Pomiar wpływu przeciwciał na funkcje komórkowe izolowanych kardiomiocytów

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wykrycie przeciwciał kardiotropowych w osoczu pacjentów z kardiomiopatią rozszerzoną lub innymi chorobami serca o podłożu autoimmunologicznym. Osiąga się to poprzez wstępną mini immunoabsorpcję osocza pacjentów na kolumnach spheros anti IgG w celu oczyszczenia immunoglobulin G w drugim kroku. Kardiomiocyty komór komór zdejmowane są z dorosłych szczurów Wistar, stanowiąc bazę komórkową dla tego bioanalizy.

Następnie kardiomiocyty pozostawia się do przytwierdzenia do szkiełek nakrywkowych komory i barwi za pomocą URA 2:00 AM, aby umożliwić obserwację wewnątrzkomórkowych stanów przejściowych wapnia podczas skurczów, a następnie testuje się IgG pacjenta, aby zaobserwować jego wpływ na kurczliwość kardiomiocytów. Wyniki wskazują, czy IgG pacjenta zawiera przeciwciała tropowe, na podstawie zmian w kurczliwości i stanach przejściowych wapnia w izolowanych kardiomiocytach. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak standardowe testy immunoologiczne do wykrywania przeciwciał, jest to, że jest ona niezależna od konkretnego antygenu i pozwala odróżnić przeciwciała stymulujące od blokujących.

Procedura zostanie zademonstrowana przez Google i przy wsparciu technicznym z naszego laboratorium. Aby rozpocząć procedurę, przygotuj minikolumny do immunoabsorpcji, wsypując trzy mililitry sfer anti IgG na dwa mililitry osocza pacjenta pobranego do EDTA do pustej kolumny econopak. Następnie umieść filtr na wierzchu sfer anti IgG.

Przetnij dolną końcówkę kolumny i dociśnij filtr, aby uzyskać szybkość przepływu wynoszącą około jednej kropli na sekundę. Następnie przemyj kolumnę trzykrotnie objętością plazmy odpowiadającą jednej jednostce 0,9% NaCl. Pipetuj plazmę do kolumny; gdy plazma całkowicie obleje sfery anty-IgG, przemyj ją taką samą objętością 0,9% NaCl. Następnie do kolumny pipetuj objętość plazmy odpowiadającą jednej jednostce 0,2 M glicynianu hydrochloru o pH 2,8 i pozostaw do namoczenia w fazie stacjonarnej.

Następnie dodaj do kolumny kolejną objętość chlorku glicyny. Zbierz przesącz do probówki o pojemności 15 ml i dostosuj pH do 7,3 za pomocą 0,5 M chlorku TRIS o pH 8,0, aby zregenerować kolumnę. Przemyj ją trzykrotną objętością plazmy chlorku glicyny po końcowym przemyciu dwukrotną objętością 0,9% NaCl.

Kolumnę można wykorzystać do kolejnej próbki osocza przeznaczonej do użycia na kardiomiocytach. Zebrana frakcja IgG musi zostać poddana dializie przeciwko buforowi eksperymentalnemu; w tym celu należy najpierw przelać frakcję IgG do probówki z membraną dializacyjną z octanu celulozy o progu odcięcia masy cząsteczkowej 100 kilodaltonów. Następnie probówkę umieszcza się w jednym litrze EB i miesza powoli za pomocą mieszadła magnetycznego w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po ośmiu godzinach probówkę do dializy przenosi się do trzech litrów świeżego EB i dializuje przez kolejne 20 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Gotuj próbkę przez 30 minut w temperaturze 57 °C w kąpieli wodnej. Aby dezaktywować czynniki dopełniacza, wyznacz całkowite stężenie IgG i przygotuj alikwoty, z których każda zawiera 330 µg IgG. W tej procedurze przygotuj bufor izolacyjny wolny od wapnia zgodnie z towarzyszącym manuskryptem.

Następnie wlej 80 ml IB do górnego zbiornika systemu perfuzji lanor z termostatem, utrzymuj bufor w temperaturze 37 °C i napowietrzaj go mieszaniną 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla przez 30 minut. Rozpuść około 7 000 do 10 000 jednostek kolagenazy typu II oraz 174 mg BSA wolnego od kwasów tłuszczowych w 20 ml IB zawierającego 112,5 µM chlorku wapnia i w razie potrzeby skoryguj pH buforu izolacyjnego w górnym zbiorniku.

Następnie znieczul szczura linii Wistar o masie od 175 do 200 g, podając tiopentat w dawce 375 µg/kg, z dodatkiem 2 500 IU heparyny do roztworu tiopentatu. Po wykonaniu torakotomii ostrożnie wyciśnij serce wraz z nienaruszoną aortą i przenieś je do lodowatego, 0% roztworu NaCl. Usuń krew oraz tkanki otaczające serce.

Następnie przenieś go do świeżego 0,9% roztworu chlorku sodu i odsłoń aortę. Włącz reduktor przepływu systemu Langendorfa, aby uzyskać prędkość kapania od dwóch do trzech kropli na sekundę. Następnie przymocuj serce do kaniuli.

Przepłukuj organ przez maksymalnie trzy minuty przy szybkości przepływu jednej kropli na sekundę, aby wypłukać pozostałą krew. Następnie wprowadź IB do obiegu w systemie LOR. Teraz pobierz 20 ml buforu z górnego zbiornika.

Napełnij zbiornik roztworem kolagenazy i dolej tyle buforu, ile jest potrzebne, aby osiągnąć objętość 80 mililitrów. Następnie cyrkuluj roztwór trawienny przez kolejne 27 minut. Na koniec oddziel serce od kaniuli.

Usunąć przedsionki i aortę, a następnie posiekać komory na małe kawałki. Pozwolić, aby bufor trawienny spłynął do dolnego zbiornika. Zredukować objętość do maksymalnie 40 ml, aby kontynuować trawienie posiekanych komór przez 10 do 15 minut przy ciągłym napowietrzaniu mieszanką 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla.

Następnie przefiltruj zawiesinę komórkową przez gazę o rozmiarze oczek 200 micron do probówki o pojemności 50 mililitrów. Na koniec przywróć zawartość wapnia w komórkach, wirując zawiesinę komórkową przy 40 3G przez dwie minuty. W temperaturze pokojowej resuspenduj komórki w 10 mililitrach.

Bufor IB zawierający 200 µM chlorku wapnia należy ponownie odwirować, a komórki resuspender w 10 ml buforu IB z 500 µM chlorku wapnia. Po końcowym wirowaniu kardiomiocyty resuspender w sterylnie filtrowanym buforze EB do zagęszczenia 50 000 komórek/ml.

Pokryj szkiełka podstawowe w komorze czterodołkowej 10 µg lamininy na dołek i odczekaj do całkowitego wyschnięcia. Następnie wlej jeden mililitr zawiesiny kardiomiocytów do każdego dołka. Używając mikropipety z uciętą końcówką, pozwól komórkom przytwierdzić się przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, rozcieńcz 10 µL roztworu stokowego fira 2:00 AM o stężeniu 1 mg/mL w pięciu mililitrach eb i przechowuj roztwór barwiący w ciemności.

Następnie usuń bufor oraz nieprzytwierdzone komórki z szkiełek podstawowych i pipetuj 0,5 mililitra roztworu barwiącego. Inkubuj komórki w każdej studzience przez 10 minut przy umiarkowanym wstrząsaniu. Następnie usuń roztwór barwiący i przemyj komórki raz jednym mililitrem eb.

Następnie dodać 0,5 milliliters EB do każdej studzienki w tej procedurze, a szkiełko nakrywkowe umieścić pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym połączonym z systemem rejestracji wapnia i kurczliwości miocytów. Umieścić wykonaną na zamówienie elektrodę z rurką doprowadzającą i odprowadzającą w pierwszej studni oraz przepłukać kardiomiocyty eb z przepływem 1 milliliter per minute.

Rozpocznij stymulację elektryczną przy napięciu 20 voltów, częstotliwości 1 herca i czasie trwania impulsu 5 milisekund, a następnie pozwól komórkom zaadaptować się do stymulacji przez około dwie minuty. Wybierz nienaruszoną, prętowatą kardiomiocyt z wyraźnym prążkowaniem i stałą kontrakcją, a następnie ustaw ją w centrum pola widzenia. Następnie otwórz kanał kamery i zorientuj komórkę poziomo w obszarze wideo, obracając adapter kadrujący oraz przesuwając stolik mikroskopu.

Dostosuj granice elementów kontrolnych detekcji obszaru wideo. Włącz kanał fluorescencyjny i zarejestruj od 10 do 15 skurczów, aby uzyskać początkowe skrócenie komórek oraz przejściowe stężenie wapnia. Następnie wyłącz kanał światła mikroskopu, aby zapobiec blaknięciu barwnika fluorescencyjnego.

Przełącz przepływ z EB na obejście próbki za pomocą zaworu trójdrożnego i przemyj kardiomiocyty jednym mililitrem IgG pacjenta. Zatrzymaj pompę tuż przed dotarciem powietrza do studzienki, włącz kanał świetlny i zarejestruj kolejne 10 do 15 skurczów, aby uzyskać ostrą odpowiedź komórkową. Następnie wstrzymaj rejestrację i ponownie wyłącz kanał świetlny; powtórz pomiary po dwóch i pięciu minutach, a po ich zakończeniu wyjmij elektrodę ze studzienki. Na koniec przeanalizuj skrócenie komórek oraz przejściowy wzrost stężenia wapnia za pomocą oprogramowania IonWizard, wykorzystując odpowiednio okno edge length/length oraz URA two numeric subtracted/ratio.

Następnie należy obliczyć procentowe zmiany dla odpowiedzi ostrej, dwuminutowej oraz pięciominutowej względem początkowego skrócenia komórki i szczytowej wysokości przejściowego stężenia wapnia. Oto reprezentatywny przykład pomiaru kontrolnego. Skrócenie komórki i przejściowe stężenie wapnia monitorowano online przed superfuzją z IgG oraz bezpośrednio po dwóch i pięciu minutach od superfuzji z IgG.

Oto przykład pomiaru próbki IgG zawierającej przeciwciała kardiodepresyjne. Skrócenie komórki oraz przejściowy wzrost poziomu wapnia mierzono online przed superfuzją IgG oraz bezpośrednio dwie i pięć minut po superfuzji IgG. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat wykrywania przeciwciał kardiotoksycznych w osoczu pacjentów poprzez pomiar wpływu izolowanego IgG na skrócenie komórek i przejściowy wzrost poziomu wapnia w izolowanych kardiomiocytach dorosłych szczurów.