Test plackowy dla mysiego norowirusa

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ilościowe oznaczenie zakaźnych cząsteczek norowirusa neuronów. Osiąga się to najpierw poprzez przygotowanie dziesięciokrotnych rozcieńczeń inokulum wirusa. W drugim kroku rozcieńczone inokulum wirusa przenosi się na monowarstwę 2 6 4 0.7 i inkubuje płytki w pozycji poziomej w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.

Następnie odessaj inokulum i nałóż warstwę z mieszaniny agarowej do płytkowań w stosunku jeden do jednego z medium XMEM, a następnie inkubuj płytki przez 48 godzin w inkubatorze do hodowli tkankowych. Ostatnim krokiem jest nałożenie roztworu barwiącego czerwienią neutralną i inkubacja płytek od jednej do trzech godzin w inkubatorze do hodowli tkankowych. Na koniec ostrożnie odessaj roztwór barwiący czerwienią neutralną, nie usuwając warstwy agarowej, i policz powstałe plaques przy użyciu pulpitu świetlnego.

Ta metoda ilościowego oznaczania zakaźnych cząstek wirusowych może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad norowirusami, takie jak ilość zakaźnych cząstek wydalanych z kałem lub to, które tkanki sprzyjają infekcji. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mają trudności z utrzymaniem zdrowych, żywotnych komórek przez cały czas trwania analizy. Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ test plackowy dla norowirusa może być trudny do zrozumienia dla osób bez wcześniejszego doświadczenia.

Pomyślne przeprowadzenie tego testu wymaga wykonania serii kroków, w tym zapewnienia odpowiedniej liczby komórek, właściwej temperatury oraz precyzyjnego obchodzenia się z próbkami, aby umożliwić łatwą obserwację placków. Najpierw należy zbadać monowarstwę komórek pod mikroskopem świetlnym w celu sprawdzenia ich morfologii. Większość komórek powinna mieć okrągły kształt.

Należy dopilnować, aby komórki nie uległy przerośnięciu, ponieważ zazwyczaj nie będą one tworzyć plam. Aby przygotować niemal konfluencyjną hodowlę komórek 2 6 4 0.7 w kolbie do hodowli tkanek o powierzchni 175 cm² do testu plamkowego wirusa murn, należy odessać medium z kolby i dodać do komórek 10 ml świeżego DMEM 10. Następnie, za pomocą skrobaka do komórek, należy zebrać komórki z dna kolby, a za pomocą pipety 10 ml odessać i wypuścić zawiesinę komórkową bezpośrednio na dno kolby. Czynność tę należy powtórzyć co najmniej trzy razy, aby rozbić wszelkie grudki komórek.

Aby dopasować do kolby zapasowej. Odlać od jednego do dwóch mililitrów zawiesiny komórkowej i przenieść ją do nowej kolby o powierzchni 175 cm² zawierającej od 33 do 34 ml DMEM 10. Inkubować kolbę w inkubatorze do hodowli tkanek w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide przez dwa do trzech dni, a następnie ponownie pasażować.

Po przygotowaniu komórek do wysiewu na płytki do analizy, dostosuj gęstość zawiesiny komórkowej do 1×10⁶ żywych komórek na ml w pożywce DMEM 10 i dodaj 2 ml tej zawiesiny do każdej studni płytki 6-dołkowej o średnicy 3,5 cm, a następnie przykryj płytkę. Natychmiast potrząśnij płytką ręcznie 10 razy, aby równomiernie rozłożyć komórki w studniach.

Nie należy nadmiernie napełniać płytki, ponieważ spowoduje to skupianie się komórek w centrum dołka. Następnie należy umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych na minimum cztery godziny, a najlepiej na całą noc, aby komórki mogły przywrzeć. Inokulum wirusa można uzyskać z homogenizowanych tkanek zainfekowanych MNV lub z próbek kału od myszy zainfekowanych MNV. W przypadku użycia próbek tkanek, należy umieścić fragment tkanki wielkości ziarnka grochu w probówce z nakrętką o pojemności 2 ml zawierającej sterylne kuleczki krzemionkowe oraz 1 ml DMEM 10, a następnie przeprowadzić homogenizację.

Magnetyzera należy używać przy 6 000 RPM przez jedną minutę. W przypadku stosowania próbek kału, należy zhomogenizować nie więcej niż trzy granulki kału w ten sam sposób, zamrozić zhomogenizowane próbki w temperaturze minus 80 °C i rozmrozić inokulum w dniu przeprowadzenia testu plackowego. Za pomocą pipety wielokrotnej należy rozdać 1,35 ml DMEM five do każdego dołka płytki 24-dołkowej, a następnie nanieść 0,15 ml trzeciego inokulum wirusa do pierwszego dołka płytki.

Wykonaj dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne, pobierając 0,15 mililitra pierwszego rozcieńczenia 10⁻¹ i przenosząc je do drugiej studzienki płytki, aby uzyskać rozcieńczenie 10⁻². Następnie powtórz ten proces, korzystając z rozcieńczenia z drugiej studzienki, aby uzyskać rozcieńczenie 10⁻³. Należy pamiętać, że w zależności od próbki może być konieczne dalsze rozcieńczanie aż do 10⁻⁹.

Po przygotowaniu rozcieńczeń seryjnych, opisz płytki z komórkami RAW 264.7 o konfluencji od 60 do 80%, podając nazwy próbek oraz stosowane rozcieńczenia. Następnie usuń całe medium z jednej z płytek poprzez aspirację lub wylanie, a do dołka dodaj 0,5 milliliters rozcieńczonej próbki. Powtórz czynność w dołku dubletowym, a następnie przejdź do kolejnego, niższego rozcieńczenia.

Po dodaniu wszystkich trzech rozcieńczeń w dwóch powtórzeniach na jedną płytkę, przechylaj ją w przód i w tył, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały pokryte. Powtórz procedurę z kolejną płytką komórek. Po przetraktowaniu wszystkich płytek umieść je na platformie kołyszącej ustawionej na około 18 oscylacji na minutę na jedną godzinę w temperaturze pokojowej, a w międzyczasie podgrzej w kuchence mikrofalowej butelkę wcześniej przygotowanego i/lub autoklawowanego agarosu, aż do całkowitego stopienia.

Następnie umieść stopiony agaros w kąpieli wodnej o temperaturze 42 °C, aby wyrównać temperaturę. Potem wymieszaj stopiony agaros ze sterylnym podłożem 2XMEM w sterylnej butelce w stosunku jeden do jednego. Butelkę zawierającą ten roztwór nakładkowy umieść w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C do momentu użycia.

Po zakończeniu jednogodzinnej inkubacji odessać inokulum z każdej studni i powoli dodać dwa mililitry roztworu nakładki do każdej studni, upewniając się, że końcówka pipety jest oparta o ściankę studni. Aby zapobiec odrywaniu się komórek, przykryć płytki i pozostawić nakładkę do zastygnięcia na około 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przenieść płytki do inkubatora do hodowli tkanek na 48 godzin.

Po okresie inkubacji należy sprawdzić płytki pod kątem obecności plaques. Jeśli plaques nie są widoczne, należy zwrócić płytki do inkubatora, a następnie sprawdzić je ponownie po czterech godzinach. W razie potrzeby należy powtórzyć tę procedurę, jednak czas inkubacji nie powinien przekroczyć 72 godzin.

W pierwszej kolejności należy przygotować roztwór barwiący z czerwienią neutralną. Następnie do każdego dołka należy dodać 2 mL roztworu czerwieni neutralnej; w tym protokole nie ma potrzeby usuwania korka z agarosu. Płytki należy inkubować w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę.

Po upływie czasu inkubacji sprawdzić płytki pod kątem obecności placków, pozostawiając roztwór neutralnej czerwieni w dołkach. Jeśli zabarwienie nie jest widoczne, inkubować płytki przez kolejną godzinę, maksymalnie do trzech godzin. Po pojawieniu się placków odessać roztwór neutralnej czerwieni, dbając o to, aby nie poruszyć zatyczki z agarozu, a następnie przystąpić do liczenia placków.

Obejrzyj płytki i znajdź rozcieńczenie, w którym plaki są wyraźnie odseparowane. Umieść płytkę na podświetlaczu i policz plaki, zaznaczając kropką te, które zostały już policzone, aby uniknąć powtórzeń.

Następnie powtórz liczenie w dołku z innym rozcieńczeniem wirusa i oblicz miano wirusa w jednostkach tworzących plaki na mililitr. Zgodnie z instrukcjami w protokole pisemnym, ten reprezentatywny obraz przedstawia monowarstwę przed infekcją. Surowe komórki 2 6 4 0.7 hodowano przez noc i obrazowano pod mikroskopem świetlnym przy 20-krotnym powiększeniu.

Na tym obrazie przedstawiono tę samą monowarstwę po utworzeniu plamków. Komórki zabarwiono 0,01% roztworem neutral red po 48 godzinach od infekcji i zobrazowano za pomocą mikroskopu świetlnego przy czterokrotnym powiększeniu. Rzymskie cyfry I, II i III wskazują trzy widoczne plamki.

Na tym obrazie przedstawiono płytkę po zakończeniu protokołu testu plackowego z dubletami trzech rozcieńczeń dziesięciokrotnych oznaczonych cyframi rzymskimi. Numery jeden i cztery odpowiadają rozcieńczeniu 10⁻¹, dwa i pięć odpowiadają rozcieńczeniu 10⁻², a trzy i sześć odpowiadają rozcieńczeniu 10⁻³.

Titr wirusa w próbce wskazano poniżej. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o wymianie końcówek pipet między rozcieńczeniami, aby uniknąć kontaminacji krzyżowej próbek, o doprowadzeniu roztworów do odpowiedniej temperatury oraz o tym, aby nie dopuścić do wyschnięcia monowarstwy komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przeprowadzania testu plackowego i ilościowego oznaczania zakaźnych cząstek mi neurovirus.

Należy pamiętać, że podczas pracy z Norowirusem Mira w komorze z laminarnym przepływem powietrza, podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie rękawiczek i fartucha, a odpady powinny być utylizowane zgodnie z wytycznymi ustalonymi przez lokalny komitet ds. bezpieczeństwa biologicznego.