych kardiomiocytach. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak standardowe testy immunologiczne do wykrywania przeciwciał, jest to, że jest ona niezależna od określonego antygenu i pozwala na rozróżnienie przeciwciał stymulujących i blokujących.

Demonstracja procedury będzie wymagała od Google i skorzystania z pomocy technicznej ze strony naszego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować mini kolumny absorpcji immunologicznej, wypełniając trzy mililitry sfery anty IgG na dwa mililitry osocza EDTA pacjenta do pustej kolumny econopak. Następnie umieść filtr na sferach anty IgG.

Rozetnij dolną końcówkę kolumny i naciśnij filtr, aby osiągnąć natężenie przepływu około jednej kropli na sekundę. Następnie przemyć kolumnę trzykrotnie jedną objętością osocza 0,9% chlorku sodu, odpipetować osocze w kolumnie, gdy osocze jest całkowicie zanurzone w anty IgG Spheros, przepłukać tą samą objętością 0,9% chlorku sodu. Następnie odpipetować jedną objętość osocza 0,2 molowego chlorowodorku glicyny o pH 2,8 w kolumnie i pozwolić mu zanurzyć się w phos.

Następnie dodaj kolejną objętość chlorowodorku glicyny do kolumny. Zbierz przepływ do 15-mililitrowej probówki i dostosuj pH do 7,3 za pomocą 0,5 molowego chlorowodorku tris o pH p 8,0, aby zregenerować kolumnę. Przemyć go trzema objętościami osocza chlorowodorku glicyny po ostatnim przemyciu dwiema objętościami 0,9% chlorku sodu.

Kolumna może być używana do następnej próbki osocza do wykorzystania na kardiomiocytach. Pobrana frakcja IgG musi być dializowana w eksperymentalnym buforze poprzez uprzednie napełnienie frakcji IgG do probówki z membraną dializacyjną z estrów celulozy z odcięciem masy cząsteczkowej na poziomie 100 kilodaltonów. Następnie włóż probówkę do jednego litra EB i powoli mieszaj mieszaniem magnetycznym w temperaturze czterech stopni Celsjusza Po ośmiu godzinach przenieś rurkę do dializy do trzech litrów świeżego EB i dializuj przez kolejne 20 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza po dializie.

Gotować próbkę przez 30 minut w temperaturze 57 stopni Celsjusza w łaźni wodnej. Aby dezaktywować czynniki dopełniacza, należy oznaczyć całkowite stężenie IgG i przygotować podwielokrotności, z których każda zawiera 330 mikrogramów IgG. W tej procedurze należy przygotować bufor izolacyjny wolny od wapnia zgodnie z dołączonym manuskryptem.

Następnie napełnij 80 mililitrów IB w górnym zbiorniku termostatycznego systemu perfuzyjnego lanor i utrzymuj bufor w temperaturze 37 stopni Celsjusza i napowietrzaj go 95% tlenem, 5% dwutlenkiem węgla przez 30 minut. Rozpuść około 7 000 do 10 000 jednostek kolagenazy typu drugiego i 174 miligramy BSA bez kwasów tłuszczowych w 20 mililitrach. IB zawierający 112,5 mikromolowy chlorek wapnia i w razie potrzeby dostosować pH buforu izolacyjnego w górnym zbiorniku.

Następnie znieczulij szczura wistar w ilości od 175 do 200 gramów za pomocą tiopentalu w dawce 375 mikrogramów na kilogram z dodatkiem 2 500 IU heparyny do roztworu tiopentalu. Po torakotomii ostrożnie wytnij serce z nienaruszonym łukiem aorty i przenieś je do lodowatego chlorku sodu o zerowym procencie w lodowatym chlorku sodu. Usuń krew i otaczającą tkankę z serca.

Następnie przenieś go do świeżego 0,9% chlorku sodu i odsłoń aortę. Włącz reduktor przepływu systemu langor, aby uzyskać prędkość opadania od dwóch do trzech na sekundę. Następnie przymocuj serce do kaniuli.

Perfuzjuj go przez maksymalnie trzy minuty z szybkością przepływu jednej kropli na sekundę, aby wypłukać pozostałą krew. Następnie rozprowadź IB w systemie LOR. Teraz usuń 20 mililitrów buforu z górnego zbiornika.

Napełnij zbiornik roztworem kolagenazy i uzupełnij tyle buforu, ile jest potrzebne, aby osiągnąć 80 mililitrów. Następnie cyrkuluj roztwór wytrawiający przez kolejne 27 minut. Następnie odłącz serce od kaniuli.

Usuń przedsionki i aortę, a następnie posiekaj komory na małe kawałki. Pozwolić, aby bufor wytrawiający spłynął do dolnego zbiornika. Zmniejsz objętość do maksymalnie 40 mililitrów, aby dalej trawić posiekane komory przez 10 do 15 minut pod ciągłym napowietrzaniem 95% tlenu, 5% dwutlenku węgla.

Następnie przefiltruj zawiesinę komórek przez gazę o rozmiarze oczek 200 mikronów do 50-mililitrowej probówki. Na koniec przywróć zawartość wapnia w komórkach, odwirowując zawiesinę komórkową w temperaturze 40 3G przez dwie minuty. W temperaturze pokojowej ponownie zawieś ogniwa w 10 mililitrach.

IB zawierający 200 mikromolowy chlorek wapnia ponownie odwirować i ponownie zawiesić komórki w 10 mililitrach. IB z 500 mikromolowym chlorkiem wapnia. Po końcowym odwirowaniu, resus, zawiesić kardiomiocyty w sterylnym przefiltrowanym EB do gęstości 50 000 komórek na mililitr.

Pokryj szkła nakrywkowe w komorze z czterema dołkami z 10 mikrogramami lamininy na studzienkę i poczekaj, aż całkowicie wyschną. Następnie wlej jeden mililitr zawiesiny kardiomiocytów do każdej studzienki. Za pomocą mikropipety z odciętą końcówką i pozostawić komórki do przylegania przez godzinę w temperaturze pokojowej, rozcieńczyć 10 mikrolitrów jednego miligrama na mililitr roztworu podstawowego fira 2:00 w pięciu mililitrach, eb i trzymać roztwór barwiący w ciemności.

Następnie usuń bufor i nieprzyłączone komórki z okularów nakrywkowych, odpipetuj 0,5 mililitra roztworu barwiącego. W każdym z nich dobrze inkubuj komórki przez 10 minut pod umiarkowanym wstrząsaniem. Następnie usuń roztwór barwiący i umyj komórki raz jednym mililitrem eb.

Następnie dodaj 0,5 mililitra EB do każdej studzienki w tej procedurze, umieść szkło nakrywkowe pod mikroskopem fluorescencji odwrotnej podłączonym do systemu rejestracji wapnia i kurczliwości miocytów. Umieść specjalnie wykonaną elektrodę z rurką napływową i napływową w pierwszej studzience i super. Połącz kardiomiocyty z jednym mililitrem na minutę eb.

Rozpocznij stymulację elektryczną przy napięciu 20 woltów, jednym hercu i pięciu milisekundach na impuls i pozwól komórkom przystosować się do stymulacji przez około dwie minuty. Wybierz nienaruszony kardiomiocyt w kształcie pręcika z wyraźnym prążkiem i ciągłym skurczem i umieść go w centrum pola widzenia. Następnie otwórz kanał kamery i zorientuj komórkę poziomo w obszarze wideo, obracając adapter kadrowania komórki i przesuwając stolik mikroskopu.

Dostosuj granicę elementów sterujących wykrywania w obszarze wideo. Włącz kanał fluorescencyjny i zapisz od 10 do 15 skurczów, aby uzyskać początkowe skrócenie komórek i przejściowy wapń. Następnie wyłącz kanał świetlny mikroskopu, aby uniknąć blaknięcia plamy fluorescencyjnej.

Przełącz przepływ z EB na obejście próbki za pomocą zaworu trójdrogowego i połącz kardiomiocyty jednym mililitrem IgG pacjenta. Zatrzymaj pompę tuż przed dotarciem powietrza do studni, włącz kanał świetlny i zapisz kolejne 10 do 15 skurczów, aby uzyskać ostrą odpowiedź komórki. Następnie wstrzymaj nagrywanie i ponownie wyłącz kanał świetlny, powtórz nagrania po dwóch i pięciu minutach i wyjmij elektrodę ze studzienki, gdy zakończą się na końcu, przeanalizuj skrócenie komórek i stan przejściowy wapnia za pomocą oprogramowania kreatora jonów, używając odpowiednio długości ukośnika długości krawędzi i okna URA z dwoma odjętymi liczbami odjętego współczynnika ukośnika.

Następnie oblicz procentowe zmiany dla ostrych, dwuminutowych i pięciominutowych odpowiedzi od początkowego skrócenia komórek i przejściowej wysokości piku wapnia. Oto reprezentatywny przykład pomiaru kontrolnego. Skracanie się komórek i przemijanie wapnia monitorowano online przed superfuzją z IgG i natychmiast dwie minuty i pięć minut po superfuzji z IgG.

A oto przykład pomiaru próbki IgG zawierającej przeciwciała sercowo-depresyjne. Skrócenie komórek i przejściowe stany wapnia mierzono online przed superfuzją z IgG i natychmiast dwie minuty i pięć minut po superfuzji z IgG. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykrywać przeciwciała ruchu sercowo-naczyniowego w osoczu pacjenta, mierząc wpływ izolowanej IgG na skracanie komórek w przejściowym wapniu izolowanych dorosłych czerwonych kardiomiocytów.