Name: Badanie funkcji kanału potasowego Kv7 mięśni gładkich tętnic za pomocą elektrofizjologii zacisku krosowego i miografii ciśnieniowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Poznaj metodę badania aktywności kanałów potasowych Kv7 w komórkach mięśni gładkich tętnic krezkowych szczura przy użyciu elektrofizjologii zacisku krosowego i miografii ciśnieniowej. Technika ta pozwala korelować aktywność jonową ze zmianami średnicy naczyń.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była finansowana z grantu National Heart, Lung, and Blood Institute (NIH R01-HL089564) przyznanego KLB oraz stypendiów przeddoktoranckich z American Heart Association (09PRE2260209) i Arthur J. Schmitt Foundation przyznanych BKM.

<ol><li>Passmore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KCNQ%2FM+Currents+in+Sensory+Neurons%3A+Significance+for+Pain+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">KCNQ/M Currents in Sensory Neurons: Significance for Pain Therapy.</a> J. Neurosci. 23, 7227-7236 (2003).</li>
<li>Falloon, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+small+artery+sensitivity+and+morphology+in+pressurized+and+wire-mounted+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of small artery sensitivity and morphology in pressurized and wire-mounted preparations.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 268, H670-H678 (1995).</li>
<li>Dunn, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+resistance+artery+sensitivity+to+agonists+under+isobaric+compared+with+isometric+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Enhanced resistance artery sensitivity to agonists under isobaric compared with isometric conditions.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 266, H147-H155 (1994).</li>
<li>Buus, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+sensitivity+of+rat+mesenteric+small+arteries+to+agonists+when+studied+as+ring+preparations+or+as+cannulated+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Differences in sensitivity of rat mesenteric small arteries to agonists when studied as ring preparations or as cannulated preparations.</a> Br. J. Pharmacol. 112, 579-587 (1994).</li>
<li>Abdelhalim, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+big+endothelin-1+in+comparison+with+endothelin-1+on+the+microvascular+blood+flow+velocity+and+diameter+of+rat+mesentery+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of big endothelin-1 in comparison with endothelin-1 on the microvascular blood flow velocity and diameter of rat mesentery in vivo.</a> Microvasc. Res. 72, 108-112 (2006).</li>
<li>Altura, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-response+relationships+for+arginine+vasopressin+and+synthetic+analogs+on+three+types+of+rat+blood+vessels%3A+possible+evidence+for+regional+differences+in+vasopressin+receptor+sites+within+a+mammal%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Dose-response relationships for arginine vasopressin and synthetic analogs on three types of rat blood vessels: possible evidence for regional differences in vasopressin receptor sites within a mammal.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 193, 413-423 (1975).</li>
<li>Henderson, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasopressin-induced+vasoconstriction%3A+two+concentration-dependent+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Vasopressin-induced vasoconstriction: two concentration-dependent signaling pathways.</a> J. Appl. Physiol. 102, 1402-1409 (2007).</li>
<li>Mackie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+KCNQ+potassium+channels+as+novel+targets+for+the+control+of+mesenteric+artery+constriction+by+vasopressin%2C+based+on+studies+in+single+cells%2C+pressurized+arteries%2C+and+in+vivo+measurements+of+mesenteric+vascular+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Vascular KCNQ potassium channels as novel targets for the control of mesenteric artery constriction by vasopressin, based on studies in single cells, pressurized arteries, and in vivo measurements of mesenteric vascular resistance.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 325, 475-483 (2008).</li>
<li>Brueggemann, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+selective+cyclooxygenase-2+inhibitors+on+vascular+smooth+muscle+ion+channels+may+account+for+differences+in+cardiovascular+risk+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Differential effects of selective cyclooxygenase-2 inhibitors on vascular smooth muscle ion channels may account for differences in cardiovascular risk profiles.</a> Mol. Pharmacol. 76, 1053-1061 (2009).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Patch+Clamp+Technique%22">Patch Clamp Technique</a>. Kaneez, F. S. , Intech. (2012).</li>
<li>Berra-Romani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TTX-sensitive+voltage-gated+Na%2B+channels+are+expressed+in+mesenteric+artery+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">TTX-sensitive voltage-gated Na+ channels are expressed in mesenteric artery smooth muscle cells.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 289, H137-H145 (2005).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Opisane tutaj metody i podejścia eksperymentalne są dość stabilne i mogą przynieść przejrzyste oraz powtarzalne wyniki, jeśli zostaną zastosowane z pieczołowitą dbałością o szczegóły. Jakość zapisów elektrofizjologicznych oraz skurczu/rozkurczu segmentów tętnic zależy odpowiednio od stanu zdrowotnego komórek i fragmentów tętnic. Preparaty komórkowe mogą różnić się z dnia na dzień, nawet przy zastosowaniu tego samego protokołu. Roztwory do izolacji można stosować przez maksymalnie 2 tygodnie, jednak jeśli przez dwa kolejn...

badanie funkcji kanałów potasowych kv7 w mięśniach gładkich tętnic z wykorzystaniem elektrofizjologii patch-clamp i myografii ciśnieniowej

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Skurcz lub rozkurcz komórek mięśni gładkich w ścianach tętnic oporowych determinuje średnicę tętnicy, a tym samym kontroluje przepływ krwi przez naczynie i wpływa na systemowe ciśnienie tętnicze. Proces skurczu jest regulowany przede wszystkim przez stężenie wapnia w cytozolu ([Ca2+]cyt), które z kolei jest kontrolowane przez szereg transporterów i kanałów jonowych. Kanały jonowe są powszechnymi pośrednikami w szlakach transdukcji sygnałów aktywowanych przez hormony wazoaktywne w celu wywołania skurczu naczyń lub rozszerzenia naczyniowego. Kanały jonowe są często celem środków terapeutycznych, albo celowo (np. blokery kanałów wapniowych stosowane w celu wywołania rozszerzenia naczyń i obniżenia ciśnienia krwi), albo nieumyślnie (np. prowadząc do niepożądanych działań niepożądanych ze strony układu sercowo-naczyniowego).
Kanały potasowe Kv7 (KCNQ) aktywowane napięciem zostały niedawno uznane za istotne cele fizjologiczne i terapeutyczne w regulacji skurczu mięśni gładkich. Aby wyjaśnić konkretną rolę kanałów Kv7 zarówno w fizjologicznej transdukcji sygnału, jak i w działaniu czynników terapeutycznych, konieczne jest zbadanie, w jaki sposób ich aktywność jest modulowana na poziomie komórkowym, a także ocena ich wkładu w kontekście nienaruszonej tętnicy.
Tętnice krezkowe szczura stanowią użyteczny system modelowy. Tętnice te można łatwo wypreparować, oczyścić z tkanki łącznej i wykorzystać do przygotowania izolowanych miocytów tętniczych do elektrofizjologii metodą patch-clamp lub kaniulować i poddać ciśnieniu w celu pomiaru odpowiedzi naczynioskurczowych/naczyniorozkurczowych w stosunkowo fizjologicznych warunkach. W niniejszym opracowaniu opisujemy metody stosowane dla obu rodzajów pomiarów i przedstawiamy przykłady tego, jak projekt eksperymentalny może zostać zintegrowany, aby zapewnić lepsze zrozumienie roli tych kanałów jonowych w regulacji napięcia naczyniowego.

Pomiary aktywności kanałów potasowych Kv7 (KCNQ) w izolowanych miocytach tętniczych (przy użyciu technik elektrofizjologicznych patch clamp) równolegle z pomiarami odpowiedzi skurczowych/rozkurczowych (przy użyciu myografii ciśnieniowej) mogą dostarczyć istotnych informacji na temat roli kanałów Kv7 w fizjologii i farmakologii mięśni gładkich naczyń krwionośnych.

Badanie funkcji kanałów potasowych Kv7 w mięśniach gładkich tętnic z wykorzystaniem elektrofizjologii patch-clamp i myografii ciśnieniowej

Skurcz lub rozkurcz komórek mięśni gładkich w ścianach tętnic oporowych determinuje średnicę tętnicy, a tym samym kontroluje przepływ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar aktywności kanałów potasowych KV7 w świeżo dysocjowanych komórkach mięśni gładkich tętnicy krezkowej oraz powiązanie go z pomiarami średnicy tętnicy zarejestrowanymi w warunkach fizjologicznych. Osiąga się to najpierw poprzez chirurgiczne usunięcie łuku naczyniowego krezki u szczura. Drugim krokiem jest wypreparowanie i oczyszczenie segmentów tętnic krezkowych.Następnie niektóre fragmenty są wykorzystywane do izolowania pojedynczych komórek mięśni gładkich w celu przeprowadzenia pomiarów elektrofizjologicznych metodą patch-clamp dla prądów potasowych KV7. Ostatnim krokiem jest kanulacja nienaruszonych fragmentów tętnic w celu wykonania pomiarów miograficznych ciśnieniowych w celu oceny skurczu lub rozszerzenia tętnic w odpowiedzi na farmakologiczne modulatory kanałów potasowych KV7. Ostatecznie połączenie elektrofizjologii patch-clamp i miografii ciśnieniowej służy do wykazania, w jaki sposób wzrost lub spadek aktywności kanałów potasowych KV7 wpływa na skurcz tętnic krezkowych.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wykorzystanie kanałów klonalnych ekspresywnych w liniach komórkowych, jest fakt, że

exploring-arterial-smooth-muscle-kv7-potassium-channel-function-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Badanie funkcji kanału potasowego Kv7 w mięśniach gładkich tętnic za pomocą elektrofizjologii zaciskowej i miografii ciśnieniowej

Prąd jonowy kanałów BK rejestruje się przy użyciu technik patch clamp. Kanały BK są eksprymowane w oocytach Xenopus poprzez wstrzykiwanie mRNA. Roztwór wewnątrzkomórkowy podczas pomiarów patch clamp jest kontrolowany przez system perfuzyjny.

Techniki patch clamp i perfuzji do badania kanałów jonowych ekspresowanych w oocytach Xenopus

Dysfunkcja kanału Kv jest związana z zaburzeniami rytmu serca. W celu zbadania mechanizmów molekularnych, które prowadzą do takich arytmii, stosujemy systematyczny protokół izolacji kardiomiocytów przedsionkowych i komorowych od myszy z nokautem podjednostki pomocniczej kanału Kv. Wyizolowane kardiomiocyty można następnie natychmiast wykorzystać do komórkowych badań elektrofizjologicznych, testów biochemicznych lub immunofluorescencyjnych (IF).

Izolacja i zapisy kanału Kv w kardiomiocytach przedsionkowych i komorowych myszy

Tutaj opisujemy izolację dorosłych kardiomioktyesów myszy za pomocą systemu perfuzyjnego Langendorffa.  Powstałe komórki tolerują Ca2+, są elektrycznie uśpione i mogą być hodowane i transfekowane adeno- lub lentiwirusami w celu manipulowania ekspresją genów.  Ich funkcjonalność może być również analizowana za pomocą systemu MMSYS i technik zacisków krosowych.

Izolacja, hodowla i charakterystyka funkcjonalna kardiomioktaków dorosłych myszy

Miografia ciśnieniowa służy do oceny wazoaktywności małych tętnic, które rozwijają trwałe zwężenie pod wpływem ciśnienia. Manuskrypt ten zawiera szczegółowy protokół oceny w izolowanych odcinkach małych tętnic krezkowych u szczurów, wazoaktywności i wpływu ciśnienia śródświetlnego na średnicę naczyń krwionośnych.

Ocena odpowiedzi miogennej i wazoaktywności w opornych tętnicach krezkowych za pomocą miografii ciśnieniowej

Rekonstytucja białka transbłonowego, KvAP, w gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe (GUVs) jest demonstrowana dla dwóch metod odwodnienia i ponownego nawodnienia — elektroformacji i pęcznienia wspomaganego żelem. W obu metodach małe jednowarstwowe pęcherzyki zawierające białko są łączone ze sobą, tworząc GUV, które można następnie badać za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i elektrofizjologii patch-clamp.

Rekonstytucja białka transbłonowego, kanału jonowego bramkowanego napięciem, KvAP, w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych do badań mikroskopowych i patch clamp

Ten manuskrypt opisuje prosty protokół izolacji tętniczek od siatkówki szczura, który może być wykorzystany w badaniach elektrofizjologicznych, obrazowania wapnia i miografii ciśnieniowej.

Izolacja tętniczek siatkówki do badań fizjologii komórek ex vivo

Głównym celem tego artykułu jest dostarczenie szczegółowych informacji na temat sposobu rejestrowania potencjału błonowego (Vm) z tętnicy środkowej mózgu za pomocą metody nabijania mikroelektrod. Kaniulowana tętnica środkowa mózgu jest równoważona w celu uzyskania tonu miogennego, a ściana naczynia jest przebijana za pomocą mikroelektrod o wysokiej rezystancji.

Metoda przebijania mikroelektrod w celu zarejestrowania potencjału błony z kaniulowanej tętnicy środkowej mózgu

Niniejszy protokół opisuje koncepcje i techniczne zastosowanie techniki miografu tensometrycznego z wykorzystaniem wielokomorowego systemu miograficznego w eksperymentalnej ocenie ex vivo funkcji śródbłonka aorty myszy.

Pomiar zależnej od śródbłonka wazorelaksacji w aorcie piersiowej myszy za pomocą tensometrycznej miografii komory o małej objętości

Obecny protokół opisuje efektywną metodę dynamicznego pozyskiwania prądów kanału potasowego (Kv) w czasie rzeczywistym w kardiomiocytach H9c2 za pomocą techniki patch-clamp dla całych komórek.

Zależny od napięcia zapis prądu potasu na kardiomiocytach H9C2 za pomocą techniki Whole-Cell Patch-Clamp

Ten protokół opisuje szybką i skuteczną metodę izolowania komórek mięśni gładkich od tętnicy podstawnej szczura i rejestrowania do wewnątrz korygujących prądów kanału potasowego w tych komórkach za pomocą techniki zacisku krosowego dla całych komórek. Stanowi on nowatorskie podejście dla naukowców badających tętnicę podstawną i kanały jonowe.

Rejestracja wewnętrznych prądów prostowniczych K+ w świeżo wyizolowanych komórkach mięśni gładkich tętnicy podstawnej techniką patch clamp

Poznaj metodę badania aktywności kanałów potasowych Kv7 w komórkach mięśni gładkich tętnic krezkowych szczura przy użyciu elektrofizjologii zacisku krosowego i miografii ciśnieniowej. Technika ta pozwala korelować aktywność jonową ze zmianami średnicy naczyń.

Badanie funkcji kanału potasowego Kv7 mięśni gładkich tętnic za pomocą elektrofizjologii zacisku krosowego i miografii ciśnieniowej (Wideo) | JoVE Journal

Badanie funkcji kanałów potasowych Kv7 w mięśniach gładkich tętnic z wykorzystaniem elektrofizjologii patch-clamp i myografii ciśnieniowej

Przeglądaj więcej filmów