Synteza nanoemulsji przesunięcia fazowego o wąskim rozkładzie wielkości do akustycznej waporyzacji kropli i ablacji wspomaganej ultradźwiękami z wykorzystaniem pęcherzyków

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest obserwacja wpływu pęcherzyków generowanych akustycznie poprzez waporyzację nanoemulsji powlekanych lipidami na ablację wspomaganą ultradźwiękami. Osiąga się to najpierw poprzez rozproszenie nanoemulsji powlekanych lipidami w hydrożelach poliakrylamidowych obciążonych albuminą. W drugim kroku skupiający przetwornik wysyła do hydrożelu krótkie impulsy o wysokiej amplitudzie, które powodują lokalną waporyzację nanoemulsji w ognisku; następnie powstałe pęcherzyki są stale pobudzane ultradźwiękami, a promieniowana przez nie energia akustyczna jest szybko pochłaniana przez hydrożel, co przyspiesza tempo nagrzewania wspomaganego ultradźwiękami.

Wyniki pokazują, że obecność pęcherzyków drastycznie skraca czas i zmniejsza energię potrzebną do podgrzania hydrożelu powyżej temperatury progowej denaturacji białek, co skutkuje szybszą i bardziej wydajną ablacją wspomaganą ultradźwiękami. Rozmiar nanoemulsji z przesunięciem fazowym jest krytycznym czynnikiem determinującym próg ciśnienia. W celu przeprowadzenia waporyzacji akustycznej opracowaliśmy protokół wytwarzania stabilnych nanoemulsji z przesunięciem fazowym o wąskim rozkładzie wielkości cząstek i dobrze określonych progach waporyzacji, a także system in vitro do oceny wpływu na ablację ośrodka ultradźwiękowego.

Choć opisano układ in vitro, nanoemulsje fazowo-przejściowe są zaprojektowane tak, aby docierać do tkanek pozanaczyniowych i guzów litych za pomocą cząstek, które można odparować akustycznie. Powstałe pęcherzyki mogą być następnie wykorzystywane w zastosowaniach diagnostycznych lub terapeutycznych w leczeniu nowotworów. Aby rozpocząć procedurę przygotowania nanoemulsji fazowo-przejściowej (PSNE), najpierw wymieszaj lipidy, rozpuszczając 11 mg DPPC i 1,7 mg DSPE.

Peg 2000 w chloroformie w szklanej kolbie okrągłodennej. Umieść kolbę okrągłodenną w kąpieli wodnej o temperaturze 50 °C w dygestorium i użyj strumienia argonu do odparowania rozpuszczalnika organicznego. Aby utworzyć suchy film lipidowy, umieść kolbę w eksykatore i pozostaw pod próżnią przez noc, aby osuszyć film lipidowy następnego ranka.

Rehydratyzuj film lipidowy, dodając 5,5 milliliters PBS. Podgrzewaj roztwór w kąpieli wodnej o temperaturze 45 °C aż do rozpuszczenia filmu lipidowego. Przelej roztwór lipidowy do fiolki o pojemności siedmiu mililitrów, a następnie poddaj sonikacji za pomocą sonikatora głowicowego przez dwie minuty przy amplitudzie 20%.

Rozdziel roztwór do dwóch probówek, po 2,5 mililitra do każdej. Pozostałe 0,5 mililitra należy odrzucić. Do każdej probówki dodaj 2,5 mililitra PBS, a następnie umieść obie probówki w łaźni lodowej o temperaturze zero stopni Celsjusza.

Do każdej probówki dodaj 50 µL dokafluoropentanu (DDFP). To etap przygotowania mieszaniny lipidowej DDFP. Utrzymywanie próbek w kąpieli wodno-lodowej jest najbardziej krytycznym elementem tej procedury.

Kąpiel wodno-lodowa jest stosowana w celu zapobiegania odparowywaniu ciekłego perfluorowęglowodoru. Podczas tego procesu każdą fiolkę w kąpieli wodno-lodowej poddaje się sonikacji przy następujących ustawieniach: amplituda 25%, tryb impulsowy, całkowity czas 60 sekund. Po sonikacji roztwór PSNE przenosi się do 20 mililitrowych fiolek scyntylacyjnych, dodając do każdej fiolki 5 mililitrów PBS, co daje objętość końcową 10 mililitrów na fiolkę.

Zmontuj ekstruder zgodnie z instrukcjami producenta, aby go zaprzesić. Pipetuj 10 milliliters wody dejonizowanej do górnego otworu na próbkę. Zamknij otwór i dokręć zawór odpowietrzający.

Powoli otwórz linię z azotem, aby zwiększyć ciśnienie i wymusić przepływ próbki przez membrany. Zbierz próbkę z rurki wylotowej, a następnie przeciskaj PSNE 16 razy przez filtr o rozmiarze 100 nanometrów lub 200 nanometrów, aby uzyskać wąski rozkład wielkości cząstek. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania hydrożelu z poliakryloamidu zawierającego PSNE.

Najpierw przygotuj 24% roztwór albuminy surowicy bydlęcej (BSA), rozpuszczając 2,4 g proszku BSA w 10 ml wody dejonizowanej. Następnie przygotuj 10% roztwór raźnika amonowego (PS), rozpuszczając 1 g proszku PS w 10 ml wody dejonizowanej. Wymieszaj te odczynniki w plastikowej formie w następującej kolejności: 2,1 ml roztworu akryloamidu, 1,2 ml buforu Tris, 0,1 ml 10% roztworu PS, 4,5 ml 24% roztworu BSA oraz 3,6 ml wody dejonizowanej. Podgrzej roztwór do 40 °C w łaźni wodnej, a następnie poddaj działaniu próżni przez jedną godzinę w celu odgazowania cieczy.

Jest to niezbędne, aby uniknąć niepożądanego tworzenia się pęcherzyków powietrza wewnątrz hydrożelu po godzinie. Wyjąć z próżni, dodać 480 µL zawiesiny PSNE i dokładnie wymieszać, delikatnie obracając plastikową komorę. W dygestorium dodać 12 µL tetraetylenodiaminy (TEMED) w celu polimeryzacji akryloamidu, a następnie umieścić komorę w kąpieli wodnej o temperaturze 12 °C na dwie godziny.

Polimeryzacja jest procesem egzotermicznym, dlatego konieczne jest zastosowanie kąpieli chłodzącej, aby uniknąć odparowania PSE podczas polimeryzacji. Po spolimeryzowaniu akrylamidu ustawić przetwornik mocy o skupionej wiązce oraz sondę obrazującą w akrylowym zbiorniku wypełnionym odjonizowaną wodą DGA w taki sposób, aby płaszczyzna obrazowania pokrywała się z objętością ogniskową przetwornika. Następnie umieścić hydrożel poliakrylamidowy z załadowanym PSNE w ognisku przetwornika mocy, odparować PSNE wewnątrz hydrożelu za pomocą krótkich impulsów akustycznych, a następnie zastosować 15-sekundową ekspozycję falą ciągłą w celu ablacji wspomaganej pęcherzykami.

W miarę denaturacji BSA hydrożel staje się nieprzezroczysty z powodu absorpcji ultradźwięków i generowania ciepła podczas monitorowania waporyzacji i tworzenia się pęcherzyków za pomocą diagnostycznego skanera ultradźwiękowego. Na tym przykładowym obrazie strzałka wskazuje obszar ogniskowy, w którym powstała chmura pęcherzyków w wyniku waporyzacji PSNE. Powtórz ekspozycję akustyczną w nowym miejscu w hydrożelu, zwiększając stężenie PSNE, aby porównać czas i objętość ablacji.

Niniejszy protokół pozwala na otrzymanie kropli perfluorowęglowych powlekanych lipidami o wąskim rozkładzie wielkości. Przedstawiono tutaj rozkład wielkości zmierzony za pomocą dynamicznego rozpraszania światła dla PSNE otrzymanych przy użyciu filtrów o porach 100 i 200 nanometrów. Jednostki osi rzędnych opierają się na intensywności światła rozproszonego przez cząstki o danej wielkości w stosunku do całkowitej intensywności światła rozproszonego z próbki.

Gdy średnica i odchylenie standardowe PSNE w pierwszym i siódmym dniu po ekstruzji przez filtry o rozmiarach 100 i 200 nanometrów są mierzone za pomocą dynamicznego rozpraszania światła, wyniki wykazują, że PSNE są stabilne przez co najmniej tydzień. Na tej rycinie przedstawiono obrazy w trybie B PSNE przed i po waporyzacji. W hydrożelu z poliakryloamidu strzałka wskazuje obszar ogniskowania, w którym w wyniku waporyzacji PSNE utworzyła się chmura pęcherzyków.

Są to obrazy hydrożelu poliakrylamidowego zawierającego albuminę i PSNE przed oraz po waporyzacji i sonikacji za pomocą wysokointensywnego skupionego ultradźwięku (HiFu). Uszkodzenie powstaje w wyniku 15-sekundowego ogrzewania za pośrednictwem HiFu. Asymetryczny kształt uszkodzenia jest wynikiem ogrzewania przedogniskowego, które występuje z powodu obecności chmury pęcherzyków na drodze ultradźwięków. Ogrzewanie przedogniskowe oraz powstawanie uszkodzeń wynikających z rozproszenia przez pęcherzyki można zminimalizować poprzez zmniejszenie transmitowanej mocy akustycznej po ich powstaniu.

Ta metoda wytwarzania stabilnych nanoemulsji z przesunięciem fazowym utoruje drogę badaczom w dziedzinie terapii wspomaganej ultradźwiękami do eksploracji ablacji HIFU wspomaganej pęcherzykami w guzach litych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak wytwarzać stabilne nanoemulsje z przesunięciem fazowym o wąskim rozkładzie rozmiarów oraz jak badać nukleację pęcherzyków i wzmocnioną ablację wspomaganą ultradźwiękami.