Dwu- i trójwymiarowe obrazowanie żywych komórek białek odpowiedzi na uszkodzenia DNA
September 28th, 2012
Ten protokół opisuje metodę wizualizacji białka sygnalizacyjnego dwuniciowego DNA, aktywowanego w odpowiedzi na uszkodzenie DNA, jak również jego lokalizacji podczas mitozy.
Demonstracja ta wykorzystuje obrazowanie żywych komórek w dwóch kolorach i 3D, aby zrozumieć przestrzenne relacje czasowe białek zaangażowanych w odpowiedź na uszkodzenie DNA. Po pierwsze, przetransfekuj lub przetransdukuj wybraną linię komórkową za pomocą konstruktów ekspresyjnych zawierających odpowiednie markery fluorescencyjne. Tutaj M, Cherry i GFP uzyskują następnie serię filmów kontrolnych pokazujących fluorescencyjnie znakowane komórki w normalnych warunkach.
Następnie zastosuj odpowiednią obróbkę i uchwyć dane dotyczące wpływu leczenia na proces komórek fluorescencyjnych i przeanalizuj dane wideo pod kątem przestrzennych relacji czasowych białek. Ostatecznie mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek może szczegółowo opisać dynamikę komórkową, taką jak tworzenie się ognisk 53 BP w odpowiedzi na czynniki uszkadzające DNA lub zachowanie 53 BP podczas mitozy. Po raz pierwszy zainteresowaliśmy się obrazowaniem stylu życia w dwóch i 3D, kiedy chcieliśmy zbadać, jak różne terapie wpływają na mitozę w niektórych liniach komórkowych.
To eksperymentalne podejście pozwala nam badać reakcję na uszkodzenia DNA i utrzymanie stabilności genomu łatwiej niż tradycyjne metody. Dodatkowo możesz użyć tej metody do zbadania, w jaki sposób niektóre białka oddziałują na różne szlaki sygnałowe i różne linie komórkowe. Główną zaletą obrazowania stylu życia w porównaniu z tradycyjnymi technikami, takimi jak cytochemia, jest to, że umożliwia badanie białek odpowiedzi na uszkodzenia DNA w czasie rzeczywistym.
Optymalizacja odpowiednich warunków nagrywania może być wyzwaniem. Ta demonstracja może być wykorzystana do zobaczenia wielu małych kroków potrzebnych do zapewnienia sukcesu. Pamiętaj, że wytrwałość opłaca się, jeśli chodzi o zminimalizowanie wybielania zdjęć, znalezienie odpowiednich interwałów nagrywania i odpowiedniej długości czasu nagrywania i tak dalej.
Transfekcja lub transdukcja odpowiednich linii komórkowych za pomocą plazmidów do ekspresji białek fuzyjnych mCherry i GFP. Utrzymuj hodowle pod selekcją leków i okresowo sprawdzaj ekspresję białek fluorescencyjnych na dzień przed akwizycją obrazu. Zbierz komórki za pomocą trypsyny.
Następnie wysiewaj kultury o niskiej gęstości na 3,5-centymetrowych płytkach dolnych ze szkła fluorowego. Protokół ten został opracowany przy użyciu mikroskopu konfokalnego Zeiss cell observer SD z wirującym dyskiem, wyposażonego w obserwatora aksjologicznego Z jednym stanowiskiem Najpierw sprawdź, czy gaz CO2 przepływa do modułu CO2 systemu inkubacji. Jeśli mikroskop jest podtrzymywany przez antywibracyjny stół powietrzny, włącz dopływ powietrza do stołu powietrznego.
Teraz włącz zasilanie dla statywu mikroskopu, kamer z obracającymi się dyskami, modułów inkubacyjnych, oświetlacza HXP, zmotoryzowanego stolika, lasera argonne i komputera. Włącz przełączniki dla linii laserowych, które mają być używane. Uruchom oprogramowanie Axio Vision.
Oprogramowanie Avision można dostosować za pomocą okien i rozwijanych menu, które są specyficzne dla mikroskopu i komponentów, którymi steruje. W związku z tym każdy interfejs użytkownika ma potencjalnie unikalny wygląd na około godzinę przed obrazowaniem. Zlokalizuj elementy sterujące inkubatora i włącz ogrzewanie górnej komory i płyty stopnia.
Ustaw temperaturę na 37 stopni Celsjusza. Włącz kontrolę CO2 i ustaw poziom na 5%Wybierz soczewkę obiektywu do obrazowania W tym badaniu. Soczewka obiektywu wymaga użycia ośrodka immersyjnego o współczynniku załamania światła podobnym do wody.
Jeśli chcesz obrazować wiele pozycji przez długi czas, upewnij się, że nałożyłeś wystarczającą ilość medium zanurzeniowego, aby luneta nie wyschła. Umieść naczynie hodowlane na stoliku i doprowadź soczewkę obiektywu do kontaktu z dnem, używając elementów sterujących mikroskopu lub oprogramowania. Skieruj emitowane światło na okulary i wybierz odpowiedni zestaw filtrów szerokokątnych dla interesującego nas sygnału fluorescencyjnego.
Teraz spójrz przez soczewki okularowe. Ustaw ostrość obrazu i zlokalizuj odpowiednie pole komórek za pomocą oprogramowania lub elementów sterujących mikroskopu. Skieruj emitowane światło z dala od okularów do portu z konfokalnym obracającym się dyskiem w oprogramowaniu.
Włącz odpowiedni laser do tego badania. Dla każdego kanału dostosuj intensywność lasera, dostosowując sterowanie filtrem przestrajalnym kuo optic do odpowiedniego poziomu. Następnie należy dobrać odpowiednie zwierciadło dichroiczne i filtry emisyjne.
Otwórz żaluzję zespołu obracającego się dysku. Teraz wybierz okno na żywo, aby wyświetlić bieżące pole view. Teraz otwórz okno sterowania kamerą.
Wybierz aparat, który ma być używany, i ustaw czas naświetlania na około 100 milisekund. W razie potrzeby dostosuj procent i wzmocnienie EM. Otwórz również element sterujący konfokalnego zespołu obracającego się dysku i dostosuj prędkość obracającej się tarczy, wprowadzając czas ekspozycji aparatu, który został ustawiony, aby uchwycić odpowiedni obraz.
Kliknij przycisk Ustaw, aby zablokować zmianę. Teraz otwórz okno akwizycji wielowymiarowej. Wybierz zakładkę kanałów i załaduj lub wybierz odpowiednie kanały zdefiniowane dla Flora Fours.
Aby zapewnić rejestrację obrazu, należy użyć wspólnego lustra dichroicznego dla obu kanałów. Ustaw oprogramowanie na automatyczne ustawianie ostrości. Przejdź do okna MDA i kliknij zakładkę stosu ZS.
Wybierz stos ZS w bieżącej pozycji ostrości. Ustaw zakres dla 10 mikronów Zacka i wybierz optymalny dla liczby kroków, aby zapewnić próbkowanie nyquist przez Z. Teraz kliknij start i przeanalizuj wynikowy obraz stosu Z. Wybierz zakładkę czasu.
Ustaw interwał między punktami czasowymi obrazowania i całkowity czas trwania sesji. Aby uzyskać wielopunktowe obrazowanie kilku komórek w naczyniu, otwórz okno MDA. Wybierz kartę pozycji i sprawdź, czy jest zaznaczone ustawienie stosowania przed lub po punkcie czasu dla każdej pozycji.
Teraz wybierz mark. Znajdź za pomocą podglądu na żywo, przesuwaj antenę i wybierz odpowiednie pola widzenia. Kliknij przycisk Start w menu akwizycji wielowymiarowej, aby rozpocząć eksperyment i nagrać kontrolne wideo wideo.
Kontynuuj dodawanie odpowiedniego leczenia i nagrywaj eksperymentalne wideo w określonych odstępach czasu przez określony okres czasu. Dla tej linii komórkowej i do monitorowania całego procesu mitozy użyliśmy interwału siedmiu i pół minuty i to przez cztery do pięciu godzin. Będziesz musiał określić konkretne ustawienia dla swojej linii komórkowej i dla tego, co chcesz badać.
Otwórz oprogramowanie do pomiaru prędkości, utwórz i nazwij nową bibliotekę, a następnie zaimportuj eksperymentalne pliki wideo w celu wyświetlenia plików. Spróbuj użyć rozszerzonego ustawienia ostrości, dostosuj filmy zgodnie z potrzebami. Velocity jest wyposażony w szereg narzędzi, które pomagają poprawić jakość pozyskiwanych obrazów.
Jeśli ustawienia w mikroskopie są odpowiednie, zaoszczędzi to dużo czasu później podczas edycji. Często pomocne jest przeniesienie obrazów i dostosowanie jasności i kontrastu, które będą się różnić w zależności od eksperymentu, aby wyświetlić komórki w 3D. Przełącz się na ustawienie krycia 3D.
Pozwala to na obracanie renderowanych komórek 3D w przestrzeni, zapewniając w ten sposób wiele perspektyw interesujących struktur w komórkach. Filmy. Obrazy nieruchome można eksportować do różnych typów plików w zależności od preferencji użytkownika w porównaniu z elementami sterującymi. Komórki fibroblastów wystawione na działanie CPT tworzyły ogniska w ciągu pięciu do 10 minut i utrzymywały te ogniska przez cały czas trwania zapisu.
Co ciekawe, w ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych 53 BP one dysocjuje od chromatyny na początku mitozy, tworząc cienką mgiełkę wokół kondensujących się chromosomów. Gdy pojawia się teleph i mitoza dobiega końca 53 BP, jeden, po raz kolejny agreguje się w wyraźne ogniska. Mamy nadzieję, że ten film umożliwi Ci zbadanie czasoprzestrzennych relacji białek zaangażowanych w odpowiedź na uszkodzenie DNA, a także innych szlaków.
Na przykład w dziedzinie dynamiki chromatyny technika ta została wykorzystana do zbadania, w jaki sposób wiązanie 53 BP one wpływa na ruch telomerowych końców DNA. Po stworzeniu genetycznie zmodyfikowanych komórek, obrazowanie żywych komórek i 3D można wykonać w ciągu około czterech do ośmiu godzin. Upewnij się, że ustawienia mikroskopu są odpowiednio dostosowane, aby uzyskać optymalne obrazowanie.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę wizualizacji białka sygnalizującego pęknięcie podwójnego łańcucha DNA, aktywowanego w odpowiedzi na uszkodzenia DNA, oraz jego lokalizację podczas mitozy. Demonstracja wykorzystuje dwu- i trójwymiarowe obrazowanie komórek żywych w celu zbadania przestrzenno-czasowych zależności białek zaangażowanych w odpowiedź na uszkodzenia DNA.
Kluczowe Elementy Badania
Dziedzina Nauki
- Biologia Komórkowa
- Odpowiedź na Uszkodzenia DNA
- Obrazowanie Komórek Żywych
Tło
- Zrozumienie odpowiedzi na uszkodzenia DNA jest kluczowe dla regulacji cyklu komórkowego.
- Markery fluorescencyjne pomagają wizualizować dynamikę białek w komórkach żywych.
- Techniki dwu- i trójwymiarowego obrazowania wzmacniają analizę przestrzenną i czasową.
- 53 BP1 jest kluczowym białkiem zaangażowanym w odpowiedź na uszkodzenia DNA.
Cel Badania
- Wizualizacja aktywacji i lokalizacji białek sygnalizujących uszkodzenia DNA.
- Analiza wpływu czynników uszkadzających DNA na dynamikę komórkową.
- Badanie zachowania białek podczas mitozy.
Wykorzystane Metody
- Transfekcja lub transdukcja linii komórkowych konstruktami markerów fluorescencyjnych.
- Nagrywanie filmów kontrolnych komórek oznaczonych fluorescencyjnie w normalnych warunkach.
- Zastosowanie metod leczenia i rejestrowanie danych na temat efektów leczenia.
- Analiza danych wideo pod kątem przestrzenno-czasowych zależności białek.
Główne Wyniki
- Mikroskopia fluorescencyjna komórek żywych ujawnia dynamikę powstawania ognisk 53 BP1.
- Zachowanie białek podczas mitozy jest modyfikowane przez czynniki uszkadzające DNA.
- Obrazowanie dwu- i trójwymiarowe dostarcza informacji na temat odpowiedzi komórkowych na leczenie.
- Przestrzenno-czasowe zależności białek można skutecznie analizować.
Wnioski
- Ta metoda pozwala na szczegółową obserwację białek odpowiedzi na uszkodzenia DNA.
- Obrazowanie komórek żywych jest potężnym narzędziem do badania dynamiki komórkowej.
- Zrozumienie tych procesów może informować strategie terapeutyczne przeciwko uszkodzeniom DNA.
Często Zadawane Pytania
Executive Industry Relevance
Live cell 2D and 3D imaging of DNA damage response proteins such as 53BP1 enables direct visualization of spatiotemporal protein dynamics following genotoxic stress. This capability supports mechanistic de-risking and predictive confidence in early discovery, particularly for targets and pathways involved in genomic stability. Integrating these imaging approaches informs target validation and portfolio triage decisions in oncology and genome maintenance programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables real-time interrogation of DNA repair pathway activation and protein recruitment.
- Supports functional validation of DDR targets by visualizing protein localization and kinetics.
- Facilitates mechanistic de-risking by clarifying pathway engagement and cellular context.
- Provides predictive confidence for advancing DDR modulators or synthetic lethality strategies.
Screening & Assay Development
- Establishes validated live cell systems for quantitative assessment of DDR protein dynamics.
- Enables reproducible measurement of foci formation and chromatin changes post-treatment.
- Supports assay standardization for compound screening targeting DNA repair pathways.
- Allows for scalable adaptation to multiple cell lines and genetic backgrounds.
Translational & Preclinical Research
- Aligns imaging outputs with disease-relevant models of genomic instability.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of DDR-targeting agents.
- Enables risk-adjusted advancement by linking mechanistic readouts to translational endpoints.
- Supports biomarker development for DDR pathway engagement.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging method integrates at the interface of early discovery and lead identification, supporting both hypothesis-driven target validation and downstream assay development for DDR-focused programs.
- Discovery Biology: Visualizes protein recruitment and chromatin remodeling in response to DNA damage, clarifying pathway function.
- Screening: Provides quantitative, reproducible readouts of DDR protein foci for compound evaluation.
- Analytics: Enables measurement of spatiotemporal protein dynamics and comparison across treatments or cell lines.
- Translational Research: Connects mechanistic imaging outputs to disease-relevant models and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for studying diverse DDR proteins and pathways across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in DDR target validation.
- Operational Value: Standardizes live cell imaging workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and capital allocation by providing robust mechanistic data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of DDR-targeting assets and translational biomarker strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live cell imaging, fluorescent protein engineering, and image analysis.
- Demands access to advanced confocal microscopy and environmental control systems.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols and data analysis pipelines.
- Adaptable to various cell lines and DDR proteins with appropriate construct design.
- Imaging conditions must be optimized to minimize photobleaching and ensure data quality.
