Name: Dwu- i trójwymiarowe obrazowanie żywych komórek białek odpowiedzi na uszkodzenia DNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Poznaj metodę dwu- i trójwymiarowego obrazowania żywych komórek do wizualizacji białek odpowiedzi na uszkodzenia DNA, w tym dynamiki 53BP1 podczas mitozy. Technika fluorescencyjna umożliwia analizę przestrzenno-czasowych relacji białek w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wspierane częściowo przez granty R01NS064593 i R21ES016636 (K.V.). Mikroskopia została przeprowadzona w VCU - Department of Neurobiology &amp; Anatomy Microscopy Facility, wspieranej częściowo z funduszy z grantu rdzeniowego NIH-NINDS 5P30NS047463. Konfokalny mikroskop z wirującym dyskiem został zakupiony dzięki dotacji NIH-NCRR (1S10RR027957).

A. Przygotowanie komórek
<ol>
 <li>Pierwotne ludzkie fibroblasty prawidłowe (GM02270) pozyskano z Coriell Cell Repository, Camden, New Jersey i unieśmiertelniono za pomocą hTERT 6. Komórki hodowano i namnażano w 6-cm szalkach CellStar w pożywce (4 ml) składającej się z MEM uzupełnionej o 20% płodowej surowicy bydlęcej (GIBCO), niezbędne/niezbędne aminokwasy, witaminy, pirogronian sodu oraz penicylinę/streptomycynę (HyClone).</li>
 <li>Komórki ludzkiej embrionalnej nerki 293 (HEK293) pozyskano z American Type Culture Collection i hodowano oraz namnażano w 6-cm szalkach CellStar. Komórki utrzymywano w pożywce (4 ml) składającej się z DMEM uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej, niezbędne aminokwasy, L-glutaminę oraz penicylinę/streptomycynę.</li>
 <li>Konstrukty genów fuzyjnych 53BP1-mCherry (N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro; plazmid Addgene 19836) i H2B-GFP (pCLNR-H2BG; plazmid Addgene 17735), wykazujące również ekspresję genów oporności na puromycynę lub G418 odpowiednio, wprowadzono do komórek poprzez transdukcję (fibroblasty) lub transfekcję (HEK293) przy użyciu SuperFect (Qiagene) i utrzymywano pod selekcją lekową. Okresowo sprawdzano utrzymywanie się fluorescencji.</li>
 <li>Na 24-48 h przed akwizycją obrazów komórki poddano trypsynizacji do zawiesiny pojedynczych komórek i wysiano w niskiej gęstości na szklane płytki FluroDish 3,5-cm.</li>
</ol>
B. Konfiguracja mikroskopu i akwizycja obrazów
Protokół ten opracowano przy użyciu konfokalnego mikroskopu z dyskiem wirującym Zeiss Cell Observer SD, wyposażonego w statyw AxioObserver Z1, dwukanałową jednostkę dysku wirującego Yokagawa CSU-X1A 5000, dwie kamery emCCD Photometrics QuantEM 512SC, iluminator światłowodowy HXP 120C, 4 lasery (wielolinijny laser argonowy Lasos 100mW [458, 488, 514 nm], diodę 50 mW 405 nm, diodę 40 mW 561 nm oraz diodę 30 mW 635 nm), AOTF, system inkubacji stołu Pecon XL multiS1, moduły inkubacyjne Zeiss (O2 Module S, CO2 Module S, TempModule S, Heating Unit XL S) oraz zmotoryzowany stół XY firmy Prior z wkładką piezoelektryczną NanoScanZ Z. Aby zminimalizować aberracje sferyczne podczas obrazowania żywych komórek w medium wodnym, zastosowano obiektyw C-Apochromat 63x/1.20 Water/Corr oraz ciecz imersyjną Zeiss Immersol W (o współczynniku refrakcji n = 1.334). Do dwukanałowego obrazowania konfokalnego użyto lustra dichroicznego RQFT 405/488/568/647 oraz filtrów emisyjnych BP525/50 (zielony) i BP629/62 (czerwony). Wykorzystano oprogramowanie systemowe Zeiss Axiovision (ver. 4.8.2.0) z modułami AV4 Multi-channel/Z/T, Fast Imaging, Physiology, MosaiX, Mark &amp; Find, Dual Camera, Inside 4D, Autofocus oraz 3-D Deconvolution.
<ol>
 <li>Upewnij się, że CO2 gaz dopływa do CO2 Moduł systemu inkubacyjnego. Jeśli mikroskop jest wsparty na antywibracyjnym stole pneumatycznym, włącz dopływ powietrza (lub N2 gaz) do stołu pneumatycznego.</li>
 <li>Włącz zasilanie statywu mikroskopu, jednostki dysku obrotowego, kamer, modułów inkubacyjnych, iluminatora HXP, zmotoryzowanego stolika, lasera argonowego oraz komputera.</li>
 <li>Po 1 minucie czasu rozgrzewania przekręć klucz zapłonu lasera argonowego do pozycji „On”.</li>
 <li>Na panelu sterowania laserem Zeiss włącz przełączniki odpowiadające liniom laserowym, które będą wykorzystywane.</li>
 <li>Przełącz przełącznik kontrolera lasera argonowego Lasos z pozycji „standby” na „laser run” i dostosuj kontroler światła do optymalnego poziomu (t. j. tuż poniżej punktu, w którym zielony wskaźnik zmienia kolor na czerwony).</li>
 <li>Uruchom oprogramowanie AxioVision. Uwagainterfejs użytkownika programu AxioVision może być dostosowany do konkretnego mikroskopu oraz sterowanych przez niego komponentów poprzez konfigurację okien i menu rozwijanych. W związku z tym każdy system może posiadać unikalny interfejs. Dlatego w kolejnych krokach przedstawiono ogólne instrukcje obsługi oprogramowania, zamiast wskazówek dotyczących konkretnych okien, kart i/lub menu rozwijanych.</li>
 <li>Na około 1 godzinę przed obrazowaniem w oprogramowaniu zlokalizuj sterowniki inkubatora i włącz ogrzewanie górnej komory oraz płytki stolika. Ustaw temperaturę na 37 °CWłącz CO2 kontrolować i ustawić poziom na 5%.</li>
 <li>Wybierz obiektyw do obrazowania. W niniejszym badaniu zastosowano obiektyw C-Apochromat Water/Corr o powiększeniu 63x i aperturze numerycznej (N.A.) 1,20. UwagaDo tej soczewki wymagane jest zastosowanie medium imersyjnego o współczynniku załamania zbliżonym do wody (płyn imersyjny Zeiss Immersol W).</li>
 <li>Jeśli w dłuższym odstępie czasu planowane jest pobranie próbek z wielu oddzielnych pozycji, należy upewnić się, że zastosowano wystarczającą ilość medium imersyjnego, aby zapewnić jego przeniesienie z jednej pozycji do drugiej.</li>
 <li>Umieść szalkę na stoliku i podnieś obiektyw tak, aby stykał się z jej dnem.</li>
 <li>Za pomocą elementów sterujących mikroskopu lub oprogramowania skieruj emitowane światło do okularów i wybierz odpowiedni zestaw filtrów do szerokiego pola dla interesującego sygnału fluorescencyjnego (w niniejszym badaniu zestaw filtrów „Red” dla 53BP1 oraz zestaw filtrów „GFP” dla H2B).</li>
 <li>Patrząc przez okulary, ustaw ostrość obrazu i zlokalizuj odpowiednie pole z komórkami.</li>
 <li>Za pomocą oprogramowania lub sterowników mikroskopu skieruj emitowane światło z okularów do portu z jednostką konfokalnego dysku obrotowego.</li>
 <li>W oprogramowaniu włącz odpowiedni laser (w przypadku niniejszego badania laser 561 nm dla 53BP1 oraz linię 488 nm lasera argonowego dla H2B).</li>
 <li>Dla każdego kanału należy dostosować intensywność lasera, ustawiając sterownik akustooptycznego filtra przestrajalnego (AOTF) na odpowiedni poziom.</li>
 <li>Wybierz odpowiednie lustro dichroiczne (RQFT 405/488/568/647) oraz filtry emisyjne (BP 629/62 dla 53BP1 i BP 525/50 dla H2B). Otwórz migawkę jednostki tarczy rotacyjnej.</li>
 <li>Wybierz okno „Live”, aby wyświetlić aktualne pole widzenia.</li>
 <li>W oprogramowaniu otwórz panel sterowania „Camera”, wybierz kamerę, której chcesz użyć (w przypadku systemu z dwiema kamerami) i ustaw czas ekspozycji na około 100 ms. Dostosuj wzmocnienie % oraz wzmocnienie EM w razie potrzeby. Uwaga: Konstrukt 53BP1-mCherry wydaje się być dość słabo widoczny. Pomocne okazało się zwiększenie wzmocnienia EM.</li>
 <li>W oprogramowaniu otwórz panel sterowania jednostką konfokalnego dysku obrotowego i dostosuj prędkość obrotu dysku, wpisując czas naświetlania kamery, który został ustawiony w celu uzyskania odpowiedniego obrazu (np. ~100 ms). Kliknij „Set”, aby zatwierdzić zmianę.</li>
 <li>Otwórz „multi-dimensional acquisition”. Wybierz kartę kanałów i wczytaj lub wybierz odpowiednie kanały. W niniejszym badaniu stosujemy kanały zdefiniowane dla dsRed (pobudzenie laserem 561 nm i filtr BP 629/62 dla emisji) oraz GFP (linia lasera 488 nm dla pobudzenia i filtr BP525/50 dla emisji).</li>
 <li>Aby zapewnić rejestrację obrazu, dla obu kanałów zastosowano wspólne lustro dichroiczne (RQFT 405/488/568/647). W oprogramowaniu należy ustawić funkcję „Autofocus”. UwagaPrzejdź do Tools $\rightarrow$ Settings editor, aby dostosować ustawienia MDA. Upewnij się, że ustawiono odpowiednią moc lasera („Odpowiednia moc lasera” odnosi się do ustawienia, które umożliwia wzbudzenie właściwego fluoroforu przy jednoczesnym zminimalizowaniu fotobleachingu).</li>
 <li>W oknie MDA wybierz kartę z-stack. Wybierz opcję „Z-stack at current focus position”. Ustaw zakres dla ~10 μm wykonać stos z-stack i wybrać opcję „optimal” dla liczby kroków, aby zapewnić próbkowanie Nyquista w osi Z. Uwaga: Dokładny rozmiar stosu z (z-stack) będzie zależał od wysokości komórek. Należy go odpowiednio dostosować.</li>
 <li>23. Kliknij „Start” i przeanalizuj otrzymany obraz z-stack, aby upewnić się, że ustawienia są odpowiednie dla badanego zagadnienia (np. w niniejszym badaniu istotne było obrazowanie całego jądra).</li>
 <li>Wybierz zakładkę „T” (czas). W naszym eksperymencie z kamptotecyną ustawiliśmy odstęp między punktami czasowymi obrazowania na 5 min, a całkowity czas trwania sesji na 1 h dla filmu kontrolnego (komórki niepoddane działaniu substancji). Uwaga: Aby zminimalizować fotoblaknięcie komórek, eksperyment należy skonfigurować w taki sposób, aby AOTF blokował laser pomiędzy punktami czasowymi obrazowania.</li>
 <li>W celu obrazowania wielopunktowego kilku komórek w naczyniu, w oknie MDA wybierz kartę position. Upewnij się, że zaznaczono opcję „Apply 'setting before/after time point' per position”. Wybierz „Mark_Find”. Korzystając z widoku „Live”, przesuń naczynie i wybierz odpowiednie pola widzenia.</li>
 <li>Kliknij „Start” w menu wielowymiarowego pozyskiwania danych (multi-dimensional-acquisition), aby rozpocząć eksperyment i zarejestrować film kontrolny (niepoddanych działaniu czynnika komórek).</li>
 <li>Po nagraniu kontrolnym należy dodać odpowiedni preparat (w tym przypadku, 10 μM kamptotecynę). Nagrania wideo z grupy eksperymentalnej (komórki traktowane lekiem) rejestrowano w odstępach 5–10 min przez okres od 2 do 4 h. Uwaga: Ważną kwestią, którą należy wziąć pod uwagę, jest szybkość, z jaką dany efekt występuje po zastosowaniu preparatu. Jak pokazano na filmie, ogniska 53BP1 zaczynają tworzyć się około 5 min po dodaniu CPT. Choć dodawanie leku do szalki ręcznie i ponowna kalibracja mikroskopu są procesami stosunkowo prostymi, zajmują one pewną ilość czasu. Należy uwzględnić ten fakt podczas projektowania eksperymentów.</li>
 <li>W celu monitorowania mitozy ustawiliśmy interwał na 7,5 min i prowadziliśmy rejestrację przez 4–5 h (konkretne ustawienia zależą od użytej linii komórkowej i długości jej cyklu komórkowego). W przypadku dłuższych pomiarów może być konieczne wprowadzenie korekt, aby zapobiec fotobieleniu.</li>
</ol>
C. Przetwarzanie i analiza obrazu
Protokół ten został opracowany przy użyciu oprogramowania Volocity (PerkinElmer). Oprogramowanie wykorzystane do pozyskania tych danych (AxioVision) posiada również funkcję przetwarzania i analizy obrazów. Zachęca się użytkowników do korzystania z dostępnego im oprogramowania oraz zapoznania się z odpowiednią literaturą dotyczącą jego zastosowania.
<ol>
 <li>Uruchom oprogramowanie Volocity. Utwórz i nazwij nową bibliotekę, a następnie zaimportuj pliki wideo.</li>
 <li>Do przeglądania plików najczęściej najkorzystniej jest używać ustawienia „Extended Focus”. Pozwala ono na nałożenie na siebie przekrojów stosu z (z-stack), co w przypadku niniejszego protokołu umożliwia wizualizację ognisk 53BP1 w różnych obszarach jądra.</li>
 <li>Dostosuj filmy w razie potrzeby. Program Volocity jest wyposażony w szereg narzędzi służących do poprawy jakości uzyskanych obrazów. Odpowiednie ustawienie mikroskopu pozwala zaoszczędzić czas podczas późniejszej edycji. Często pomocne jest odszumianie obrazu (dekonwolucja) oraz regulacja jasności i kontrastu. Konkretne potrzeby edycyjne będą różnić się w zależności od eksperymentu.</li>
 <li>Dodaj względny znacznik czasu oraz pasek skali.</li>
 <li>Aby wyświetlić komórki w 3D, przełącz się na ustawienie „3-D Opacity”. Pozwala to na obracanie renderowanych w 3D komórek w przestrzeni, zapewniając tym samym wiele perspektyw oglądu interesujących struktur wewnątrz komórek. Uwaga: Pomocna jest wizualizacja komórek w różnych płaszczyznach, aby określić kierunek przemieszczania się badanych struktur. Na przykład w ustawieniu „Extended Focus” trudno dostrzec, że 53BP1 rzeczywiście dyssocjuje z DNA podczas mitozy, podczas gdy w 3D jest to łatwo zauważalne.</li>
 <li>Filmy i obrazy statyczne można eksportować do różnych typów plików, zależnie od preferencji użytkownika.</li>
</ol>
D. Reprezentatywne wyniki
Przykład tworzenia się ognisk 53BP1 w odpowiedzi na CPT przedstawiono na Rysunku 1. Komórki poddane działaniu CPT tworzą ogniska w ciągu 5-10 min i utrzymują je przez cały czas rejestracji. Jak pokazano na Rysunku 2, 53BP1 dysocjuje z chromatyny na początku mitozy, tworząc cienką mgiełkę wokół kondensujących się chromosomów. Wraz z nastąpieniem telofazy i zakończeniem mitozy, 53BP1 ponownie agreguje w wyraźne ogniska. Choć komórki HEK293 nie były eksponowane na CPT, mimo to tworzyły liczne, spontaniczne ogniska naprawcze 53BP1 powstałe w wyniku endogennych uszkodzeń DNA. Obserwacja ta pozwoliła nam wyciągnąć wniosek, że 53BP1 nie tworzy ognisk we wczesnej fazie mitozy, co jest zgodne z wcześniejszym doniesieniem wykazującym podobny efekt po narażeniu komórek na promieniowanie jonizujące i leki radiomimetyczne 5.
<img alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej jąder komórkowych z i bez zastosowania kamptotecyny, skala 21 μm." src="/files/ftp_upload/4251/4251fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
 Rycina 1. Kamptotecyna (10 μM) indukuje pęknięcia dwuniciowe (DSBs) oraz tworzenie się ognisk 53BP1 w cyklujących fibroblastach w ciągu 30 min od dodania leku do medium.
<img alt="Fazy podziału komórki, od prometafazy do telofazy, mikroskopia fluorescencyjna, mitoza, analiza cyklu komórkowego." src="/files/ftp_upload/4251/4251fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
 Rycina 2. Białko 53BP1 nie tworzy ognisk podczas mitozy aż do telofazy/G1 w komórkach HEK293.

<ol><li>Botuyan, M. V., Lee, J., Ward, I. M., Kim, J. E., Thompson, J. R., Chen, J., Mer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+methylation+state-specific+recognition+of+histone+H4-K20+by+53BP1+and+Crb2+in+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the methylation state-specific recognition of histone H4-K20 by 53BP1 and Crb2 in DNA repair.</a> Cell. 127, 1361-1373 (2006).</li>
<li>Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((53BP1+promotes+non-homologous+end+joining+of+telomeres+by+increasing+chromatin+mobility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility.</a> Nature. 456, 524-528 (2008).</li>
<li>Feuerhahn, S., Egly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+to+study+DNA+repair%3A+what%27s+in+the+box%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Tools to study DNA repair: what's in the box.</a> Trends Genet. 24, 467-474 (2008).</li>
<li>Giunta, S., Belotserkovskaya, R., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+signaling+in+response+to+double-strand+breaks+during+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA damage signaling in response to double-strand breaks during mitosis.</a> J. Cell Biol. 190, 197-207 (2010).</li>
<li>Giunta, S., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Give+me+a+break%2C+but+not+in+mitosis%3A+the+mitotic+DNA+damage+response+marks+DNA+double-strand+breaks+with+early+signaling+events%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Give me a break, but not in mitosis: the mitotic DNA damage response marks DNA double-strand breaks with early signaling events.</a> Cell Cycle. 10, 1215-1221 (2011).</li>
<li>Golding, S. E., Morgan, R. N., Adams, B. R., Hawkins, A. J., Povirk, L. F., Valerie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-survival+AKT+and+ERK+signaling+from+EGFR+and+mutant+EGFRvIII+enhances+DNA+double-strand+break+repair+in+human+glioma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Pro-survival AKT and ERK signaling from EGFR and mutant EGFRvIII enhances DNA double-strand break repair in human glioma cells.</a> Cancer Biol. Ther. 8, 730-738 (2009).</li>
<li>Huyen, Y., Zgheib, O., Ditullio, R. A., Gorgoulis, V. G., Zacharatos, P., Petty, T. J., Sheston, E. A., Mellert, H. S., Stavridi, E. S., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylated+lysine+79+of+histone+H3+targets+53BP1+to+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Methylated lysine 79 of histone H3 targets 53BP1 to DNA double-strand breaks.</a> Nature. 432, 406-411 (2004).</li>
<li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461, 1071-1078 (2009).</li>
<li>Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone-GFP+fusion+protein+enables+sensitive+analysis+of+chromosome+dynamics+in+living+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells.</a> Curr. Biol. 8, 377-385 (1998).</li>
<li>Massignani, M., Canton, I., Sun, T., Hearnden, V., Macneil, S., Blanazs, A., Armes, S. P., Lewis, A., Battaglia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+fluorescence+imaging+of+live+cells+by+effective+cytosolic+delivery+of+probes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Enhanced fluorescence imaging of live cells by effective cytosolic delivery of probes.</a> PLoS One. 5, e10459(2010).</li>
<li>Nakamura, K., Sakai, W., Kawamoto, T., Bree, R. T., Lowndes, N. F., Takeda, S., Taniguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+vertebrate+53BP1%3A+a+major+role+in+non-homologous+end+joining+of+DNA+double+strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of vertebrate 53BP1: a major role in non-homologous end joining of DNA double strand breaks.</a> DNA Repair (Amst). 5, 741-749 (2006).</li>
<li>Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+binding+protein+1+%2853BP1%29+is+an+early+participant+in+the+cellular+response+to+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks.</a> J. Cell. Biol. 151, 1381-1390 (2000).</li>
<li>Valerie, K., Povirk, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+mechanisms+of+mammalian+double-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Regulation and mechanisms of mammalian double-strand break repair.</a> Oncogene. 22, 5792-5812 (2003).</li>
<li>Wang, B., Matsuoka, S., Carpenter, P. B., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((53BP1%2C+a+mediator+of+the+DNA+damage+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">53BP1, a mediator of the DNA damage checkpoint.</a> Science. 298, 1435-1438 (2002).</li>
<li>Ward, I. M., Minn, K., Jorda, K. G., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+checkpoint+protein+53BP1+at+DNA+breaks+involves+its+binding+to+phosphorylated+histone+H2AX%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Accumulation of checkpoint protein 53BP1 at DNA breaks involves its binding to phosphorylated histone H2AX.</a> J. Biol. Chem. 278, 19579-19582 (2003).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Utrzymanie integralności genomu jest kluczowe dla przeżycia komórek. Brak ochrony genomu prowadzi do przedwczesnego starzenia się, kancerogenezy lub śmierci 8. Istnieje duże zainteresowanie poznaniem mechanizmów funkcjonowania DDR, co wynika z jego znaczenia zarówno dla badań podstawowych, jak i klinicznych. Na przestrzeni lat opracowano wiele technik wspomagających badanie sposobów, w jakie komórki wykrywają i naprawiają uszkodzenia DNA. Tradycyjne metody, takie jak immunocytochemia i western blotting, stanow...

<table><tbody><tr><td>szalki hodowlane CellStar</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td></tr><tr><td>szalki z przeszklonym dnem FluroDish</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pożywka MEM</td><td>GIBCO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aminokwasy nieessentialne</td><td>GIBCO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aminokwasy</td><td>GIBCO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Witaminy</td><td>GIBCO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pirowinian sodu</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna </td><td>HyClone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca</td><td>GIBCO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro;&lt;br/&gt; plazmid 19836</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCLNR-H2BG; plazmid 17735</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperFect</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System obrazowania Zeiss Cell Observer SD</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxioVision (wersja 4.8.2)</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olej immersyjny Zeiss Immersol W</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>oprogramowanie Volocity (wersja 6.0)</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dwuwymiarowe i trójwymiarowe obrazowanie żywych komórek w celu badania białek odpowiedzi na uszkodzenia dna

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Pęknięcia obu nici (DSBs) są najbardziej szkodliwymi uszkodzeniami DNA, z jakimi może spotkać się komórka. Jeśli nie zostaną naprawione, DSBs niosą ze sobą ogromny potencjał do generowania mutacji i aberracji chromosomowych1. Aby zapobiec katalizowaniu niestabilności genomowej przez te uszkodzenia, kluczowe jest, aby komórki wykryły DSBs, aktywowały odpowiedź na uszkodzenia DNA (DDR) i naprawiły DNA. Po stymulacji DDR działa w celu zachowania integralności genomu, wywołując zatrzymanie cyklu komórkowego, aby umożliwić przeprowadzenie naprawy, lub wymuszając przejście komórki w apoptozę. Dominujące mechanizmy naprawy DSB zachodzą poprzez niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) oraz naprawę poprzez rekombinację homologiczną (HRR) (przegląd w2). Istnieje wiele białek, których aktywność musi być precyzyjnie skoordynowana, aby DDR funkcjonował prawidłowo. W niniejszej pracy opisujemy metodę dwu- i trójwymiarowej (D) wizualizacji jednego z tych białek, 53BP1.
Białko wiążące p53 1 (53BP1) lokalizuje się w obszarach DSB poprzez wiązanie zmodyfikowanych histonów3,4, tworząc ogniska w ciągu 5-15 minut5. Przyjmuje się, że modyfikacje histonów oraz rekrutacja 53BP1 i innych białek DDR do miejsc DSB ułatwiają reorganizację strukturalną chromatyny wokół obszarów uszkodzeń i przyczyniają się do naprawy DNA6. Poza bezpośrednim udziałem w naprawie, opisano dodatkowe role 53BP1 w DDR, takie jak regulacja punktu kontrolnego wewnątrz fazy S, punktu kontrolnego G2/M oraz aktywacja białek DDR działających w dalszej kaskadzie7-9. Niedawno odkryto, że 53BP1 nie tworzy ognisk w odpowiedzi na uszkodzenia DNA indukowane podczas mitozy, lecz oczekuje na wejście komórek w fazę G1 przed lokalizacją w pobliżu DSB6. Stwierdzono, że białka DDR, takie jak 53BP1, łączą się ze strukturami mitotycznymi (takimi jak kinetochory) podczas postępu mitozy10.
W niniejszym protokole opisujemy zastosowanie obrazowania żywych komórek w 2D i 3D do wizualizacji tworzenia się ognisk 53BP1 w odpowiedzi na działanie czynnika uszkadzającego DNA, kamptotecyny (CPT), a także zachowania 53BP1 podczas mitozy. Kamptotecyna jest inhibitorem topoizomerazy I, który powoduje przede wszystkim powstawanie DSB podczas replikacji DNA. W tym celu wykorzystaliśmy wcześniej opisany konstrukt białka fuzyjnego 53BP1-mCherry, składający się z domeny białka 53BP1 zdolnej do wiązania się z DSB11. Dodatkowo zastosowaliśmy konstrukt białka fuzyjnego histony H2B-GFP, umożliwiający monitorowanie dynamiki chromatyny w całym cyklu komórkowym, a w szczególności podczas mitozy12. Wielowymiarowe obrazowanie żywych komórek jest doskonałym narzędziem pozwalającym pogłębić naszą wiedzę na temat funkcji białek DDR w komórkach eukariotycznych.

Niniejszy protokół opisuje metodę wizualizacji białka sygnałowego pęknięć dwuniciowych DNA, aktywowanego w odpowiedzi na uszkodzenie DNA, a także jego lokalizacji podczas mitozy.

Dwuwymiarowe i trójwymiarowe obrazowanie żywych komórek w celu badania białek odpowiedzi na uszkodzenia DNA

Pęknięcia dwuniciowe (DSB) są najbardziej szkodliwymi uszkodzeniami DNA, z jakimi może zetknąć się komórka. Jeśli nie zostaną one naprawione, DSB stwarzają ogromny potencjał do generowania...

Niniejsza demonstracja wykorzystuje obrazowanie żywych komórek w 2D i 3D w celu zrozumienia relacji przestrzenno-czasowych białek zaangażowanych w odpowiedź na uszkodzenia DNA. Najpierw należy przeprowadzić transfekcję lub transdukcję wybranej linii komórkowej konstruktami ekspresyjnymi zawierającymi odpowiednie markery fluorescencyjne; w tym przypadku M Cherry i GFP. Następnie należy zarejestrować serię filmów kontrolnych przedstawiających komórki znakowane fluorescencyjnie w warunkach normalnych.Następnie należy zastosować odpowiednią metodę traktowania, zarejestrować dane dotyczące wpływu tego działania na procesy w komórkach fluorescencyjnych, a następnie przeanalizować dane wideo pod kątem relacji czasowo-przestrzennych białek. Ostatecznie fluorescencyjna mikroskopia żywych komórek pozwala na szczegółowe badanie dynamiki komórkowej, takiej jak formowanie się ognisk 53 BP1 w odpowiedzi na czynniki uszkadzające DNA lub zachowanie białka 53 BP1 podczas mitozy. Zainteresowaliśmy się obrazowaniem żywych komórek w 2D i 3D, gdy chcieliśmy zbadać, w jaki sposób różne metody traktowania wpływają na mitozę w określonych liniach komórkowych.To podejście eksperymentalne pozwala na łatwiejsze niż w przypadku metod tradycyjnych badanie odpowiedzi na uszkodzenia DNA oraz utrzymania stabilności genomu. Dodatkowo metodę tę można wykorzystać do badania interakcji określonych białek w różnych szlakach sygnałowych i różnych liniach komórkowych. Główną zaletą obrazowania w czasie rzeczywistym w porównaniu z technikami tradycyjnymi, takimi jak cytochemia, jest możliwość badania białek odpowiedzi na uszkodzenia DNA w czasie rzeczywistym.Optymalizacja odpowiednich warunków rejestracji może być wyzwaniem. Niniejsza demonstracja może służyć do zapoznania się z wieloma drobnymi krokami niezbędnymi do zapewnienia sukcesu. Należy pamiętać, że wytrwałość popłaca w kwestii minimalizacji fotoblaknięcia, ustalania odpowiednich odstępów między pomiarami oraz właściwego czasu trwania rejestracji i tak dalej.Przeprowadź transfekcję lub transdukcję odpowiednich linii komórkowych plazmidami do ekspresji białek fuzyjnych mCherry i GFP. Hoduj kultury pod wpływem selekcji lekowej i okresowo sprawdzaj ekspresję białek fluorescencyjnych na dzień przed akwizycją obrazów. Zbierz komórki przy użyciu trypsyny.Następnie wysiej kultury o niskiej gęstości na płytki z szklanym dnem typu fluoro dish o średnicy 3,5 centymetra. Niniejszy protokół opracowano przy użyciu konfokalnego mikroskopu z dyskiem wirującym Zeiss cell observer SD, wyposażonego w statyw axio observer Z one. Najpierw upewnij się, że gaz CO2 jest dostarczany do modułu CO2 systemu inkubacyjnego. Jeśli mikroskop spoczywa na antywibracyjnym stole pneumatycznym, włącz zasilanie powietrzem dla stołu pneumatycznego.Teraz włącz zasilanie kamer jednostki tarczy wirującej statywu mikroskopu, modułów inkubacji, iluminatora HXP, zmotoryzowanego stolika, lasera argonowego oraz komputera. Włącz przełączniki dla linii laserowych, które będą wykorzystywane. Uruchom oprogramowanie Axio vision.Oprogramowanie Avision może być dostosowywane poprzez okna i menu rozwijane specyficzne dla mikroskopu oraz sterowanych przez niego komponentów. W związku z tym każdy interfejs użytkownika może mieć unikalny wygląd. Około godziny przed rozpoczęciem obrazowania należy zlokalizować sterowniki inkubatora i włączyć ogrzewanie górnej komory oraz płyty stolika.Ustaw temperaturę na 37 °C. Włącz kontrolę CO2 i ustaw poziom na 5%. Wybierz obiektyw do obrazowania w niniejszym badaniu. Obiektyw wymaga zastosowania medium immersyjnego o współczynniku załamania światła zbliżonym do wody.Jeśli obrazowanie wielu pozycji ma trwać przez dłuższy czas, należy nałożyć wystarczającą ilość medium immersyjnego, aby zapobiec jego wysychaniu. Umieść szalkę hodowlaną na stole przedmiotowym i za pomocą sterowników mikroskopu lub oprogramowania przesuń obiektyw tak, aby stykał się z dnem szalki. Skieruj emitowane światło do okularów i wybierz odpowiedni zestaw filtrów szerokopasmowych dla interesującego sygnału fluorescencyjnego.Teraz należy spojrzeć przez okulary. Ustawić ostrość obrazu i zlokalizować odpowiednie pole komórek, korzystając z oprogramowania lub sterowników mikroskopu. Przekierować emitowane światło z okularów do portu z jednostką konfokalnego dysku obrotowego w oprogramowaniu.Włącz odpowiedni laser dla tego badania. Dla każdego kanału dostosuj intensywność lasera, regulując sterownik strojącego filtra optycznego kuo do odpowiedniego poziomu. Następnie wybierz odpowiednie lustro dichroiczne i filtry emisyjne.Otwórz migawkę jednostki dysku rotacyjnego. Następnie wybierz okno podglądu na żywo, aby wyświetlić aktualne pole widzenia. Teraz otwórz okno sterowania kamerą.Wybierz kamerę, której będziesz używać, i ustaw czas ekspozycji na około 100 milisekund. Dostosuj procent sygnału oraz wzmocnienie EM w razie potrzeby. Otwórz również panel sterowania jednostką konfokalnego dysku obrotowego i dostosuj prędkość dysku obrotowego, wpisując czas ekspozycji kamery, który został ustawiony w celu uchwycenia odpowiedniego obrazu.Kliknij przycisk set, aby zatwierdzić zmianę. Następnie otwórz okno akwizycji wielowymiarowej. Wybierz kartę kanałów i wczytaj lub wybierz odpowiednie kanały zdefiniowane dla Flora Fours.Aby zapewnić rejestrację obrazu, należy użyć wspólnego lustra dichroicznego dla obu kanałów. Ustaw oprogramowanie na automatyczne ustawianie ostrości (auto focus). Przejdź do okna MDA i kliknij kartę ZS stack.Wybierz stos ZS w aktualnej pozycji ogniskowej. Ustaw zakres dla stosu o grubości 10 µm i wybierz optymalną liczbę kroków, aby zapewnić próbkowanie Nyquista wzdłuż osi Z. Teraz kliknij start i przeanalizuj otrzymany obraz stosu Z. Wybierz kartę czasu.Ustaw odstęp między punktami czasowymi obrazowania oraz całkowity czas trwania sesji. W przypadku obrazowania wielopunktowego kilku komórek w naczyniu, otwórz okno MDA. Wybierz kartę Position i upewnij się, że zaznaczona jest opcja apply setting before or after time point per position.Teraz wybierz znacznik. Korzystając z podglądu na żywo, przesuń szalkę i wybierz odpowiednie pola widzenia. Kliknij start w menu akwizycji wielowymiarowej, aby rozpocząć eksperyment i nagrać film kontrolny.Następnie należy dodać odpowiedni preparat traktujący i rejestrować wideo z eksperymentu w określonych odstępach czasu przez zdefiniowany okres. W przypadku tej linii komórkowej i w celu monitorowania całego procesu mitozy zastosowano odstęp siedmiu i pół minut przez okres od czterech do pięciu godzin. Należy dobrać odpowiednie ustawienia dla konkretnej linii komórkowej oraz badanego procesu.Uruchom oprogramowanie Velocity, utwórz i nazwij nową bibliotekę, a następnie zaimportuj eksperymentalne pliki wideo w celu ich wyświetlenia. Wypróbuj ustawienie rozszerzonego fokusu i dostosuj filmy w razie potrzeby. Program Velocity jest wyposażony w szereg narzędzi pomagających poprawić jakość uzyskanych obrazów.Odpowiednie ustawienia mikroskopu pozwolą zaoszczędzić wiele czasu na późniejszym etapie edycji. Często pomocne jest rozwinięcie obrazów oraz dostosowanie jasności i kontrastu; konkretne potrzeby będą zależeć od rodzaju prowadzonego eksperymentu. Aby wyświetlić komórki w 3D, należy przełączyć się na ustawienie przezroczystości 3D.Pozwala to na obracanie komórek renderowanych w 3D w przestrzeni, co zapewnia wiele perspektyw oglądu interesujących struktur wewnątrz komórek. Filmy oraz obrazy statyczne mogą zostać wyeksportowane do różnych typów plików, zależnie od preferencji użytkownika. W porównaniu z próbami kontrolnymi, komórki fibroblastów poddane działaniu CPT utworzyły ogniska w ciągu od 5 do 10 minut i utrzymywały je przez cały czas trwania nagrania.Ciekawym jest fakt, że w ludzkich komórkach embrionalnych nerek białko 53 BP1 dysocjuje z chromatyny na początku mitozy, tworząc cienką mgiełkę wokół kondensujących się chromosomów. W miarę jak telofaza postępuje i mitoza dobiega końca, 53 BP1 ponownie agreguje się w wyraźne ogniska. Mamy nadzieję, że ten film umożliwi Państwu badanie zależności czasowo-przestrzennych białek zaangażowanych w odpowiedź na uszkodzenia DNA, jak i innych szlaków.Na przykład w dziedzinie dynamiki chromatyny technika ta została wykorzystana do zbadania, w jaki sposób wiązanie 53 BP1 wpływa na ruch końców telomerycznych DNA. Po stworzeniu genetycznie zmodyfikowanych komórek, obrazowanie żywych komórek 2D i 3D można przeprowadzić w ciągu około czterech do ośmiu godzin. Należy upewnić się, że ustawienia mikroskopu są odpowiednio dostrojone w celu uzyskania optymalnego obrazowania.

two-three-dimensional-live-cell-imaging-dna-damage-response

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Obrazowanie żywych komórek w dwóch i trzech wymiarach białek odpowiedzi na uszkodzenia DNA

W tym filmie opisujemy metodę immunofluorescencji, aby zobrazować lokalizację białek naprawy DNA γH2AX i 53BP1 w miejscach pęknięć dwuniciowego DNA w napromieniowanych jądrach komórkowych.

Oparta na immunofluorescencji wizualizacja interakcji białek naprawy DNA

Lasery są często używane w badaniach nad odpowiedzią komórkową na uszkodzenie DNA. Generują jednak zmiany, których odstępy, częstotliwość i kolizje z widełkami replikacyjnymi są rzadko charakteryzowane. W tym miejscu opisujemy podejście, które umożliwia określenie tych parametrów za pomocą laserowo zlokalizowanych wiązań międzypasmowych.

Analiza pojedynczych cząsteczek zlokalizowanych laserowo adduktów psoralenu

Tutaj pokazano, jak test ligacji zbliżeniowej in situ (PLA) może być wykorzystany do wykrywania i wizualizacji bezpośrednich interakcji białko-białko między ATM i p53 w hodowlach komórek zawiesinowych narażonych na stres genotoksyczny.

Wykrywanie i wizualizacja kompleksów białkowych indukowanych uszkodzeniem DNA w hodowlach komórek zawiesinowych za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

Mikronaświetlanie laserowe jest użytecznym narzędziem do badań nad naprawą DNA w żywych komórkach. Przedstawiono metodologiczne podejście do stosowania laserów UVA do wywoływania różnych zmian w DNA. Zoptymalizowaliśmy metodę miejscowego mikronapromieniowania, która utrzymuje normalny cykl komórkowy; W ten sposób napromieniowane komórki przechodzą przez mitozę.

Zaawansowane techniki mikroskopii konfokalnej do badania interakcji białko-białko i kinetyki zmian w DNA

Celem tego protokołu jest opisanie, jak używać mikronapromieniowania laserowego do wywoływania różnych rodzajów uszkodzeń DNA, w tym stosunkowo prostych pęknięć nici i złożonych uszkodzeń, do badania sygnalizacji uszkodzeń DNA i montażu czynników naprawczych w miejscach uszkodzenia in vivo.

Mikronapromienianie laserowe do badania in vivo odpowiedzi komórkowych na proste i złożone uszkodzenia DNA

Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna i mikropromieniowanie laserowe oferują narzędzia do indukowania uszkodzeń DNA i monitorowania odpowiedzi białek naprawy DNA w wybranych obszarach subjądrowych. Technika ta znacznie poszerzyła naszą wiedzę na temat wykrywania uszkodzeń, sygnalizacji i rekrutacji. Niniejszy manuskrypt demonstruje te technologie do badania naprawy pęknięć jedno- i dwuniciowych.

Zastosowanie mikronapromieniania laserowego do badania naprawy pęknięć jedno- i dwuniciowych w komórkach ssaków

Badanie kinetyki naprawy uszkodzeń DNA wymaga systemu do wywoływania uszkodzeń w określonych regionach subjądrowych. Opisujemy metodę tworzenia zlokalizowanych dwuniciowych pęknięć za pomocą laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w laser 405 nm i zapewniamy zautomatyzowane procedury ilościowego określania dynamiki czynników naprawczych w tych zmianach.

Badanie rekrutacji białek do zmian DNA za pomocą mikropromieniowania laserowego 405 nm

Naprawa pęknięć dwuniciowego DNA jest procesem dynamicznym, wymagającym nie tylko tworzenia kompleksów naprawczych w miejscach pęknięć, ale także ich rozwiązania po usunięciu zmiany. W tym przypadku używamy mikroskopii immunofluorescencyjnej do przejściowych i długotrwałych pęknięć dwuniciowych jako narzędzia do analizy tego mechanizmu utrzymania genomu.

Charakterystyka procesów naprawy DNA przy przejściowych i długotrwałych pęknięciach dwuniciowego DNA za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej

Po uszkodzeniu DNA, ludzkie komórki aktywują niezbędne szlaki naprawcze, aby przywrócić integralność swojego genomu. W tym miejscu opisujemy metodę immunofluorescencji pośredniej jako sposób na wykrycie białek naprawy DNA, analizę ich przestrzennej i czasowej rekrutacji oraz pomoc w badaniu interakcji białko-białko w miejscach uszkodzenia DNA.

Wizualizacja oddziaływania białek naprawy DNA za pomocą immunofluorescencji

Ten artykuł przedstawia podstawowe etapy immunobarwienia i immunoprecypitacji chromatyny. Protokoły te są powszechnie stosowane do badania procesów komórkowych związanych z uszkodzeniem DNA oraz do wizualizacji i ilościowego określenia rekrutacji białek zaangażowanych w naprawę DNA.

Wizualizacja i ilościowe określanie uszkodzeń DNA specyficznych dla miejsca na podstawie endonukleazy

Ten protokół przedstawia nowy system genów reporterowych i eksperymentalne ustawienie do wykrywania transkrypcji przy pęknięciach dwuniciowych DNA z czułością pojedynczej cząsteczki.

Obrazowanie aktywności transkrypcyjnej żywych komórek przy pęknięciach dwuniciowych DNA

Poznaj metodę dwu- i trójwymiarowego obrazowania żywych komórek do wizualizacji białek odpowiedzi na uszkodzenia DNA, w tym dynamiki 53BP1 podczas mitozy. Technika fluorescencyjna umożliwia analizę przestrzenno-czasowych relacji białek w czasie rzeczywistym.

Dwuwymiarowe i trójwymiarowe obrazowanie żywych komórek w celu badania białek odpowiedzi na uszkodzenia DNA

Przeglądaj więcej filmów