Name: Wrażliwy na napięcie zapis barwnika z aksonów, dendrytów i kolców dendrytycznych poszczególnych neuronów w wycinkach mózgu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 51 s
Description: Poznaj technikę obrazowania potencjału błonowego neuronów z rozdzielczością submikrometrową i submilisekundową. Metoda wykorzystuje barwniki wrażliwe na napięcie do śledzenia sygnałów w aksonach, dendrytach i kolcach dendrytycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni naszym współpracownikom, Knutowi Holthoffowi, Arthurowi Konnerthowi i Marco Canepariemu, którzy uczestniczyli w początkowym opracowaniu tej techniki, a także Leslie M. Loew za uprzejme udostępnienie barwników. Praca finansowana z grantu NSF IOS-0817969, grantów NIH NS068407 i M136043 oraz przez Instytut Neuronauk Kavli na Uniwersytecie Yale.

1. Konfiguracja sprzętu
Krok 1.1. Konfiguracja obrazowania
Kluczem do rejestracji sygnałów z barwników napięciowo-wrażliwych jest odpowiednia konstrukcja układu. Używamy mikroskopu odwróconego (BX51WI Olympus lub Zeiss AxioExaminer) wyposażonego w trzy kamery. Układ został zaprojektowany do oświetlania poszczególnych neuronów w skrawkach mózgu światłem wzbudzenia w trybie epi-fluorescencji i mikroskopii szerokopolowej, przy użyciu obiektywów imersyjnych wodnych Nikon 60X/1.0 NA lub Zeiss 63X/1.0 NA. Nasze mikroskopy są przytwierdzone do stołu wibroizolacyjnego i wyposażone w zmotoryzowane stoliki. Każdy mikroskop posiada trzy porty kamer. Jeden port kamery posiada standardową kamerę CCD o wysokiej rozdzielczości przestrzennej do wideomikroskopii DIC w podczerwieni (IR-1000, Dage MTI, USA). Drugi port kamery posiada kamerę do szybkiej akwizycji danych (częstotliwość klatek do 20 kHz) o stosunkowo niskiej rozdzielczości przestrzennej (80 x 80 pikseli), ale wyjątkowej rozpiętości tonalnej (14 bitów) i wyjątkowo niskim szumie odczytu (NeuroCCD-SM, RedShirtImaging LLC, Decatur, GA). Trzeci port kamery posiada kamerę CCD o wysokiej rozdzielczości przestrzennej (PixelFly, 1392x1024 pikseli; PCO AG, Niemcy) zamontowaną na konfokalnym skanerze z wirującym dyskiem (CSU-10, Yokogawa, Japonia), służącym do zbierania stosów obrazów konfokalnych (z-stacks) w celu szczegółowej rekonstrukcji morfologicznej zbarwionej komórki. Źródłem światła wzbudzenia jest laser Nd:YVO4 pompowany diodą z podwojeniem częstotliwości, pracujący w trybie ciągłym (400 mW), emitujący światło o długości 532 nm (MLL-III/400 mW; CNI, Changchun, Chiny). Wiązka laserowa o średnicy 2 mm, sterowana migawką (LS6; Vincent Associates), jest kierowana do światłowodu sprzężonego z mikroskopem za pomocą jednoportowego kondensora epifluorescencyjnego (TILL Photonics GmbH, Gräfelfing, Niemcy), zaprojektowanego tak, aby przepełnić tylną aperturę obiektywu i zapewnić niemal jednorodne oświetlenie płaszczyzny obiektu. Światło laserowe jest stosowane zamiast konwencjonalnej lampy łukowej ksenonowej w celu zmaksymalizowania czułości obrazowania Vm poprzez: (1) zastosowanie monochromatycznego światła wzbudzenia w czerwonym skrzydle widma absorpcji, aby zmaksymalizować czułość barwnika na Vm 9, 10 oraz (2) zwiększenie natężenia światła wzbudzenia powyżej poziomu osiągalnego za pomocą lampy łukowej. Światło wzbudzenia było odbijane na preparat przez lustro dichroiczne o centralnej długości fali 560 nm, a rejestrowane światło fluorescencyjne przechodziło przez filtr odcinający 610 nm (Schott RG610). Połączony efekt zwiększenia natężenia światła i zastosowania niemal optymalnych monochromatycznych długości fal wzbudzenia przyniósł drastyczną poprawę czułości obrazowania napięcia o około 50 razy w porównaniu do wcześniejszych pomiarów 6.
Krok 1.2. Korekta w celu uzyskania równomiernego oświetlenia
Należy użyć standardowego preparatu do fluorescencji (pobudzenie zielone/emisja czerwona). W torze wiązki lasera należy umieścić odpowiednie filtry neutralne, aby uniknąć nasycenia detektora CCD. Obiektyw należy ustawić w ostrości na powierzchni preparatu. Należy wyregulować pozycję końcówki odbiorczej kwarcowego światłowodu przed obiektywem emitującym laser oraz ustawić pozycję końcówki wyjściowej światłowodu przymocowanego do mikroskopu, korzystając z odpowiednich elementów sterujących kondensora epi-fluorescencyjnego, aby uzyskać wycentrowane i jednorodne oświetlenie pola widzenia.
Krok 1.3. Określenie szumu wibracyjnego
Nanieś niewielką czarną kropkę z atramentu na powierzchnię preparatu do fluorescencji. Zarejestruj natężenie światła za pomocą NeuroCCD w trybie ciągłego zapisu. Ustaw ostrość obiektywu na ciemną krawędź czarnej kropki. Rejestruj natężenie światła przez około 100 msec przy częstotliwości odświeżania 2 kHz. Wyświetl średnią przestrzenną śladów ułamkowego natężenia światła (ΔF/F) z około 20 pikseli odbierających światło z obszaru równomiernie oświetlonego oraz z około 20 pikseli wzdłuż krawędzi kropki. Nadmiarowy szum w zapisach z pikseli o wysokim kontraście krawędzi odzwierciedla szum wibracyjny w systemie.
Krok 1.4. Izolacja od wibracji
Niezbędne jest ograniczenie drgań poprzez zastosowanie stołu wibroizolacyjnego do poziomu poniżej szumu śrutowego przy natężeniu światła porównywalnym z warunkami rejestracji eksperymentalnej. Należy regulować stół wibroizolacyjny do momentu, aż szum wibracyjny w natężeniu światła z pikseli obejmujących ostrą krawędź obrazu stanie się pomijalny. Na stole nie mogą znajdować się żadne urządzenia z ruchomymi częściami (migawki mechaniczne, wentylatory). Przewody łączące urządzenia znajdujące się na stole z innymi komponentami, które nie są izolowane od drgań, muszą być luźne, aby nie przenosiły wibracji mechanicznych na mikroskop.
2. Wybór odpowiedniego neuronu do obrazowania Vm
Krok 2.1. Wybór neuronów
Przygotować skrawki mózgu zgodnie ze standardowymi procedurami. Należy użyć linii myszy wykazującej ekspresję EGFP w interesujących badacza pojedynczych komórkach nerwowych. Za pomocą konfokalnego systemu ze srebrnym dyskiem (spinning disc) należy zwizualizować neurony znakowane EGFP w skrawku. Do obrazowania Vm należy wybrać neurony z nienaruszonymi drzewami dendrytycznymi/aksonalnymi oraz z wypustkami biegnącymi równolegle i blisko powierzchni skrawka. Nie jest to możliwe w przypadku myszy typu dzikiego, ponieważ aksony i cienkie dendryty w większości nie są widoczne w trybie mikroskopii DIC.
3. Obciążanie neuronów barwnikiem wrażliwym na napięcie
Krok 3.1. Napełnianie pipety patch
Napełnij szklane pipety do patch-clamp od strony końcówki roztworem wewnątrzkomórkowym bez barwnika, przykładając podciśnienie przez około 15 s, aż roztwór osiągnie 2/3 zwężenia elektrody. Obecność roztworu bez barwnika w końcówce jest niezbędna, aby zapobiec rozlaniu barwnika na skrawek tkanki, co zwiększyłoby fluorescencję tła i drastycznie obniżyło stosunek sygnału do szumu. Następnie napełnij elektrodę od tyłu roztworem zawierającym nieprzenikający przez błonę barwnik napięciowy JPW3028 rozpuszczony w roztworze wewnątrzkomórkowym (0,8 mM).
JPW3028, najskuteczniejsza sonda napięciowa do zastosowań wewnątrzkomórkowych, jest dwukrotnie dodatnio naładowanym analogiem lipofilnych barwników styrylowych z serii ANEP, który pozostaje wystarczająco rozpuszczalny w wodzie, aby można go było stosować do mikroiniekcji. Analog dietylowy tego barwnika posiada praktycznie identyczne właściwości (w tym czułość na napięcie) i jest dostępny w sprzedaży jako JPW1114 (patrz Tabela 1). Przygotowujemy 20 mM roztwór zapasowy w destylowanej wodzie H2O. Alikwoty roztworu zapasowego o objętości 50 μl przechowujemy w zamrożeniu w temperaturze -20 °C. Aby uzyskać końcowe stężenie barwnika wynoszące 0,8 mM, w dniu eksperymentu 2 μl roztworu zapasowego rozpuszcza się w 50 μl roztworu wewnątrzkomórkowego. Zapasowy roztwór barwnika jest stabilny i może być przechowywany w temperaturze pokojowej przez kilka miesięcy. W związku z tym jedną alikwotę 50 μl przechowujemy w temperaturze pokojowej aż do jej wykorzystania.
Krok 3.2. Szybkie utworzenie giga-uszczelnienia (giga-seal)
Wykonaj patch-clamp wcześniej wybranego neuronu i pozwól na swobodną dyfuzję barwnika z pipety do patchingu somatycznego do somy w konfiguracji whole-cell przez 20-45 min. Niezbędne jest jak najszybsze uzyskanie szczelnego połączenia (seal), aby ilość roztworu bez barwnika w końcówce pipety była jak najmniejsza. Rozpocznij od ćwiczenia szybkiego patchingu bez barwnika w elektrodzie. Następnie ćwicz patching i wprowadzanie barwnika do neuronów, dążąc do wykorzystania minimalnej ilości roztworu bez barwnika w końcówce, bez zanieczyszczania otaczającej tkanki. Dzięki praktyce możliwe jest uzyskanie szczelnego połączenia w ciągu 1-2 min.
Krok 3.3. Monitorowanie poziomu barwienia
Podczas dyfuzji barwnika w konfiguracji whole-cell monitoruj stan fizjologiczny neuronu, rejestrując wywołane potencjały czynnościowe w trybie clamp prądowy (current-clamp). Dodatkowo monitoruj stopień barwienia, rejestrując spoczynkową intensywność światła (RLI) z somy komórki przy częstotliwości odświeżania 2 kHz i przy ułamku pełnej intensywności światła dostosowanym za pomocą filtrów neutralnych (stosujemy 0,04% intensywności światła lasera z lasera 400 mW). Kontynuuj proces wprowadzania barwnika do czasu, aż potencjał czynnościowy zacznie się poszerzać, co zazwyczaj następuje po 20-40 minutach, w zależności od rozmiaru i oporności elektrody.
Poszerzenie potencjału czynnościowego jest całkowicie odwracalne i najprawdopodobniej wynika z efektu obciążenia pojemnościowego spowodowanego nasyceniem błony somatycznej barwnikiem. Kształt fali potencjału czynnościowego zostaje w pełni przywrócony po wyrównaniu stężenia barwnika w całym neuronie.
Krok 3.4. Usuń elektrodę z barwnikiem
Po zakończeniu okresu barwienia ostrożnie odsuń pipetę patchową od somy w konfiguracji clampa napięciowego, upewniając się, że w tym procesie nastąpiło przejście z konfiguracji whole-cell do konfiguracji outside-out.
Krok 3.5. Oczekiwanie na dyfuzję barwnika
Inkubuj skrawek przez dodatkowe 1,5-2 hr w temperaturze pokojowej, aby umożliwić rozprzestrzenienie się barwnika wrażliwego na napięcie do wypustek neuronalnych. Po dyfuzji znacznej ilości barwnika z somy do wypustek dendrytycznych i aksonalnych, kształt fali potencjału czynnościowego zostaje w pełni przywrócony.
4. Rejestracja optyczna
Krok 4.1. Wybór przedziału komórkowego do obrazowania
Zlokalizuj somę zabarwionego neuronu przy niskim poziomie fluorescencji i ponownie wykonaj patch neuronu za pomocą standardowej elektrody patch (bez barwnika) w trybie DIC. Wizualizuj wypustki neuronalne przy niskim poziomie światła z częstotliwością klatek 10-40 Hz w trybie ciągłego rejestrowania kamery CCD w celu obrazowania napięcia. Zredukuj poziom światła za pomocą filtrów neutralnych do minimum wymaganego do wizualizacji interesującego obiektu. Podczas pozycjonowania zabarwionego neuronu stosujemy 0,01% intensywności lasera 400 mW. Używając stolika X-Y, ustaw interesującą wypustkę neuronalną na środku obszaru obrazowania. Chroń somę przed światłem wzbudzenia, używając częściowo zamkniętej przysłony ograniczającej pole widzenia mikroskopu. Osłonięcie somy przed intensywnym światłem wzbudzenia znacznie zredukuje uszkodzenia fotodynamiczne podczas rejestracji.
Krok 4.2 Rejestracja sygnałów optycznych związanych z przejściami potencjału błonowego
Rejestruj sygnały optyczne związane z potencjałami czynnościowymi (AP) propagującymi się wstecz w poszczególnych gałęziach dendrytycznych. Rejestruj sygnały optyczne związane z AP w aksonie. Rejestruj sygnały optyczne związane z AP propagującymi się wstecz w kolcach dendrytycznych. Stosuj częstotliwości odświeżania klatek odpowiednie do dokładnej rekonstrukcji kształtu fali sygnału i utrzymuj okresy rejestracji oraz czas ekspozycji na światło wzbudzenia o wysokiej intensywności tak krótko, jak to możliwe, aby zminimalizować blaknięcie barwnika i uszkodzenia fotodynamiczne. Na przykład badanie sekwencji inicjacji i propagacji pojedynczych potencjałów czynnościowych w aksonie wymaga okresów rejestracji rzędu 5-10 msec. Intensywność światła wzbudzenia podczas rejestracji stanowi kompromis pomiędzy stosunkiem sygnału do szumu z jednej strony, a stopniem blaknięcia barwnika i uszkodzeń fotodynamicznych z drugiej. Podczas rejestracji z długich odcinków aksonów, przy oświetleniu obszaru o średnicy 300 μm, stosujemy 100% intensywności lasera 400 mW. Gdy światło wzbudzenia jest skupione na obszarze o średnicy 30 μm do obrazowania kolców dendrytycznych, stosujemy 10-25% intensywności światła laserowego. Wymagany czas rejestracji jest istotnym czynnikiem determinującym optymalną intensywność światła wzbudzenia; krótsze okresy rejestracji pozwalają na zastosowanie wyższych intensywności światła. Optymalną intensywność oświetlenia najlepiej wyznaczyć empirycznie dla każdego preparatu i ustawień pomiarowych.
5. Analiza danych
Krok 5.1. Korekcja surowych danych pod kątem znanych błędów
Analizę i prezentację danych przeprowadzono przy użyciu programu NeuroPlex (RedShirtImaging) napisanego w języku IDL (ITT Visual Information Solutions, Boulder, Colorado) oraz niestandardowych procedur Visual Basic. W warunkach niskiego poziomu światła fluorescencja tła staje się istotnym czynnikiem determinującym wielkość sygnału ΔF/F. Surowe dane skorygowano najpierw pod kątem tego efektu poprzez odjęcie średniej intensywności fluorescencji tła wyznaczonej z obszaru niebarwionego na skrawku. Następnie zastosowano oprogramowanie do wyrównywania sygnałów w celu korekcji jittera czasowego w inicjacji AP, a także ewentualnych niewielkich ruchów preparatu podczas uśredniania. W dziedzinie czasu sygnały AP wyrównano poprzez korelację wzajemną elektrycznie rejestrowanych AP w każdej próbie z sygnałem referencyjnym uzyskanym na początku uśredniania (Rycina 1B). W dziedzinie przestrzennej obrazy wyrównano w dwóch wymiarach offline za pomocą korelacji wzajemnej obrazów, aby skompensować ewentualne niewielkie ruchy boczne preparatu. Prawidłowe ogniskowanie obrazu w wymiarze z weryfikowano przed każdą pojedynczą próbą; często konieczne były niewielkie korekty. Sygnały wyrównane przestrzennie i czasowo uśredniono, jak pokazano na Rycynie 1B. Powolne zmiany natężenia światła wynikające z blaknięcia barwnika skorygowano poprzez podzielenie danych przez odpowiednią funkcję dwueksponencjalną wyprowadzoną z prób rejestracyjnych bez stymulacji (Rycina 1B). Kształt sygnału AP zrekonstruowano z zestawu punktów danych przy użyciu interpolacji splajnem sześciennym (Cubic Spline Interpolation), będącej ciągłą krzywą kawałkową przechodzącą przez każdy punkt danych. Aby potwierdzić, że sygnał barwnika wrażliwego na napięcie śledzi potencjał błonowy bez istotnych zniekształceń w skali milisekundowej, elektryczny sygnał AP z somy porównano z optycznym sygnałem AP z sąsiedniego kopca aksonu, jak pokazano na Rycynie 3B. Oba sygnały nakładają się bardzo ściśle, uwzględniając szum śrutowy w rejestracji optycznej.
<img alt="Analiza sygnałów neuronalnych; jitter czasowy, dane elektryczne i optyczne; porównanie somy, AIS i węzła." src="/files/ftp_upload/4261/4261fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
 Rycina 1. Analiza danych (Animacja). (A) Górny panel: obraz konfokalny o wysokiej rozdzielczości zabarwionego neuronu z aksonem w pozycji pomiarowej. Schematycznie przedstawiono elektrodę rejestrującą przyłączoną do somy oraz zewnątrzkomórkową elektrodę stymulującą obok dendrytu podstawnego. Potencjały czynnościowe wywołane zewnątrzkomórkową stymulacją synaptyczną. Dolny panel: obraz fluorescencyjny aksonu o niskiej rozdzielczości przestrzennej uzyskany za pomocą CCD użytego do obrazowania Vm. (B) Rejestracje elektrodowe z somy (ślady czarne), rejestracje optyczne z AIS (ślady czerwone) oraz z węzła Ranviere’a (ślady zielone). Górne ślady: surowe dane z 9 prób wykazujące jitter czasowy w inicjacji AP. Drugi rząd śladów: sygnały wyrównane czasowo. Trzeci rząd śladów: sygnał uśredniony. Czwarty rząd śladów: korekcja wybielania. Dolne ślady: interpolacja metodą funkcji sklejanych trzeciego stopnia z jednym przebiegiem wygładzania czasowego.

<ol><li>Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch-clamp+recording+from+mossy+fiber+terminals+in+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices.</a> Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).</li>
<li>Cohen, L. B., Salzberg, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+measurement+of+membrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optical measurement of membrane potential.</a> Ann. Rev. Neurosci. 1, 171-182 (1978).</li>
<li>Cohen, L. B. Historical overview and general methods of membrane potential imaging. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCohen%2C+LB+%22Membrane+Potential+Imaging+in+the+Nervous+System%22">Membrane Potential Imaging in the Nervous System</a>. Canepari, M., Zecevic, D. , Springer Neuroscience. New York. (2010).</li>
<li>Canepari, M., Djurisic, M., Zecevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+signals+from+rat+hippocampal+CA1+pyramidal+neurons+during+coincident+pre-+and+post-synaptic+activity%3A+a+combined+voltage-+and+calcium+imaging+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dendritic signals from rat hippocampal CA1 pyramidal neurons during coincident pre- and post-synaptic activity: a combined voltage- and calcium imaging study.</a> J. Physiol. 580, 463-484 (2007).</li>
<li>Canepari, M., Popovic, M., Vogt, K., Holthoff, K., Konnerth, A., Salzberg, B. M., Grinvald, A., Antic, S. D., Zecevic, D. Imaging submillisecond membrane potential changes from individual regions of single axons, dendrites and spines. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCanepari%2C+M+%22Membrane+Potential+Imaging+in+the+Nervous+System%22">Membrane Potential Imaging in the Nervous System</a>. Canepari, M., Zecevic, D. , Springer Neuroscience. New York. (2010).</li>
<li>Djurisic, M., Antic, S., Chen, W. R., Zecevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage+imaging+from+dendrites+of+mitral+cells%3A+EPSP+attenuation+and+spike+trigger+zones%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Voltage imaging from dendrites of mitral cells: EPSP attenuation and spike trigger zones.</a> J. Neurosci. 24, 6703-6714 (2004).</li>
<li>Holthoff, K., Zecevic, D., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+time-course+of+action+potentials+in+spines+and+remote+dendrites+of+mouse+visual+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rapid time-course of action potentials in spines and remote dendrites of mouse visual cortical neurons.</a> J. Physiol. 588, 1085-1096 (2010).</li>
<li>Kole, M. H. P., Letzkus, J. J., Stuart, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+initial+segment+Kv1+channels+control+axonal+action+potential+waveform+and+synaptic+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Axon initial segment Kv1 channels control axonal action potential waveform and synaptic efficacy.</a> Neuron. 55, 633-647 (2007).</li>
<li>Kuhn, B., Fromherz, P., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+of+Stark-shift+voltage-sensing+dyes+by+one-+or+two-photon+excitation+near+the+red+spectral+edge%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+J%22%5BJournal%5D)">High sensitivity of Stark-shift voltage-sensing dyes by one- or two-photon excitation near the red spectral edge.</a> Biophysical J. 87, 631-639 (2004).</li>
<li>Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+characterization+of+electrochromic+membrane+probes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem.+Biophys.+Method%22%5BJournal%5D)">Design and characterization of electrochromic membrane probes.</a> J. Biochem. Biophys. Method. 6, 243-260 (1982).</li>
<li>Loew, L. Design and use of organic voltage sensitive dyes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLoew%2C+L+%22Membrane+Potential+Imaging+in+the+Nervous+System%22">Membrane Potential Imaging in the Nervous System</a>. Canepari, M., Zecevic, D. , Springer Neuroscience. New York. (2010).</li>
<li>Palmer, L. M., Stuart, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site+of+action+potential+initiation+in+layer+5+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Site of action potential initiation in layer 5 pyramidal neurons.</a> J. Neurosci. 26, 1854-1863 (2006).</li>
<li>Popovic, M. A., Foust, A. J., McCormick, D. A., Zecevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spatio-temporal+characteristics+of+action+potential+initiation+in+layer+5+pyramidal+neurons%3A+a+voltage+imaging+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The spatio-temporal characteristics of action potential initiation in layer 5 pyramidal neurons: a voltage imaging study.</a> J. Physiol. 589, 4167-4187 (2011).</li>
<li>Ross, W. N., Salzberg, B. M., Cohen, L. B., Grinvald, A., Davila, H. V., Waggoner, A. S., Wang, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+absorption%2C+fluorescence%2C+dichroism%2C+and+birefringence+in+stained+giant+axons%3A+optical+measurement+of+membrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Membr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Changes in absorption, fluorescence, dichroism, and birefringence in stained giant axons: optical measurement of membrane potential.</a> J. Membr. Biol. 33, 141-183 (1977).</li>
<li>Shu, Y., Duque, A., Yu, Y., Haider, B., McCormick, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+action+potential+initiation+in+neocortical+pyramidal+cells%3A+evidence+from+whole+cell+axon+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Properties of action potential initiation in neocortical pyramidal cells: evidence from whole cell axon recordings.</a> J Neurophysiol. 97, 746-760 (2007).</li>
<li>Wu, J. -Y., Cohen, L. B. Fast multisite optical measurement of membrane potential. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWu%2C+J-Y+%22A+practical+guide+to+technology+for+quantitative+real-time+analysis%22">A practical guide to technology for quantitative real-time analysis</a>. Mason, W. T. , Academic. New York. 389-404 (1993).</li>
<li>Yuste, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYuste%2C+R+%22Dendritic+Spines%22">Dendritic Spines</a>. , MIT Press. (2010).</li>
</ol>

Dejan Zecevic oświadcza, że jest współwłaścicielem firmy RedShirtImaging LLC., specjalizującej się w szybkich kamerach CCD o niskim poziomie szumów, wykorzystywanych w rejestracji barwników napięciowo-czułych. Pozostali autorzy nie zgłaszają żadnych interesów finansowych ani potencjalnych konfliktów interesów związanych z niniejszym badaniem.

Niniejszy artykuł opisuje metodę rejestracji z użyciem barwnika wrażliwego na napięcie w celu monitorowania aktywności elektrycznej pojedynczych neuronów z submikrometryczną i submilisekundową rozdzielczością czasoprzestrzenną. Wzbudzanie laserowe przy niemal optymalnej długości fali (pod kątem wielkości sygnału) poprawiło czułość rejestracji około 50-krotnie w porównaniu z wcześniejszymi podejściami. Obecna czułość umożliwia monitorowanie sygnałów elektrycznych ze wszystkich części pojedynczych neuronów, w tym z dendryt...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Komponenty zestawu&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Mikroskop pionowy</td><td>Olympus Inc.</td><td>BX51WI</td><td>Z trzema portami kamerowymi</td></tr><tr><td>Zmotoryzowany stolik przesuwny</td><td>Siskiyou</td><td>MXOPi.2</td><td></td></tr><tr><td>Kondensator do epi-fluorescencji dla Olympus BX51</td><td>TILL Photonics</td><td>0000-560-11659</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop pionowy</td><td>Carl Zeiss, LLC</td><td>AxioExaminer D1</td><td>Z trzema portami kamerowymi</td></tr><tr><td>Zmotoryzowana płyta górna</td><td>Scientifica Limited</td><td>MMBP</td><td></td></tr><tr><td>Kondensator do epi-fluorescencji dla Zeiss Axi&amp;#8211;xaminer</td><td>TILL Photonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kamera do akwizycji danych</td><td>RedShirtImaging LLC</td><td>NeuroCCD-SM</td><td>Wysoka prędkość, niski szum odczytu</td></tr><tr><td>CCD do IR-DIC</td><td>Dage-MTI</td><td>IR-1000</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalny skaner z wirującym dyskiem</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-10</td><td></td></tr><tr><td>CCD o wysokiej rozdzielczości przestrzennej w skanerze konfokalnym</td><td>PCO AG</td><td>PixelFly</td><td>1392x1024 pikseli</td></tr><tr><td>Laser DPSS CW (532 Nm)</td><td>CNI Optoelectronics Tech. Co., Ltd</td><td>MLL-III-532 400mW</td><td>Źródło światła wzbudzenia</td></tr><tr><td>Wielomodowy sprzęgacz światłowodowy</td><td>Siskiyou</td><td>SM-CFT</td><td></td></tr><tr><td>Przewodnik świetlny</td><td>TILL Photonics</td><td>0000-515-11524</td><td></td></tr><tr><td>Migawka</td><td>Vincent Associates</td><td>LS6</td><td></td></tr><tr><td>Stół wibroizolacyjny</td><td>Minus k Technology</td><td>MK26</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Odczynniki specyficzne&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Di-2-ANEPEQ (JPW 1114)</td><td>Life Technologies</td><td>D-6923</td><td>Barwnik wrażliwy na napięcie</td></tr><tr><td>Linia myszy Crym-EGFP</td><td>GENSAT (MMRRC)</td><td>STOCK Tg(Crym-EGFP)GF82Gsat/Mmcd</td><td>Rzadka ekspresja EGFP w neuronach warstwy 5 kory mózgowej</td></tr></tbody></table>

rejestracja za pomocą barwników napięciowo-czułych z aksonów, dendrytów i kolców dendrytycznych pojedynczych neuronów w skrawkach mózgu

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Zrozumienie właściwości biofizycznych i organizacji funkcjonalnej pojedynczych neuronów oraz sposobu, w jaki przetwarzają one informacje, jest kluczowe dla zrozumienia mechanizmów działania mózgu. Podstawową funkcją każdej komórki nerwowej jest przetwarzanie sygnałów elektrycznych, zazwyczaj pochodzących z wielu źródeł. Właściwości elektryczne wypustek neuronalnych są niezwykle złożone, dynamiczne i w ogólnym przypadku niemożliwe do przewidzenia bez szczegółowych pomiarów. Aby uzyskać taki pomiar, idealnie byłoby móc monitorować w wielu miejscach zdarzenia podprogowe w czasie, gdy przemieszczają się one z miejsc powstawania na wypustkach neuronalnych i sumują się w konkretnych lokalizacjach, wpływając na inicjację potencjału czynnościowego. Cel ten nie został osiągnięty w żadnym neuronie ze względu na ograniczenia techniczne pomiarów z wykorzystaniem elektrod. Aby wyeliminować tę wadę, wysoce pożądane jest uzupełnienie metody patch-clamp o techniki obrazowania, które pozwalają na rozległe równoległe rejestracje ze wszystkich części neuronu. W niniejszym opracowaniu opisujemy taką technikę – optyczną rejestrację przejściowych zmian potencjału błonowego za pomocą organicznych barwników napięciowo-czułych (obrazowanie Vm) – charakteryzującą się rozdzielczością poniżej milisekundy i mikrometra. Nasza metoda opiera się na pionierskich pracach nad molekularnymi sondami napięciowo-czułymi 2. Wiele aspektów pierwotnej technologii było sukcesywnie udoskonalanych przez kilka dekad 3, 5, 11. Ponadto wcześniejsze prace udokumentowały dwie istotne cechy obrazowania Vm. Po pierwsze, sygnały fluorescencyjne są liniowo proporcjonalne do potencjału błonowego w całym zakresie fizjologicznym (-100 mV do +100 mV; 10, 14, 16). Po drugie, wprowadzenie do neuronów zastosowanego tutaj barwnika napięciowo-czułego (JPW 3028) nie wywołuje wykrywalnych efektów farmakologicznych. Odnotowane poszerzenie kolca podczas wprowadzania barwnika jest całkowicie odwracalne 4, 7. Dodatkowo dowody eksperymentalne wykazują, że możliwe jest wykonanie znacznej liczby (do setek) rejestracji przed wystąpieniem jakichkolwiek wykrywalnych efektów fototoksycznych 4, 6, 12, 13. Obecnie wykorzystujemy doskonałą jasność i stabilność laserowego źródła światła o niemal optymalnej długości fali, aby zmaksymalizować czułość techniki obrazowania Vm. Obecna czułość pozwala na wielopunktową optyczną rejestrację zmian Vm ze wszystkich części neuronu, w tym z aksonów i kolaterali aksonalnych, końcowych gałęzi dendrytycznych oraz poszczególnych kolców dendrytycznych. Uzyskane informacje o oddziaływaniach sygnałów mogą być analizowane ilościowo, jak również bezpośrednio wizualizowane w formie filmu.

Prawidłowo wykonana mikroskopia konfokalna powinna umożliwiać wyraźną identyfikację nienaruszonych wypustek neuronalnych, które znajdują się blisko powierzchni skrawka i leżą w jednej płaszczyźnie ogniskowania. Krytyczne jest wybranie neuronów odpowiednich do obrazowania napięcia przed obciążeniem ich barwnikiem wrażliwym na napięcie. Przykład obrazów konfokalnych neuronów piramidowych L5 wykazujących ekspresję EGFP w skrawku kory (transgeniczna linia myszy Crym) przedstawiono na Rysunku 2. Aksony poszcz...

Opisano technikę obrazowania służącą do monitorowania zmian potencjału błonowego z rozdzielczością przestrzenną poniżej mikrometra i rozdzielczością czasową poniżej milisekundy. Technika ta, oparta na wzbudzaniu laserowym barwników wrażliwych na napięcie, umożliwia pomiar sygnałów w aksonach i kolaterałach aksonalnych, końcowych gałęziach dendrytycznych oraz pojedynczych kolcach dendrytycznych.

Rejestracja za pomocą barwników napięciowo-czułych z aksonów, dendrytów i kolców dendrytycznych pojedynczych neuronów w skrawkach mózgu

Zrozumienie właściwości biofizycznych i organizacji funkcjonalnej pojedynczych neuronów oraz sposobu, w jaki przetwarzają one informacje, jest kluczowe dla zrozumienia ...

Ogólnym celem opisanych eksperymentów jest optyczny monitoring integracji sygnału potencjału błonowego oraz przetwarzania informacji przez pojedynczą komórkę nerwową z rozdzielczością submikrometryczną i submilisekundową w wielu miejscach neuronu. Osiąga się to poprzez budowę układu obrazowania o odpowiedniej czułości, pozwalającego na rejestrację niewielkich zmian frakcyjnych natężenia światła odpowiadających przejściowemu potencjałowi błonowemu. Następnie wybiera się neurony o odpowiedniej anatomii, umożliwiającej efektywne obrazowanie neuronów z długimi, nienaruszonymi wypustkami w jednej płaszczyźnie ogniskowania blisko powierzchni skrawka.Następnie należy załadować wyselekcjonowane neurony barwnikami napięciowo-czułymi, aby umożliwić optyczne śledzenie zmian potencjału błonowego. Wyniki wykazują wyjątkową zdolność tej metody do uzyskiwania informacji o integracji sygnałów elektrycznych przez pojedyncze komórki nerwowe poprzez monitorowanie sygnałów potencjału błonowego z aksonów, dendrytów i kolców dendrytycznych. W neurofizjologii komórkowej.Nowe narzędzia są opracowywane ze względu na dwa wieloletnie ograniczenia konwencjonalnej elektrofizjologii: niską rozdzielczość przestr

voltage-sensitive-dye-recording-from-axons-dendrites-dendritic-spines

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Rejestrowanie barwników czułych na napięcie z aksonów, dendrytów i kolców dendrytycznych pojedynczych neuronów w kronach mózgowych

Niniejszy raport demonstruje technikę mechanicznej izolacji pojedynczych żywych neuronów z zachowaniem przytwierdzonych boutonów presynaptycznych. Neurony poddane wibrodysocjacji charakteryzują się zaletami takimi jak szybki czas przygotowania, doskonała kontrola farmakologiczna oraz usprawniona stabilizacja potencjału błonowego (space-clamp) bez wpływu komórek sąsiednich. Metoda ta może być wykorzystywana do obrazowania elementów synaptycznych oraz rejestracji metodą patch-clamp.

Wibrodysocjacja neuronów z plastrów mózgu gryzoni w celu badania transmisji synaptycznej i obrazowania terminali presynaptycznych

Ten film demonstruje technikę nagrywania za pomocą zacisku krosowego z powierzchni membrany dendrytycznej. Pomaga to bezpośrednio badać właściwości elektryczne dendrytów i leżących u ich podstaw kanałów jonowych bramkowanych napięciem w neuronach dopaminergicznych.

Nagrania patch-clamp z dendrytu neuronu dopaminergicznego w wycinku mózgu

Ten film demonstruje procedurę obserwacji zmian w aktywności neuronalnej w wycinku mózgu zabarwionym barwnikiem wrażliwym na napięcie. Barwnik odzwierciedla zmiany w potencjale błonowym neuronu poprzez zmianę jego intensywności fluorescencji. Dzięki zastosowaniu bodźców elektrycznych i zaawansowanych technik obrazowania, proces ten umożliwia wizualne śledzenie zmian potencjału błony neuronalnej w czasie rzeczywistym w oparciu o fluorescencję VSD.

Optyczny zapis aktywności neuronalnej w wycinkach mózgu barwionych barwnikiem wrażliwym na napięcie

Ten film przedstawia metodę jednoczesnego obrazowania i rejestrowania aktywności elektrycznej z transgenicznych wycinków mózgu, które zawierają specyficzne dla neuronów białka fluorescencyjne. Procedura polega na utrzymywaniu wycinka mózgu w komorze perfuzyjnej z napowietrzonym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym, użyciu źródła światła do wzbudzenia komórek znakowanych fluorescencyjnie oraz rejestrowaniu sygnałów elektrycznych za pomocą wielokanałowej sondy i zacisku krosowego.

Jednoczesne optyczne i elektrofizjologiczne monitorowanie komórek neuronalnych w wycinkach mózgu

Ten film demonstruje procedurę badania efektywności synaptycznej w bocznej korze śródwęchowej (LEC) poprzez optogenetyczną stymulację aksonów przyśrodkowej kory przedczołowej (mPFC) i rejestrowanie odpowiedzi neuronów piramidowych w LEC. Metoda ta łączy zapisy patch-clamp z aktywacją synaptyczną przez stymulację światłem w celu zbadania plastyczności synaptycznej.

Stymulacja optogenetyczna i elektrofizjologiczny zapis zdarzeń synaptycznych w wycinkach mózgu szczura

W tym artykule opisujemy użyteczną metodę badania funkcji kanałów jonowych bramkowanych ligandem w neuronach ostro izolowanych wycinków mózgu.  Metoda ta polega na użyciu mikropipety wypełnionej lekiem do miejscowego nakładania leków na neurony zarejestrowane przy użyciu standardowych technik patch clamp.

Lokalne zastosowanie leków do badania funkcji nikotynowego receptora acetylocholiny w wycinkach mózgu myszy

Tutaj przedstawiono procedurę selektywnej aktywacji białka neuronalnego za pomocą krótkiego impulsu światła poprzez genetyczne kodowanie fotoreaktywnego nienaturalnego aminokwasu do docelowego białka neuronalnego wyrażanego w neuronach w hodowli lub in vivo.

Optyczna kontrola białka neuronalnego za pomocą genetycznie kodowanego nienaturalnego aminokwasu w neuronach

Prezentujemy metodę łączącą zapisy z całokomórkowego patch-clampu i obrazowania dwufotonowego w celu zarejestrowania stanów przejściowych Ca2+ w dendrytach neuronalnych w ostrych wycinkach mózgu.

Dwufotonowe obrazowanie wapnia w dendrytach neuronalnych w wycinkach mózgu

Tutaj opisujemy podstawowe kroki dla zapisów całokomórkowych krosówek z neuronów istoty żelowej (SG) w przekroju rdzenia kręgowego in vitro. Metoda ta pozwala na badanie wewnętrznych właściwości błony, przekaźnictwa synaptycznego i charakterystyki morfologicznej neuronów SG.

Przygotowanie wycinków ostrego rdzenia kręgowego do zapisu całokomórkowego patch-clamp w neuronach istoty żelatynowej

Wprowadzamy powtarzalną i stabilną metodę zapisu optycznego dla wycinków mózgu przy użyciu barwnika wrażliwego na napięcie. W artykule opisano barwienie barwnikiem wrażliwym na napięcie oraz rejestrację sygnałów optycznych przy użyciu konwencjonalnych preparatów plastrów hipokampa.

Szerokokątny zapis optyczny pojedynczych fotonów w wycinkach mózgu przy użyciu barwnika wrażliwego na napięcie

Wycinki mózgu ex vivo mogą być używane do badania wpływu lotnych środków znieczulających na wywołane reakcje na bodźce aferentne. Optogenetyka jest wykorzystywana do niezależnej aktywacji aferentów wzgórzowo-korowych i korowo-korowych do niepierwotnej kory nowej, a odpowiedzi synaptyczne i sieciowe są modulowane izofluranem.

Optogenetyczna aktywacja szlaków aferentnych w wycinkach mózgu i modulacja odpowiedzi za pomocą lotnych środków znieczulających

Poznaj technikę obrazowania potencjału błonowego neuronów z rozdzielczością submikrometrową i submilisekundową. Metoda wykorzystuje barwniki wrażliwe na napięcie do śledzenia sygnałów w aksonach, dendrytach i kolcach dendrytycznych.

Rejestracja za pomocą barwników napięciowo-czułych z aksonów, dendrytów i kolców dendrytycznych pojedynczych neuronów w skrawkach mózgu

Przeglądaj więcej filmów