Name: Inżynieria tkanek mięśni szkieletowych z mysich komórek progenitorowych mioblastów i zastosowanie stymulacji elektrycznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Poznaj inżynierię tkanki mięśniowej z mysich komórek progenitorowych mioblastów przy użyciu stymulacji elektrycznej. Ta metoda umożliwia badanie organizacji sarkomerowej i kontrakcji mięśniowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Yabin Wu za hodowlę tkanek przedstawionych na Rysunku 2; zdjęcie zostało wykonane przez Bart van Overbeeke. Praca była finansowana przez SenterNovem w ramach grantu ISO 42022.

1. Hodowla progenitorowych komórek mioblastów mysich lub komórek C2C12
<ol>
	<li>Wyizolować komórki zgodnie z protokołem pierwotnie opublikowanym przez Shefera i współpracowników 10, a następnie zaadaptowanym przez Collinsa et al. 11 oraz Boonena et al. 12, i przechowywać je w ciekłym azocie. Wymagane są myszy, np. C57Bl/6. W innych laboratoriach stosowane są alternatywne metody, np. metoda opublikowana w Journal of Visualized Experiments przez Li Y et al. 13. W kwestii odczynników i sprzętu należy zapoznać się z tabelą na stronach 7 i 8. Z mięśni jednej myszy zazwyczaj uzyskuje się wystarczającą liczbę komórek do krioarkiwizacji około 20 fiolek w ciekłym azocie. Następnie rozpoczynamy protokół rozmrażania komórek z przechowywania w ciekłym azocie.</li>
	<li>Przenieść komórki z 1 fiolki do kolby hodowlanej o powierzchni 25 cm2 powlekanej Matrigelem (1 mg/ml) i dodać medium wzrostowe (GM) składające się z (335 ml DMEM advanced, 100 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 50 ml HS, 5 ml penicyliny/streptomycyny, 5 ml L-glutaminy, 5 ml ekstraktu z zarodka kurczaka (CEE)).</li>
</ol>
Uwaga: inkubować przez 2 hr w temperaturze pokojowej, a następnie usunąć Matrigel poprzez aspirację.
<ol start="3">
	<li>Przesiewaj komórki w stosunku około 1:3 co 3 dni. 
	Oznacza to: w dniu 3. przenieś komórki z jednej kolby 25 cm2 do kolby 75 cm2; w dniu 6. przenieś komórki z jednej kolby 75 cm2 do dwóch kolb 150 cm2 (z 30-minutowym wstępnym wysiewaniem do kolb niepowlekanych). W dniu 9. przenieś zawartość jednej kolby 150 cm2 do jednej potrójnej kolby 150 cm2 lub, jeśli taka jest niedostępna, do trzech kolb 150 cm2 (w razie potrzeby ponownie zastosuj wstępny wysiew, zależnie od fenotypu komórek). W dniu 12. komórki są gotowe do wysiewu do konstrukcji mięśniowej.</li>
</ol>
Uwagi: - Na każdą potrójną płytkę 150 cm2 liczba komórek wyniesie około 4,5 x 106 komórek. 
- W celu uzyskania mieszanej populacji komórek w momencie wysiewu, należy użyć fiolek z różnych izolacji i wymieszać je.
Uwaga: Jeśli zdecydują się Państwo nie pracować z komórkami pierwotnymi, dobrą alternatywą są mioblasty C2C12.
2. Inżynieria tkanek mięśni szkieletowych
<ol>
	<li>Przygotować klej silikonowy, mieszając „elastomer” z „utwardzaczem” (10:1). Wyciąć kwadratowe fragmenty rzepu o boku +/- 5 mm z jednym trójkątnym bokiem (kształt przypominający domek; Rysunek 1). Przykleić rzep do dołków płytki hodowlanej 6-dołkowej, zachowując odstęp około 12 mm pomiędzy kwadratami.</li>
</ol>
Uwagi: - Należy używać wyłącznie miękkiej strony rzepa, kierując tę stronę do góry. 
- Należy upewnić się, że wierzchołki są skierowane ku sobie. 
- Silikonowym klejem należy pokryć tylko rzep; nie wolno rozprowadzać kleju w całej studni. 
- W celu późniejszej stymulacji elektrycznej istotne jest ustawienie konstruktów w pionowym kierunku płytki wielodobowej (wzdłuż długiej osi).
<ol start="2">
	<li>Pozostawić do wyschnięcia na noc w nieogrzewanej suszarce próżniowej, głównie w celu usunięcia pęcherzyków powietrza. Sterylizować poprzez dodanie 70% EtOH do dołków i inkubować przez 15 min. Przepłukać 3x buforem PBS i naświetlać promieniowaniem UV przez 15 min. Usunąć cały PBS z dołków oraz z rzepów (Velcro) i umieścić w inkubatorze do momentu użycia.</li>
	<li>Rozmrozić roztwór Matrigelu w lodówce i przygotować roztwór kolagenu o pożądanym stężeniu krótko przed przygotowaniem konstruktów 3D. Rozcieńczyć zapas kolagenu sterylnym 0,02% kwasem octowym (stężenie końcowe 3,2 mg/ml).</li>
</ol>
Uwaga: wszystkie odczynniki i próbki należy przechowywać w lodzie.
<ol start="4">
	<li>Poddać komórki trypsynizacji, resuspendować w GM i policzyć. Pozostawić komórki w probówce do wirowania w inkubatorze.</li>
	<li>Do probówki dodać odpowiednią ilość roztworu zapasu kolagenu dla liczby konstruktów, które zamierza się przygotować (zgodnie z Tabelą 1), a następnie dodawać 0,5M NaOH do tego roztworu kolagenu, aż jasnoróżowy kolor wskaże pH 7,5. Pomieszać delikatnie, pipetując w górę i w dół, unikając powstawania pęcherzyków powietrza. Następnie dodać Matrigel i bardzo delikatnie, ale dokładnie wymieszać. Na koniec dodać GM do mieszaniny kolagenu i Matrigelu (odpowiednie ilości znajdują się w Tabeli 1).</li>
</ol>
Uwagi: - Każdy krok należy wykonywać w lodzie! Matrigel i kolagen szybko żelują w temperaturze powyżej 0°C. 
- Należy upewnić się, że kolor jest rzeczywiście różowy! Wzrost pH również wywoła szybką żelację. 
- Końcowe stężenie kolagenu: 1.6 mg/ml.
<ol start="6">
	<li>Odwirować odpowiednią ilość komórek przy 1,000 rpm przez 5 min, a następnie usunąć nadsącz.</li>
</ol>
Uwaga: - W zależności od aktywności komórek liczbę komórek na konstrukt należy odpowiednio dostosować. Zazwyczaj liczba ta mieści się w przedziale od 750 000 do 1 250 000 komórek na konstrukt.
<ol start="7">
	<li>Użyj części mieszaniny żelowej, aby resuspendować pellet komórkowy, a następnie przenieś komórki do pozostałej części mieszaniny i wymieszaj dokładnie, unikając wprowadzania pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Wyjmij podgrzane wcześniej płytki z inkubatora i pipetuj 0,35 - 0,4 ml mieszaniny komórkowo-żelowej najpierw na rzepy. Następnie zacznij pipetować mieszaninę od środka, pomiędzy miejscami mocowania, rozszerzając ją w stronę rzepów. Na koniec wykorzystaj pozostały żel, aby wypełnić lukę między dwoma kotwicami z rzepów i pipetuj wokół fragmentów rzepów.</li>
	<li>Po 5-10 min ostrożnie sprawdź, czy żele są wystarczająco stałe, aby można było je przenieść, i.e. delikatnie stuknij płytki i sprawdź wizualnie, czy żel jest sztywny. Jeśli tak, ostrożnie umieść płytki w inkubatorze. Zazwyczaj można je wyjąć po dziesięciu minutach. Następnie, po 1-2 h, delikatnie przykryj każdy żel 4 ml ciepłego medium GM.</li>
</ol>
Uwaga: -Należy unikać gwałtownych ruchów podczas przenoszenia płytek.
<ol start="10">
	<li>Po 24 h zastąp GM pożywką różnicującą (pożywka wzrostowa bez ekstraktu z zarodka kurczaka), a następnie wymieniaj pożywkę na świeżą co 2-3 dni. W 7. dniu powinny powstać dojrzałe, zorientowane włókna mięśniowe, co można ocenić poprzez barwienie w celu oceny rozwoju poprzecznych prążków w stopionych włóknach mięśniowych.</li>
</ol>
3. Stymulacja elektryczna
<ol>
	<li>Przed użyciem wysterylizować elektrody z płytki ionoptix (patrz tabela odczynników i sprzętu) za pomocą 70% etanolu, a następnie wysuszyć pod promieniowaniem UV w komorze bezpiecznej. Umieścić płytkę z elektrodami na płytce hodowlanej z konstruktami, przykryć pokrywką z płytki hodowlanej i przenieść do inkubatora. Podłączyć urządzenie Ionoptix C-pacer za pomocą odpowiednich kabli.</li>
</ol>
Uwaga: Elektrody są umieszczone równolegle wzdłuż konstruktu mięśniowego (Rysunek 2).
<ol start="2">
	<li>Zastosuj przewidziany protokół stymulacji.</li>
</ol>
Uwaga: Zazwyczaj stosujemy impulsy o wartości 4 V/CM i czasie trwania 6ms przy częstotliwości 2Hz. Wymieniaj pożywkę hodowlaną co 24 hr w trakcie stymulacji.

<ol><li>Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Polak, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meet+the+new+meat%3A+tissue+engineered+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Food+Sci.+Tech%22%5BJournal%5D)">Meet the new meat: tissue engineered skeletal muscle.</a> Trends Food Sci. Tech. 21 (2), 59-66 (2010).</li>
<li>Shansky, J., Chromiak, J., Tatto, M., Vandenburgh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+method+for+tissue+engineering+skeletal+muscle+organoids+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev.+Biol.+Animal%22%5BJournal%5D)">A simplified method for tissue engineering skeletal muscle organoids in vitro.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. Animal. 33 (9), 659-661 (1997).</li>
<li>Vandenburgh, H., Del Tatto, M., Shansky, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+skeletal+muscle+organoids+for+reversible+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy.</a> Hum. Gene Ther. 7 (17), 2195-2200 (1996).</li>
<li>Yaffe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retention+of+differentiation+potentialities+during+prolonged+cultivation+of+myogenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 61 (2), 477-483 (1968).</li>
<li>Rando, T. A., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+mouse+myoblast+purification%2C+characterization%2C+and+transplantation+for+cell-mediated+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy.</a> J. Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).</li>
<li>Koning, M., Werker, P. M. N., vander Schaft, D. W. J., Bank, R. A., Harmsen, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-1+and+MicroRNA-206+Improve+Differentiation+Potential+of+Human+Satellite+Cells%3A+A+Novel+Approach+for+Tissue+Engineering+of+Skeletal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-1 and MicroRNA-206 Improve Differentiation Potential of Human Satellite Cells: A Novel Approach for Tissue Engineering of Skeletal Muscle.</a> Tissue Eng. Part A. , (2011).</li>
<li>Darabi, R., Pan, W., Bosnakovski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+myogenic+engraftment+from+mouse+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Functional myogenic engraftment from mouse iPS cells.</a> Stem Cell Rev. 7 (4), 948-957 (2011).</li>
<li>Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Rosaria-Chak, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+maturation+by+electrical+stimulation%3A+Differences+in+response+between+C2C12+and+primary+muscle+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Tissue+Eng.+Regen.+Med%22%5BJournal%5D)">Advanced maturation by electrical stimulation: Differences in response between C2C12 and primary muscle progenitor cells.</a> J. Tissue Eng. Regen. Med. 5 (7), 529-539 (2011).</li>
<li>van der Schaft, D., van Spreeuwel, A. C., van Assen, H. C., Baaijens, F. Mechanoregulation of vascularization in aligned tissue engineered muscle; a role for VEGF. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3avan+der+Schaft%2C+D+%22Tissue+Eng.+Part+A%22">Tissue Eng. Part A</a>. , (2011).</li>
<li>Shefer, G., Wleklinski-Lee, M., Yablonka-Reuveni, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+satellite+cells+can+spontaneously+enter+an+alternative+mesenchymal+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle satellite cells can spontaneously enter an alternative mesenchymal pathway.</a> J. Cell. Sci. 117 (Pt. 22), 5393-5404 (2004).</li>
<li>Collins, C. A., Olsen, I., Zammit, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+function%2C+self-renewal%2C+and+behavioral+heterogeneity+of+cells+from+the+adult+muscle+satellite+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche.</a> Cell. 122 (2), 289-301 (2005).</li>
<li>Boonen, K. J. M., Rosaria-Chak, K. Y., Baaijens, F. P. T., van der Schaft, D. W. J., Post, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+environmental+cues+from+the+satellite+cell+niche%3A+optimizing+proliferation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Essential environmental cues from the satellite cell niche: optimizing proliferation and differentiation.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296 (6), C1338-C1345 (2009).</li>
<li>Li, Y., Pan, H., Huard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+Stem+Cells+from+Soft+Musculoskeletal+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolating Stem Cells from Soft Musculoskeletal Tissues.</a> J. Vis. Exp. (41), e2011(2010).</li>
<li>Boonen, K. J. M., Langelaan, M. L. P., Polak, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+combined+mechanical+stimulation+protocol%3A+Value+for+skeletal+muscle+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech%22%5BJournal%5D)">Effects of a combined mechanical stimulation protocol: Value for skeletal muscle tissue engineering.</a> J. Biomech. 43 (8), 1514-1521 (2010).</li>
<li>Gawlitta, D., Boonen, K. J. M., Oomens, C. W. J., Baaijens, F. P. T., Bouten, C. V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+serum-free+culture+conditions+on+skeletal+muscle+differentiation+in+a+tissue-engineered+model%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">The influence of serum-free culture conditions on skeletal muscle differentiation in a tissue-engineered model.</a> Tissue Eng. Part A. 14 (1), 161-171 (2008).</li>
<li>Koning, M., van Luijn, M., van der Schaft, D. W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+muscle+formation+and+engraftment+In+vivo+is+independent+of+preconditioning+In+vitro+with+HUVEC%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Human skeletal muscle formation and engraftment In vivo is independent of preconditioning In vitro with HUVEC.</a> , In revision (2013).</li>
<li>Levenberg, S., Rouwkema, J., Macdonald, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+vascularized+skeletal+muscle+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering vascularized skeletal muscle tissue.</a> Nat. Biotechnol. 23 (7), 879-884 (2005).</li>
<li>Koffler, J., Kaufman-Francis, K., Yulia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+vascular+organization+enhances+functional+integration+of+engineered+skeletal+muscle+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Improved vascular organization enhances functional integration of engineered skeletal muscle grafts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (36), 14789-14794 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Inżynieria tkanek mięśniowych wykazuje ogromny potencjał w zastosowaniach jako model choroby, w przesiewaniu leków, w medycynie regeneracyjnej oraz w produkcji mięsa. Wymagania dla tych zastosowań są jednak zróżnicowane. Zdecydowaliśmy się pracować z kombinacją kolagenu i matrigelu, ponieważ kolagen umożliwia wyrównanie komórek, a komórki progenitorowe mioblastów wymagają obecności białek pochodzących z błony podstawnej, co ustalono w poprzednich badaniach 2D 12. Ponadto w naszym laboratorium testowano żele fi...

<table><tbody><tr><td>Matrigel z obniżoną zawartością czynników wzrostu</td><td>Beckton and Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM (wysoka zawartość glukozy)*</td><td>Gibco</td><td>42430</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM</td><td>Gibco</td><td>12491</td><td></td></tr><tr><td>Surowica konia</td><td>Gibco</td><td>65050-122</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Greiner</td><td>758075</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy 0,45 i 0,22 &amp;mu;m*</td><td>Whatmann (Schleicher and Scheull)</td><td>10462100</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna</td><td>Gibco</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>Plastik hodowlany</td><td>Greiner</td><td></td><td>Obejmuje kolby hodowlane i pipety</td></tr><tr><td>Ekstrakt z zarodka kurczaka</td><td>United States Biological</td><td>C3999</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteura*</td><td>Hilgenberg</td><td></td><td>Pipety Pasteura, z przewężeniem, z watą, z otwartym końcem L: 230 mm z średnicą końcówki 0,9 - 1,1 mm</td></tr><tr><td>Pipeta Pasteura*</td><td>Hilgenberg</td><td></td><td>Pipety Pasteura, z przewężeniem, z watą, z otwartym końcem L: 230 mm z średnicą końcówki 1,4 - 1,6 mm</td></tr><tr><td>Pipeta Pasteura</td><td>VWR</td><td>612-1702</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu I*</td><td>Sigma</td><td>C0130-16</td><td></td></tr><tr><td>Sito do komórek 40 &amp;mu;m*</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Igła 19G</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elastomer</td><td>Dow Corning corporation</td><td>3097358-1004</td><td>Silastic MDX 4-4210#</td></tr><tr><td>Utwardzacz</td><td>Dow Corning corporation</td><td></td><td>Silastic MDX 4-4210#</td></tr><tr><td>Rzep</td><td>Sklep ogólnodostępny</td><td></td><td>Można kupić w zwykłym sklepie, używać tylko miękkiej strony</td></tr><tr><td>Kolagen typu I, z ogona szczura</td><td>BD Biosciences</td><td>3544236</td><td></td></tr><tr><td>C-Pace EP Culture Pacer</td><td>Ionoptix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płytki hodowlane 6-dołkowe do stymulacji elektrycznej</td><td>Beckton Dickinson-Falcon</td><td>BD Falcon #353846</td><td></td></tr><tr><td>Elektrody do płytek hodowlanych C-Dish</td><td>Ionoptix</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">* Wymagane do izolacji komórek (punkt 1.1)&lt;br/&gt; # Razem w jednym zestawie</td></tr></tbody></table>

inżynieria tkanek mięśni szkieletowych z murynych komórek progenitorowych mioblastów i zastosowanie stymulacji elektrycznej

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Sztucznie wytworzone tkanki mięśniowe mogą być wykorzystywane w wielu różnych celach, w tym do produkcji tkanek służących jako modele chorób in vitro, np. do badania odleżyn, w medycynie regeneracyjnej oraz jako alternatywa dla mięsa 1. Pierwsze raportowane trójwymiarowe konstrukty mięśniowe zostały stworzone wiele lat temu, a pionierami w tej dziedzinie byli Vandenburgh i współpracownicy 2,3. Postępy w inżynierii tkankowej mięśni są nie tylko wynikiem ogromnego wzrostu wiedzy na temat czynników biochemicznych, komórek macierzystych i komórek progenitorowych, ale opierają się w szczególności na spostrzeżeniach badaczy, że czynniki fizyczne odgrywają kluczową rolę w kontrolowaniu zachowania komórek i rozwoju tkanek. Nowoczesne sztuczne konstrukty mięśniowe składają się obecnie z konstrukcji hydrożelowych zasiedlonych przez komórki. W naszym laboratorium składają się one zazwyczaj z mysich komórek progenitorowych mioblastów, wyizolowanych z mięśni kończyn tylnych myszy lub mysiej linii komórkowej mioblastów C2C12, zmieszanych z mieszaniną kolagenu/Matrigelu i wysianych między dwoma punktami kotwiczącymi, co naśladuje więzadła mięśniowe. Można rozważyć również inne komórki, np. alternatywne linie komórkowe, takie jak mioblasty szczura L6 4, noworodkowe komórki progenitorowe pochodzenia mięśniowego 5, komórki pochodzące z tkanek mięśniowych osobników dorosłych innych gatunków, np. ludzkich 6, a nawet indukowane pluripotentne komórki macierzyste (komórki iPS) 7. Kurczliwość komórek powoduje ich wyrównanie wzdłuż długiej osi konstruktu 8,9 oraz różnicowanie komórek progenitorowych mięśni po około jednym tygodniu hodowli. Ponadto zastosowanie stymulacji elektrycznej może w pewnym stopniu wspomóc proces różnicowania 8. Ze względu na ograniczony rozmiar (8 x 2 x 0,5 mm) całą tkankę można analizować za pomocą mikroskopii konfokalnej w celu monitorowania np. żywotności, różnicowania i wyrównania komórek. W zależności od konkretnego zastosowania wymagania wobec sztucznej tkanki mięśniowej będą się różnić; np. zastosowanie w medycynie regeneracyjnej wymaga zwiększenia rozmiaru tkanki i unaczynienia, natomiast w celu wykorzystania jako alternatywy dla mięsa konieczna jest translacja na inne gatunki.

Produktem końcowym będą konstrukty mięśniowe przedstawione na Ryc. 3. Rozmiar tkanki będzie wynosić około 8 mm długości, 2 mm szerokości i 0,5 mm grubości. Stymulacja elektryczna podczas różnicowania zmieni ekspresję izoform ciężkiego łańcucha miozyny, ale nie wzmocni znacząco procesu różnicowania indukowanego przez medium różnicujące 8; stymulację elektryczną można również zastosować na koniec procesu w celu sprawdzenia funkcjonalności mięśnia, ponieważ mięsień z w pełni rozwiniętymi sarkomerami będzie ...

Sztucznie wytworzona tkanka mięśniowa ma ogromny potencjał w medycynie regeneracyjnej, jako model chorób, a także jako alternatywne źródło mięsa. W niniejszej pracy opisujemy proces tworzenia konstruktu mięśniowego, w tym przypadku z progenitorowych mioblastów mysich, oraz jego stymulację impulsami elektrycznymi.

Inżynieria tkanek mięśni szkieletowych z murynych komórek progenitorowych mioblastów i zastosowanie stymulacji elektrycznej

Sztucznie wytworzone tkanki mięśniowe mogą być wykorzystywane w kilku różnych celach, w tym do produkcji tkanek służących jako modele chorób in vitro, np. do...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie inżynieryjnych tkanek mięśniowych. Osiąga się to poprzez uprawę komórek satelitarnych lub linii komórkowej mioblastów w celu uzyskania wymaganej liczby komórek. Drugim krokiem jest przygotowanie punktów zakotwiczenia.Następnie komórki miesza się z żelem, a otrzymaną mieszaninę odlewa pomiędzy punktami zakotwiczenia. Ostatnim krokiem jest różnicowanie komórek w tkankę mięśniową. W końcowej fazie można zastosować stymulację elektryczną w celu wywołania skurczów komórek, natomiast do wykrycia organizacji sarkomerycznej cytoszkieletu w zróżnicowanych komórkach mięśniowych można wykorzystać barwienie fluorescencyjne oraz mikroskopię fluorescencyjną lub konfokalną.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że komórki mięśniowe w tych tkankach będą układać się w jednym kierunku. Technika ta ma również znaczenie dla pacjentów cierpiących na zanik mięśni. Jeśli w przyszłości wykorzystamy np. własne komórki pacjenta do wytworzenia tych tkanek, mogą one zostać użyte do celów transplantacyjnych.Metoda ta pozwala na uzyskanie wglądu w rozwój mięśni oraz uszkodzenia mięśni, ale dostarczy również informacji przydatnych w nowatorskich zastosowaniach, takich jak medycyna regeneracyjna i mięso hodowane in vitro. Przedstawiona procedura będzie opierać się na metodach izolacji i zamrażania komórek progenitorowych mioblastów, które zostały opisane w innych publikacjach.W celu uzyskania pełnych odniesień prosimy o zapoznanie się z protokołem pisemnym. Po wyjęciu ampułki z progenitorami mioblastów myszy z ciekłego azotu, należy umieścić ją w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C w celu rozmrożenia.Następnie dodaj 10 mililitrów podgrzanego pożywki wzrostowej do kolby do hodowli tkankowej o powierzchni 25 centymetrów kwadratowych pokrytej Matrigelem. Natychmiast po rozmrożeniu komórek przelej zawartość fiolki do pożywki. Inkubuj komórki w kolbie do hodowli tkankowej w temperaturze 37 stopni Celsjusza i przy 5% dwutlenku węgla.Trzeciego dnia inkubacji zbierz komórki za pomocą trypsyny, inkubacji i wirowania przy 1000 RPM, a następnie przenieś komórki do 75 cm² powlekanego Matrigelem flakonu do hodowli tkankowej. Passażuj komórki co trzy dni, a szóstego dnia przenieś je do 150 cm² powlekanego Matrigelem flakonu do hodowli tkankowej. Dziewiątego dnia przenieś komórki z 150 cm² powlekanego Matrigelem flakonu do hodowli tkankowej do trzech 150 cm² powlekanych Matrigelem flakonów do hodowli tkankowej lub trzech flakonów 150 cm².W 12. dniu inkubacji komórki są gotowe do wysiewu do konstruktu mięśniowego. Należy rozpocząć od wycięcia fragmentów rzepa o powierzchni około pięciu milimetrów kwadratowych, z jedną krawędzią w kształcie trójkąta, zgodnie z przedstawionym schematem; należy używać wyłącznie miękkiej strony rzepa. Następnie należy przygotować klej silikonowy, mieszając elastomer z utwardzaczem w stosunku 10:1.Następnie przyklej dwa kawałki rzepa do każdego dołka płytki hodowlanej z sześcioma dołkami, zachowując odstęp około 12 mm między fragmentami, i pozostaw do wyschnięcia na noc. Następnego dnia wysterylizuj dołki i rzepy, dodając do dołków 70% etanol i inkubując przez 15 minut. Następnie wypłucz dołki trzykrotnie PBS.Pozostaw trzecią porcję płuczki w studniach i naświetlaj płytkę światłem UV przez 15 minut. Następnie odessij PBS i przenieś płytki do inkubatora do hodowli tkankowych do momentu użycia. Przygotuj roztwór kolagenu o stężeniu 3,2 mg/mL w sterylnym 0,02% roztworze kwasu octowego.Umieścić roztwór kolagenu na lodzie wraz z roztworem matrigelu, który został wcześniej rozmrożony w lodówce. Następnie zebrać komórki poprzez trypsynizację i wirowanie. Potem resuspendować osad komórkowy w pożywce wzrostowej i przeprowadzić zliczenie komórek zgodnie ze standardowymi procedurami.Po policzeniu komórek umieść probówkę z zawiesiną w inkubatorze do hodowli tkanek. Roztwór macierzy przygotowuje się poprzez zmieszanie na lodzie następujących składników w podanych procentach: 51,3% roztworu kolagenu 0,2% w 0,5 M wodorotlenku sodu, 8,6% żelu macierzy (matrix gel) oraz 39,9% pożywki wzrostowej. Upewnij się, że końcowy roztwór ma różowy kolor, ponieważ wzrost pH może doprowadzić do szybkiej polimeryzacji.Objętość końcowa zależy od liczby do napełnienia dołków. W poniższej tabeli przedstawiono objętości dla 10 mięśni. Należy upewnić się, że komórki zostały całkowicie resuspenderowane, a następnie przenieść od 750 000 do 1 250 000 komórek na konstrukt do nowej probówki do wirowania; wirować przy 1000 RPM przez pięć minut, odessać nadsącz i resuspenderować osad komórkowy w niewielkiej, lecz wystarczającej objętości mieszaniny macierzy.Następnie, po pełnym resuspensowaniu osadu, dodaj komórki do pozostałej objętości mieszaniny macierzy. Po wyjęciu wcześniej ogrzanych płytek z inkubatora, pipetuj od 0,35 do 0,4 mililitra mieszaniny komórkowo-macierzowej do każdego elementu rzepa. Następnie zacznij pipetować mieszaninę od środka, pomiędzy miejscami przytwierdzonymi, rozprzestrzeniając ją na rzep.Na koniec wykorzystaj pozostały żel, aby wypełnić szczelinę między dwoma kotwicami rzepowymi i nanieś pipetą żel wokół elementów rzepowych. Przykryj płytkę i pozostaw ją w temperaturze pokojowej od 5 do 10 minut. Następnie delikatnie stuknij naczyniem i sprawdź wizualnie, czy żel jest sztywny.Jeśli tak, płytki można delikatnie przenieść do inkubatora do hodowli tkanek. Po jednej lub dwóch godzinach w inkubatorze każdy żel należy delikatnie pokryć czterema mililitrami podgrzanego wcześniej medium wzrostowego. Następnie płytkę należy ponownie umieścić w inkubatorze do hodowli tkanek.Po 24 godzinach należy zastąpić pożywkę wzrostową pożywką różnicującą. Wymianę pożywki należy powtarzać co dwa do trzech dni. Dojrzałe, zorientowane włókna mięśniowe powinny być widoczne w siódmym dniu hodowli.Na tym etapie włókna można stymulować elektrycznie. Najpierw należy wysterylizować elektrody z płytki do optyki jonowej 70% etanolem przez 15 minut, a następnie wysuszyć je pod światłem UV przez 30 minut. Następnie umieść wysterylizowane elektrody na płytce hodowlanej, upewniając się, że elektrody są rozmieszczone równolegle do konstruktu mięśniowego, jak pokazano na tym zdjęciu przedstawiającym dno płytki; białe strzałki wskazują elektrody; przykryj płytkę pokrywką i przenieś do inkubatora do hodowli tkanek.Podłącz stymulator optyki jonowej C za pomocą odpowiednich kabli i zastosuj tutaj protokół stymulacji. Używa się impulsów o napięciu 4 V/cm i czasie trwania 6 ms przy częstotliwości 2 Hz.Stymulację elektryczną zazwyczaj przeprowadza się przez okres 48 godzin. Pożywkę hodowlaną należy zmieniać co 24 godziny podczas stymulacji. Na tym zdjęciu przedstawiono typowy przykład dojrzałego konstruktu mięśniowego.Rozmiar tkanki wynosi w przybliżeniu osiem milimetrów długości, dwa milimetry szerokości i 0,5 milimetra grubości. Ten obraz przedstawia typowy przykład komórki progenitorowej mięśni w inżynieryjnie wytworzonych tkankach mięśni szkieletowych. Przekroje mrożone niestymulowanych lustrzanych bio-sztucznych mięśni lub M bms.W ósmym dniu różnicowania przeprowadzono barwienie na alfa-aktyninę sarkomeryczną (kolor czerwony), miozynę sarkomeryczną (kolor zielony) oraz jądra komórkowe (kolor niebieski). Panele po prawej stronie stanowią powiększenie obszarów zaznaczonych ramkami. Protokół można również zastosować w przypadku komórek C2C12.Na tym obrazie przedstawiono zróżnicowane komórki C2C12 barwione w taki sam sposób, jak pokazano na ostatnim obrazie. Czerwonym kolorem zaznaczono sarkomeryczną alfa-aktyninę. Sarkomeryczna miozyna jest pokazana na zielono, a jądra komórkowe na niebiesko.Ponownie, panele po prawej stronie stanowią powiększenia obszarów zaznaczonych ramkami. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest pamiętanie o utrzymywaniu wszystkich komponentów na lodzie. Po zakończeniu tej procedury można zastosować inne metody w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak ilościowy PCR, aby wykazać zmiany w poziomach ekspresji genów po jej przeprowadzeniu.Technika ta utorowała drogę badaczom do analizy roli mechaniki w morfogenezie tkanek. Pomogła ona również w projektowaniu inżynieryjnych modeli mięśnia sercowego. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat generowania inżynieryjnych tkanek mięśniowych z wykorzystaniem rusztowania opartego na hydrożelu.

engineering-skeletal-muscle-tissues-from-murine-myoblast-progenitor

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Inżynieria tkanek mięśniowych z myoblastów pochodzenia myogenicznego i zastosowanie stymulacji elektrycznej

Technika mikrodysekcji eksplantów jest solidną i niezawodną metodą izolacji proliferujących komórek mięśni szkieletowych z mięśni młodocianych, dorosłych lub embrionalnych w celu pozyskania macierzystych komórek mięśni szkieletowych. Wyjątkowo komórki te zostały wyprowadzone klonalnie, co pozwoliło na stworzenie linii macierzystych komórek mięśni szkieletowych wykorzystywanych do transplantacji in vivo.

Kultura mikroeksplantów szkieletowych mięśni dorosłych i embrionalnych oraz izolacja komórek macierzystych mięśni szkieletowych

Opisano mysi model przezskórnej elektrycznej stymulacji nerwowo-mięśniowej (NMES), bezpiecznej i niedrogiej metody klinicznej, zastosowany do mięśni przedziału przedniego. Model ten ma tę zaletę, że wykorzystuje zmodyfikowane, powszechnie dostępne urządzenie kliniczne w celu wywołania ukierunkowanych i specyficznych skurczów mięśni u myszy.

Mysi model treningu mięśniowego za pomocą neuromuskularnej stymulacji elektrycznej

Izolacja i hodowla włókien mięśniowych to złoty standard systemu in vitro do badania przejścia komórek satelitarnych przez spoczynek, aktywację i różnicowanie.  Co ważne, system hodowli pojedynczych włókien mięśniowych zachowuje asocjację miofiber/komórki macierzyste, która jest niezbędnym składnikiem niszy komórek macierzystych mięśni.

Izolacja i hodowla poszczególnych włókien mięśniowych i ich komórek satelitarnych z dorosłych mięśni szkieletowych

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) pochodzące z miogennych komórek macierzystych są obiecującymi kandydatami na strategie terapii komórkowej w leczeniu dystrofii mięśniowych. Protokół ten opisuje przeszczep i pomiary funkcjonalne wymagane do oceny wszczepienia i różnicowania mezoangioblastów pochodzących z iPSC (rodzaj komórek progenitorowych mięśni) w mysich modelach ostrej i przewlekłej regeneracji mięśni.

Przeszczep indukowanych pluripotencjalnych progenitorów miogennych podobnych do mezoangioblastów pochodzących z mezoangioblastów w mysich modelach regeneracji mięśni

Ten protokół wykorzystuje elektroporację do wprowadzania i ekspresji fluorescencyjnie znakowanych białek we włóknach mięśniowych myszy. Po rekonwalescencji po elektroporacji włókna są izolowane. Poszczególne włókna są następnie obrazowane za pomocą mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości w celu wizualizacji struktury mięśni.

Elektroporacja DNA, izolacja i obrazowanie włókien mięśniowych

Opisujemy nowatorską technikę eksperymentalną, którą nazywamy Minimalnie Inwazyjnym Osadzaniem Mięśni (MIME), która opiera się na dowodach, że tkanka mięśni szkieletowych zawiera żywotne komórki miogenne, które mogą ułatwić miogenezę za pośrednictwem komórek dawcy, gdy zostaną wszczepione do mięśnia gospodarza.

Minimalnie inwazyjne osadzanie mięśni (MIME) - nowatorska technika eksperymentalna ułatwiająca miogenezę za pośrednictwem komórek dawcy

Tutaj prezentujemy protokół treningu populacji komórek za pomocą bodźców elektrycznych i mechanicznych naśladujących fizjologię serca. Ta elektromechaniczna stymulacja zwiększa potencjał kardiomiogenny leczonych komórek i jest obiecującą strategią dla dalszej terapii komórkowej, modelowania choroby i badań przesiewowych leków.

Jednoczesna stymulacja elektryczna i mechaniczna w celu zwiększenia potencjału kardiomiogennego komórek

Mioblasty to proliferujące komórki prekursorowe, które różnicują się, tworząc wielojądrowe miotuby, a w końcu mięśnie szkieletowe mięśni szkieletowych. W tym miejscu przedstawiamy protokół skutecznej izolacji i hodowli pierwotnych mioblastów z mięśni szkieletowych młodych dorosłych myszy. Metoda umożliwia badania molekularne, genetyczne i metaboliczne komórek mięśniowych w hodowli.

Izolacja i różnicowanie pierwotnych mioblastów z eksplantatów mięśni szkieletowych myszy

W tym protokole opisana jest metoda hodowli in vitro i analizy funkcjonalnej komórek macierzystych mięśni, która zachowuje większość ich interakcji z ich endogenną niszą.

Test pojedynczej hodowli włókien mięśniowych do oceny funkcjonalności dorosłych komórek macierzystych mięśni ex vivo

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół tworzenia matryc 3D mikrotkanek ludzkich mięśni szkieletowych oraz minimalnie inwazyjnych testów funkcji in situ, w tym analizy siły skurczu i obchodzenia się z wapniem.

Ocena funkcjonalnych wskaźników zdrowia mięśni szkieletowych w mikrotkankach mięśni szkieletowych człowieka

Przejrzystość optyczna jest główną zaletą dla biologicznej i fizjologicznej pracy komórek u danio pręgowanego. Opisano solidne metody pomiaru wzrostu komórek u poszczególnych zwierząt, które pozwalają na nowy wgląd w to, w jaki sposób wzrost mięśni szkieletowych i sąsiednich tkanek jest zintegrowany ze wzrostem całego ciała.

Wielokrotne pomiary wzrostu mięśni szkieletowych w czasie rzeczywistym u poszczególnych żywych ryb danio pręgowanych poddanych zmienionej aktywności elektrycznej

Poznaj inżynierię tkanki mięśniowej z mysich komórek progenitorowych mioblastów przy użyciu stymulacji elektrycznej. Ta metoda umożliwia badanie organizacji sarkomerowej i kontrakcji mięśniowych.

Inżynieria tkanek mięśni szkieletowych z murynych komórek progenitorowych mioblastów i zastosowanie stymulacji elektrycznej

Przeglądaj więcej filmów