Dwuwymiarowe i trójwymiarowe obrazowanie żywych komórek w celu badania białek odpowiedzi na uszkodzenia DNA

Niniejsza demonstracja wykorzystuje obrazowanie żywych komórek w 2D i 3D w celu zrozumienia relacji przestrzenno-czasowych białek zaangażowanych w odpowiedź na uszkodzenia DNA. Najpierw należy przeprowadzić transfekcję lub transdukcję wybranej linii komórkowej konstruktami ekspresyjnymi zawierającymi odpowiednie markery fluorescencyjne; w tym przypadku M Cherry i GFP. Następnie należy zarejestrować serię filmów kontrolnych przedstawiających komórki znakowane fluorescencyjnie w warunkach normalnych.

Następnie należy zastosować odpowiednią metodę traktowania, zarejestrować dane dotyczące wpływu tego działania na procesy w komórkach fluorescencyjnych, a następnie przeanalizować dane wideo pod kątem relacji czasowo-przestrzennych białek. Ostatecznie fluorescencyjna mikroskopia żywych komórek pozwala na szczegółowe badanie dynamiki komórkowej, takiej jak formowanie się ognisk 53 BP1 w odpowiedzi na czynniki uszkadzające DNA lub zachowanie białka 53 BP1 podczas mitozy. Zainteresowaliśmy się obrazowaniem żywych komórek w 2D i 3D, gdy chcieliśmy zbadać, w jaki sposób różne metody traktowania wpływają na mitozę w określonych liniach komórkowych.

To podejście eksperymentalne pozwala na łatwiejsze niż w przypadku metod tradycyjnych badanie odpowiedzi na uszkodzenia DNA oraz utrzymania stabilności genomu. Dodatkowo metodę tę można wykorzystać do badania interakcji określonych białek w różnych szlakach sygnałowych i różnych liniach komórkowych. Główną zaletą obrazowania w czasie rzeczywistym w porównaniu z technikami tradycyjnymi, takimi jak cytochemia, jest możliwość badania białek odpowiedzi na uszkodzenia DNA w czasie rzeczywistym.

Optymalizacja odpowiednich warunków rejestracji może być wyzwaniem. Niniejsza demonstracja może służyć do zapoznania się z wieloma drobnymi krokami niezbędnymi do zapewnienia sukcesu. Należy pamiętać, że wytrwałość popłaca w kwestii minimalizacji fotoblaknięcia, ustalania odpowiednich odstępów między pomiarami oraz właściwego czasu trwania rejestracji i tak dalej.

Przeprowadź transfekcję lub transdukcję odpowiednich linii komórkowych plazmidami do ekspresji białek fuzyjnych mCherry i GFP. Hoduj kultury pod wpływem selekcji lekowej i okresowo sprawdzaj ekspresję białek fluorescencyjnych na dzień przed akwizycją obrazów. Zbierz komórki przy użyciu trypsyny.

Następnie wysiej kultury o niskiej gęstości na płytki z szklanym dnem typu fluoro dish o średnicy 3,5 centymetra. Niniejszy protokół opracowano przy użyciu konfokalnego mikroskopu z dyskiem wirującym Zeiss cell observer SD, wyposażonego w statyw axio observer Z one. Najpierw upewnij się, że gaz CO2 jest dostarczany do modułu CO2 systemu inkubacyjnego. Jeśli mikroskop spoczywa na antywibracyjnym stole pneumatycznym, włącz zasilanie powietrzem dla stołu pneumatycznego.

Teraz włącz zasilanie kamer jednostki tarczy wirującej statywu mikroskopu, modułów inkubacji, iluminatora HXP, zmotoryzowanego stolika, lasera argonowego oraz komputera. Włącz przełączniki dla linii laserowych, które będą wykorzystywane. Uruchom oprogramowanie Axio vision.

Oprogramowanie Avision może być dostosowywane poprzez okna i menu rozwijane specyficzne dla mikroskopu oraz sterowanych przez niego komponentów. W związku z tym każdy interfejs użytkownika może mieć unikalny wygląd. Około godziny przed rozpoczęciem obrazowania należy zlokalizować sterowniki inkubatora i włączyć ogrzewanie górnej komory oraz płyty stolika.

Ustaw temperaturę na 37 °C. Włącz kontrolę CO2 i ustaw poziom na 5%. Wybierz obiektyw do obrazowania w niniejszym badaniu. Obiektyw wymaga zastosowania medium immersyjnego o współczynniku załamania światła zbliżonym do wody.

Jeśli obrazowanie wielu pozycji ma trwać przez dłuższy czas, należy nałożyć wystarczającą ilość medium immersyjnego, aby zapobiec jego wysychaniu. Umieść szalkę hodowlaną na stole przedmiotowym i za pomocą sterowników mikroskopu lub oprogramowania przesuń obiektyw tak, aby stykał się z dnem szalki. Skieruj emitowane światło do okularów i wybierz odpowiedni zestaw filtrów szerokopasmowych dla interesującego sygnału fluorescencyjnego.

Teraz należy spojrzeć przez okulary. Ustawić ostrość obrazu i zlokalizować odpowiednie pole komórek, korzystając z oprogramowania lub sterowników mikroskopu. Przekierować emitowane światło z okularów do portu z jednostką konfokalnego dysku obrotowego w oprogramowaniu.

Włącz odpowiedni laser dla tego badania. Dla każdego kanału dostosuj intensywność lasera, regulując sterownik strojącego filtra optycznego kuo do odpowiedniego poziomu. Następnie wybierz odpowiednie lustro dichroiczne i filtry emisyjne.

Otwórz migawkę jednostki dysku rotacyjnego. Następnie wybierz okno podglądu na żywo, aby wyświetlić aktualne pole widzenia. Teraz otwórz okno sterowania kamerą.

Wybierz kamerę, której będziesz używać, i ustaw czas ekspozycji na około 100 milisekund. Dostosuj procent sygnału oraz wzmocnienie EM w razie potrzeby. Otwórz również panel sterowania jednostką konfokalnego dysku obrotowego i dostosuj prędkość dysku obrotowego, wpisując czas ekspozycji kamery, który został ustawiony w celu uchwycenia odpowiedniego obrazu.

Kliknij przycisk set, aby zatwierdzić zmianę. Następnie otwórz okno akwizycji wielowymiarowej. Wybierz kartę kanałów i wczytaj lub wybierz odpowiednie kanały zdefiniowane dla Flora Fours.

Aby zapewnić rejestrację obrazu, należy użyć wspólnego lustra dichroicznego dla obu kanałów. Ustaw oprogramowanie na automatyczne ustawianie ostrości (auto focus). Przejdź do okna MDA i kliknij kartę ZS stack.

Wybierz stos ZS w aktualnej pozycji ogniskowej. Ustaw zakres dla stosu o grubości 10 µm i wybierz optymalną liczbę kroków, aby zapewnić próbkowanie Nyquista wzdłuż osi Z. Teraz kliknij start i przeanalizuj otrzymany obraz stosu Z. Wybierz kartę czasu.

Ustaw odstęp między punktami czasowymi obrazowania oraz całkowity czas trwania sesji. W przypadku obrazowania wielopunktowego kilku komórek w naczyniu, otwórz okno MDA. Wybierz kartę Position i upewnij się, że zaznaczona jest opcja apply setting before or after time point per position.

Teraz wybierz znacznik. Korzystając z podglądu na żywo, przesuń szalkę i wybierz odpowiednie pola widzenia. Kliknij start w menu akwizycji wielowymiarowej, aby rozpocząć eksperyment i nagrać film kontrolny.

Następnie należy dodać odpowiedni preparat traktujący i rejestrować wideo z eksperymentu w określonych odstępach czasu przez zdefiniowany okres. W przypadku tej linii komórkowej i w celu monitorowania całego procesu mitozy zastosowano odstęp siedmiu i pół minut przez okres od czterech do pięciu godzin. Należy dobrać odpowiednie ustawienia dla konkretnej linii komórkowej oraz badanego procesu.

Uruchom oprogramowanie Velocity, utwórz i nazwij nową bibliotekę, a następnie zaimportuj eksperymentalne pliki wideo w celu ich wyświetlenia. Wypróbuj ustawienie rozszerzonego fokusu i dostosuj filmy w razie potrzeby. Program Velocity jest wyposażony w szereg narzędzi pomagających poprawić jakość uzyskanych obrazów.

Odpowiednie ustawienia mikroskopu pozwolą zaoszczędzić wiele czasu na późniejszym etapie edycji. Często pomocne jest rozwinięcie obrazów oraz dostosowanie jasności i kontrastu; konkretne potrzeby będą zależeć od rodzaju prowadzonego eksperymentu. Aby wyświetlić komórki w 3D, należy przełączyć się na ustawienie przezroczystości 3D.

Pozwala to na obracanie komórek renderowanych w 3D w przestrzeni, co zapewnia wiele perspektyw oglądu interesujących struktur wewnątrz komórek. Filmy oraz obrazy statyczne mogą zostać wyeksportowane do różnych typów plików, zależnie od preferencji użytkownika. W porównaniu z próbami kontrolnymi, komórki fibroblastów poddane działaniu CPT utworzyły ogniska w ciągu od 5 do 10 minut i utrzymywały je przez cały czas trwania nagrania.

Ciekawym jest fakt, że w ludzkich komórkach embrionalnych nerek białko 53 BP1 dysocjuje z chromatyny na początku mitozy, tworząc cienką mgiełkę wokół kondensujących się chromosomów. W miarę jak telofaza postępuje i mitoza dobiega końca, 53 BP1 ponownie agreguje się w wyraźne ogniska. Mamy nadzieję, że ten film umożliwi Państwu badanie zależności czasowo-przestrzennych białek zaangażowanych w odpowiedź na uszkodzenia DNA, jak i innych szlaków.

Na przykład w dziedzinie dynamiki chromatyny technika ta została wykorzystana do zbadania, w jaki sposób wiązanie 53 BP1 wpływa na ruch końców telomerycznych DNA. Po stworzeniu genetycznie zmodyfikowanych komórek, obrazowanie żywych komórek 2D i 3D można przeprowadzić w ciągu około czterech do ośmiu godzin. Należy upewnić się, że ustawienia mikroskopu są odpowiednio dostrojone w celu uzyskania optymalnego obrazowania.