Name: Hodowla i wstrzykiwanie larw Manduca sexta w celu oceny zjadliwości bakterii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Poznaj metodę oceny zjadliwości bakterii w larwach Manduca sexta poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie do hemocelu. Technika ta pozwala precyzyjnie badać interakcje gospodarz-patogen i określać różnice w wirulencji szczepów bakteryjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować byłym członkom laboratorium Goodrich-Blair: Samanthy Orchard, Kimberly Cowles, Erin Herbert-Tran, Gregowi Richardsowi, Megan Menard oraz Youngjin Park za ich wkład w opracowanie niniejszego protokołu. Praca ta była finansowana z grantu National Science Foundation IOS-0950873 oraz stypendium National Institutes of Health NRSA FAI084441Z.

1. Sterylizacja i hodowla jaj owadów
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę, najpierw autoklawując 15 g dostarczonego agaru w 900-1000 ml H2O. Bezpośrednio po autoklawowaniu wymieszać z 166 g pożywki z zarodkami pszenicy i dokładnie zmiksować w blenderze laboratoryjnym. Przelać do naczynia (lub naczyń) w celu schłodzenia, następnie przenieść pożywkę na folię aluminiową, szczelnie zawinąć i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po otrzymaniu jaj M. sexta, wysterylizować je za pomocą 250 ml 0,6% roztworu wybielacza przez 2-3 min w aparaturze składającej się ze szklanego uchwytu do filtrów i kolby próżniowej z papierem filtrującym o średnicy 90 mm, okresowo mieszając.</li>
	<li>Włączyć pompę próżniową, aby odprowadzić roztwór wybielacza, a następnie przemyć jaja 3-4 razy, używając za każdym razem 250 ml sterylnej wody destylowanej H2O.</li>
	<li>Przenieść jaja na świeży papier filtrujący o średnicy 90 mm umieszczony w pokrywce szalki Petriego i pozostawić do wyschnięcia, aż przestaną się do siebie kleić (około 20-30 min).</li>
	<li>Przenieść jaja na dno plastikowych pojemników z pożywką dla owadów, umieszczając około 40 jaj w każdym pojemniku (Rycina 1A). Jaja należy oddzielić od pożywki, aby zapobiec zanieczyszczeniu grzybiczemu wywołanemu przez wilgoć. Przechowywać jaja w temperaturze 26 °C przy fotoperiodzie 16 h światła : 8 h ciemności. Przed wykluciem jaja zmienią kolor na żółto-biały.</li>
	<li>Po zakończeniu wykluwania ostrożnie przenieść około 25 larw do nowych pojemników z pożywką na dnie (Rycina 1B). Ważne jest, aby chwytać każdą larwę pęsetą za długi czarny róg, aby uniknąć ich uszkodzenia podczas wczesnych, delikatnych stadiów rozwojowych. Inkubować przez 2 dni w warunkach opisanych powyżej. Choć śmierć larw na tym etapie jest rzadka, mogą zaobserwować niektóre osobniki martwe lub, co bardziej prawdopodobne, zahamowane w rozwoju. Takie owady należy wykluczyć z dalszych badań i uśmiercić poprzez zamrożenie.</li>
	<li>Aby uniknąć kanibalizmu, przenieść larwy do indywidualnych pojemników z niewielkimi porcjami pokarmu (Rycina 1C) i inkubować jak wyżej. Monitorować rozwój owadów, wymieniając pokarm i usuwając odchody z pojemników co drugi dzień, aż do trzeciego linienia larwalnego (zazwyczaj 6-9 dni po wykluciu). Jest to stadium 4go stadium larwalnego, charakteryzujące się pojawieniem się czarnych, haczykowatych kroczków (crochets) na każdej nodze brzusznej oraz wyraźniejszymi pasami wzdłuż ciała owada (Rycina 1D). Larwy mogą znacznie różnić się rozmiarem, ale zazwyczaj ważą 0,15-0,4 g w momencie wejścia w 4te stadium. Do iniekcji należy wybrać larwy o podobnej wielkości.</li>
</ol>
2. Przygotowanie bakterii do iniekcji
<ol>
	<li>Hodować badane szczepy bakteryjne zgodnie ze standardowymi procedurami do fazy wzrostu, którą zamierza się poddać badaniu.</li>
	<li>Zeskupić 500 μl każdego badanego szczepu bakteryjnego poprzez wirowanie przez 2 min w mikrowirówce przy 13,000 rpm w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Resuspender komórki w 1 ml sterylnego 1x roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS), a następnie ponownie zeskupić zgodnie z powyższą procedurą.</li>
	<li>Resuspender komórki w 0,5 ml sterylnego 1x PBS i zmierzyć gęstość optyczną (OD) zawiesiny. W razie potrzeby rozcieńczyć wszystkie zawiesiny do tej samej wartości OD. Jeśli jest to preferowane, do resuspensji i rozcieńczania komórek zamiast 1x PBS można użyć sterylnych pożywek wzrostowych.</li>
</ol>
3. Iniekcja larw w 4tym stadium rozwojowym
<ol>
	<li>Przygotować seryjne rozcieńczenia 10-krotne pierwszego szczepu bakterii w 6 dołkach płytki mikrotitracyjnej 96-dołkowej w sterylnym 1x PBS, używając nowej końcówki pipety do każdego rozcieńczenia (Rycina 2A). Końcowa objętość zawiesiny komórkowej w każdym dołku powinna przekraczać objętość wymaganą do iniekcji (10 μl na owada) plus 20 μl na wysianie inokulum (patrz kroki 3.2 i 3.7).</li>
	<li>Nanieść po 10 μl dla 5 rozcieńczeń (od 10-2 do 10-6) wzdłuż górnej krawędzi szalki Petriego zawierającej odpowiednią pożywkę wzrostową. Przechylić szalkę tak, aby krople rozprzestrzeniły się w kierunku środka (Rycina 2B).</li>
	<li>Usunąć pokarm i odchody owadów, a następnie umieścić owady w pojemnikach na lodzie na około 5 min.</li>
	<li>Zsterylizować igłę strzykawki, płucząc ją 3 razy w każdej z 2 probówek z 70-100% etanolem, a następnie raz w probówce ze sterylną H2O (Rycina 2C). Objętość cieczy musi być wystarczająca, aby całkowicie zanurzyć igłę.</li>
	<li>Oznaczyć ilość komórek w rozcieńczonych zawiesinach pod mikroskopem przy użyciu komory countingowej (hemocytometru). W zależności od pożądanego inokulum, pobrać 10 μl z odpowiedniego dołka płytki mikrotitracyjnej (Rycina 2D).</li>
	<li>Przetrzeć powierzchnię owada 95% etanolem i wstrzyknąć 10 ml zawiesiny komórkowej do owada pod kątem (mniejszym niż 45°) za jedną z odnóży brzusznych. Należy uważać, aby nie przebić jelita i wstrzyknąć zawartość tuż pod warstwę epidermy (Rycina 2E). Chociaż pewna utrata hemolimfy (przezroczysty, zielono-niebieski płyn) jest normalna, pojawienie się materii cząsteczkowej i żółtego płynu w miejscu iniekcji świadczy o przebiciu jelita. W takim przypadku należy uśmiercić owada i pobrać nową larwę na jego zastąpienie.</li>
	<li>Powtórzyć krok 3.6 dla każdego pozostałego owada w pierwszej grupie iniekcyjnej. Sterylizacja igły nie jest konieczna między owadami iniekowanymi tym samym rozcieńczeniem i szczepem bakterii, chyba że dojdzie do zanieczyszczenia. Alternatywnie, w celu uzyskania większej spójności objętości iniekcji między próbkami, można zastosować dozownik wielokrotny.</li>
	<li>Po iniekcji każdego owada pierwszym szczepem bakterii powtórzyć krok 3.2, tym razem nanosząc zawiesiny komórkowe na środku szalki i pozwalając im spłynąć w dół (Rycina 2F). Inkubować szalki w odpowiedniej temperaturze i przeliczyć kolonie, aby określić liczbę komórek w inokulum. Ten drugi etap wysiewu służy do weryfikacji, czy próbki nie zostały zanieczyszczone podczas procesu iniekcji, co objawiłoby się rozbieżnością w liczbie kolonii między pierwszym a drugim wysiewem.</li>
	<li>Powtórzyć kroki od 3.1 do 3.8 dla każdego szczepu bakterii w eksperymencie. Na koniec wstrzyknąć 3-5 owadom sterylną 1x PBS za pomocą sterylnej igły jako grupę kontrolną negatywną. Inkubować owady w temperaturze 26 °C z fotoperiodem 16 h światła : 8 h ciemności.</li>
	<li>Monitorować przeżywalność owadów w czasie po iniekcji. Śmierć owada definiuje się jako brak ruchów dobrowolnych po stymulacji. Owady podczas infekcji przed śmiercią często wykazują utratę apetytu, biegunkę (wodniste, żółte odchody) i/lub utratę wody („pocenie się”); cechy te również mogą być warto odnotować.</li>
</ol>

<ol><li>Bintrim, S. B., Ensign, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+inactivation+of+genes+encoding+the+crystalline+inclusion+proteins+of+Photorhabdus+luminescens+results+in+mutants+with+pleiotropic+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Insertional inactivation of genes encoding the crystalline inclusion proteins of Photorhabdus luminescens results in mutants with pleiotropic phenotypes.</a> J. Bacteriol. 180, 1261-1269 (1998).</li>
<li>Schesser, J. H., Kramer, K. J., Bulla, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioassay+for+homogeneous+parasporal+crystal+of+Bacillus+thuringiensis+using+the+tobacco+hornworm%2C+Manduca+sexta%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bioassay for homogeneous parasporal crystal of Bacillus thuringiensis using the tobacco hornworm, Manduca sexta.</a> Appl. Environ. Microbiol. 33, 878-880 (1977).</li>
<li>Péchy-Tarr, M., Bruck, D. J., Maurhofer, M., Fischer, E., Vogne, C., Henkels, M. D., Donahue, K. M., Grunder, J., Loper, J. E., Keel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+a+novel+gene+cluster+encoding+an+insect+toxin+in+plant-associated+strains+of+Pseudomonas+fluorescens%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of a novel gene cluster encoding an insect toxin in plant-associated strains of Pseudomonas fluorescens.</a> Environ. Microbiol. 10, 2368-2386 (2008).</li>
<li>Nuñez-Valdez, M. E., Calderón, M. A., Aranda, E., Hernández, L., Ramírez-Gama, R. M., Lina, L., Rodríguez-Segura, Z., Gutiérrez Mdel, C., Villalobos, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+putative+Mexican+strain+of+Serratia+entomophila+pathogenic+against+root-damaging+larvae+of+Scarabaeidae+%28Coleoptera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of a putative Mexican strain of Serratia entomophila pathogenic against root-damaging larvae of Scarabaeidae (Coleoptera).</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 802-810 (2008).</li>
<li>Forst, S. A., Tabatabai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+histidine+kinase%2C+EnvZ%2C+in+the+production+of+outer+membrane+proteins+in+the+symbiotic-pathogenic+bacterium+Xenorhabdus+nematophilus%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Role of the histidine kinase, EnvZ, in the production of outer membrane proteins in the symbiotic-pathogenic bacterium Xenorhabdus nematophilus.</a> Appl. Environ. Microbiol. 63, 962-968 (1997).</li>
<li>Kanost, M. R., Jiang, H., Yu, X. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+responses+of+a+lepidopteran+insect%2C+Manduca+sexta%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Innate immune responses of a lepidopteran insect, Manduca sexta.</a> Immunol. Rev. 198, 97-105 (2004).</li>
<li>Yu, X. Q., Zhu, Y. F., Ma, C., Fabrick, J. A., Kanost, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+recognition+proteins+in+Manduca+sexta+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Pattern recognition proteins in Manduca sexta plasma.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1287-1293 (2002).</li>
<li>Eleftherianos, I., ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Dowling, A. J., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+immune+response+to+the+entomopathogen+Photorhabdus%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Dissecting the immune response to the entomopathogen Photorhabdus.</a> Trends Microbiol. 18, 552-560 (2010).</li>
<li>Tobacco Hornworm Genome Project [Internet]. , Baylor College of Medicine. Houston, TX. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/content/tobacco-hornworm-genome-project">http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/content/tobacco-hornworm-genome-project</a> (2012).</li>
<li>Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Friend+and+foe%3A+the+two+faces+of+Xenorhabdus+nematophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Friend and foe: the two faces of Xenorhabdus nematophila.</a> Nat. Rev. Microbiol. 5, 634-646 (2007).</li>
<li>D'Argenio, D. A., Gallagher, L. A., Berg, C. A., Manoil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+model+host+for+Pseudomonas+aeruginosa+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a model host for Pseudomonas aeruginosa Infection.</a> J. Bacteriol. 183, 1466-1471 (2001).</li>
<li>Waterfield, N., Dowling, A., Sharma, S., Daborn, P. J., Potter, U., Ffrench-Constant, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+toxicity+of+Photorhabdus+luminescens+W14+toxin+complexes+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Oral toxicity of Photorhabdus luminescens W14 toxin complexes in Escherichia coli.</a> Appl. Environ. Microbiol. 67, 5017-5024 (2001).</li>
<li>Park, Y., Herbert, E. E., Cowles, C. E., Cowles, K. N., Menard, M. L., Orchard, S. S., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+variation+in+Xenorhabdus+nematophila+virulence+and+suppression+of+Manduca+sexta+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Clonal variation in Xenorhabdus nematophila virulence and suppression of Manduca sexta immunity.</a> Cell. Microbiol. 9, 645-656 (2007).</li>
<li>Park, Y., Kim, Y., Putnam, S. M., Stanley, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bacterium+Xenorhabdus+nematophilus+depresses+nodulation+reactions+to+infection+by+inhibiting+eicosanoid+biosynthesis+in+tobacco+hornworms%2C+Manduca+sexta%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Insect+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The bacterium Xenorhabdus nematophilus depresses nodulation reactions to infection by inhibiting eicosanoid biosynthesis in tobacco hornworms, Manduca sexta.</a> Arch. Insect Biochem. Physiol. 52, 71-80 (2003).</li>
<li>Cowles, K. N., Cowles, C. E., Richards, G. R., Martens, E. C., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+regulator+Lrp+contributes+to+mutualism%2C+pathogenesis+and+phenotypic+variation+in+the+bacterium+Xenorhabdus+nematophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The global regulator Lrp contributes to mutualism, pathogenesis and phenotypic variation in the bacterium Xenorhabdus nematophila.</a> Cell. Microbiol. 9, 1311-1323 (2007).</li>
<li>Cowles, K. N., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+activity+of+a+Xenorhabdus+nematophila+haemolysin+required+for+full+virulence+towards+Manduca+sexta+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Expression and activity of a Xenorhabdus nematophila haemolysin required for full virulence towards Manduca sexta insects.</a> Cell. Microbiol. 7, 209-219 (2005).</li>
<li>Goodrich-Blair, H., Clarke, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutualism+and+pathogenesis+in+Xenorhabdus+and+Photorhabdus%3A+two+roads+to+the+same+destination%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mutualism and pathogenesis in Xenorhabdus and Photorhabdus: two roads to the same destination.</a> Mol. Microbiol. 64, 260-268 (2007).</li>
<li>Eleftherianos, I., Baldwin, H., ffrench-Constant, R. H., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+modulation+of+immunity%3A+changes+within+the+feeding+period+of+the+fifth+larval+stage+in+the+defence+reactions+of+Manduca+sexta+to+infection+by+Photorhabdus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Developmental modulation of immunity: changes within the feeding period of the fifth larval stage in the defence reactions of Manduca sexta to infection by Photorhabdus.</a> J. Insect Physiol. 54, 309-318 (2008).</li>
<li>Kavanagh, K., Reeves, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+the+potential+of+insects+for+in+vivo+pathogenicity+testing+of+microbial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Exploiting the potential of insects for in vivo pathogenicity testing of microbial pathogens.</a> FEMS Microbiol. Rev. 28, 101-112 (2004).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Bezpośredni wtrysk bakterii entomopatogennych do larw M. sexta, opisany w niniejszej procedurze, stanowi prosty i skuteczny sposób analizy wirulencji bakterii. Metoda ta jest również wysoce adaptowalna do różnych obiektów badawczych i/lub warunków doświadczalnych. Bakterie mogą być przygotowywane na różne sposoby przed iniekcją. W przypadku X. nematophila, komórki typu dzikiego hodowane w bogatym w składniki odżywcze medium Luria-Bertani (LB) do środkowej fazy logarytmicznej są zazwyczaj najbardziej wir...

<table><tbody><tr><td>papier filtracyjny 90 mm</td><td>Whatman</td><td>1001 090</td><td></td></tr><tr><td>szklany uchwyt do filtra</td><td>Millipore</td><td>XX1004700</td><td></td></tr><tr><td>jaja &lt;em&gt;Manduca sexta&lt;/em&gt;</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>143880</td><td></td></tr><tr><td>pożywka dla ćmy jedwabnika + agar</td><td>MP Biomedicals</td><td>0296029301</td><td></td></tr><tr><td>plastikowe pojemniki i pokrywki 5,5 oz.</td><td>Solo Cup Company</td><td>URC55-0090 Pl4-0090</td><td></td></tr><tr><td>plastikowe pojemniki i pokrywki 1 oz.</td><td>DART Container Corporation</td><td>100PC 100PCL25</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td></td><td></td><td>137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 1,46 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, pH 7,4</td></tr><tr><td>strzykawka</td><td>Hamilton</td><td>80208</td><td>rozmiar igły 30 G, długość 0,375&quot;, typ końcówki 2</td></tr></tbody></table>

hodowla i iniekcja larw manduca sexta w celu oceny wirulencji bakterii

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Manduca sexta, znana powszechnie jako omacnica tytoniowa, jest uważana za istotnego szkodnika rolniczego, żerującego na roślinach psiankowatych, w tym na tytoniu i pomidorach. Podatność larw M. sexta na szereg entomopatogennych gatunków bakterii1-5, a także bogactwo dostępnych informacji na temat układu odpornościowego tego owada6-8 oraz oczekiwana sekwencja genomu9 sprawiają, że jest on dobrym organizmem modelowym do badania interakcji gospodarz-mikrob podczas patogenezy. Ponadto larwy M. sexta są stosunkowo duże, łatwe w manipulacji i utrzymaniu w warunkach laboratoryjnych w porównaniu z innymi podatnymi gatunkami owadów. Ich duży rozmiar ułatwia również efektywną ekstrakcję tkanek/hemolimfy w celu analizy odpowiedzi gospodarza na infekcję.
Metoda przedstawiona w niniejszej pracy opisuje bezpośrednie wstrzykiwanie bakterii do hemocelu (jamni krwi) larw M. sexta . Podejście to można wykorzystać do analizy i porównania charakterystyki wirulencji różnych gatunków, szczepów lub mutantów bakterii poprzez proste monitorowanie czasu do śmierci owada po iniekcji. Metoda ta została opracowana w celu zbadania patogenności gatunków Xenorhabdus oraz Photorhabdus , które zazwyczaj wiążą się z wektorami z rodzaju nicieni, aby uzyskać dostęp do organizmu owada. Nicienie entomopatogenne zazwyczaj infekują larwy poprzez naturalne otwory pokarmowe lub oddechowe, a następnie uwalniają symbiotyczne bakterie do hemolimfy (krwi) owada10. Opisana tutaj metoda iniekcji eliminuje konieczność stosowania wektora w postaci nicienia, oddzielając tym samym wpływ bakterii i nicieni na owada. Metoda ta pozwala na dokładne wyliczenie materiału zakaźnego (komórek lub białka) w inokulum, co nie jest możliwe przy zastosowaniu innych istniejących metod analizy entomopatogenezy, w tym metody nacinania11 oraz testów toksyczności doustnej12. Ponadto testy toksyczności doustnej odnoszą się do wirulencji wydzielanych toksyn wprowadzanych do układu pokarmowego larw, podczas gdy metoda bezpośredniej iniekcji pozwala ocenić wirulencję inokulum w postaci całych komórek.
Użyteczność metody bezpośredniej iniekcji, opisanej w niniejszym opracowaniu, polega na analizie patogenezy bakteryjnej poprzez monitorowanie śmiertelności owadów. Metodę tę można jednak łatwo rozszerzyć w celu badania wpływu infekcji na układ odpornościowy M. sexta. Owad reaguje na infekcję zarówno poprzez odpowiedzi humoralne, jak i komórkowe. Odpowiedź humoralna obejmuje rozpoznawanie wzorców związanych z bakteriami i następującą po nim produkcję różnych peptydów przeciwdrobnoustrojowych7; ekspresję genów kodujących te peptydy można monitorować po bezpośredniej infekcji poprzez ekstrakcję RNA i ilościowy PCR13. Komórkowa odpowiedź na infekcję obejmuje tworzenie guzków, enkapsulację i fagocytozę czynników zakaźnych przez hemocyty6. Aby przeanalizować te odpowiedzi, zainfekowane owady można poddać sekcji i ocenić za pomocą mikroskopii13, 14.

Reprezentatywny przykład testu śmiertelności owadów przedstawiono na Rysunku 3. W tym eksperymencie owadom wstrzyknięto około 50 jednostek tworzących kolonie (CFU) szczepu dzikiego (ATCC19061) lub osłabionego szczepu mutanta (lrp13) Xenorhabdus nematophila wyhodowanego do średniej fazy logarytmicznej (n=6 owadów na szczep). Owady obserwowano przez około 72 hr, a w każdym punkcie czasowym odnotowywano procent wstrzykniętych owadów, które nadal żyły. W tym przypadku szczep osła...

Opisana tutaj metoda wykorzystuje bezpośrednią iniekcję bakterii entomopatogennych do hemocelu larw owada Manduca sexta. M. sexta jest owadem dostępnym komercyjnie i dobrze przebadanym. W związku z tym metoda ta stanowi proste podejście do analizy interakcji gospodarz-bakteria z perspektywy jednego lub obu partnerów.

Hodowla i iniekcja larw Manduca sexta w celu oceny wirulencji bakterii

*Manduca sexta*, powszechnie znana jako omacnica tytoniowa, jest uznawana za istotnego szkodnika rolniczego, żywiącego się roślinami psiankowatymi, w tym tytoniem i...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ocena patogenności bakterii wobec larw owadów z wykorzystaniem manduka seca jako organizmu modelowego. Cel ten osiąga się poprzez najpierw hodowlę larw owadów z wysterylizowanych jaj do czwartego stadium rozwojowego. W drugim kroku przygotowuje się próbki bakteryjne do iniekcji.Następnie bakterie wstrzykuje się larwom czwartego stadium *Manduka seca*. W ostatnim kroku monitoruje się śmiertelność owadów w czasie po iniekcji. Ostatecznie rejestruje się czas do śmierci owadów, który służy do oceny wirulencji bakterii.Ta metoda może pomóc w rozwiązaniu kluczowych kwestii w dziedzinie symbiozy, w tym w odkrywaniu nowych patogenów owadów oraz określaniu różnic w zjadliwości pomiędzy gatunkami lub szczepami bakterii. Należy rozpocząć od autoklawowania 15 gramów augera w 900 do 1000 mililitrach wody. Bezpośrednio po autoklawowaniu.Wymieszaj świder z 166 gramami diety na bazie zarodków pszenicy. Za pomocą blendera laboratoryjnego przelej zblendowaną dietę dla owadów do naczynia. Po ochłodzeniu przenieś dietę z naczynia na kawałek folii aluminiowej.Owiń szczelnie i przechowuj w temperaturze 4°C. Po dostarczeniu umieść jaja M sex w aparaturze składającej się ze szklanego uchwytu do filtrów i kolby próżniowej z papierem filtrowanym o średnicy 90 mm. Następnie wlej 250 ml 0,6% roztworu wybielacza na jaja na okres od dwóch do trzech minut, okazjonalnie mieszając.Następnie należy włączyć próżnię, aby odprowadzić roztwór wybielacza, a następnie przemyć wysterylizowane jaja od trzech do czterech razy, używając 250 ml sterylnej wody destylowanej na każde płukanie. Następnie należy umieścić nowy fragment papieru filtracyjnego o długości 90 mm w pokrywce szalki Petriego, a następnie przenieść jaja na papier filtracyjny i pozostawić je do wyschnięcia w komorze z laminarnym przepływem powietrza, aż przestaną się do siebie przyklejać. Teraz należy umieścić świeżo przygotowaną pożywkę dla owadów na zabezpieczonym korku gumowym w kilku plastikowych pojemnikach i przenieść około 40 jaj do każdego pojemnika, oddzielając jaja od pożywki, aby zapobiec zapobiegnąć kontaminacji grzybiczej wywołanej wilgocią.Przechowywać jaja w temperaturze 26°C przy 16-godzinnym okresie światła i 8-godzinnym okresie ciemności. Przed wykluciem jaja nabiorą żółtawo-białego koloru. Za pomocą pęsety, chwytając każdą z larw za długi czarny róg, ostrożnie przenieść około 25 larw do każdego z nowych pojemników z pożywką na dnie.Inkubuj larwy przez dwa dni w tych samych warunkach, co w przypadku jaj; choć śmierć larw na tym etapie jest rzadka, mogą zaobserwować niektóre martwe lub, co bardziej prawdopodobne, zahamowane w rozwoju osobniki. Następnie przenieś larwy do oddzielnych pojemników z niewielkimi porcjami pokarmu, aby uniknąć kanibalizmu, i ponownie poddaj je inkubacji. Wymieniaj pokarm i usuwaj odchody z pojemników co drugi dzień, aż owady przejdą trzecią linienie larwalną.Trzecie linienie larwalne prowadzi do czwartego stadium larwalnego, które charakteryzuje się pojawieniem się czarnych, haczykowatych crochetów na każdym prolegu oraz wyraźniejszymi prążkami wzdłuż ciała owada. Po wyhodowaniu odpowiednich szczepów bakterii do testów, odwiruj 500 µL każdego szczepu bakteryjnego przez dwie minuty w mikrowirówce przy 17 000 ×g w temperaturze pokojowej. Następnie przemyj osady w 1 mL sterylnego PBS w tych samych warunkach.Po ponownym zawieszeniu komórek w kolejnych 0,5 ml sterylnego PBS należy zmierzyć gęstość optyczną zawiesin. Przed rozpoczęciem iniekcji, używając nowej końcówki pipety dla każdego rozcieńczenia, należy przygotować sześć dziesięciokrotnych rozcieńczeń seryjnych pierwszego szczepu bakterii w sterylnym PBS na 96-dołkowej płytce mikrotitracyjnej. Następnie należy nanieść po 10 µL każdego rozcieńczenia, od 10⁻² do 10⁻⁶, wzdłuż górnej krawędzi szalki Petriego zawierającej odpowiednią pożywkę wzrostową. Potem należy przechylić płytkę tak, aby naniesione krople rozprzestrzeniły się w kierunku centrum.Następnie, po usunięciu pożywki i odchodów owadów, umieść pojemniki z owadami na lodzie na około pięć minut, aby uległy schłodzeniu. Przepłucz igłę strzykawki trzykrotnie w dwóch probówkach z 70-100% ethanol oraz raz w probówce z wodą sterylną. Następnie użyj hemocytometru, aby określić ilość komórek w rozcieńczonych zawiesinach pod mikroskopem.W zależności od pożądanej ilości inokulum, pobierz 10 µL z odpowiedniej dołki mikropłytki. Następnie przemyj powierzchnię owada przeznaczonego do iniekcji 95% etanolem. Najtrudniejszym etapem jest utrzymanie owada w odpowiedniej pozycji do iniekcji przy jednoczesnym manipulowaniu igłą i dbaniu o to, aby nie przebić jelita owada.Należy również pracować sprawnie, aby owad nie ogrzał się i nie zaczął wiercić podczas utrzymywania go do iniekcji. Wstrzyknąć 10 µl zawiesiny komórkowej do owada pod kątem mniejszym niż 45° za jedną z odnóży brzusznych. Dbając o to, aby nie przebić jelita, wstrzyknąć zawartość tuż pod warstwę naskórka.Po wstrzyknięciu do każdego owada pierwszego szczepu bakterii, ponownie wysiej rozcieńczenia od 10⁻² do 10⁻⁶, tym razem w centralnej części płytki. Pozostaw je do spłynięcia w stronę dołu płytki. Następnie inkubuj płytki w odpowiedniej temperaturze, a potem policz kolonie, aby określić liczbę komórek w inokulum.Po powtórzeniu procesu rozcieńczania, wysiewania i iniekcji dla każdego szczepu bakterii, wstrzyknij sterylny PBS trzem do pięciu owadom w celu utworzenia grupy kontrolnej negatywnej. Następnie inkubuj wszystkie owady w temperaturze 26 °C przy fotoperiodzie 16 godzin światła i 8 godzin ciemności. Na koniec monitoruj przeżywalność owadów w czasie po iniekcjach; w trakcie infekcji, przed śmiercią, u owadów często występuje utrata apetytu, wodnista, żółta biegunka, zmiany w odchodach i/lub utrata wody.Śmierć owada definiuje się jako brak ruchów dobrowolnych po stymulacji. W tym teście owadom wstrzyknięto około 50 jednostek tworzących kolonie szczepu dzikiego lub osłabionego szczepu mutanty Xer Haus NLA wyhodowanego do średniej fazy logarytmicznej. Owady obserwowano przez około 72 godziny i odnotowywano odsetek wstrzykniętych osobników, które w każdym punkcie czasowym wciąż żyły.W tym eksperymencie szczep atenuowany wykazał wyraźne opóźnienie w zabijaniu owadów, podczas gdy szczep typu dzikiego zabił wszystkie sześć larw w ciągu 30 godzin po iniekcji, zanim doszło do śmierci którejkolwiek z larw zakażonych mutantem. Uzyskane dane są statystycznie istotne. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak ekstrakcja RNA i ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład w celu ustalenia, czy bakteria jest w stanie manipulować odpowiedzią immunologiczną owada.

rearing-injection-manduca-sexta-larvae-to-assess-bacterial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Hodowla i wstrzyknięcie larw Manduca sexta w celu oceny wirulencji bakterii

Przezroczyste zarodki rybek danio-ostrolepisnych okazały się użytecznymi modelami gospodarzy do wizualizacji i funkcjonalnego badania oddziaływań między komórkami odporności wrodzonej a wewnątrzkomórkowymi patogenami bakteryjnymi, takimi jak Salmonella typhimurium oraz Mycobacterium marinum. Mikrowstrzykiwanie bakterii oraz wielobarwne obrazowanie fluorescencyjne to kluczowe techniki stosowane w modelach infekcji zarodków rybek danio-ostrolepisnych.

Zakażanie zarodków danio pręgowanego wewnątrzkomórkowymi patogenami bakteryjnymi

Opisano doustną i wewnątrzhemokoliczną infekcję larw mchowca dużego Galleria mellonella. Owad ten może być wykorzystywany do badania czynników wirulencji bakterii entomopatogennych, a także oportunistycznych bakterii ssaków. Opisano hodowlę owadów, metody infekcji oraz przykłady analiz in vivo.

Owad Galleria mellonella jako potężny model infekcji do badania patogenezy bakteryjnej

Źródło: Bernut, A. i in., Rozszyfrowanie i obrazowanie patogenezy oraz układania korzeni Mycobacterium abscessus w embrionach danio pręgowanego. J. Vis. Exp. (2015).Ten film pokazuje protokół izolowania i ilościowego określania ropnia Mycobacterium z zakażonego zarodka danio pręgowanego. Procedura obejmuje eutanazję zarodków, lizę tkanek oraz homogenizację w celu uwolnienia bakterii, a następnie wirowanie i ponowną zawiesinę w buforze powierzchniowo czynnym. Na koniec zawiesina bakteryjna jest...

Izolacja i hodowla bakterii z zarodków danio dano w celu oceny obciążenia infekcją

Ten film demonstruje metodę tworzenia modelu infekcji Mycobacterium bovis u larw woskowej większej, Galleria mellonella. Bioluminescencyjny szczep Mycobacterium bovis BCG jest wstrzykiwany do hemolimfy larwy w celu wywołania infekcji, a bioluminescencja jest mierzona w określonych odstępach czasu w celu zbadania postępu infekcji.

Technika tworzenia modelu infekcji bakteryjnej u larw owadów

Ten film prezentuje pomiar obciążenia bakteryjnego in vivo za pomocą Bacillus Calmette-Guérin, BCG, larw owadów zakażonych luksem. Proces obejmuje homogenizację larw, traktowanie substratem lucyferazy i pomiar bioluminescencji w celu określenia względnych jednostek światła, które korelują z obciążeniem bakteryjnym.

Pomiar obciążenia in vivo bakteriami eksprymującymi lucyferazy w larwie owada

Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół dla modelu doustnego podawania z użyciem larw Galleria mellonella i jak scharakteryzować indukowane wrodzone reakcje immunologiczne. Korzystając z tego protokołu, naukowcy bez praktycznego doświadczenia będą mogli stosować metodę wymuszonego karmienia G. mellonella.

Model doustnego podawania Galleria mellonella do badania wrodzonych odpowiedzi immunologicznych wywołanych komensalem

Tutaj prezentujemy protokół wstrzykiwania jaj świerszczy, technikę, która służy jako podstawowa metoda w wielu eksperymentach na świerszczu, w tym, ale nie tylko, interferencji RNA i manipulacji genomem.

Wstrzykiwanie jaj Gryllus bimaculatus

Ten artykuł przedstawia protokół do badania wpływu poszczególnych bakterii jelitowych komarów, w tym izolację i identyfikację mikrobów hodowlanych w jelicie środkowym komarów, antybiotykowe zubożenie bakterii jelitowych komarów i ponowne wprowadzenie jednego konkretnego gatunku bakterii.

Bakteryjny test żywienia doustnego z komarami leczonymi antybiotykami

Ten protokół opisuje procedury mikroiniekcji dla zarodków Culex quinquefasciatus, które są zoptymalizowane do pracy z narzędziami do edycji genów CRISPR/Cas9. Technika ta może skutecznie generować specyficzne dla danego miejsca, dziedziczne mutacje linii zarodkowej, które można wykorzystać do budowy technologii genetycznych w tym niedostatecznie zbadanym wektorze choroby.

Techniki mikroiniekcji zarodków w celu skutecznej mutagenezy specyficznej dla miejsca w Culex quinquefasciatus

Dorosłe muchy Drosophila melanogaster były szeroko wykorzystywane jako organizmy modelowe do badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw wrodzonych odpowiedzi immunologicznych gospodarza i strategii infekcji mikrobiologicznej. Aby promować stadium larwy D. melanogaster jako dodatkowy lub alternatywny system modelowy, opisano technikę iniekcji larw.

Drosophila melanogaster (Drosophila melanogaster) Protokół wstrzyknięcia larw

Poznaj metodę oceny zjadliwości bakterii w larwach Manduca sexta poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie do hemocelu. Technika ta pozwala precyzyjnie badać interakcje gospodarz-patogen i określać różnice w wirulencji szczepów bakteryjnych.

Hodowla i iniekcja larw Manduca sexta w celu oceny wirulencji bakterii

Przeglądaj więcej filmów