Wrażliwy na napięcie zapis barwnika z aksonów, dendrytów i kolców dendrytycznych poszczególnych neuronów w wycinkach mózgu
29 listopada 2012
Opisano technikę obrazowania do monitorowania zmian potencjału błonowego z submikrometrową rozdzielczością przestrzenną i submilisekundową czasową. Technika, oparta na laserowym wzbudzaniu barwników wrażliwych na napięcie, umożliwia pomiary sygnałów w aksonach i zabezpieczeniach aksonów, końcowych gałęziach dendrytycznych oraz pojedynczych kolcach dendrytycznych.
Ogólnym celem opisywanych eksperymentów jest monitorowanie potencjału błonowego, integracji sygnału i przetwarzania informacji przez pojedynczą komórkę nerwową optycznie z rozdzielczością submikrometrową i submilisekundową z wielu miejsc na neuronie. Osiąga się to poprzez zbudowanie najpierw zestawu do obrazowania o odpowiedniej czułości, aby umożliwić rejestrację niewielkich ułamkowych zmian natężenia światła odpowiadających stanom przejściowym potencjału błonowego. Następnie wybierz neurony o odpowiedniej anatomii, aby skutecznie obrazować neurony z długimi, nienaruszonymi procesami w pojedynczej płaszczyźnie ogniskowej blisko powierzchni wycinka.
Następnie załaduj wstępnie wybrane neurony barwnikami wrażliwymi na napięcie, aby umożliwić optyczne śledzenie zmian potencjału błonowego. Wyniki wskazują na unikalną zdolność tego podejścia do uzyskiwania informacji na temat integracji sygnałów elektrycznych przez poszczególne komórki nerwowe poprzez monitorowanie sygnałów potencjału błonowego z aksonów, dendrytów i kolców dendrytycznych. W neurofizjologii komórkowej.
Nowe narzędzia są opracowywane ze względu na dwa długotrwałe ograniczenia konwencjonalnej elektrofizjologii: niską rozdzielczość przestrzenną pomiarów elektrod oraz niemożność rejestrowania z małych struktur, takich jak aksony lub kolce dendrytyczne. Aby przezwyciężyć te wady, podejście z elektrodą krosową można połączyć z technikami optycznymi, które pozwalają na równoległe zapisy ze wszystkich części neuronu. Tutaj opisujemy taką technikę, wielostronny zapis optyczny stanów przejściowych potencjału błonowego z rozdzielczością pojedynczego grzbietu.
W tym eksperymencie pionowy mikroskop i trzy kamery są używane do regulacji równomiernego oświetlenia. Najpierw umieść odpowiedni filtr o neutralnej gęstości na ścieżce wiązki laserowej. Następnie ustaw ostrość obiektywu na powierzchni standardowego szkiełka fluorescencyjnego.
Obserwując obraz CCD pola widzenia na ekranie monitora, wyreguluj położenie końca odbiorczego światłowodu kwarcowego oraz położenie końca wyjściowego światłowodu za pomocą odpowiednich siłowników na kondensatorze fluorescencyjnym epi w celu uzyskania wyśrodkowanego i równomiernego oświetlenia pola widzenia. Aby określić hałas wibracyjny, użyj standardowego szkiełka fluorescencyjnego z niefluorescencyjnym oznaczeniem na powierzchni. Rejestruj natężenie światła za pomocą neuro CCD w trybie ciągłym.
Ustaw ostrość obiektywu na ciemnej krawędzi czarnego znaku i rejestruj natężenie światła przez około 100 milisekund z częstotliwością odświeżania dwóch kiloherców. Następnie wyświetl średnią przestrzenną ułamkowych śladów natężenia światła z około 20 pikseli odbierających światło z równomiernie oświetlonego obszaru i z około 20 pikseli wzdłuż krawędzi czarnego znacznika. Nadmiar szumu w średniej przestrzennej z pikseli o krawędziach o wysokim kontraście odzwierciedla szum wibracyjny w systemie.
Istotne jest, aby migawka mechaniczna była zamontowana poza stołem wibroizolacyjnym, aby otwarcie żaluzji nie powodowało szumów wibracyjnych w nagraniu optycznym. Jest to kluczowy krok. Zamontuj migawkę za pomocą plastikowych i materiału izolującego drgania, aby zredukować akustyczny szum wibracyjny, który może być odbierany przez optyczny system nagrywania.
Aby wyizolować drgania, wyreguluj tabelę izolacji drgań tak, aby szum drgań pikseli pokrywających ostrą krawędź obrazu był mniejszy niż odgłos ujęcia. Przewody sprzętowe na stole muszą być luźne, aby uniknąć przenoszenia drgań mechanicznych na mikroskop. W tej procedurze należy przygotować wycinki mózgu o grubości od 300 do 400 mikronów zgodnie ze standardowymi procedurami z linią myszy wyrażającą EGFP w poszczególnych interesujących komórkach nerwowych za pomocą systemu konfokalnego z wirującym dyskiem.
Wizualizuj neurony oznaczone EGFP w wycinku. Następnie wybierz neurony z nienaruszonymi dendrytycznymi drzewami aksonalnymi i z procesami przebiegającymi równolegle i blisko powierzchni wycinka w celu obrazowania potencjału błonowego. Następnie napełnij szklaną pipetę z plastrem od końcówki bezbarwnikowym roztworem wewnątrzkomórkowym do dwóch trzecich stożka elektrody, stosując podciśnienie przez około 15 sekund.
Następnie wypełnij elektrodę roztworem zawierającym membranowy IMP przenika barwnik wrażliwy na napięcie rozpuszczony w roztworze wewnątrzkomórkowym. Teraz załataj wcześniej wybrany neuron w ciągu jednej minuty od załadowania barwnika do elektrody. Zastosuj niskie nadciśnienie około 10 milimetrów rtęci przed opuszczeniem pipety do kąpieli, a podczas umieszczania elektrody w plastrze zapewnia to, że barwnik nie wycieknie z elektrody przed ustanowieniem uszczelnienia.
Zwiększ do wysokiego ciśnienia około 100 milimetrów słupa rtęci tuż przed kontaktem elektrody z powierzchnią ogniwa. Ustanawiając uszczelnienie w całej konfiguracji komórki, pozwól na swobodną dyfuzję barwnika z pipety z plastrem somatycznym do somy przez 20 do 45 minut. Podczas dyfuzji barwnika monitoruj stan fizjologiczny neuronu, rejestrując wywołane potencjały czynnościowe w bieżącym trybie cęgowym.
Dodatkowo monitoruj ilość barwienia, rejestrując natężenie światła spoczynkowego z somy komórkowej z częstotliwością odświeżania dwóch kiloherców i przy ułamku pełnego natężenia światła dostosowanego za pomocą filtrów o neutralnej gęstości. Kontynuuj proces pobierania, aż potencjał czynnościowy zacznie się rozszerzać. Pod koniec barwienia ostrożnie odciągnij pipetę z łatą od somy w konfiguracji zacisków napięciowych, aby upewnić się, że w tym procesie zostanie osiągnięte przejście z całego ogniwa do konfiguracji łaty na zewnątrz.
Następnie S inkubuje plasterek przez dodatkowe 1,5 do dwóch godzin w temperaturze pokojowej, aby umożliwić wrażliwemu na napięcie barwnikowi rozprzestrzenienie się w procesach neuronalnych. Po dyfuzji znacznej ilości barwnika z somy do procesów dendrytycznych i aksonalnych, forma falowa potencjału czynnościowego powinna zostać całkowicie przywrócona. W następnym kroku zlokalizuj somę neuronu barwnikowego pod fluorescencją o niskiej intensywności.
Zmniejsz natężenie światła za pomocą filtrów o neutralnej gęstości do minimum wymaganego do wizualizacji obiektu zainteresowania za pomocą stolika XY Skanuj obszar wycinka zawierającego neuron fluorescencyjny, aż do zidentyfikowania somy fluorescencyjnej. Umieść somę barwionej komórki w środku pola mikroskopu, powtórz neuron za pomocą standardowej elektrody łatowej bez barwnika pod DIC. Następnie wizualizuj procesy neuronalne pod wpływem fluorescencji o niskiej intensywności z częstotliwością klatek od 10 do 40 Hz w trybie ciągłego nagrywania CCD do obrazowania napięciowego.
Używając pozycji etapu XY, proces neuronalny będący przedmiotem zainteresowania w środku obszaru obrazowania. Ponadto należy chronić SOMA przed światłem wzbudzającym za pomocą częściowo zamkniętej przysłony zatrzymującej pole mikroskopu, aby zmniejszyć uszkodzenia fotodynamiczne. Następnie zarejestruj sygnały optyczne związane z wstecznie rozchodzącymi się potencjałami czynnościowymi w poszczególnych gałęziach dendrytycznych.
Następnie zarejestruj sygnały optyczne związane z potencjałami czynnościowymi w aksonie. Następnie zarejestruj sygnały optyczne związane z wstecznie propagującymi potencjały czynnościowe w kolcach dendrytycznych. Użyj odpowiedniej liczby klatek na sekundę, aby dokładnie zrekonstruować kształt fali sygnału.
Jednocześnie okresy rejestracji i ekspozycja na światło wzbudzające o dużym natężeniu powinny być jak najkrótsze, aby zminimalizować bielenie barwnika i uszkodzenia fotodynamiczne. Zapis sygnałów optycznych jest pokazany tutaj. Tu. Górny panel pokazuje konfokalny obraz o wysokiej rozdzielczości barwionego neuronu z aksonem w pozycji nagrywania.
Podczas gdy środkowy panel pokazuje obraz fluorescencyjny aksonu o niskiej rozdzielczości przestrzennej uzyskany za pomocą CCD używanego do obrazowania potencjału błonowego, dolny panel prezentuje zapisy elektrod z somy oraz nagrania optyczne z A IS i węzła rvi. Wyświetlane są surowe dane i przetworzone sygnały. Ten rysunek pokazuje sygnały potencjału czynnościowego z aksonu neuronu korowego L 5 naładowanego działaniem barwnika wrażliwego na napięcie.
Sygnały związane z potencjałem były rejestrowane z szybkością 10 kiloherców. Ślady te wskazują na przejściowy potencjał czynnościowy z trzech lokalizacji. Po pierwsze, zapis elektrody z somy.
Po drugie, nagrania optyczne ze wzgórza aksonu, a po trzecie, zapis optyczny z pierwszej nuty vie, a oto nałożone na siebie sygnały z tych samych trzech miejsc. Rysunek ten pokazuje serię czterech wstecznie rozchodzących się sygnałów potencjału czynnościowego z wielu miejsc na dendrytycznej altanie neuronu korowego L 5, zainicjowaną krótkimi impulsami prądu depolaryzacyjnego o częstotliwości 100 Hz. Pokazane są tutaj sygnały potencjału czynnościowego z pojedynczego grzbietu dendrytycznego.
Poniżej przedstawiono rekonstrukcję anatomiczną uzyskaną ze stosu obrazów konfokalnych wirującego dysku, a poniżej obraz fluorescencyjny tego samego obszaru uzyskany za pomocą kamery CCD. W przypadku obrazowania potencjału błonowego, ślady intensywności fluorescencji odpowiadające wstecznie rozchodzącym się potencjałom czynnościowym z miejsc od pierwszego do trzeciego, jak pokazano na obrazie CCD, pokazano w prawym panelu. Dolna ścieżka wskazuje zapis elektrody z somy.
Przygotowanie wstępnego nagrania trwa około trzech godzin, wliczając w to okres oczekiwania na rozłożenie kostki na procesy dystalne. Czas rejestracji jest ograniczony przez normalny przebieg preparatu i uszkodzenia fotodynamiczne PO. Wielkość uszkodzeń fotodynamicznych jest proporcjonalna do natężenia światła wzbudzającego oraz do czasu trwania i liczby indywidualnych prób rejestracyjnych.
W niektórych eksperymentach możliwe jest przeprowadzenie ponad 50 prób nagrania w ciągu jednej lub dwóch godzin. Inne pomiary wymagają dużego wzbudzenia, natężenia światła i dłuższych zapisów, a także są ograniczone przez uszkodzenia fotodynamiczne do zaledwie kilku prób nagrywania. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić obrazowanie napięcia z całej struktury aksonalnej i endrowej poszczególnych neuronów w wycinkach mózgu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje technikę obrazowania służącą do monitorowania zmian potencjału błonowego w neuronach z podmikrometrową rozdzielczością przestrzenną i podmilisekundową rozdzielczością czasową. Metoda ta wykorzystuje wzbudzanie laserowe barwników napięcioczułych do rejestracji sygnałów z różnych struktur neuronalnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurofizjologia komórkowa
- Techniki obrazowania w neuronauce
- Monitorowanie potencjału błonowego
Wprowadzenie
- Zrozumienie potencjału błonowego jest kluczowe dla badania funkcji neuronów.
- Tradycyjne metody mogą nie zapewniać rozdzielczości przestrzennej i czasowej niezbędnej do szczegółowej analizy.
- Barwniki napięciowo-czułe umożliwiają optyczne śledzenie zmian potencjału błonowego.
- Układy obrazowania muszą być wystarczająco czułe, aby wykryć niewielkie zmiany natężenia światła.
Cel badania
- Monitorowanie integracji sygnałów potencjału błonowego w pojedynczych komórkach nerwowych.
- Uzyskanie obrazowania o wysokiej rozdzielczości z wielu obszarów neuronu.
- Badanie integracji sygnałów elektrycznych w aksonach, dendrytach i kolcach dendrytycznych.
Zastosowane metody
- Budowa układu obrazowania o wysokiej czułości.
- Wybór neuronów o anatomii odpowiedniej do efektywnego obrazowania.
- Obciążanie neuronów barwnikami napięciowo-wrażliwymi.
- Optyczne śledzenie zmian potencjału błonowego w strukturach neuronalnych.
Główne wyniki
- Technika ta umożliwia szczegółowe monitorowanie zmian potencjału błonowego.
- Wyniki wykazują możliwość obserwacji integracji sygnałów w poszczególnych komórkach nerwowych.
- Informacje pozyskuje się z aksonów, dendrytów oraz kolców dendrytycznych.
- Podejście to pozwala na lepsze zrozumienie przetwarzania informacji przez neurony.
Wnioski
- Opisana technika obrazowania dostarcza cennych informacji na temat funkcji neuronów.
- Umożliwia ona badanie integracji sygnałów elektrycznych z wysoką rozdzielczością.
- Metoda ta może przyczynić się do rozwoju badań w dziedzinie neurofizjologii komórkowej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Obrazowanie za pomocą barwników napięciowo-czułych umożliwia monitorowanie dynamiki potencjału błonowego w poszczególnych przedziałach neuronalnych z rozdzielczością submikrometryczną i submilisekundową, co wypełnia krytyczną lukę w elektrofizjologii w badaniu integracji sygnałów w aksonach, dendrytach i kolcach. Możliwość ta wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego w walidacji celów poprzez zapewnienie bezpośrednich, ilościowych odczytów elektrycznego zachowania neuronów w systemach istotnych dla danej choroby. Metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w modelach przedklinicznych, umożliwiając równoległe, wysokiej jakości rejestracje z wielu miejsc w obrębie pojedynczych neuronów, co dostarcza kluczowych informacji dla identyfikacji wiodących związków oraz strategii modulacji szlaków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez ilościowe określanie podprogowych i nadprogowych zdarzeń potencjału błonowego w aksonach, dendrytach i kolcach dendrytycznych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia liniowe, niezależne od barwnika odczyty fluorescencyjne potencjału błonowego w pełnym zakresie fizjologicznym (-100 mV do +100 mV), co wspiera spójną ocenę stopnia oddziaływania na cel.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia ograniczanie ryzyka biologicznego dzięki odwracalnemu, niefarmakologicznemu wprowadzaniu barwnika (JPW 3028), który nie wykazuje wykrywalnego wpływu na funkcje neuronalne.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Gotowość do analizy: Generuje ilościowe sygnały optyczne z setek miejsc rejestracji na jeden neuron, co umożliwia wysokoprzepustową analizę propagacji i integracji sygnałów.
- Powtarzalność: Pozwala na stabilne rejestracje przez dłuższy czas (nawet do setek prób) przed wystąpieniem efektów fototoksycznych, co zapewnia spójność analizy.
- Skalowalność: Kompatybilność z wzbudzeniem laserowym i detekcją wielokamerową umożliwia równoległe monitorowanie przedziałów aksonalnych, dendrytycznych i kolców dendrytycznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- System istotny dla choroby: Zastosowanie w przypadku skrawków mózgu z genetycznie znakowanymi neuronami (np. linie wykazujące ekspresję EGFP), co umożliwia badanie obwodów neuronalnych w modelach zaburzeń neurologicznych.
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez rejestrację dynamiki sygnałów w czasie rzeczywistym w kolcach dendrytycznych i aksonach — kluczowych miejscach plastyczności synaptycznej i dysfunkcji sieci.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez ilościowe określenie wpływu zaburzeń na integrację sygnałów w różnych przedziałach neuronalnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Technika ta integruje się z procesem odkrywania leków, od wczesnej walidacji celu po badania przesiewowe w fazie przedklinicznej, w których wysokorozdzielcze obrazowanie potencjału błonowego wspiera weryfikację hipotez oraz ocenę związków wiodących w systemach neuronalnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez monitorowanie wstecznie propagujących potencjałów czynnościowych w dendrytach i aksonach, ujawniając mechanizmy sumowania i tłumienia sygnałów.
- Przesiewanie: Umożliwia standaryzację testów dzięki jednolitej kalibracji oświetlenia i minimalizacji szumów wibracyjnych, co jest kluczowe dla niezawodnych pomiarów optycznych.
- Analityka: Dostarcza ilościowych przebiegów intensywności fluorescencji odpowiadających przejściowym zmianom potencjału błonowego, co pozwala na bezpośrednie porównanie kształtów fal sygnału w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy się z pracami przedklinicznymi poprzez rejestrację wzorców przesyłania sygnałów na poziomie kolców oraz aksonów, istotnych dla mechanizmów chorób neuropsychiatrycznych i neurodegeneracyjnych.
- Zastosowania w przedsiębiorstwach: Tworzy wielokrotnego użytku platformę obrazowania do podłużnych badań funkcji neuronów w wielu paradygmatach eksperymentalnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną poprzez rejestrację sygnałów elektrycznych z struktur podkomórkowych (np. kolców dendrytycznych), które są niedostępne dla konwencjonalnych elektrod.
- Wartość operacyjna: Osiąga standaryzację dzięki zastosowaniu filtrów gęstości neutralnej, izolacji od wibracji oraz kontrolowanych protokołów dyfuzji barwników w celu zminimalizowania uszkodzeń fotodynamicznych i blaknięcia.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez zmniejszenie zależności od niskoprzepustowej elektrofizjologii w celu uzyskania danych o rozdzielczości podkomórkowej.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka na podstawie ilościowych efektów integracji sygnałów neuronalnych w zwalidowanych systemach istotnych dla danej choroby.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie obrazowania optycznego, elektrofizjologii patch-clamp oraz pracy z barwnikami napięciowo-czułymi.
- Zależność od laserowych źródeł światła, szybkich kamer CCD oraz stołów antywibracyjnych w celu uzyskania czułości poniżej milisekundy.
- Konieczność standaryzacji czasu barwienia, natężenia wzbudzenia i częstotliwości odświeżania klatek pomiędzy zespołami w celu zapewnienia powtarzalności wyników w różnych ośrodkach.
- Konieczność uwzględnienia adaptacji do różnych typów neuronów i obszarów mózgu, w oparciu o integralność anatomiczną oraz orientację wypustek względem powierzchni skrawka.
- Ograniczenie przez uszkodzenia fotodynamiczne przy wysokich natężeniach wzbudzenia i długotrwałym rejestrowaniu, co limituje liczbę prób w zależności od ekspozycji na światło i czasu trwania pomiaru.
Często zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
2:09
Equipment Setup
4:35
Whole-cell Patch-clamp Recording and Dye Diffusion
7:35
Optical Recording
9:30
Results: Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices
11:54
Conclusion
