Inżynieria tkanek mięśni szkieletowych z mysich komórek progenitorowych mioblastów i zastosowanie stymulacji elektrycznej

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie zmodyfikowanych tkanek mięśniowych. Osiąga się to poprzez pierwszą hodowlę komórek satelitarnych lub linii komórkowej mioblastów w celu uzyskania wymaganej liczby komórek. Drugim krokiem jest wykonanie punktów kotwiczenia.

Następnie komórki miesza się z żelem, a powstałą mieszaninę między punkty kotwiczenia. Ostatnim krokiem jest różnicowanie komórek w tkankę mięśniową. Ostatecznie stymulacja elektryczna może być wykorzystana do wywołania skurczów komórek, a barwienie fluorescencyjne i mikroskopia fluorescencyjna lub konfokalna mogą być wykorzystane do wykrycia sarkomeralnej organizacji cytoszkieletu w zróżnicowanych komórkach mięśniowych.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami jest to, że komórki mięśniowe będą ustawiać się w jednym kierunku w tych tkankach. Technika ta ma również implikacje dla pacjentów, którzy cierpią z powodu utraty mięśni. Jeśli, na przykład, w przyszłości użyjemy własnych komórek pacjenta do wytworzenia tych tkanek, będą one mogły być wykorzystane do celów transplantacyjnych.

Metoda ta zapewnia wgląd w rozwój mięśni i ich uszkodzenia, ale zapewni również wgląd w nowe zastosowania, takie jak medycyna regeneracyjna i mięso hodowane metodą e vitro. Demonstracją procedury będą ariańskie metody izolowania i zamrażania mirinu. Komórki progenitorowe mioblastów zostały opisane w innym miejscu.

Prosimy o zapoznanie się z pisemnym protokołem w celu uzyskania pełnych referencji. Po pobraniu fiolki z komórkami progenitorowymi myoblastów myszy z ciekłego azotu. Umieścić fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza do rozmrożenia.

Następnie dodaj 10 mililitrów podgrzanej pożywki do kolby do hodowli tkankowych pokrytej żelem o powierzchni 25 centymetrów kwadratowych. Jak tylko komórki zostaną rozmrożone, dodać zawartość fiolki do pożywki. W kolbie do hodowli tkankowej inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

W trzecim dniu inkubacji zbierz komórki za pomocą trypsyny, izacji i odwirowania. Przy 1000 obr./min następnie przejdź komórki do 75-centymetrowej głównej kolby tkankowej pokrytej żelem, dziel komórki co trzy dni, a szóstego dnia przejdź komórki do 150-centymetrowej kolby do hodowli tkankowej pokrytej żelem matri. W dziewiątym dniu przenieś komórki z kolby do hodowli tkankowej pokrytej żelem matri o średnicy 150 centymetrów kwadratowych do potrójnej kolby do hodowli tkankowych pokrytej żelem matri o powierzchni 150 centymetrów kwadratowych lub trzech kolb o powierzchni 150 centymetrów kwadratowych.

W 12 dniu inkubacji komórki są gotowe do wysiewu do konstrukcji mięśniowej. Zacznij od wycięcia segmentów rzepów o długości około pięciu milimetrów do kwadratu z jedną krawędzią w kształcie trójkąta, jak pokazano na tym schemacie, używana jest tylko miękka strona rzepu. Następnie przygotuj klej silikonowy, mieszając elastomer z utwardzaczem w stosunku 10 do jednego.

Następnie przyklej dwa kawałki rzepów do każdej studzienki sześciodołkowej płytki hodowlanej, pozostawiając około 12 milimetrów między kawałkami i pozostaw do wyschnięcia na noc. Następnego dnia wysterylizuj studzienki i rzepy, dodając 70% etanolu do studzienek i inkubując przez 15 minut. Następnie przepłucz studzienki trzykrotnie PBS.

Pozostaw trzecie płukanie w studzienkach i wystaw płytkę na działanie światła UV przez 15 minut. Następnie odessać PBS i przenieść płytki do inkubatora do hodowli tkankowych, aż będą gotowe do użycia. Przygotuj roztwór 3,2 miligrama na mililitr, kolagen i sterylny 0,02% kwas octowy.

Umieść roztwór kolagenu na lodzie wraz z roztworem matrigelu, który został wcześniej rozmrożony w lodówce. Następnie zbierz komórki za pomocą trypsyny, izacji i wirowania. Następnie ponownie zawieś osad komórkowy w pożywce wzrostowej i wykonaj zliczanie komórek zgodnie ze standardowymi procedurami.

Po zliczeniu komórek umieścić probówkę zawierającą komórki w inkubatorze do hodowli tkankowych. Roztwór matrycy przygotowuje się przez zmieszanie roztworów na lodzie w następujących procentach: 51,3% roztwór kolagenu 0,2%0,5 molowego wodorotlenku sodu, 8,6% żel matrycowy i 39,9% wzrost. Średni. Upewnij się, że końcowy roztwór ma różowy kolor, ponieważ wzrost pH może spowodować szybkie działanie.

Ostateczna objętość zależy od liczby dołków do platerowania. Ta tabela przedstawia objętości dla 10 mięśni. Upewnij się, że komórki są całkowicie ponownie zawieszone i przenieś 750 000 do 1 250 000 komórek na konstrukcję do świeżej wirówki wirówkowej z prędkością 1000 obr./min na pięć minut, odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w małej, ale wystarczającej objętości mieszaniny matryc.

Następnie, gdy osad zostanie całkowicie zawieszony, dodaj komórki do pozostałej objętości mieszaniny matrycowej. Teraz po pobraniu wstępnie rozgrzanych płytek z rury inkubatora po 0,35 do 0,4 mililitra mieszaniny matrycy komórkowej do każdego kawałka rzepu. Następnie zacznij mieszaninę od środka między miejscami mocowania i rozciągaj do rzepu.

Na koniec użyj pozostałej części żelu, aby wypełnić szczelinę między dwoma kotwicami na rzepy i odpipetować wokół elementów rzepów. Przykryj talerz i pozostaw go w temperaturze pokojowej na pięć do 10 minut. Następnie delikatnie postukaj w naczynie i sprawdź wzrokowo, czy żel jest sztywny.

Jeśli tak, szalki można delikatnie przenieść do inkubatora do hodowli tkankowych. Po jednej do dwóch godzin w inkubatorze delikatnie pokryj każdy żel czterema mililitrami wstępnie podgrzanej pożywki wzrostowej. Następnie umieść płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli tkankowych.

Po 24 godzinach zastąp pożywkę wzrostową pożywką różnicującą. Powtarzaj wymianę podłoża co dwa do trzech dni. Dojrzałe zorientowane włókna mięśniowe powinny być widoczne w siódmym dniu hodowli.

W tym momencie włókna mogą być stymulowane elektrycznie. Najpierw wysterylizuj elektrody z płytki optyki jonowej 70% etanolem przez 15 minut i wysusz w świetle UV przez 30 minut. Następnie umieść wysterylizowane elektrody na płytce hodowlanej, upewniając się, że elektrody są umieszczone równolegle do konstrukcji mięśniowej, jak pokazano na rysunku przedstawiającym spód płytki, białe strzałki wskazują, że elektrody zakrywają płytkę pokrywką i przenoszą do inkubatora do hodowli tkankowych.

Podłącz stymulator jonowo-optyczny C za pomocą odpowiednich i zastosuj protokół stymulacji tutaj. Cztery wolty na centymetr. Stosuje się impulsy sześciomilisekundowe o częstotliwości dwóch herców.

Stymulacja elektryczna jest zwykle wykonywana przez okres 48 godzin. Zmieniaj pożywkę hodowlaną co 24 godziny podczas stymulacji. Ten obraz przedstawia typowy przykład dojrzałej konstrukcji mięśniowej.

Rozmiar tkanki wynosi około ośmiu milimetrów długości, dwa milimetry szerokości i 0,5 milimetra grubości. Zdjęcie przedstawia typowy przykład komórki progenitorowej mięśni w zmodyfikowanych tkankach mięśni szkieletowych. Zamrożone odcinki niestymulowanych lustrzanych bio sztucznych mięśni lub M bms.

W ósmym dniu różnicowania barwiono sarkomeryczne alfa-aktyninę zaznaczoną na czerwono, sarkomeryczną miozynę zaznaczoną na zielono i jądra na niebiesko. Panele po prawej stronie to powiększenie obszarów ramkowych. Protokół może być również używany na dwóch ogniwach C 12.

Ten obraz przedstawia zróżnicowane C dwie komórki C 12 barwione w taki sam sposób, jak pokazano na ostatnim obrazie. Sarkomeryczna alfa aktynina jest pokazana na czerwono. Miozyna sarkomeryczna jest pokazana na zielono, a jądra są pokazane na niebiesko.

Ponownie, panele po prawej stronie to powiększenia obszarów pudełkowych. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby wszystko było na lodzie. Po tej procedurze można zastosować inne metody, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak ilościowy PCR, aby wykazać zmiany w poziomach ekspresji genów po jego opracowaniu.

Technika ta utorowała naukowcom drogę do zbadania roli mechaniki w morfogenezie tkanek. Pomogło to również w projektowaniu zmodyfikowanych modeli mięśnia sercowego. Po obejrzeniu tego filmu, powinieneś mieć dobre zrozumienie, jak generować zmodyfikowane tkanki mięśniowe za pomocą rusztowania na bazie hydrożelu.