Badanie funkcji kanałów potasowych Kv7 w mięśniach gładkich tętnic z wykorzystaniem elektrofizjologii patch-clamp i myografii ciśnieniowej

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar aktywności kanałów potasowych KV7 w świeżo dysocjowanych komórkach mięśni gładkich tętnicy krezkowej oraz powiązanie go z pomiarami średnicy tętnic rejestrowanymi w warunkach fizjologicznych. W pierwszej kolejności dokonuje się chirurgicznego usunięcia łuku naczyniowego krezki u szczura. Drugim krokiem jest wypreparowanie i oczyszczenie segmentów tętnic krezkowych.

Następnie niektóre segmenty są wykorzystywane do izolacji pojedynczych komórek mięśni gładkich w celu przeprowadzenia pomiarów elektrofizjologicznych metodą patch clamp w celu analizy prądów potasowych KV seven. Ostatnim etapem jest kaniulacja nienaruszonych segmentów tętnic do pomiarów miograficznych pod ciśnieniem w celu oceny skurczu lub rozkurczu tętnic w odpowiedzi na modulatory farmakologiczne kanałów potasowych KV seven. Ostatecznie połączenie elektrofizjologii patch clamp i miografii ciśnieniowej służy do wykazania, w jaki sposób zwiększenie lub zmniejszenie aktywności kanałów potasowych KV seven wpływa na skurcz tętnic krezkowych.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wykorzystanie kanałów klonowanych ekspresjonowanych w liniach komórkowych, jest to, że prądy są rejestrowane z niehodowanych komórek, które natywnie ekspresjonują kanały, a prądy KV mogą zostać wyizolowane z innych klas kanałów potasowych, które mogą być aktywowane w tych samych komórkach. Myografia ciśnieniowa pozwala na rejestrację odpowiedzi funkcjonalnych z tej samej tkanki, z której pochodzą izolowane komórki, a metoda ta jest zarówno bardziej czuła, jak i bardziej fizjologiczna niż inne preparaty, takie jak pierścienie tętnicze lub paski tętnicze. Dr Bareth Mani, stażysta podoktorski z mojego laboratorium, zaprezentuje techniki kaniulacji tętniczej i myografii ciśnieniowej, a dr Luba Brueggeman, adiunkt w moim laboratorium, zaprezentuje procedury izolacji komórek i techniki patch-clamp.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy użyć nożyczek chirurgicznych do odcięcia odcinka o długości od 10 do 12 centymetrów na obu końcach jelita cienkiego szczura. Następnie należy wyizolować jelito wraz z przytwierdzonymi naczyniami krwionośnymi. W kolejnym kroku należy przypiąć odcinek jelita cienkiego.

Rozpostrzyj krezkę na bliskiej ścianie komory w taki sposób, aby główna gałąź tętnicy krezkowej górnej znajdowała się w centrum, a kolejne rzędy odgałęzień promieniowały od środka. Następnie umieść piny wyłącznie na segmentach jelit, obserwując je przez oświetlony mikroskop sekcyjny. Ostrożnie usuń tkankę tłuszczową oraz tkankę łączną otaczającą tętnice drugiego do czwartego rzędu w pobliżu jelit, używając mikropincety i nożyczek.

Przytrzymaj sąsiednie żyły, aby ułatwić usunięcie tkanki tłuszczowej i tkanki łącznej oraz uniknąć niepotrzebnego rozciągania tętnic. Następnie przenieś dwa do trzech segmentów tętnicy krezkowej do 35 milimetrowej szalki hodowlanej zawierającej dwa mililitry lodowatego roztworu izolacyjnego. Umieść szalkę na lodzie, a następnie potnij segmenty tętnicy krezkowej na kawałki o długości od trzech do czterech milimetrów, używając pipety Pasteura z wypalanym końcem.

Przenieś segmenty tętnic do szklanej fiolki zawierającej dwa mililitry podgrzanego do 37 °C roztworu izolacyjnego. Następnie inkubuj je przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Po 30 minutach ostrożnie odessij roztwór izolacyjny o temperaturze 37 °C za pomocą pipety Pasteura.

Dodaj do niego dwa mililitry ciepłego roztworu enzymu, a następnie inkubuj przez 35 minut w temperaturze 37 °C. Natychmiast po 35-minutowej inkubacji w roztworze enzymu umieść probówkę na lodzie, odessaj roztwór enzymu i dodaj dwa mililitry lodowatego roztworu izolacyjnego. Powtórz tę procedurę cztery razy.

Następnie w jednym mililitrze lodowatego roztworu izolacyjnego delikatnie pipetuj fragmenty tętnic za pomocą wypolerowanej pipety z tylnym końcem. Powtórz tę czynność od 10 do 20 razy, aby uwolnić pojedyncze komórki mięśni gładkich tętnic krezkowych. Okresowo weryfikuj wygląd miocytów, nakładając kroplę zawiesiny komórkowej na szalkę 35 milimetrową i obserwując je pod mikroskopem.

Zdrowe komórki mięśni gładkich tętnic szyjnych (MA SMCs) powinny mieć gładki, wydłużony wygląd. Następnie przenieś około 100 do 200 µL zawiesiny komórek do komory rejestracyjnej za pomocą wypolerowanej pipety pastierskiej i odczekaj 15 minut, aż komórki przylgną. Na tym etapie napełnij końcówkę pipety do patch-clampu roztworem wewnętrznym wolnym od amfoterycyny B, zanurzając w nim końcówkę pipety.

Następnie należy zastosować ssanie z drugiego końca za pomocą strzykawki 10 ml podłączonej za pomocą odcinka rurki, dodając od góry roztwór pipetujący do terinu B. Należy użyć końcówki do mikropipety einor, aż pipeta zostanie wypełniona roztworem w około połowie. Pęcherzyki powietrza należy usunąć poprzez delikatne opukanie pipety.

Następnie włóż pipetę do uchwytu elektrody. Za pomocą mikromanipulatora opuść pipetę na powierzchnię wydłużonego miocytu. Gdy oporność pipety wzrośnie do 6–10 MΩ, zastosuj ssanie, aby uzyskać tzw. giga seal.

Jednocześnie ustaw napięcie podtrzymujące na 0 mV, oczekując na perforację błony. Następnie zastosuj 100 ms skoki napięcia do +10 mV, a potem do -10 mV. Użyj wzmacniacza, aby skompensować szybki przejściowy prąd pojemności pipety pojawiający się równocześnie z pojawieniem się pojemności całej komórki.

Przejściowe, niewielkie, stabilne prądy dodatnie od 2 do 10 pA, ich polaryzacja i amplituda wskazują na obecność funkcjonalnych kanałów KV7. Prawidłowa perforacja za pomocą amfoterycyny B obniży oporność dostępu do 35 MΩ lub mniej. Aby zapisać zależność prądu KV7 od napięcia, należy zastosować pięciosekundowe skoki napięcia w zakresie od -84 mV, przy którym prawdopodobieństwo otwarcia kanałów KV7 jest minimalne, do +16 mV, przy którym prawdopodobieństwo otwarcia kanałów KV7 osiąga plateau. Po pięciu sekundach przy każdym napięciu testowym należy powrócić do napięcia holdingowego wynoszącego -4 mV na 10 sekund.

W tej procedurze luźno zawieś dwie wcześniej przygotowane cienkie szwy nylonowe po każdej stronie. Obok szklanej kaniuli ostrożnie przenieś wypreparowany odcinek tętnicy krezkowej z komory preparacyjnej do komory ciśnieniowej do przeszczepów mięśniowych, trzymając jeden koniec odcinka za pomocą mikropincety. Następnie, obserwując preparat przez oświetlony mikroskop preparacyjny, przytrzymaj jeden koniec odcinka tętnicy i delikatnie nasuń go na lewą szklaną kaniulę.

Zabezieczyć koniec za pomocą szwów nylonowych. Następnie delikatnie przepłukać światło naczynia płynem w celu usunięcia krwi i zanieczyszczeń. Zawór strzykawki po lewej stronie należy następnie zamknąć, tak aby po tej stronie powstała statyczna kolumna cieczy, względem której regulowane będzie ciśnienie z prawej strony; za pomocą mikromanipulatora ustawić ruchomą prawą kaniulę szklaną bliżej odcinka tętnicy i naciągnąć prawy koniec odcinka na nią.

Na koniec zabezpiecz segment tętnicy szwami nylonowymi i odetnij nadmiar nici chirurgicznych. Teraz zamontuj jednostkę wykresu ciśnienia na stole nad mikroskopem do mikrografii ciśnienia. Podłącz kolumnę ciśnienia do prawej strony komory wykresowej, a następnie nałóż pokrywę na komorę.

Stopniowo podnoś strzykawkę o pojemności 10 ml w ciągu 15 minut i sprawdzaj, czy naczynie nie przecieka, aż przetwornik ciśnienia P1 wskaże 80 mm Hg. W razie potrzeby skoryguj odległość między kaniulami; odległość tę należy dobrać tak, aby podciśnieniowy segment tętnicy był w przybliżeniu prosty i tworzył kształt przypominający ramię w miejscach zawiązania sznurków. Sprawdź żywotność zamontowanego naczynia, wykonując krótkotrwałą superfuzję 60 mM KCl przez 30 sekund. Żywotne naczynie szybko kurczy się po dodaniu KCl i natychmiast rozszerza po jego wypłukaniu.

Następnie dodaj skoncentrowaną substancję testową do roztworu kąpieli, pipetując ją bezpośrednio i delikatnie w przód i w tył w pobliżu końca komory, aby wymieszać substancję testową z roztworem kąpieli, uzyskując odpowiednią stężenie końcowe w 10 mililitrowej komorze. Zmiany objętości w średnicy naczynia po dodaniu substancji testowej mogą być monitorowane na obrazie wideo na żywo, a także rejestrowane w oknie analizy obrazu w trakcie trwania eksperymentu. Rysunek ten przedstawia rodzinę sekwencyjnych przebiegów prądowych zarejestrowanych w odpowiedzi na skoki napięcia przed traktowaniem (zaznaczone na czarno) oraz po stabilizacji w obecności 100 nanomolowego jonu cynku (zaznaczone na czerwono) w pojedynczym miocycie tętnicy krezkowej; przedstawione są tutaj reprezentatywne prądy dla kontroli oraz dla 100 nanomolowego jonu cynku.

Szare paski wskazują przedziały czasowe, w których mierzono uśrednione amplitudy prądu. Na wykresach zależności prądu od napięcia skokowe wartości napięcia są zaznaczone po prawej stronie grotami strzałek. Przedstawiono przebieg czasowy zwiększenia prądu KV7 przez 100 nM jonów cynku, pomierzony przy ciągłym zaciskaniu napięcia (voltage clamp) przy -20 mV. Tutaj przedstawiono uśrednione krzywe zależności prądu od napięcia, wyznaczone z gęstości prądu KV7 zarejestrowanych przed, w trakcie traktowania 100 nM jonami cynku oraz w trakcie traktowania 10 µM blokerem kanałów KV7 XC 9 9 1. Przedstawiono rozkurcz tętnicy krezkowej wstępnie skurczonej 100 pM argyniny wazopresyny, wywołany jonami cynku.

Rysunek ten przedstawia przebieg czasowy zmian średnicy zewnętrznej naczynia w odpowiedzi na podanie 100 pM argyniny wazopresyny, a następnie podanie 100 nM jonów cynku. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przygotowania tętnic do izolacji pojedynczych komórek lub do miograficznych pomiarów ciśnieniowych skurczu tętniczego i odpowiedzi rozszerzających. Ponadto powinni Państwo wiedzieć, jak rejestrować prądy KV7 w izolacji od innych prądów w świeżo izolowanych miocytach tętniczych.