Badanie funkcji kanału potasowego Kv7 mięśni gładkich tętnic za pomocą elektrofizjologii zacisku krosowego i miografii ciśnieniowej

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar aktywności siedmiu kanałów potasowych KV w świeżo zdysocjowanych komórkach mięśni gładkich tętnicy krezkowej i odniesienie tego do pomiarów średnicy tętnicy zarejestrowanych w warunkach fizjologicznych. Osiąga się to poprzez najpierw chirurgiczne usunięcie arkady naczyń krwionośnych krezki u szczura. Drugim krokiem jest wypreparowanie i oczyszczenie segmentów tętnic krezkowych.

Następnie niektóre segmenty są wykorzystywane do izolowania pojedynczych komórek mięśni gładkich do pomiarów elektrofizjologicznych prądów potasowych KV seven za pomocą zacisku krosowego. Ostatnim etapem jest kaniulacja nienaruszonych odcinków tętnicy w celu pomiaru ciśnienia mięśnia zwężenia lub poszerzenia tętnicy w odpowiedzi na farmakologiczne modulatory KV siedmiu kanałów potasowych. Ostatecznie połączenie elektrofizjologii klamry łatowej i miografii ciśnieniowej służy do pokazania, w jaki sposób wzrost lub spadek aktywności kanałów potasowych KV seven wpływa na zwężenie tętnicy krezkowej.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wykorzystanie kanałów klonowych wyrażonych w liniach komórkowych, jest to, że prądy są rejestrowane z komórek niehodowanych, które natywnie wyrażają kanały, a prądy KV można wyizolować z innych klas kanałów potasowych, które mogą być aktywowane w tych samych komórkach. Miografia ciśnieniowa pozwala na zarejestrowanie odpowiedzi funkcjonalnych z tej samej tkanki, z której pochodzą izolowane komórki, a metoda jest zarówno bardziej czuła, jak i bardziej fizjologiczna niż inne preparaty, takie jak pierścienie tętnicze lub paski tętnicze. Dr Bareth Mani, adiunkt z mojego laboratorium, zademonstruje techniki kaniulacji tętniczej i miografii ciśnieniowej, a dr Luba Brueggeman, adiunkt w moim laboratorium, zademonstruje procedury izolacji komórek i planowania plastrów.

Aby rozpocząć tę procedurę, użyj nożyczek chirurgicznych, aby przeciąć 10 do 12 centymetrów segmentu na obu końcach jelita cienkiego szczura. Następnie odizoluj jelito wraz z przyczepionymi do niego naczyniami krwionośnymi. Następnie przypnij odcinek jelita cienkiego.

Rozłóż mesentariusza na bliższej stronie komory tak, aby pierwotna gałąź tętnicy krezkowej górnej znajdowała się pośrodku, a kolejny rząd gałęzi rozchodził się promieniście od środka. Następnie umieść szpilki tylko na segmentach jelita, uwidoczniwszy je za pomocą oświetlonego mikroskopu preparacyjnego. Ostrożnie oczyść tkankę tłuszczową i tkankę łączną otaczającą tętnice drugiego do czwartego rzędu w pobliżu jelit za pomocą mikrokleszczyków i nożyczek.

Przytrzymaj sąsiednie żyły, aby ułatwić oczyszczanie tkanki tłuszczowej i tkanki łącznej oraz uniknąć niepotrzebnego rozciągania tętnic. Teraz przenieś dwa do trzech segmentów tętnicy krezkowej do 35-milimetrowego naczynia do hodowli tkankowej zawierającego dwa mililitry lodowatego roztworu izolacyjnego. Następnie umieść naczynie na lodzie, pokrój segmenty tętnicy krezkowej na kawałki o długości od trzech do czterech milimetrów za pomocą pipety PE z wypolerowaną końcówką.

Przenieść segmenty tętnicze do szklanej fiolki zawierającej dwa mililitry wstępnie ogrzanego roztworu izolacyjnego o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 30 minutach ostrożnie odessać roztwór izolacyjny o temperaturze 37 stopni Celsjusza za pomocą tylnej pipety.

Dodaj do niego dwa mililitry ciepłego roztworu enzymatycznego, a następnie inkubuj przez 35 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Natychmiast po 35-minutowej inkubacji w roztworze enzymu umieścić fiolkę na lodzie, odessać roztwór enzymu i dodać dwa mililitry lodowatego roztworu izolacyjnego. Powtórz tę procedurę cztery razy.

Następnie w jednym mililitrze lodowatego roztworu izolacyjnego delikatnie powtórz odcinki tętnic za pomocą wypolerowanej tylnej pipety. 10 do 20 razy, aby uwolnić poszczególne komórki mięśni gładkich tętnicy krezkowej. Okresowo sprawdzaj wygląd miocytów, umieszczając kroplę zawiesiny komórek na 35-milimetrowej czaszy i oglądając je pod mikroskopem.

Zdrowe SMC MA powinny mieć gładki, wydłużony wygląd. Następnie przenieś około 100 do 200 mikrolitrów zawiesiny komórek do komory rejestracyjnej za pomocą polerowanej pipety pastierowej i pozwól komórkom przylegać przez 15 minut. Na tym etapie napełnij końcówkę pipety z plastrem amfoterycyną B, wolnym roztworem wewnętrznym, wsuwając w nią końcówkę pipety.

Następnie zastosuj ssanie na drugim końcu za pomocą 10-mililitrowej strzykawki przymocowanej za pomocą kawałka rurki, dodaj od góry info terin B zawierające roztwór pipety. Za pomocą końcówki pipety do mikroładowarki EINOR, aż pipeta zostanie wypełniona roztworem w około połowie. Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza, delikatnie stukając w pipetę.

Następnie włóż pipetę do uchwytu elektrody. Użyj mikromanipulatora, aby opuścić pipetę na powierzchnię wydłużonych miocytów. Gdy rezystancja pipety wzrośnie do sześciu do 10 megaomów, zastosuj ssanie, aby uzyskać giga uszczelnienie.

W tym samym czasie ustaw napięcie podtrzymania na zero miliwoltów, czekając na perforację membrany. Następnie zastosuj 100-milisekundowe kroki napięcia do plus 10 miliwoltów, a następnie do minus 10 miliwoltów. Użyj wzmacniacza, aby skompensować stan przejściowy pojemności pipety szybki równoczesny z pojawieniem się pojemności całej komórki.

Przejściowe małe trwałe prądy dodatnie od dwóch do 10 amperów PICO, czyste i amplitudowe wskazują na obecność funkcjonalnych siedmiu kanałów KV. Udana perforacja amfoterycyną B zmniejszy rezystancję dostępu do 35 megaomów lub mniej. Aby zarejestrować zależność napięcia dwuprądowego KV siedmioprądowego, zastosuj pięciosekundowe kroki napięcia do napięć w zakresie od minus 84 miliwoltów, przy których prawdopodobieństwo otwarcia siedmiu kanałów KV jest minimalne, do plus 16 miliwoltów, przy których prawdopodobieństwo otwarcia siedmiu kanałów KV osiąga plateau Po pięciu sekundach przy każdym napięciu testowym cofnij się do napięcia podtrzymania na poziomie minus cztery miliwolty przez 10 sekund.

W tej procedurze luźno zawieś dwa gotowe cienkie nylonowe szwy z każdej strony. W sąsiedztwie szklanej kaniuli ostrożnie przenieś wypreparowany segment tętnicy krezkowej z komory preparacyjnej do komory ciśnieniowej przeszczepu mięśniowego, przytrzymując jeden koniec segmentu za pomocą pary mikrokleszczyków. Następnie, wizualizując przez oświetlony mikroskop preparacyjny, przytrzymaj jeden koniec odcinka tętnicy i delikatnie przesuń go po lewej szklanej kaniuli.

Zabezpiecz koniec za pomocą nylonowych szwów. Następnie delikatnie przepłucz płyn świetlny przez zamontowane naczynie, aby usunąć krew i zanieczyszczenia. Zastawkę lewej strzykawki należy następnie zamknąć tak, aby po tej stronie znajdowała się statyczna kolumna płynu, względem której reguluje się ciśnienie z prawej strony, za pomocą mikromanipulatora ustawić ruchomą prawą szklaną kaniulę bliżej odcinka tętnicy i pociągnąć nad nią prawy koniec segmentu.

Na koniec zabezpiecz odcinek tętnicy nylonowymi szwami i odetnij nadmiar nici szwów. Teraz zamontuj wykres ciśnienia na stoliku nad mikroskopem ciśnieniowym. Podłącz kolumnę ciśnieniową po prawej stronie komory wykresu, a następnie umieść pokrywę nad komorą.

Stopniowo podnoś 10-mililitrową strzykawkę przez okres 15 minut i sprawdzaj, czy w naczyniu nie ma żadnych wycieków, aż przetwornik ciśnienia P jeden wskaże 80 milimetrów słupa rtęci, w razie potrzeby dostosuj odległość między kaniulą, odległość należy wyregulować w taki sposób, aby odcinek tętnicy pod ciśnieniem był w przybliżeniu prosty i tworzył wzór przypominający ramię, w którym wykonane są opaski. Sprawdzić żywotność zamontowanego naczynia przez przejściowe superfuzję 60-milimolowym chlorkiem potasu przez 30 sekund. Żywe naczynie szybko zwęża się po dodaniu chlorku potasu i rozszerza się natychmiast po wypłukaniu.

Następnie dodać stężoną substancję badaną do roztworu kąpieli bezpośrednio, delikatnie pipetować tam i z powrotem w pobliżu końca komory, aby wymieszać substancję badaną w roztworze kąpieli, uzyskując odpowiednie stężenie końcowe w komorze 10 mililitrów. Zmiany objętości średnicy naczynia po dodaniu substancji badanej mogą być monitorowane na obrazie wideo na żywo, a także przedstawiane na wykresie w oknie analizy obrazu w trakcie trwania eksperymentu. Rysunek ten przedstawia rodzinę sekwencyjnych śladów prądowych zarejestrowanych w odpowiedzi na kroki napięcia przed leczeniem, jak pokazano na czarno i po stabilizacji w obecności 100 nanomolowych obwodów w pojedynczym miocycie tętnicy krezkowej, jak pokazano na czerwono, oto reprezentatywne prądy dla kontroli i dla 100 nanomolowych perionów.

Szare paski wskazują przedział czasu, w którym zmierzono uśrednione amplitudy prądu W przypadku wykresów napięcia prądu napięcia krokowego są one oznaczone po prawej stronie grotami strzałek. Jest to przebieg czasowy wzmocnienia prądu KV seven o 100 nanomolowy peryon mierzony za pomocą ciągłych cęgów napięciowych o napięciu minus 20 miliwoltów. Pokazano. Oto uśrednione krzywe napięcia prądu wyprowadzone z siedmiu gęstości prądu KV zarejestrowanych wcześniej podczas leczenia 100 nanomolowym perionem i podczas leczenia 10 mikromolami siedmiokanałowego blokera KV XC 9 9 1 indukowanego jonem relaksacji tętnicy krezkowej wstępnie zwężonej 100 wazopresyną argininy picomolar.

Rysunek ten przedstawia przebieg w czasie zmian średnicy zewnętrznej naczynia w odpowiedzi na zastosowanie 100 pikomolarnych wazopresyny argininy, a następnie zastosowanie 100 nanomolowych jonów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować tętnice do izolacji pojedynczych komórek lub do graficznego pomiaru ciśnienia mięśni zwężenia tętnic, odpowiedzi rozszerzacza. Ponadto powinieneś wiedzieć, jak rejestrować prądy KV siedem w izolacji od innych prądów w świeżo izolowanych miocytach tętniczych.