Name: Pomiar wpływu przeciwciał na funkcję komórkową izolowanych kardiomiocytów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 42 s
Description: Poznaj metodę wykrywania kardiotropowych przeciwciał w osoczu pacjentów z kardiomiopatią rozstrzeniową poprzez analizę wpływu izolowanego IgG na skracanie komórek i transjenty wapniowe w izolowanych kardiomiocytach szczura.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była finansowana przez Sonderforschungsbereich Transregio 19 (SFB/TR19, C2) niemieckiej Fundacji Badawczej (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG), projekt ZIM-KF 2727801MD0 Federalnego Ministerstwa Gospodarki i Technologii oraz Centrum Kompetencji Innowacyjnych - Humoralne Odpowiedzi Immunologiczne w Chorobach Sercowo-Naczyniowych (ZIK-HIKE, BMBF FKZ 03Z2CN12) Federalnego Ministerstwa Edukacji i Badań w Niemczech. Zakwaterowanie i eksperymenty z udziałem zwierząt przeprowadzono zgodnie z zaleceniami Towarzystwa Nauk o Zwierzętach Laboratoryjnych (Gesellschaft für Versuchstierkunde, GV-SOLAS) oraz Federacji Europejskich Stowarzyszeń Nauk o Zwierzętach Laboratoryjnych (FELASA).

1. Izolacja IgG z próbek pacjentów
<ol>
	<li>Przygotować minikolumny do immunoadsorpcji, wypełniając pustą kolumnę Econo Pac sepharosem anty-IgG w proporcji 3 ml na każde 2 ml osocza pacjenta pobranego w EDTA. Izolacja IgG wymaga co najmniej 2 ml osocza pacjenta.</li>
	<li>Na wierzchu sepharosu anty-IgG umieścić filtr, odciąć dolną końcówkę kolumny i docisnąć filtr tak, aby uzyskać szybkość przepływu wynoszącą około 1 kropli/s. Pozwolić na całkowite wypłukanie roztworu konserwującego z kolumny.</li>
	<li>Przemyć kolumnę 0,9% NaCl w ilości 3 objętości roztworu na każdą objętość osocza.</li>
	<li>Napepipetować osocze na kolumnę. Po całkowitym wniknięciu osocza w sepharose anty-IgG przemyć kolumnę taką samą objętością 0,9% NaCl.</li>
	<li>Napepipetować na kolumnę jedną objętość osocza 0,2 M glicyny HCl o pH 2,8 i pozwolić jej wniknąć w sepharose. Dodać kolejną objętość glicyny HCl na kolumnę. Zebrać filtrat do probówki 15 ml i dostosować pH do 7,3 za pomocą 0,5 M Tris-HCl o pH 8,0.</li>
	<li>W celu regeneracji kolumny przemyć ją 3 objętościami osocza glicyną HCl. Po końcowym przemyciu 2 objętościami 0,9% NaCl kolumna może być użyta do następnej próbki osocza. Alternatywnie kolumnę można wypełnić roztworem konserwującym i przechowywać w temperaturze 4 – 8 °C do 4 tygodni.</li>
	<li>Do zastosowania na kardiomiocytach zebrana frakcja IgG musi zostać poddana dializie przeciwko buforowi eksperymentalnemu (EB). Aby przygotować EB, do 1 L wody destylowanej na mieszadle magnetycznym dodać 117 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 0,6 mM MgCl2, 1,2 mM KH2PO4, 1,2 mM CaCl2, 10 mM HEPES oraz 20 mM glukozy i dostosować pH do 7,3.</li>
	<li>Frakcję IgG przelać do probówki z membraną dializacyjną z octanu celulozy o progu odcięcia masy cząsteczkowej (MWCO) 100 kDa. Umieścić probówkę w 1 L EB i powoli mieszać mieszadłem magnetycznym w temperaturze 4 °C. Po 8 h przenieść probówkę dializacyjną do 3 L świeżego EB i dializować przez kolejne 20 h w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po dializie podgrzewać próbkę przez 30 min w temperaturze 57 °C w kąpieli wodnej w celu inaktywacji czynników dopełniacza. Wyznaczyć całkowite stężenie IgG i przygotować aliquoty zawierające po 330 μg IgG. Przy dodawaniu próbki do kardiomiocytów w celu pomiaru (krok 4.3), dopełnić aliquoty do 1 ml za pomocą EB. Niediluowane aliquoty można przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.</li>
</ol>
2. Izolacja kardiomiocytów szczura
<ol>
	<li>W celu przygotowania buforu do izolacji (IB) pozbawionego Ca2+, do 1 L wody destylowanej dodać 110 mM NaCl, 2.6 mM KCl, 1.2 mM MgSO4, 1.2 mM KH2PO4, 20 mM HEPES oraz 11 mM glukozy, mieszając za pomocą mieszadła magnetycznego. Dostosować pH do 7.4 w temperaturze pokojowej i przefiltrować przez filtr nakrętkowy 0.2 μm w celu sterylizacji.</li>
	<li>Wypełnić górny zbiornik termostatowanego systemu perfuzji Langendorffa 80 ml buforu IB. Ustawić parametry termostatu tak, aby utrzymać temperaturę buforu na poziomie 37 °C, i napowietrzać bufor mieszaniną 95% O2/5% CO2 przez 30 min.</li>
	<li>Odważyć około 10 000 - 12 000 U kolagenazy typu II oraz 175 mg BSA wolnej od kwasów tłuszczowych i rozpuścić w 20 ml IB zawierającego 22.5 μl roztworu stokowego 100 mM CaCl2. Skontrolować pH buforu izolacyjnego w górnym zbiorniku i w razie potrzeby je skorygować.</li>
	<li>Zanestetyzować szczura szczepu Wistar o masie 175 - 200 g za pomocą tiopentalu w dawce 375 μg/kg masy ciała. Do roztworu tiopentalu dodać 2500 IU heparyny. Po torakotomii ostrożnie wyciąć serce wraz z nienaruszonym łukiem aorty i przenieść je do lodowatego 0.9% NaCl. Oczyścić serce z krwi i tkanek otaczających, a następnie przenieść do świeżego 0.9% NaCl. Odsłonić aortę, otworzyć reduktor przepływu systemu Langendorffa, aby uzyskać szybkość kapania 2-3/sek, i przymocować serce do kaniuli.</li>
	<li>Przeprowadzić perfuzję serca przez maksymalnie 3 min przy szybkości przepływu 1 kropla/sek w celu wypłukania pozostałej krwi. Rozpocząć cyrkulację buforu IB w systemie Langendorffa. Odlać 20 ml buforu z górnego zbiornika, wlać roztwór kolagenazy i uzupełnić bufor do objętości 80 ml. Cyrkulować roztwór kolagenazy przez kolejne 27 min. Szybkość przepływu należy okresowo kontrolować i utrzymywać na poziomie 1 kropla/sek za pomocą reduktora przepływu.</li>
	<li>Odłączyć serce od kaniuli, usunąć przedsionki oraz aortę i posiekać na małe kawałki. Pozwolić roztworowi kolagenazy spłynąć do dolnego zbiornika, zredukować jego objętość do maksymalnie 40 ml i kontynuować trawienie posiekanych komór przez 10 - 15 min przy ciągłym napowietrzaniu mieszaniną 95% O2/5% CO2. Następnie przefiltrować zawiesinę komórkową przez gazę o rozmiarze oczek 200 μm do probówki 50 ml.</li>
	<li>Przywrócić zawartość Ca2+ w komórkach w 3 etapach: odwirować zawiesinę komórkową przy 43 x g przez 2 min w temperaturze pokojowej i resuspenderć komórki w 10 ml IB zawierającego 200 μM CaCl2. Ponownie odwirować i resuspenderć komórki w 10 ml IB z 500 μM CaCl2. Po końcowym wirowaniu resuspenderć kardiomiocyty w sterylnie przefiltrowanym EB (patrz 1.8) do gęstości 50 000 komórek/ml.</li>
</ol>
3. Barwienie kardiomiocytów barwnikiem Fura-2
<ol>
	<li>Pokryć szkiełko podstawowe z 4 komorami lamininą w ilości 10 μg na komorę i odczekać do całkowitego wyschnięcia.</li>
	<li>Do każdej komory wprowadzić 1 ml zawiesiny kardiomiocytów za pomocą mikropipety z odciętym końcem. Pozostawić komórki do przyczepienia na 1 hr w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Rozcieńczyć 10 μl roztworu stokowego Fura-2 AM o stężeniu 1 mg/ml w 5 ml EB. Roztwór barwiący przechowywać w ciemności.</li>
	<li>Usunąć bufor i nieprzyczepione komórki ze szkiełka, a następnie do każdej komory nanieść 0,5 ml roztworu barwiącego. Inkubować komórki przez 10 min przy umiarkowanym wstrząsaniu. Następnie usunąć roztwór barwiący, przepłukać komórki raz 1 ml EB i na koniec wprowadzić 0,5 ml EB do każdej komory. Podczas procesu barwienia unikać bezpośredniego naświetlania, a zabarwione komórki zawsze przechowywać w ciemności.</li>
</ol>
4. Rejestracja skracania się komórek i przejściowych zmian stężenia Ca2+
<ol>
	<li>Umieść szkiełko nakrywkowe z komorami na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym połączonym z systemem zapisu wapnia i kurczliwości miocytów. Umieść wykonaną na zamówienie elektrodę z rurką doprowadzającą i odprowadzającą w pierwszej komorze. Przepłukuj kardiomiocyty EB z prędkością 1 ml/min i rozpocznij stymulację elektryczną (20 V, 1 Hz, czas trwania 5 msec). Pozostaw komórki do adaptacji do stymulacji przez około 2 min.</li>
	<li>Wybierz nienaruszonego, pręcikowatego kardiomiocyta z wyraźnymi prążkowaniami i stałym skurczem. Ustaw komórkę w centrum pola widzenia i otwórz kanał kamery. Zorientuj komórkę poziomo w obszarze wideo, obracając adapter kadrowania komórek i przesuwając stolik mikroskopu.</li>
	<li>Dostrój elementy sterujące detekcją krawędzi obszaru wideo (Rysunek 2), otwórz kanał fluorescencyjny i zarejestruj 10–15 skurczów, aby uzyskać początkowe skrócenie komórki i przejściowy wzrost Ca2+.</li>
	<li>Zamknij kanał świetlny mikroskopu, aby uniknąć blaknięcia barwnika fluorescencyjnego. Przełącz przepływ z EB na obejście próbki za pomocą zaworu trójdrożnego i przepłucz kardiomiocyty 1 ml IgG pacjenta. Zatrzymaj pompę tuż przed dotarciem powietrza do komory.</li>
	<li>Otwórz kanał świetlny i zarejestruj kolejne 10–15 skurczów, aby uzyskać ostrą odpowiedź komórki. Wstrzymaj zapis i ponownie zamknij kanał świetlny. Powtórz rejestrację po 2 i 5 min.</li>
	<li>Wyjmij elektrodę z komory. Dokładnie oczyść rurki za pomocą EB i przejdź do następnej komory szkiełka nakrywkowe.</li>
	<li>Przeanalizuj skrócenie komórki i przejściowy wzrost Ca2+ za pomocą oprogramowania IonWizard, korzystając odpowiednio z okien „Edge-Length/Length” oraz „fura 2-Numeric subtracted/Ratio”. Oblicz procentową zmianę wysokości szczytu w stosunku do linii bazowej (bl%peak h) względem początkowego skrócenia komórki i przejściowego wzrostu Ca2+ dla odpowiedzi ostrej, po 2 min i po 5 min.</li>
</ol>

<ol><li>Roger, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics--2011+update%3A+a+report+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association.</a> Circulation. 123 (4), e18(2011).</li>
<li>Caforio, A. L., Vinci, A., Iliceto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-heart+autoantibodies+in+familial+dilated+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Anti-heart autoantibodies in familial dilated cardiomyopathy.</a> Autoimmunity. 41 (6), 462(2008).</li>
<li>Yoshikawa, T., Baba, A., Nagatomo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+mechanisms+underlying+dilated+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+J%22%5BJournal%5D)">Autoimmune mechanisms underlying dilated cardiomyopathy.</a> Circ. J. 73 (4), 602(2009).</li>
<li>Felix, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemodynamic+effects+of+immunoadsorption+and+subsequent+immunoglobulin+substitution+in+dilated+cardiomyopathy%3A+Three-month+results+from+a+randomized+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Hemodynamic effects of immunoadsorption and subsequent immunoglobulin substitution in dilated cardiomyopathy: Three-month results from a randomized study.</a> Journal of the American College of Cardiology. 35 (6), 1590(2000).</li>
<li>Staudt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+immunoglobulin+G3+subclass+in+dilated+cardiomyopathy%3A+results+from+protein+A+immunoadsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Role of immunoglobulin G3 subclass in dilated cardiomyopathy: results from protein A immunoadsorption.</a> Am. Heart J. 150 (4), 729(2005).</li>
<li>Nikolaev, V. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+fluorescence+method+for+the+rapid+detection+of+functional+beta1-adrenergic+receptor+autoantibodies+in+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">A novel fluorescence method for the rapid detection of functional beta1-adrenergic receptor autoantibodies in heart failure.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 50 (5), 423(2007).</li>
<li>Jahns, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+activating+human+beta1-adrenergic+receptors+are+associated+with+reduced+cardiac+function+in+chronic+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies activating human beta1-adrenergic receptors are associated with reduced cardiac function in chronic heart failure.</a> Circulation. 99 (5), 649(1999).</li>
<li>Gocayne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+structure+of+rat+cardiac+beta-adrenergic+and+muscarinic+cholinergic+receptors+obtained+by+automated+DNA+sequence+analysis%3A+further+evidence+for+a+multigene+family%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Primary structure of rat cardiac beta-adrenergic and muscarinic cholinergic receptors obtained by automated DNA sequence analysis: further evidence for a multigene family.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (23), 8296(1987).</li>
<li>Jaenicke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+sequence+of+the+human+beta-myosin+heavy+chain+gene+and+a+comparative+analysis+of+its+product%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">The complete sequence of the human beta-myosin heavy chain gene and a comparative analysis of its product.</a> Genomics. 8 (2), 194(1990).</li>
<li>Piper, H. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPiper%2C+HM+%22Cell+Culture+Techniques+in+Heart+and+Vessel+Research%22">Cell Culture Techniques in Heart and Vessel Research</a>. , Springer. Berlin, Heidelberg, New York. (1990).</li>
<li>Kubin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+endothelial+cells+remodel+cultured+adult+cardiomyocytes+and+increase+their+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Microvascular endothelial cells remodel cultured adult cardiomyocytes and increase their survival.</a> Am. J. Physiol. 276 (6 Pt. 2), H2179(1999).</li>
<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+Ca2%2B+indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J. Biol. Chem. 260 (6), 3440(1985).</li>
<li>Magnusson, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmunity+in+idiopathic+dilated+cardiomyopathy.+Characterization+of+antibodies+against+the+beta+1-adrenoceptor+with+positive+chronotropic+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Autoimmunity in idiopathic dilated cardiomyopathy. Characterization of antibodies against the beta 1-adrenoceptor with positive chronotropic effect.</a> Circulation. 89 (6), 2760(1994).</li>
<li>Wakefield, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+in+vitro+methods+to+safety+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Fundam.+Clin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The application of in vitro methods to safety pharmacology.</a> Fundam. Clin. Pharmacol. 16 (3), 209(2002).</li>
<li>Kajzar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+physiological+conditions+for+cell+analyses%3A+forces+of+heart+muscle+cells+suspended+between+elastic+micropillars%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Toward physiological conditions for cell analyses: forces of heart muscle cells suspended between elastic micropillars.</a> Biophys. J. 94 (5), 1854(2008).</li>
</ol>

Brak deklarowanych konfliktów interesów.

Przedstawiona metoda oferuje odpowiedni sposób wykrywania funkcjonalnie aktywnych autoprzeciwciał przeciwsercowych u pacjentów z DCM o niejasnej etiologii. W porównaniu z innymi metodami, np. wykrywaniem funkcjonalnie aktywnych przeciwciał przeciwko β1-adrenoreceptorowi poprzez ich wpływ na poziom cAMP6, nasza metoda jest niezależna od konkretnego epitopu. Oczywiście w literaturze opisano inne testy niezależne od epitopu, tj. zliczanie częstotliwości skurczów neonatalnych kardiomiocytów1...

<table><tbody><tr><td>Roztwór do konserwacji immunosorpcyjnej</td><td>Fresenius Medical Care</td><td>903609211</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu 2</td><td>Cell System</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>BSA, wolna od kwasów tłuszczowych</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6003</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0888</td><td>1 mg/ml w DMSO</td></tr><tr><td>Kolumny chromatograficzne Econo Pac</td><td>BioRad</td><td>732-1010</td><td></td></tr><tr><td>Membrana do dializy z octanu celulozy Spectra/Por Biotech</td><td>Spectrumlabs</td><td>131417</td><td></td></tr><tr><td>Pokrywkowe szkiełka z 4 komorami</td><td>Nunc</td><td>155383</td><td></td></tr><tr><td>System zapisu wapnia i kurczliwości miocytów</td><td>IonOptix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie analityczne IonWizard 6.0</td><td>IonOptix</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar wpływu przeciwciał na funkcje komórkowe izolowanych kardiomiocytów

Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes

Kardiomiopatia rozstrzeniowa (DCM) jest jedną z głównych przyczyn niewydolności serca u młodszych dorosłych1. Choć predyspozycje genetyczne i ekspozycja na substancje toksyczne są znanymi przyczynami tej choroby w przypadku około jednej trzeciej pacjentów, pochodzenie DCM pozostaje w dużej mierze niejasne. U znacznej liczby tych pacjentów wykryto autoprzeciwciała przeciwko epitopom serca, które prawdopodobnie odgrywają kluczową rolę w początkach i progresji choroby2,3. Znaczenie autoprzeciwciał przeciwsercowych podkreśla poprawa hemodynamiczna obserwowana u pacjentów z DCM po usunięciu autoprzeciwciał za pomocą immunoadsorpcji3-5. Zidentyfikowano już szereg specyficznych antygenów2,3, a przeciwciała przeciwko tym celom można wykryć za pomocą testów immunoanalitycznych. Jednak testy te nie pozwalają odróżnić autoprzeciwciał stymulujących (a zatem funkcjonalnie aktywnych) od blokujących. Coraz więcej dowodów wskazuje na to, że rozróżnienie to jest kluczowe6,7. Można również założyć, że cele dla wielu przeciwciał kardiotropowych nie zostały jeszcze zidentyfikowane, przez co nie mogą być wykrywane za pomocą testów immunoanalitycznych. W związku z tym opracowaliśmy metodę wykrywania funkcjonalnie aktywnych przeciwciał kardiotropowych, niezależnie od ich odpowiedniego antygenu. Podstawą tej metody jest wysoka homologia zazwyczaj obserwowana dla regionów funkcjonalnych białek serca u ssaków8,9. Sugeruje to, że przeciwciała sercowe skierowane przeciwko antygenom ludzkim będą wykazywać reakcję krzyżową z nie-ludzkimi komórkami docelowymi, co umożliwia testowanie IgG od pacjentów z DCM na kardiomiocytach dorosłego szczura. Nasza metoda składa się z 3 etapów: po pierwsze, IgG jest izolowane z osocza pacjenta przy użyciu przeciwciał przeciw-IgG sprzężonych z sefarozą, pochodzących z kolumn do immunoadsorpcji (PlasmaSelect, Teterow, Niemcy). Po drugie, kardiomiocyty dorosłych osobników są izolowane poprzez perfuzję kolagenazą w aparacie perfuzyjnym Langendorffa, stosując protokół zmodyfikowany na podstawie wcześniejszych prac10,11. Uzyskane kardiomiocyty są przytwierdzone do szkiełek nakrywkowych z komorami pokrytymi lamininą i barwione Fura-2, fluorescencyjnym barwnikiem selektywnym dla wapnia, który może być łatwo wprowadzony do komórki w celu obserwacji wewnątrzkomórkowej zawartości wapnia (Ca2+)12. W ostatnim kroku efekt IgG pacjenta na skróceniu komórki i przejściowych zmianach poziomu Ca2+ w kardiomiocytach stymulowanych polem elektrycznym jest monitorowany online przy użyciu komercyjnego systemu monitorowania wapnia i kurczliwości miocytów (IonOptix, Milton, MA, USA) podłączonego do standardowego odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego.

Poniżej przedstawiono dwa przykłady pomiaru inotropii komórkowej w stymulowanych elektrycznie kardiomiocytach dorosłych (Rycina 2) z wykorzystaniem systemu rejestracji Ca2+ i kurczliwości miocytów. Rycina 3 przedstawia pomiar kontrolny, natomiast na Rycynie 4 pokazano efekt działania przeciwciał kardiodepresyjnych pobranych od pacjenta z DCM.
W obu przykładach początkowe skrócenie komórki oraz przejściowy wzrost Ca2+ podc...

Przedstawiona metoda umożliwia wykrycie funkcjonalnych, efektywnych kardiotropowych autoprzeciwciał w osoczu pacjentów z rozstrzeniowym kardiomiopatią, niezależnie od konkretnego antygenu, poprzez analizę wpływu wyizolowanych immunoglobulin pacjenta na skracanie się komórek oraz wewnątrzkomórkowe przejścia wapniowe w izolowanych kardiomiocytach szczura.

Pomiar wpływu przeciwciał na funkcje komórkowe izolowanych kardiomiocytów

Rozstrzeniowa kardiomiopatia (DCM) jest jedną z głównych przyczyn niewydolności serca u młodszych dorosłych1. Chociaż predyspozycja genetyczna i ekspozycja na toksyczne...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wykrycie przeciwciał kardiotropowych w osoczu pacjentów z rozstrzeniowym kardiomiopatią lub innymi chorobami serca o podłożu autoimmunologicznym. Osiąga się to poprzez wstępną mini immunoabsorpcję osocza pacjenta na kolumnach spheros z przeciwciałami anty-IgG w celu oczyszczenia immunoglobulin G w drugim kroku. Kardiomiocyty komór wlewkowych są izolowane z dorosłych szczurów rasy Wistar, stanowiąc bazę komórkową dla tego testu biologicznego.Następnie kardiomiocyty zostają pozostawione do przywarcia do szkiełek nakrywkowych komory i barwione barwnikiem URA 2:00 AM, aby umożliwić obserwację wewnątrzkomórkowych przejściowych zmian stężenia wapnia podczas skurczów, po czym testowane jest IgG pacjenta w celu zaobserwowania jego wpływu na kurczliwość kardiomiocytów. Wyniki wskazują, czy IgG pacjenta zawiera przeciwciała tropowe, na podstawie zmian w kurczliwości i przejściowych zmianach stężenia wapnia w izolowanych kardiomiocytach. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak standardowe testy immunoenzymatyczne do wykrywania przeciwciał, jest to, że jest ona niezależna od konkretnego antygenu i pozwala odróżnić przeciwciała stymulujące od blokujących.Procedura zostanie zademonstrowana przez Google przy wsparciu technicznym naszego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować minikolumny do immunoabsorpcji, wsypując 3 ml kulek anty-IgG na każde 2 ml osocza pacjenta pobranego do EDTA do pustej kolumny econopak. Następnie na wierzchu kulek anty-IgG należy umieścić filtr.Odetnij dolną końcówkę kolumny i dociśnij filtr, aby uzyskać szybkość przepływu wynoszącą około jednej kropli na sekundę. Następnie przemyj kolumnę trzykrotnie jedną objętością osocza roztworem 0,9% Sodium chloride. Pipetuj osocze w kolumnie; gdy osocze całkowicie obleje Anti IgG Spheros, przemyj je taką samą objętością 0,9% sodium chloride. Następnie pipetuj do kolumny jedną objętość osocza 0,2 molar glycine hydrochloride o pH 2,8 i pozostaw do pełnego przeniknięcia.Następnie dodaj do kolumny kolejną objętość chlorowodorku glicyny. Zbierz przesącz do probówki o pojemności 15 ml i dostosuj pH do 7,3 za pomocą 0,5 M chlorowodorku TRIS o pH 8,0 w celu regeneracji kolumny. Przemyj ją trzema objętościami osocza chlorowodorku glicyny, a na koniec wykonaj płukanie dwiema objętościami 0,9% NaCl.Kolumnę można wykorzystać do kolejnej próbki osocza przeznaczonej do zastosowania na kardiomiocytach. Zebraną frakcję IgG należy poddać dializie przeciwko buforowi eksperymentalnemu, najpierw przelewając frakcję IgG do rurki z membraną dializacyjną z estru celulozy o progu odcięcia masy cząsteczkowej 100 kilodaltonów. Następnie rurkę umieszczono w jednym litrze EB i powoli mieszano za pomocą mieszadła magnetycznego w temperaturze czterech stopni Celsius. Po ośmiu godzinach rurkę dializacyjną przeniesiono do trzech litrów świeżego EB i dializowano przez kolejne 20 godzin w temperaturze czterech stopni Celsius.Gotuj próbkę przez 30 minut w temperaturze 57 °C w łaźni wodnej. W celu inaktywacji czynników dopełniacza określ całkowite stężenie IgG i przygotuj alikwoty, z których każda zawiera 330 µg IgG. W tej procedurze przygotuj bufor izolacyjny wolny od wapnia zgodnie z załączonym artykułem.Następnie wlej 80 mililitrów IB do górnego zbiornika systemu perfuzyjnego lanor w termostacie, utrzymuj bufor w temperaturze 37 stopni Celsjusza i napowietrzaj go mieszanką 95% tlenu oraz 5% dwutlenku węgla przez 30 minut. Rozpuść około 7 000 do 10 000 jednostek kolagenazy typu dwa oraz 174 miligramy BSA wolnej od kwasów tłuszczowych w 20 mililitrach IB zawierającego 112,5 mikromolarnych chlorku wapnia i w razie potrzeby skoryguj pH buforu izolacyjnego w górnym zbiorniku.Następnie zanieść szczura rasy Wistar o masie od 175 do 200 g za pomocą tiopentalu w dawce 375 µg/kg, dodając do roztworu tiopentalu 2 500 IU heparyny. Po wykonaniu torakotomii ostrożnie wyciąć serce wraz z nienaruszoną aortą i przenieść je do lodowatego roztworu 0% chlorku sodu. Usunąć krew oraz tkanki otaczające serce.Następnie przenieś próbkę do świeżego 0,9% roztworu chlorku sodu i odsłoń aortę. Włącz reduktor przepływu systemu Langendorff, aby uzyskać prędkość kapania od dwóch do trzech kropel na sekundę. Następnie podłącz serce do kaniuli.Płukanie należy prowadzić przez maksymalnie trzy minuty przy prędkości przepływu jednej kropli na sekundę, aby wypłukać pozostałą krew. Następnie należy uruchomić krążenie IB w systemie LOR. Teraz należy odessać 20 mililitrów buforu z górnego zbiornika.Napełnij zbiornik roztworem kolagenazy, a następnie dolej tyle buforu, ile jest wymagane, aby osiągnąć objętość 80 mililitrów. Następnie poddawaj roztwór trawienny cyrkulacji przez kolejne 27 minut. Na koniec odłącz serce od kaniuli.Usuń przedsionki i aortę, a następnie posiekaj komory na małe kawałki. Pozwól, aby bufor trawienny spłynął do dolnego zbiornika. Zredukuj objętość do maksymalnie 40 mililitrów, aby kontynuować trawienie posiekanych komór przez 10 do 15 minut przy ciągłym napowietrzaniu mieszaniną 95%oxygen, 5%carbon dioxide.Następnie przefiltruj zawiesinę komórkową przez gazę o rozmiarze oczek 200 micronów do probówki o pojemności 50 mililitrów. Na koniec przywróć zawartość wapnia w komórkach, wirując zawiesinę komórkową przy 40 3G przez dwie minuty. W temperaturze pokojowej resuspenduj komórki w 10 mililitrach.Bufor IB zawierający 200 µM chlorku wapnia odwirować ponownie, a następnie resuspendować komórki w 10 ml. Bufor IB z 500 µM chlorku wapnia. Po końcowym wirowaniu resuspendować kardiomiocyty w sterylnie filtrowanym buforze EB do gęstości 50 000 komórek/ml.Pokryj szkiełka nakrywkowe w czteroodporyzdrowej komorze 10 µg lamininy na każdą studnię i poczekaj do całkowitego wyschnięcia. Następnie wlej 1 ml zawiesiny kardiomiocytów do każdej studni. Używając mikropipety z przyciętym końcem, pozwól komórkom przytwierdzić się przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej; rozcieńcz 10 µl roztworu stokowego fira 2:00 AM o stężeniu 1 mg/ml w 5 ml buforu EB i przechowuj roztwór barwiący w ciemności.Następnie usunąć bufor i niezwiązane komórki z szkiełek nakrywkowych i pipetować 0,5 ml roztworu barwiącego. Inkubować komórki w każdej studzience przez 10 minut przy umiarkowanym wstrząsaniu. Następnie usunąć roztwór barwiący i jednokrotnie przemyć komórki jednym mililitrem eb.Następnie dodaj 0,5 milliliters EB do każdej studni w tej procedurze, a szkiełko nakrywki umieść pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym podłączonym do systemu rejestracji wapnia i kurczliwości miocytów. Umieść wykonaną na zamówienie elektrodę z rurką doprowadzającą i odprowadzającą w pierwszej studni i przepłucz kardiomiocyty eb z prędkością jeden milliliter per minute.Rozpocznij stymulację elektryczną przy napięciu 20 V, częstotliwości 1 Hz i czasie trwania impulsu wynoszącym 5 ms, a następnie pozwól komórkom zaadaptować się do stymulacji przez około dwie minuty. Wybierz nienaruszoną, prętowatą kardiomiocyt z wyraźnym prążkowaniem i stałą kurczliwością, a następnie ustaw ją w centrum pola widzenia. Następnie otwórz kanał kamery i zorientuj komórkę poziomo w obszarze wideo, obracając adapter kadrowania komórek oraz przesuwając stolik mikroskopu.Dostosuj granice elementów sterujących detekcją obszaru wideo. Włącz kanał fluorescencyjny i zarejestruj od 10 do 15 skurczów, aby uzyskać początkowe skrócenie komórki oraz przejściowy wzrost stężenia wapnia. Następnie wyłącz kanał światła mikroskopu, aby zapobiec blaknięciu barwnika fluorescencyjnego.Przełącz przepływ z EB na obejście próbki za pomocą zaworu trójdrożnego i przepłucz kardiomiocyty jednym mililitrem IgG pacjenta. Zatrzymaj pompę tuż przed dotarciem powietrza do studni, włącz kanał świetlny i rejestruj kolejne 10 do 15 skurczów, aby uzyskać ostrą odpowiedź komórkową. Następnie wstrzymaj rejestrację i ponownie wyłącz kanał świetlny, powtórz pomiary po dwóch i pięciu minutach, a po ich zakończeniu wyjmij elektrodę ze studni. Na koniec przeanalizuj skracanie się komórek oraz przejściowe stężenie wapnia za pomocą oprogramowania IonWizard, wykorzystując odpowiednio okna edge length/length oraz URA two numeric subtracted/ratio.Następnie oblicz procentowe zmiany dla odpowiedzi ostrej, dwuminutowej i pięciominutowej względem początkowego skrócenia komórki oraz maksymalnej amplitudy przejściowego wzrostu stężenia wapnia. Oto reprezentatywny przykład pomiaru kontrolnego. Skrócenie komórki i przejściowy wzrost stężenia wapnia były monitorowane online przed superfuzją IgG oraz bezpośrednio po dwóch i pięciu minutach od superfuzji IgG.Oto przykład pomiaru próbki IgG zawierającej przeciwciała kardiodepresyjne. Skrócenie komórek oraz przejściowy wzrost poziomu wapnia mierzono online przed superfuzją IgG, a następnie bezpośrednio dwie i pięć minut po superfuzji IgG. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat wykrywania przeciwciał kardiotoksycznych w osoczu pacjenta poprzez pomiar wpływu wyizolowanego IgG na skrócenie komórek i przejściowy wzrost poziomu wapnia w izolowanych kardiomiocytach dorosłego szczura.

measurement-antibody-effects-on-cellular-function-isolated

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wpływ przeciwciał na funkcję komórkową izolowanych kardiomiocytów

Niniejsza metoda izolacji funkcjonalnych komórek odpornościowych z serca stanowi alternatywę dla konwencjonalnych metod trawienia kolagenazą, która powoduje niepożądaną aktywację komórek odpornościowych, prowadząc do obniżenia ich reaktywności. Nasza metoda izolacji pozwala na uzyskanie funkcjonalnych komórek odpornościowych serca dzięki uniknięciu problemów związanych z trawieniem enzymatycznym.

Izolacja funkcjonalnych komórek odpornościowych serca

Tutaj opisujemy izolację dorosłych kardiomioktyesów myszy za pomocą systemu perfuzyjnego Langendorffa.  Powstałe komórki tolerują Ca2+, są elektrycznie uśpione i mogą być hodowane i transfekowane adeno- lub lentiwirusami w celu manipulowania ekspresją genów.  Ich funkcjonalność może być również analizowana za pomocą systemu MMSYS i technik zacisków krosowych.

Izolacja, hodowla i charakterystyka funkcjonalna kardiomioktaków dorosłych myszy

Pojedyncze kardiomiocyty od myszy typu dzikiego i zmutowanych mogą być izolowane z serca w celu zbadania ich kurczliwości i przejściowych stanów wapnia. Pozwala to na scharakteryzowanie udziału dysfunkcji komórkowej w dysfunkcji serca z dowolnej przyczyny.

Izolacja i analiza fizjologiczna kardiomiocytów myszy

Tutaj opisujemy zoptymalizowaną, opartą na Langendorffie procedurę izolacji jednokomórkowych kardiomiocytów przedsionkowych z szczurzego modelu niewydolności serca związanej z zespołem metabolicznym z zachowaną frakcją wyrzutową. Ręczna regulacja ciśnienia śródświetlnego w jamach serca jest wdrażana w celu uzyskania funkcjonalnie nienaruszonych miocytów odpowiednich do badań pobudzenia, skurczu i sprzężenia.

Izolacja kardiomiocytów przedsionkowych od szczurzego modelu niewydolności serca związanej z zespołem metabolicznym z zachowaną frakcją wyrzutową

Ten protokół ma na celu opisanie krok po kroku techniki ekstrakcji i oceny funkcji serca za pomocą kardiomiocytów ze skóry. Metodologia ta umożliwia pomiar i ostrą modulację funkcji miofilamentów za pomocą małych zamrożonych biopsji, które można pobrać z różnych lokalizacji serca, od myszy po mężczyzn.

Ocena in vitro czynności serca przy użyciu kardiomiocytów ze skórą

Opracowaliśmy prostąmetodę izolowania wysokiej jakości pojedynczych komórek serca myszy za pomocą techniki perfuzji antegrade. Metoda ta nie zawiera metody Langendorffa i jest przydatna do izolowania miocytów komorowych i przedsionkowych lub komórek śródmiąższowych, takich jak fibroblasty serca lub komórki progenitorowe.

Metoda perfuzji antegrade do izolacji kardiomiocytów od myszy

Analiza zmian w funkcji skurczowej i integralności komórkowej ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC ma ogromne znaczenie dla nieklinicznego rozwoju leków. Hybrydowy system analizy komórek z 96 dołkami analizuje oba parametry w czasie rzeczywistym i w sposób fizjologiczny, zapewniając wiarygodne wyniki istotne dla człowieka, niezbędne do bezpiecznego przejścia do etapów klinicznych.

Hybrydowy system analizy komórek do oceny zmian strukturalnych i kurczliwych ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC do przedklinicznej oceny ryzyka kardiologicznego

Tutaj przedstawiamy protokół do kwantyfikacji i różnicowania limfocytów B mięśnia sercowego na podstawie ich lokalizacji w przestrzeni wewnątrznaczyniowej lub śródbłonkowej za pomocą cytometrii przepływowej.

Kwantyfikacja i analiza komórek B mięśnia sercowego oparta na cytometrii przepływowej

Ten protokół opisuje, jak mierzyć kurczliwość u pierwotnych kardiomiocytów dorosłych ludzi z serc dawców za pomocą systemu MyoBLAZER, niezawodnej platformy do oceny zmian kurczliwości wywołanych lekiem podczas rozwoju przedklinicznego.

Pomiar kurczliwości serca w izolowanych kardiomiocytach pierwotnych u dorosłych ludzi

Przedstawiamy metodę oceny stężenia cytosolowego Ca2+ w izolowanych naczyniach limfatycznych w celu zbadania zależnych od Ca2+ oraz uwrażliwiających na Ca2+ mechanizmów skurczu mięśni gładkich naczyń limfatycznych.

Pomiar Ca2+ cytozolu w izolowanych naczyniach limfatycznych kurczliwych

Poznaj metodę wykrywania kardiotropowych przeciwciał w osoczu pacjentów z kardiomiopatią rozstrzeniową poprzez analizę wpływu izolowanego IgG na skracanie komórek i transjenty wapniowe w izolowanych kardiomiocytach szczura.

Pomiar wpływu przeciwciał na funkcje komórkowe izolowanych kardiomiocytów

Przeglądaj więcej filmów