Hodowla i iniekcja larw Manduca sexta w celu oceny wirulencji bakterii

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ocena patogenności bakterii wobec larw owadów z wykorzystaniem manduka seca jako organizmu modelowego. Cel ten osiąga się poprzez najpierw hodowlę larw owadów z wysterylizowanych jaj do czwartego stadium rozwojowego. W drugim kroku przygotowuje się próbki bakteryjne do iniekcji.

Następnie bakterie wstrzykuje się larwom czwartego stadium *Manduka seca*. W ostatnim kroku monitoruje się śmiertelność owadów w czasie po iniekcji. Ostatecznie rejestruje się czas do śmierci owadów, który służy do oceny wirulencji bakterii.

Ta metoda może pomóc w rozwiązaniu kluczowych kwestii w dziedzinie symbiozy, w tym w odkrywaniu nowych patogenów owadów oraz określaniu różnic w zjadliwości pomiędzy gatunkami lub szczepami bakterii. Należy rozpocząć od autoklawowania 15 gramów augera w 900 do 1000 mililitrach wody. Bezpośrednio po autoklawowaniu.

Wymieszaj świder z 166 gramami diety na bazie zarodków pszenicy. Za pomocą blendera laboratoryjnego przelej zblendowaną dietę dla owadów do naczynia. Po ochłodzeniu przenieś dietę z naczynia na kawałek folii aluminiowej.

Owiń szczelnie i przechowuj w temperaturze 4°C. Po dostarczeniu umieść jaja M sex w aparaturze składającej się ze szklanego uchwytu do filtrów i kolby próżniowej z papierem filtrowanym o średnicy 90 mm. Następnie wlej 250 ml 0,6% roztworu wybielacza na jaja na okres od dwóch do trzech minut, okazjonalnie mieszając.

Następnie należy włączyć próżnię, aby odprowadzić roztwór wybielacza, a następnie przemyć wysterylizowane jaja od trzech do czterech razy, używając 250 ml sterylnej wody destylowanej na każde płukanie. Następnie należy umieścić nowy fragment papieru filtracyjnego o długości 90 mm w pokrywce szalki Petriego, a następnie przenieść jaja na papier filtracyjny i pozostawić je do wyschnięcia w komorze z laminarnym przepływem powietrza, aż przestaną się do siebie przyklejać. Teraz należy umieścić świeżo przygotowaną pożywkę dla owadów na zabezpieczonym korku gumowym w kilku plastikowych pojemnikach i przenieść około 40 jaj do każdego pojemnika, oddzielając jaja od pożywki, aby zapobiec zapobiegnąć kontaminacji grzybiczej wywołanej wilgocią.

Przechowywać jaja w temperaturze 26°C przy 16-godzinnym okresie światła i 8-godzinnym okresie ciemności. Przed wykluciem jaja nabiorą żółtawo-białego koloru. Za pomocą pęsety, chwytając każdą z larw za długi czarny róg, ostrożnie przenieść około 25 larw do każdego z nowych pojemników z pożywką na dnie.

Inkubuj larwy przez dwa dni w tych samych warunkach, co w przypadku jaj; choć śmierć larw na tym etapie jest rzadka, mogą zaobserwować niektóre martwe lub, co bardziej prawdopodobne, zahamowane w rozwoju osobniki. Następnie przenieś larwy do oddzielnych pojemników z niewielkimi porcjami pokarmu, aby uniknąć kanibalizmu, i ponownie poddaj je inkubacji. Wymieniaj pokarm i usuwaj odchody z pojemników co drugi dzień, aż owady przejdą trzecią linienie larwalną.

Trzecie linienie larwalne prowadzi do czwartego stadium larwalnego, które charakteryzuje się pojawieniem się czarnych, haczykowatych crochetów na każdym prolegu oraz wyraźniejszymi prążkami wzdłuż ciała owada. Po wyhodowaniu odpowiednich szczepów bakterii do testów, odwiruj 500 µL każdego szczepu bakteryjnego przez dwie minuty w mikrowirówce przy 17 000 ×g w temperaturze pokojowej. Następnie przemyj osady w 1 mL sterylnego PBS w tych samych warunkach.

Po ponownym zawieszeniu komórek w kolejnych 0,5 ml sterylnego PBS należy zmierzyć gęstość optyczną zawiesin. Przed rozpoczęciem iniekcji, używając nowej końcówki pipety dla każdego rozcieńczenia, należy przygotować sześć dziesięciokrotnych rozcieńczeń seryjnych pierwszego szczepu bakterii w sterylnym PBS na 96-dołkowej płytce mikrotitracyjnej. Następnie należy nanieść po 10 µL każdego rozcieńczenia, od 10⁻² do 10⁻⁶, wzdłuż górnej krawędzi szalki Petriego zawierającej odpowiednią pożywkę wzrostową. Potem należy przechylić płytkę tak, aby naniesione krople rozprzestrzeniły się w kierunku centrum.

Następnie, po usunięciu pożywki i odchodów owadów, umieść pojemniki z owadami na lodzie na około pięć minut, aby uległy schłodzeniu. Przepłucz igłę strzykawki trzykrotnie w dwóch probówkach z 70-100% ethanol oraz raz w probówce z wodą sterylną. Następnie użyj hemocytometru, aby określić ilość komórek w rozcieńczonych zawiesinach pod mikroskopem.

W zależności od pożądanej ilości inokulum, pobierz 10 µL z odpowiedniej dołki mikropłytki. Następnie przemyj powierzchnię owada przeznaczonego do iniekcji 95% etanolem. Najtrudniejszym etapem jest utrzymanie owada w odpowiedniej pozycji do iniekcji przy jednoczesnym manipulowaniu igłą i dbaniu o to, aby nie przebić jelita owada.

Należy również pracować sprawnie, aby owad nie ogrzał się i nie zaczął wiercić podczas utrzymywania go do iniekcji. Wstrzyknąć 10 µl zawiesiny komórkowej do owada pod kątem mniejszym niż 45° za jedną z odnóży brzusznych. Dbając o to, aby nie przebić jelita, wstrzyknąć zawartość tuż pod warstwę naskórka.

Po wstrzyknięciu do każdego owada pierwszego szczepu bakterii, ponownie wysiej rozcieńczenia od 10⁻² do 10⁻⁶, tym razem w centralnej części płytki. Pozostaw je do spłynięcia w stronę dołu płytki. Następnie inkubuj płytki w odpowiedniej temperaturze, a potem policz kolonie, aby określić liczbę komórek w inokulum.

Po powtórzeniu procesu rozcieńczania, wysiewania i iniekcji dla każdego szczepu bakterii, wstrzyknij sterylny PBS trzem do pięciu owadom w celu utworzenia grupy kontrolnej negatywnej. Następnie inkubuj wszystkie owady w temperaturze 26 °C przy fotoperiodzie 16 godzin światła i 8 godzin ciemności. Na koniec monitoruj przeżywalność owadów w czasie po iniekcjach; w trakcie infekcji, przed śmiercią, u owadów często występuje utrata apetytu, wodnista, żółta biegunka, zmiany w odchodach i/lub utrata wody.

Śmierć owada definiuje się jako brak ruchów dobrowolnych po stymulacji. W tym teście owadom wstrzyknięto około 50 jednostek tworzących kolonie szczepu dzikiego lub osłabionego szczepu mutanty Xer Haus NLA wyhodowanego do średniej fazy logarytmicznej. Owady obserwowano przez około 72 godziny i odnotowywano odsetek wstrzykniętych osobników, które w każdym punkcie czasowym wciąż żyły.

W tym eksperymencie szczep atenuowany wykazał wyraźne opóźnienie w zabijaniu owadów, podczas gdy szczep typu dzikiego zabił wszystkie sześć larw w ciągu 30 godzin po iniekcji, zanim doszło do śmierci którejkolwiek z larw zakażonych mutantem. Uzyskane dane są statystycznie istotne. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak ekstrakcja RNA i ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład w celu ustalenia, czy bakteria jest w stanie manipulować odpowiedzią immunologiczną owada.