Name: Test płytki nazębnej na obecność mysiego norowirusa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Poznaj metodę płytki nazębnej do ilościowego oznaczania zakaźnych cząstek wirusa MNV w hodowlach makrofagów mysich RAW 264.7. Ta technika umożliwia badaczom badanie dynamiki infekcji norowirusowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom laboratorium Wobusa za krytyczne uwagi i sugestie. Praca w laboratorium CEW była finansowana ze środków startowych Uniwersytetu Michigan, grantu na rozwój kariery z Regionalnego Centrum Doskonałości w dziedzinie Bio-obrony i Badań nad Nowymi Chorobami Zakaźnymi (RCE) w ramach programu NIH/NIAID, Regionalnego Centrum RCE „Great Lakes” w Regionie V (grant NIH 1-U54-AI-057153) oraz z grantu NIH R01 AI080611. M.B.G.-H. była finansowana z grantów szkoleniowych Experimental Immunology (NIH T32 A1007413-16) oraz Molecular Mechanisms in Microbial Pathogenesis (NIH T32 A1007528) przyznanych Uniwersytetowi Michigan. J.B.C. był finansowany przez Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Brasilia, Brazylia.

1. Hodowla linii komórkowej makrofagów RAW 264.7
<ol>
	<li>Hodować komórki RAW 264.7 (ATCC, katalog # TIB-71) w pożywce DMEM-10, składającej się z DMEM z wysoką zawartością glukozy z dodatkiem 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej o niskiej zawartości endotoksyn (&lt; 10 EU/ml), 10 mM HEPES, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 1 mM nieessentialnych aminokwasów oraz 2 mM L-glutaminy. Komórki zazwyczaj hoduje się w kolbach do hodowli tkanek o powierzchni 175 cm2, zawierających 35 ml pożywki na kolbę, inkubując je w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w inkubatorze do hodowli tkanek. Można jednak użyć kolby o dowolnym rozmiarze, stosując objętość pożywki odpowiednią dla wielkości danej kolby.</li>
	<li>W celu pasażowania komórek: odessać starą pożywkę, dodać do komórek 10 ml świeżej pożywki DMEM-10, a następnie zebrać komórki z dna kolby za pomocą skrobaka do komórek. Następnie resuspendować komórki do postaci homogenicznego roztworu, pobierając je do pipety 10 ml i energicznie przeciskając komórki przez końcówkę pipety przyciśniętą do dna kolby. Powtórzyć tę czynność co najmniej 3 razy, aż komórki przestaną tworzyć skupiska. Zweryfikować za pomocą mikroskopii świetlnej, czy uzyskano zawiesinę pojedynczych komórek. Następnie przenieść 1 ml (rozcieńczenie 1:10 lub ~1x107 komórek) – 2 ml (rozcieńczenie 1:5 lub ~2x107 komórek) zawiesiny komórkowej do nowej kolby 175 cm2 i uzupełnić objętość pożywki do 35 ml.</li>
	<li>Pasażować komórki, gdy osiągną niemal pełną konfluencję (~1x108 komórek łącznie na kolbach 175 cm2): co trzy dni przy rozcieńczeniu 1:10 lub co dwa dni przy rozcieńczeniu 1:5. Przed pasażowaniem sprawdzić morfologię komórek za pomocą mikroskopii świetlnej. Większość komórek powinna być okrągła i nieaktywowana. Komórki aktywowane charakteryzują się obecnością ziarnistości i/lub wydłużoną, wrzecionowatą morfologią z wypustkami. Nie dopuszczać do przerośnięcia hodowli, ponieważ takie komórki zazwyczaj nie tworzą plamków. Monitorować numer pasażu i regularnie rozpoczynać hodowlę od nowa, rozmrażając alikwot komórek z niższym numerem pasażu. (Przyjmujemy 30. pasaż jako wartość graniczną).</li>
</ol>
2. Zakażanie komórek RAW 264.7 inokulum MNV
<ol>
	<li>Wysiać komórki RAW 264.7 na płytki 6-dołkowe (średnica 3,5 cm) w gęstości 1x106 żywych komórek/ml w pożywce DMEM-10, dodając 2 ml tej zawiesiny do każdego dołka. Ważne jest, aby równomiernie rozłożyć komórki w dołkach poprzez co najmniej 10-krotne ręczne kołysanie płytkami lub za pomocą aparatu do kołysania przez ok. 10 min. Nie należy kręcić płytkami, ponieważ spowoduje to skupienie się komórek w centrum dołka. Płytki należy umieścić w inkubatorze do hodowli tkanek (w temperaturze 37 °C i 5% CO2). Pozostawić komórki do przyczepienia się przez noc lub przez co najmniej 4 h w 37 °C. Dla testu plackowego komórki powinny osiągnąć 60 - 80% konfluencji i być równomiernie rozmieszczone w całym dołku.</li>
	<li>Następnego dnia przygotować inokulum wirusowe, które może pochodzić z zainfekowanych MNV komórek hodowlanych, z homogenizatów tkanek lub próbek kału od myszy zainfekowanych MNV. W przypadku próbek tkanek, kawałki tkanki wielkości ziarna grochu homogenizuje się w probówkach z nakrętką o pojemności 2 ml zawierających sterylną krzemionkową kulkę w 1 ml DMEM-10 za pomocą homogenizatora tkanek (np. MagnaLyser; Roche). W przypadku próbek kału, nie więcej niż 3 pellety kału należy zhomogenizować w 1 ml pożywki. Wszystkie próbki są następnie zamrażane (w -80 °C) i raz rozmrażane przed wykonaniem testu plackowego.</li>
	<li>Przygotować 10-krotne rozcieńczenia inokulum wirusowego w kompletnej pożywce DMEM-5, która składa się z DMEM/High glucose, 5% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej o niskiej zawartości endotoksyn (&lt; 10 EU/ml), 10 mM HEPES, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 1 mM niezbędnych aminokwasów, 2 mM L-glutaminy.</li>
	<li>Dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne przygotowuje się na płytkach 24-dołkowych: za pomocą pipety wielokanałowej (repeatera) dozuje się 1,35 ml pożywki do wielu dołków, rozcieńczenie 10-1 wykonuje się poprzez zmieszanie 1,35 ml pożywki i 0,15 ml próbki zawierającej wirusa, a następnie 0,15 ml rozcieńczenia 10-1 dodaje się do 1,35 ml pożywki, aby uzyskać rozcieńczenie 10-2 i tak dalej. Ważne jest zmienianie końcówek przy każdym nowym rozcieńczeniu. Do jednoczesnego rozcieńczania wielu próbek można użyć pipety wielokanałowej, gdzie dwie końcówki mieszczą się w jednym dołku płytki 24-dołkowej, przenosząc całkowitą objętość 0,15 ml na dołek (patrz Rycina 3A).</li>
	<li>Typowy zakres rozcieńczeń dla homogenizatów tkanek i treści kału wynosi od 10-1 do 10-3. Jednak placki z tych próbek mają tendencję do bycia mniejszymi w porównaniu z plackami z próbek hodowli tkankowych. Ponadto w niektórych przypadkach konieczne jest 100-krotne rozcieńczenie próbek kału, aby wystarczająco rozcieńczyć toksyczne składniki kału, które mogłyby zniszczyć monowarstwę komórek, utrudniając tym samym liczenie placków. Zakres rozcieńczeń lizatów z hodowli tkankowych zależy od interesującego punktu czasowego w cyklu życia wirusa. W szczycie infekcji może być wymagane rozcieńczenie do 10-9.</li>
	<li>Po przygotowaniu rozcieńczeń seryjnych, płytki 6-dołkowe zawierające monowarstwy RAW 264.7 (z sekcji 2.1) należy opisać nazwą próbki i nanoszonymi rozcieńczeniami. Usuwając pożywkę z jednej płytki na raz (poprzez wylanie lub odessanie), należy natychmiast dodać 0,5 ml rozcieńczonej próbki do dołka, a następnie powtórzyć to w dołku dubletowym, zanim przejdzie się do kolejnego rozcieńczenia. Po dodaniu wszystkich 3 rozcieńczeń do jednej płytki, należy ręcznie przechylać płytkę w przód i w tył, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały pokryte. Należy operować jedną płytką na raz, aby zapobiec wysychaniu komórek.</li>
	<li>Po dodaniu 0,5 ml rozcieńczeń do każdego dołka, ułożyć płytki pionowo w stos i inkubować przez 1 h w temperaturze pokojowej. Ponieważ objętość dodana do każdego dołka nie jest wystarczająca do całkowitego pokrycia monowarstwy, płytki należy delikatnie przechylać ręcznie w przód i w tył co 10-15 min lub umieścić na aparacie do kołysania (~18 oscylacji na min). Zapobiega to wysychaniu komórek.</li>
</ol>
3. Przygotowanie warstwy agarozy o niskiej temperaturze topnienia (SeaPlaque)
Uwaga: zaleca się wcześniejsze przygotowanie kilku butelek z autoklawowanym agaroza SeaPlaque. Agaroza może zostać ponownie roztopiona w kuchence mikrofalowej przed użyciem.
<ol>
	<li>Oblicz ilość warstwy przykrywającej (overlay) wymaganą dla całkowitej objętości płytek przed zakończeniem 1-godzinnej inkubacji. Potrzebna objętość to 2 ml/dołek lub 12 ml/płytka 6-dołkowa. Przygotuj osobno agarozę (patrz sekcja 3.2) oraz pożywkę (patrz sekcja 3.3).</li>
	<li>Aby przygotować agarozę, zawieś 3 g agarozy SeaPlaque w całkowitej objętości 100 ml wody destylowanej (3% w/v) w szklanej butelce. Autoklawuj przez 20-30 min. (Jeśli agaroza została przygotowana wcześniej, ponownie ją rozpuść w mikrofalówce). Ważne jest, aby doprowadzić agarozę SeaPlaque do temperatury 42 °C w kąpieli wodnej przed użyciem, ponieważ zbyt gorąca agaroza zniszczy komórki. Upewnij się, że poziom wody jest równy lub wyższy od poziomu agarozy, aby uniknąć niepożądanego zastygnięcia.</li>
	<li>Aby przygotować pożywkę: sporządź 100 ml pożywki 2x MEM, składającej się z 2x MEM, 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej o niskiej zawartości endotoksyn (&lt; 10 EU/ml), 10 mM HEPES, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny oraz 4 mM L-glutaminy. Doprowadź pożywkę do temperatury 37 °C w kąpieli wodnej.</li>
	<li>Wymieszaj agarozę SeaPlaque oraz pożywkę 2x MEM w sterylnej butelce w stosunku 1:1 bezpośrednio przed nałożeniem na zainfekowane monowarstwy komórek. Jeśli wymagane jest więcej niż 200 ml warstwy przykrywającej, rozdziel objętość do wielu butelek i przechowuj w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C do momentu użycia.</li>
	<li>Po zakończeniu 1-godzinnej inkubacji (patrz sekcja 2.7), odessaj inokulum z każdego dołka. Powoli dodaj 2 ml warstwy przykrywającej do krawędzi każdego dołka, przykładając końcówkę pipety do ścianki dołka. Jednocześnie można przetwarzać do 5 płytek, aby zapobiec wysychaniu komórek.</li>
	<li>Pozostaw warstwę przykrywającą do zastygnięcia przez około 10 min w temperaturze pokojowej przed umieszczeniem płytek pionowo w inkubatorze do hodowli tkanek. Inkubuj płytki przez 48 hr w temperaturze 37 °C w 5% CO2.</li>
	<li>Po okresie inkubacji płytki są słabo widoczne gołym okiem, dlatego sprawdź niebarwione płytki pod kątem obecności płytek wirusowych. Jeśli płytki nie są widoczne, inkubuj przez dodatkowe 4 hr i sprawdź ponownie. Maksymalny czas inkubacji nie powinien jednak przekraczać 72 hr.</li>
</ol>
4. Wizualizacja placków za pomocą barwienia czerwienią neutralną
<ol>
	<li>Aby zwizualizować plaki, przygotowuje się roztwór barwiący z czerwienią neutralną, dodając 3 ml czerwieni neutralnej (0,33% w/v w DPBS; Sigma, katalog nr N2889) do każdych 97 ml 1x PBS (klasa do hodowli tkankowych, wolny od Mg2+- i Ca2+-; Gibco, katalog nr 10010). Należy obliczyć objętość roztworu barwiącego z czerwienią neutralną potrzebną do eksperymentu: na każdą płytkę 6-dołkową wymagane jest 12 ml roztworu barwiącego. Następnie do każdego dołka dodaje się 2 ml. Chociaż niektóre protokoły testów plackowych wymagają usunięcia zlewku agarozy z dołków, w niniejszym protokole roztwór barwiący z czerwienią neutralną dodaje się bezpośrednio na warstwę agarozy.</li>
	<li>Po jednej godzinie inkubacji w 37 °C należy sprawdzić, czy plaki są widoczne, gdy roztwór barwiący z czerwienią neutralną wciąż znajduje się w dołkach. Jeśli plaki nie są wyraźnie widoczne, należy kontynuować barwienie przez kolejną godzinę. Inkubację kontynuuje się do momentu pojawienia się plaków. (Uwaga: Barwienie trwające powyżej 3 h nie jest optymalne; jeśli po 3 h barwienia w próbce kontrolnej dodatniej nie są widoczne żadne plaki, oznacza to, że test plackowy nie przebiegł prawidłowo). Po zakończeniu barwienia należy odessać roztwór barwiący z czerwienią neutralną, dbając o to, aby nie naruszyć zlewku agarozy, a następnie przejść do liczenia plaków.</li>
	<li>Plaki liczy się, kładąc płytkę odwróconą do góry dnem na stole świetlnym i zaznaczając kropką policzone plaki, aby uniknąć wielokrotnego liczenia tych samych obiektów. Należy wybrać rozcieńczenie do liczenia plaków w dołkach, w których plaki są wyraźnie oddzielone (t.j. nie ma wizualnych dowodów na zlewanie się plaków). Jeśli to możliwe, należy policzyć plaki dla dwóch rozcieńczeń. Należy zauważyć, że wielkość plaka może różnić się w zależności od szczepów MNV, inokulum wirusowego oraz stanu komórek RAW 264.7 podczas testu plackowego.</li>
	<li>Jeśli w dołku nie są widoczne żadne plaki, oznacza to, że w próbce nie było wirusa lub jego ilość była poniżej granicy wykrywalności testu plackowego. W takim przypadku dołki barwią się na czerwono, podobnie jak inne dołki zawierające plaki. Alternatywnie, brak plaków obserwuje się również wtedy, gdy w danym rozcieńczeniu znajduje się zbyt wiele cząsteczek wirusa. Prowadzi to do lizy całej monowarstwy, a dołki przybierają kolor pomarańczowy/żółty.</li>
	<li>Oblicz miana wirusa. Zsumuj liczbę plaków w obu dołkach dla jednego rozcieńczenia i pomnóż przez czynnik rozcieńczenia (t.j. 1 ml, jeśli 2 dołki zostały zainfekowane objętością 0,5 ml). Pozwoli to wyznaczyć liczbę jednostek tworzących plaki (PFU) w objętości inokulum 1 ml. Na przykład na Rysunku 4 przy rozcieńczeniu 10-2 jeden dołek (oznaczony jako „II”) ma 14 plaków, a drugi dołek (oznaczony jako „V”) ma 17 plaków. Zatem miano wirusa wyniesie 14x102 + 17x102 = 3 100 (3,1x103) pfu/ml.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Zakaźne cząsteczki MNV-1 można ilościowo określić za pomocą testu plackowego, zgodnie ze schematem przedstawionym na Rysunku 1. Rysunek 2A przedstawia studzienkę z monowarstwą komórek RAW 264.7 bezpośrednio przed zakażeniem, natomiast Rysunek 2B pokazuje trzy widoczne placki oznaczone rzymskimi cyframi I, II i III w studzience. Poszczególne etapy testu przedstawiono na Rysunkach 3A do F. Rysunek 3A pokazuje przygotowanie serii rozcieńczeń 10-krotnych próbki zawierającej wirusa. Rysunek 3B przedstawia przenoszenie rozcieńczeń do dubletowych studzienek płytki 6-dołkowej. Rysunek 3C pokazuje urządzenie do kołysania wykorzystywane do inkubacji komórek RAW 264.7 z inokulum w temperaturze pokojowej przez 1 hr. Rysunek 3D przedstawia nakładanie mieszaniny SeaPlaque:MEM na komórki. Rysunek 3E pokazuje płytkę w temperaturze pokojowej w celu utwardzenia warstwy nakładki, a Rysunek 3F przedstawia barwienie komórek 0,01% roztworem czerwieni neutralnej po 48 hr. Po barwieniu komórek przez 1-3 hr i odessaniu roztworu barwiącego czerwienią neutralną, placki stają się widoczne i mogą zostać policzone (Rysunek 4).
<img alt="Metoda rozcieńczeń seryjnych, obserwacja wzrostu bakterii na płytkach agarowych; schemat eksperymentu mikrobiologicznego." src="/files/ftp_upload/4297/4297fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
 Rycina 1. Schemat protokołu testu plackowego MNV.
<img alt="Kultura komórek pod mikroskopem; obraz A pokazuje zdrowy wzrost komórek, obraz B pokazuje stres komórkowy." src="/files/ftp_upload/4297/4297fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
 Rysunek 2. Reprezentatywne obrazy studzienki z monowarstwą przed infekcją oraz po powstaniu placków. A) Komórki RAW 264.7 hodowano przez noc i obrazowano pod mikroskopem świetlnym przy 20-krotnym powiększeniu. B) Komórki zabarwiono 0,01% roztworem czerwieni neutralnej po 48 h infekcji i zwizualizowano pod mikroskopem świetlnym przy 4-krotnym powiększeniu. Rzymskie cyfry I, II i III wskazują trzy widoczne placki.
<img alt="Układ testu hodowli komórkowej; płytki wielodołkowe; procedura eksperymentalna; pipeta; analiza komórkowa." src="/files/ftp_upload/4297/4297fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
 Rysunek 3. Reprezentatywne obrazy poszczególnych etapów testu plackowego. A) Przygotowanie inokulum MNV-1 w rozcieńczeniach 10-krotnych. B) Dodanie inokulum do monowarstw komórkowych w dubletach dołków. C) Inkubacja komórek i inokulum przy kołysaniu przez 1 hr w temperaturze pokojowej. D) Przykrycie komórek mieszanką SeaPlaque agarose i podłoża 2x MEM w stosunku 1:1. E) Inkubacja płytek przez 10 min w temperaturze pokojowej w celu zestalenia warstwy przypowierzchniowej. F) Barwienie komórek roztworem barwiącym neutral red 48 hr po infekcji.
<img alt="Eksperyment miareczkowania wirusa, seria rozcieńczeń w płytce 6-dołkowej, wyniki testu plackowego, obliczenie PFU." src="/files/ftp_upload/4297/4297fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
 Rysunek 4. MNV-1 tworzy placki w monowarstwach komórkowych. Przedstawiona jest reprezentatywna płytka do testu plackowego 48 h po infekcji, ukazująca placki wybarwione roztworem czerwieni neutralnej po 1 h inkubacji. Płytka zawiera dublety dołków dla trzech 10-krotnych rozcieńczeń. Dołki oznaczone rzymskimi cyframi I i IV odpowiadają rozcieńczeniu 10-1; II i V odpowiadają rozcieńczeniu 10-2; III i VI odpowiadają rozcieńczeniu 10-3. Miano wirusa w próbce wskazano poniżej (szczegóły obliczeń znajdują się w sekcji 4.5).

<ol><li>Wobus, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+Norovirus+in+cell+culture+reveals+a+tropism+for+dendritic+cells+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Replication of Norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages.</a> PLoS Biol. 2, e432(2004).</li>
<li>Wobus, C. E., Thackray, L. B., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+norovirus%3A+a+model+system+to+study+norovirus+biology+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Murine norovirus: a model system to study norovirus biology and pathogenesis.</a> Journal of virology. 80, 5104-5112 (2006).</li>
<li>Condit, R. C. Ch. 2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCondit%2C+RC+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. Knipe, D. M., Howley, P. M. 1, Lippincott Williams & Wilkins. 25-58 (2007).</li>
<li>Thackray, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+noroviruses+comprising+a+single+genogroup+exhibit+biological+diversity+despite+limited+sequence+divergence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Murine noroviruses comprising a single genogroup exhibit biological diversity despite limited sequence divergence.</a> Journal of virology. 81, 10460-10473 (2007).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+estimating+50%25+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hygiene%22%5BJournal%5D)">A simple method for estimating 50% endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1932).</li>
<li>Chachu, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+is+critical+for+the+clearance+of+murine+norovirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Antibody is critical for the clearance of murine norovirus infection.</a> Journal of virology. 82, 6610-6617 (2008).</li>
<li>Barron, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+murine+norovirus+strains+isolated+from+asymptomatic+mice+of+different+genetic+backgrounds+within+a+single+U.S.+research+institute%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Diversity of murine norovirus strains isolated from asymptomatic mice of different genetic backgrounds within a single U.S. research institute.</a> PLoS ONE. 6, e21435(2011).</li>
<li>Cox, C., Cao, S., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+detection+and+study+of+murine+norovirus-1+using+a+more+efficient+microglial+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+journal%22%5BJournal%5D)">Enhanced detection and study of murine norovirus-1 using a more efficient microglial cell line.</a> Virology journal. 6, 196(2009).</li>
<li>Cooper, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plaque+assay+of+animal+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Virus+Res%22%5BJournal%5D)">The plaque assay of animal viruses.</a> Adv. Virus Res. 8, 319-378 (1961).</li>
<li>Hyde, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+norovirus+replication+is+associated+with+virus-induced+vesicle+clusters+originating+from+membranes+derived+from+the+secretory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Mouse norovirus replication is associated with virus-induced vesicle clusters originating from membranes derived from the secretory pathway.</a> Journal of virology. 83, 9709-9719 (2009).</li>
<li>Simmonds, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatic+and+functional+analysis+of+RNA+secondary+structure+elements+among+different+genera+of+human+and+animal+caliciviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Bioinformatic and functional analysis of RNA secondary structure elements among different genera of human and animal caliciviruses.</a> Nucleic acids research. 36, 2530-2546 (2008).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Przedstawiona tutaj metoda testu plackowego dla MNV-1 jest sposobem ilościowego oznaczenia zakaźnych cząsteczek MNV. Przestrzegając kroków analizy zilustrowanych na Rysunku 3, można uzyskać powtarzalne miana wirusa. Granica wykrywalności testu zależy od zastosowanego rozcieńczenia początkowego. Przy zastosowaniu rozcieńczenia próbki 1:10, opisanego powyżej, granica wykrywalności testu plackowego wynosi 10 pfu (tj. 1 placka widoczna przy rozcieńczeniu 10-1). Ponieważ każda placka reprezentuje pojedynczego wirusa, test plackowy może być również wykorzystany do oczyszczania populacji klonalnych MNV poprzez wycinanie izolowanych plackek i ich pasażowanie zgodnie z wcześniejszym opisem 1. Dodatkowo oczyszczanie plackowe może służyć do oddzielenia pojedynczej populacji wirusa od mieszanych populacji wirusowych. Ograniczeniem stosowania testu plackowego do wykrywania infekcji MNV jest fakt, że nie wszystkie szczepy MNV tworzą placki 4. Jednakże możliwe może być przełamanie braku zdolności niektórych szczepów MNV izolowanych od zwierząt do tworzenia plackek poprzez seryjne pasażowanie tych wirusów w hodowlach tkankowych 7. Alternatywą dla testu plackowego jest pomiar cząsteczek zakaźnych za pomocą techniki TCID50 3, 4. Analiza ta określa ilość wirusa niezbędną do wywołania CPE w 50% inokulowanych komórek hodowli tkankowej po rozcieńczeniach końcowych i w przypadku MNV trwa 1 tydzień 4. Oprócz tego, że test TCID50 jest wolniejszy niż test plackowy, jest on również mniej czuły (granica wykrywalności = 200 TCID50/ml) ze względu na toksyczność próbek tkankowych dla komórek RAW 264.7 4.
Choć krytyczne etapy zostały opisane w treści protokołu, poniższa sekcja stanowi podsumowanie ułatwiające rozwiązywanie problemów. Najbardziej krytycznym krokiem w protokole jest zapewnienie żywotności komórek RAW 264.7 przez cały czas trwania testu, aby umożliwić replikację wirusa. Można to monitorować na każdym etapie testu za pomocą mikroskopii świetlnej. Żywotność komórek zapewnia się na dwa sposoby. Po pierwsze, należy zadbać o to, aby komórki nie wyschły podczas manipulowania płytkami. W związku z tym płytki są inokulowane pojedynczo, kołysane podczas okresu infekcji i powinny pozostać zamknięte, gdy nie są używane. Po drugie, roztwory dodawane do komórek powinny być wyrównane do temperatury ~37 °C. Ponadto dla ogólnego stanu zdrowia komórek RAW 264.7 kluczowe jest utrzymywanie ich w pożywce zawierającej serum o niskiej zawartości endotoksyn (&lt; 10 EU/ml), co ogranicza aktywację komórek. Dodatkowo zaobserwowaliśmy wyższy odsetek niepowodzeń w teście plackowym przy użyciu komórek z pasażu 30 lub wyższego. Choć prawdopodobnie będzie się to różnić w zależności od laboratorium, ważne jest uwzględnienie kontroli dodatniej (np. próbki o znanym mianie wirusa), aby zapewnić powtarzalność mian, szczególnie przy użyciu komórek RAW 264.7 z wyższych pasażów. Aby ograniczyć stosowanie komórek z wyższych pasaży, zaleca się zamrożenie fiolek z komórkami z wczesnych pasaży bezpośrednio po otrzymaniu komórek RAW 264.7 i częste rozpoczynanie nowej hodowli z rozmrożonych fiolek. Ponowne rozpoczęcie hodowli z komórek z niskiego pasażu będzie pomocne również wtedy, gdy komórki wykażą zmienione właściwości, takie jak brak adhezji, zmiany w morfologii komórek (np. z okrągłych na wrzecionowate i rozprzestrzeniające się) lub gdy wykryto zakażenie mycoplasma. Innym ważnym punktem, na który należy zwrócić uwagę, jest zapewnienie wymiany końcówek pipet między próbkami oraz podczas rozcieńczania. Zapewni to dokładność rozcieńczeń seryjnych i zapobiegnie kontaminacji krzyżowej między próbkami. Jedynym etapem protokołu, w którym można ponownie użyć tej samej końcówki pipety, jest dodawanie rozcieńczeń seryjnych tej samej próbki do dołków. W takim przypadku należy zacząć od najbardziej rozcieńczonego inokulum do najmniej rozcieńczonego, energicznie pipetując w górę i w dół podczas pobierania nowego rozcieńczenia.
Protokół testu plackowego dopuszcza kilka modyfikacji. Jedną z modyfikacji, którą można zastosować w przypadku brakku wystarczającej liczby komórek do zaszczepienia studzienek w dublecie, jest zaszczepienie tylko jednej studzienki dla każdego rozcieńczenia. Jednakże, ponieważ objętość inokulum wynosi 0,5 ml, liczbę placków należy wówczas pomnożyć przez współczynnik 2, aby znormalizować wynik do pfu/ml. Test plackowy można również dostosować do użycia z dowolną inną adherentną linią komórkową zdolną do wspierania replikacji MNV, co zostało opisane dla mysiej linii komórkowej mikrogleju BV-2 8. Inne możliwe do wdrożenia modyfikacje to adaptacje opisane w protokołach testów plackowych opracowanych dla innych wirusów. W przypadku MNV z sukcesem zaimplementowano już następujące modyfikacje: zastosowanie metylocelulozy zamiast agarozy Sea Plaque 9 oraz barwienie komórek fioletem krystalicznym lub błękitem metylenowym zamiast czerwienią neutralną 10, 11.
Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten można łatwo dostosować w zależności od potrzeb do ilościowego oznaczania innych wirusów tworzących plakietki lub zastosować go do innych wirusów wywołujących infekcje lityczne w komórkach RAW 264.7, co czyni go użytecznym narzędziem do ogólnego oznaczania ilości zakaźnych cząsteczek wirusowych.

<table><tbody><tr><td>DMEM/ High glucose</td><td>Hyclone</td><td>SH30243.02</td><td></td></tr><tr><td>2x MEM</td><td>Gibco</td><td>11935</td><td></td></tr><tr><td>100x Penicylina i streptomycyna</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>10 mM Nieessentialne aminokwasy</td><td>Hyclone</td><td>SH30238.01</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES</td><td>Hyclone</td><td>SH30237.01</td><td></td></tr><tr><td>200 mM (100x) L-glutamina</td><td>Hyclone</td><td>SH30034.01</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Gibco, Hyclone</td><td>10437, SH30070.02</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza do metod płytek (Sea Plaque Agarose)</td><td>Lonza</td><td>50100</td><td></td></tr><tr><td>Czerwień neutralna 0,33%</td><td>Sigma</td><td>N2889</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>10010</td><td></td></tr><tr><td>Kuleczki cyrkonowe/krzemionkowe 1,0 mm</td><td>BioSpec Products</td><td>11079110z</td><td></td></tr><tr><td>Wstrząsarka Model 35 Speed Rocker</td><td>Labnet</td><td>S2035</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie Magna Lyser</td><td>Roche</td><td>03358968001</td><td></td></tr><tr><td>Linia komórkowa Raw 264.7</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator do hodowli tkankowych</td><td>Sanyo</td><td>MCO-18AIC</td><td></td></tr></tbody></table>

test plackowy dla mysiego norowirusa

Plaque Assay for Murine Norovirus

Musi norowirus (MNV) jest jedynym przedstawicielem rodzaju Norovirus, który efektywnie namnaża się w hodowlach tkankowych 1, 2. Podczas infekcji MNV-1 mysich komórek dendrytycznych lub makrofagów obserwuje się lizę komórek oraz efekt cytopatyczny (CPE) 1. Właściwość ta MNV-1 może być wykorzystana do ilościowego oznaczenia liczby cząsteczek zakaźnych w danej próbce poprzez wykonanie testu plackowego 1. Test plackowy opiera się na zdolności MNV-1 do lizy komórek i tworzenia w zwartym monowarstwie komórek ubytków, nazywanych plakami 3.
Do wykrywania infekcji wirusowych w hodowlach tkankowych, pobranych tkankach, próbkach klinicznych i środowiskowych można stosować wiele technik, jednak nie wszystkie z nich mierzą liczbę cząsteczek zakaźnych (np. qRT-PCR). Jednym ze sposobów ilościowego oznaczania zakaźnych cząsteczek wirusa jest wykonanie testu plackowego 3, który zostanie szczegółowo opisany poniżej. Wariantem testu plackowego dla MNV jest test ognisk fluorescencyjnych, w którym antygen MNV jest barwiony immunofluorescencyjnie w monowarstwach komórkowych 4. Ten test może być szybszy, ponieważ ekspresja antygenu wirusowego poprzedza powstanie placków. Jest on również przydatny do miareczkowania wirusów niezdolnych do tworzenia placków. Jednak test ognisk fluorescencyjnych wymaga dodatkowych zasobów ponad te niezbędne w teście plackowym, takich jak przeciwciała oraz mikroskop do zliczania jednostek tworzących ogniska. Zakaźny MNV można również ilościowo oznaczyć poprzez wyznaczenie 50% zakaźnej dawki dla hodowli tkankowej (TCID50) 3. Test ten mierzy ilość wirusa wymaganą do wywołania efektu cytopatycznego (CPE) w 50% inokulowanych komórek hodowli tkankowej poprzez miareczkowanie punktu końcowego 5. Jednak jego granica wykrywalności jest wyższa w porównaniu z testem plackowym 4.
W niniejszym artykule opisujemy protokół testu plackowego, który może być wykorzystany do skutecznego oznaczenia liczby zakaźnych cząsteczek MNV obecnych w próbkach biologicznych lub środowiskowych 1, 4, 6. Metoda ta opiera się na przygotowaniu dziesięciokrotnych rozcieńczeń seryjnych próbek zawierających MNV, które są wykorzystywane do inokulacji monowarstwy komórek podatnych (linie komórkowe makrofagów mysich RAW 264.7). Wirusowi pozwala się przytwierdzić do monowarstwy komórek przez określony czas, a następnie jest on odessany przed pokryciem komórek mieszaniną agarozy i pożywki hodowlanej. Agar umożliwia rozprzestrzenianie się potomstwa wirusa na sąsiednie komórki, ograniczając jednocześnie rozprzestrzenianie się do komórek oddalonych. W rezultacie zakażone komórki ulegają lizie i tworzą w monowarstwie ubytki znane jako placki. Po dostatecznym rozprzestrzenieniu się wirusa placki stają się widoczne po zabarwieniu komórek barwnikami, takimi jak czerwień neutralna, błękit metylenowy lub fiolet krystaliczny. Przy niskich rozcieńczeniach każdy plack pochodzi od jednej zakaźnej cząsteczki wirusa i jej potomstwa, które rozprzestrzeniło się na sąsiednie komórki. Zatem policzenie liczby placków pozwala obliczyć jednostki tworzące placki (PFU) obecne w nierozcieńczonej próbce 3.

W niniejszej pracy opisujemy metodę ilościowego oznaczania cząstek zakaźnych norowirusa mysiego (MNV), który jest jedynym norowirusem efektywnie replikującym się w hodowlach komórkowych. Metoda płytkowa wykorzystuje tropizm MNV do makrofagów mysich i może zostać dostosowana do analizy próbek biologicznych lub środowiskowych zawierających MNV.

Test plackowy dla mysiego norowirusa

Norowirus mysi (MNV) jest jedynym przedstawicielem rodzaju Norovirus, który efektywnie namnaża się w hodowlach tkankowych 1, 2. Liza komórek i efekt cytopatyczny (CPE) są ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ilościowe oznaczenie zakaźnych cząsteczek norowirusa neuronów. Osiąga się to najpierw poprzez przygotowanie dziesięciokrotnych rozcieńczeń inokulum wirusa. W drugim kroku rozcieńczone inokulum wirusa przenosi się na monowarstwę 2 6 4 0.7 i inkubuje płytki w pozycji poziomej w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.Następnie odessaj inokulum i nałóż warstwę z mieszaniny agarowej do płytkowań w stosunku jeden do jednego z medium XMEM, a następnie inkubuj płytki przez 48 godzin w inkubatorze do hodowli tkankowych. Ostatnim krokiem jest nałożenie roztworu barwiącego czerwienią neutralną i inkubacja płytek od jednej do trzech godzin w inkubatorze do hodowli tkankowych. Na koniec ostrożnie odessaj roztwór barwiący czerwienią neutralną, nie usuwając warstwy agarowej, i policz powstałe plaques przy użyciu pulpitu świetlnego.Ta metoda ilościowego oznaczania zakaźnych cząstek wirusowych może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad norowirusami, takie jak ilość zakaźnych cząstek wydalanych z kałem lub to, które tkanki sprzyjają infekcji. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mają trudności z utrzymaniem zdrowych, żywotnych komórek przez cały czas trwania analizy. Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ test plackowy dla norowirusa może być trudny do zrozumienia dla osób bez wcześniejszego doświadczenia.Pomyślne przeprowadzenie tego testu wymaga wykonania serii kroków, w tym zapewnienia odpowiedniej liczby komórek, właściwej temperatury oraz precyzyjnego obchodzenia się z próbkami, aby umożliwić łatwą obserwację placków. Najpierw należy zbadać monowarstwę komórek pod mikroskopem świetlnym w celu sprawdzenia ich morfologii. Większość komórek powinna mieć okrągły kształt.Należy dopilnować, aby komórki nie uległy przerośnięciu, ponieważ zazwyczaj nie będą one tworzyć plam. Aby przygotować niemal konfluencyjną hodowlę komórek 2 6 4 0.7 w kolbie do hodowli tkanek o powierzchni 175 cm² do testu plamkowego wirusa murn, należy odessać medium z kolby i dodać do komórek 10 ml świeżego DMEM 10. Następnie, za pomocą skrobaka do komórek, należy zebrać komórki z dna kolby, a za pomocą pipety 10 ml odessać i wypuścić zawiesinę komórkową bezpośrednio na dno kolby. Czynność tę należy powtórzyć co najmniej trzy razy, aby rozbić wszelkie grudki komórek.Aby dopasować do kolby zapasowej. Odlać od jednego do dwóch mililitrów zawiesiny komórkowej i przenieść ją do nowej kolby o powierzchni 175 cm² zawierającej od 33 do 34 ml DMEM 10. Inkubować kolbę w inkubatorze do hodowli tkanek w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide przez dwa do trzech dni, a następnie ponownie pasażować.Po przygotowaniu komórek do wysiewu na płytki do analizy, dostosuj gęstość zawiesiny komórkowej do 1×10⁶ żywych komórek na ml w pożywce DMEM 10 i dodaj 2 ml tej zawiesiny do każdej studni płytki 6-dołkowej o średnicy 3,5 cm, a następnie przykryj płytkę. Natychmiast potrząśnij płytką ręcznie 10 razy, aby równomiernie rozłożyć komórki w studniach.Nie należy nadmiernie napełniać płytki, ponieważ spowoduje to skupianie się komórek w centrum dołka. Następnie należy umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych na minimum cztery godziny, a najlepiej na całą noc, aby komórki mogły przywrzeć. Inokulum wirusa można uzyskać z homogenizowanych tkanek zainfekowanych MNV lub z próbek kału od myszy zainfekowanych MNV. W przypadku użycia próbek tkanek, należy umieścić fragment tkanki wielkości ziarnka grochu w probówce z nakrętką o pojemności 2 ml zawierającej sterylne kuleczki krzemionkowe oraz 1 ml DMEM 10, a następnie przeprowadzić homogenizację.Magnetyzera należy używać przy 6 000 RPM przez jedną minutę. W przypadku stosowania próbek kału, należy zhomogenizować nie więcej niż trzy granulki kału w ten sam sposób, zamrozić zhomogenizowane próbki w temperaturze minus 80 °C i rozmrozić inokulum w dniu przeprowadzenia testu plackowego. Za pomocą pipety wielokrotnej należy rozdać 1,35 ml DMEM five do każdego dołka płytki 24-dołkowej, a następnie nanieść 0,15 ml trzeciego inokulum wirusa do pierwszego dołka płytki.Wykonaj dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne, pobierając 0,15 mililitra pierwszego rozcieńczenia 10⁻¹ i przenosząc je do drugiej studzienki płytki, aby uzyskać rozcieńczenie 10⁻². Następnie powtórz ten proces, korzystając z rozcieńczenia z drugiej studzienki, aby uzyskać rozcieńczenie 10⁻³. Należy pamiętać, że w zależności od próbki może być konieczne dalsze rozcieńczanie aż do 10⁻⁹.Po przygotowaniu rozcieńczeń seryjnych, opisz płytki z komórkami RAW 264.7 o konfluencji od 60 do 80%, podając nazwy próbek oraz stosowane rozcieńczenia. Następnie usuń całe medium z jednej z płytek poprzez aspirację lub wylanie, a do dołka dodaj 0,5 milliliters rozcieńczonej próbki. Powtórz czynność w dołku dubletowym, a następnie przejdź do kolejnego, niższego rozcieńczenia.Po dodaniu wszystkich trzech rozcieńczeń w dwóch powtórzeniach na jedną płytkę, przechylaj ją w przód i w tył, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały pokryte. Powtórz procedurę z kolejną płytką komórek. Po przetraktowaniu wszystkich płytek umieść je na platformie kołyszącej ustawionej na około 18 oscylacji na minutę na jedną godzinę w temperaturze pokojowej, a w międzyczasie podgrzej w kuchence mikrofalowej butelkę wcześniej przygotowanego i/lub autoklawowanego agarosu, aż do całkowitego stopienia.Następnie umieść stopiony agaros w kąpieli wodnej o temperaturze 42 °C, aby wyrównać temperaturę. Potem wymieszaj stopiony agaros ze sterylnym podłożem 2XMEM w sterylnej butelce w stosunku jeden do jednego. Butelkę zawierającą ten roztwór nakładkowy umieść w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C do momentu użycia.Po zakończeniu jednogodzinnej inkubacji odessać inokulum z każdej studni i powoli dodać dwa mililitry roztworu nakładki do każdej studni, upewniając się, że końcówka pipety jest oparta o ściankę studni. Aby zapobiec odrywaniu się komórek, przykryć płytki i pozostawić nakładkę do zastygnięcia na około 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przenieść płytki do inkubatora do hodowli tkanek na 48 godzin.Po okresie inkubacji należy sprawdzić płytki pod kątem obecności plaques. Jeśli plaques nie są widoczne, należy zwrócić płytki do inkubatora, a następnie sprawdzić je ponownie po czterech godzinach. W razie potrzeby należy powtórzyć tę procedurę, jednak czas inkubacji nie powinien przekroczyć 72 godzin.W pierwszej kolejności należy przygotować roztwór barwiący z czerwienią neutralną. Następnie do każdego dołka należy dodać 2 mL roztworu czerwieni neutralnej; w tym protokole nie ma potrzeby usuwania korka z agarosu. Płytki należy inkubować w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę.Po upływie czasu inkubacji sprawdzić płytki pod kątem obecności placków, pozostawiając roztwór neutralnej czerwieni w dołkach. Jeśli zabarwienie nie jest widoczne, inkubować płytki przez kolejną godzinę, maksymalnie do trzech godzin. Po pojawieniu się placków odessać roztwór neutralnej czerwieni, dbając o to, aby nie poruszyć zatyczki z agarozu, a następnie przystąpić do liczenia placków.Obejrzyj płytki i znajdź rozcieńczenie, w którym plaki są wyraźnie odseparowane. Umieść płytkę na podświetlaczu i policz plaki, zaznaczając kropką te, które zostały już policzone, aby uniknąć powtórzeń.Następnie powtórz liczenie w dołku z innym rozcieńczeniem wirusa i oblicz miano wirusa w jednostkach tworzących plaki na mililitr. Zgodnie z instrukcjami w protokole pisemnym, ten reprezentatywny obraz przedstawia monowarstwę przed infekcją. Surowe komórki 2 6 4 0.7 hodowano przez noc i obrazowano pod mikroskopem świetlnym przy 20-krotnym powiększeniu.Na tym obrazie przedstawiono tę samą monowarstwę po utworzeniu plamków. Komórki zabarwiono 0,01% roztworem neutral red po 48 godzinach od infekcji i zobrazowano za pomocą mikroskopu świetlnego przy czterokrotnym powiększeniu. Rzymskie cyfry I, II i III wskazują trzy widoczne plamki.Na tym obrazie przedstawiono płytkę po zakończeniu protokołu testu plackowego z dubletami trzech rozcieńczeń dziesięciokrotnych oznaczonych cyframi rzymskimi. Numery jeden i cztery odpowiadają rozcieńczeniu 10⁻¹, dwa i pięć odpowiadają rozcieńczeniu 10⁻², a trzy i sześć odpowiadają rozcieńczeniu 10⁻³.Titr wirusa w próbce wskazano poniżej. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o wymianie końcówek pipet między rozcieńczeniami, aby uniknąć kontaminacji krzyżowej próbek, o doprowadzeniu roztworów do odpowiedniej temperatury oraz o tym, aby nie dopuścić do wyschnięcia monowarstwy komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przeprowadzania testu plackowego i ilościowego oznaczania zakaźnych cząstek mi neurovirus.Należy pamiętać, że podczas pracy z Norowirusem Mira w komorze z laminarnym przepływem powietrza, podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie rękawiczek i fartucha, a odpady powinny być utylizowane zgodnie z wytycznymi ustalonymi przez lokalny komitet ds. bezpieczeństwa biologicznego.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Test płytkowy dla mysiego norowirusa

Norowirusy są główną przyczyną gastroenteritis, jednak techniki molekularne służące do ich charakterystyki są wciąż stosunkowo nowe. W niniejszej pracy przedstawiamy dwa różne podejścia genetyki odwrotnej w celu efektywnego odzyskiwania norowirusa mysiego (MNV), jedynego przedstawiciela tego rodzaju, który może być propagowany w hodowlach komórkowych.

Odzyskiwanie zakaźnego norowirusa mysiego za pomocą genetyki odwrotnej

Source: Morales Vasquez, D., et al. Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the protocol for carrying out plaque assay–based viral titration for quantifying infectious virus levels in tissue sample collected from a virus–infected mouse model.

Plaque Assay–Based Quantification of Viral Load in an Infected Mouse Tissue Sample

Source: Kadoya, S., Sano, D. Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus. J. Vis. Exp. (2019).This video demonstrates the use of a plaque assay to assess the rotavirus growth curve. The method involves infecting host cells with diluted virus, overlaying with agarose to restrict spread, and staining to visualize plaques formed by viral replication. By counting plaque-forming units at defined time points, the resulting growth curve reveals the lag, exponential, and...

Assessing Rotavirus Growth Curve by Plaque Assay

Ten film demonstruje test do ilościowego oznaczania ludzkich cząsteczek wirusopodobnych do norowirusa (VLP) wiążących się z ludzkimi bakteriami jelitowymi. Zawiesiny bakteryjne miesza się z VLP i inkubuje, aby umożliwić tworzenie kompleksów VLP-bakterii. Kompleksy są następnie znakowane przeciwciałami specyficznymi dla VLP znakowanymi fluoroforem, a następnie wizualizacją i kwantyfikacją opartą na cytometrii przepływowej w celu zidentyfikowania procentu bakterii związanych z VLP.

Test do ilościowego określenia wiązania ludzkich norowirusów VLP z bakteriami jelitowymi

Testy płytki nazębnej są złotym standardem w kwantyfikacji wirusa, wykorzystując nakładki pułapkowe na monowarstwy komórkowe gospodarza do określenia miana wirusa. Podczas gdy tradycyjnie stosuje się różne półstałe nakładki, tutaj demonstrujemy techniki płytki nazębnej, porównując półstałe nakładki z nową ciekłą celulozą mikrokrystaliczną wśród kilku rodzin wirusów.

Oznaczanie stężenia wirusa za pomocą testów płytki nazębnej: przy użyciu tradycyjnych i nowatorskich systemów nakładek

Tutaj prezentujemy procedurę ilościowego oznaczania enterowirusa i norowirusa w wodach środowiskowych i pitnych za pomocą odwrotnej transkrypcji ilościowej PCR. Średni odzysk wirusa z wód gruntowych przy użyciu tej znormalizowanej procedury z metody EPA 1615 wynosił 20% dla wirusa polio i 30% dla mysiego norowirusa.

Metoda EPA 1615. Pomiar występowania enterowirusów i norowirusów w wodzie za pomocą hodowli i RT-qPCR. Część III. Wykrywanie wirusów za pomocą RT-qPCR

To badanie opisuje test mikroneutralizacji oparty na obrazowaniu, aby przeanalizować relacje antygenowe między wirusami. Protokół wykorzystuje skaner płaski i składa się z czterech etapów, w tym miareczkowania, miareczkowania, neutralizacji i kwantyfikacji neutralizacji. Test działa dobrze z obecnymi krążącymi wirusami grypy A(H1N1)pdm09, A(H3N2) i B.

Optymalizacja ilościowego testu mikroneutralizacji

Metodologia pobierania próbek oparta na makropianie została opracowana i oceniona pod kątem wykrywania i kwantyfikacji norowirusa na twardych powierzchniach środowiskowych.

Metoda pobierania wymazów w celu wykrycia ludzkiego norowirusa na powierzchniach

Tutaj prezentujemy dwa protokoły, jeden do pomiaru specyficznego tempa wzrostu, a drugi do zdolności wiązania komórek rotawirusa za pomocą testu płytki nazębnej i RT-qPCR. Protokoły te są dostępne w celu potwierdzenia różnic w fenotypach między szczepami rotawirusa.

Testy specyficznej szybkości wzrostu i zdolności wiązania komórkowego rotawirusa

Celem tego protokołu jest ilościowe określenie wiązania eukariotycznego patogenu ludzkiego norowirusa z bakteriami. Po wykonaniu wstępnego testu przyłączenia wirusa-bakterii, cytometria przepływowa jest stosowana do wykrywania bakterii związanych z wirusem w populacji.

Ilościowe określanie cząstek wirusopodobnych do ludzkiego norowirusa wiążących się z bakteriami komensalnymi za pomocą cytometrii przepływowej

Poznaj metodę płytki nazębnej do ilościowego oznaczania zakaźnych cząstek wirusa MNV w hodowlach makrofagów mysich RAW 264.7. Ta technika umożliwia badaczom badanie dynamiki infekcji norowirusowych.

Test plackowy dla mysiego norowirusa

Przeglądaj więcej filmów