Name: Synteza nanoemulsji z przesunięciem fazowym o wąskim rozkładzie wielkości do akustycznej parowania kropelek i ablacji ultradźwiękowej wzmocnionej pęcherzykami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Poznaj metodę syntezy stabilnych nanoemulsji z przesunięciem fazowym o wąskim rozkładzie wielkości do akustycznego parowania kropelek i ablacji ultradźwiękowej wzmocnionej pęcherzykami w badaniach nad nowotworami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez stypendium przeddoktoranckie BU/CIMIT w zakresie inżynierii opieki zdrowotnej (Applied Healthcare Engineering Predoctoral Fellowship), grant na rozpoczęcie badań National Science Foundation Broadening Participation Research Initiation Grant in Engineering (BRIGE) oraz Narodowe Instytuty Zdrowia (R21EB0094930).

1. Przygotowanie nanoemulsji przesuwającej fazę (PSNE)
<ol>
 <li>Rozpuścić 11 mg DPPC oraz 1,68 mg DSPE-PEG2000 w chloroformie</li>
 <li>Odparować rozpuszczalnik organiczny, aby utworzyć suchy film lipidowy w szklanej kolbie okrągłodennej</li>
 <li>Suszyć film lipidowy w desykatorze przez noc</li>
 <li>Rehydratować film lipidowy przy użyciu 5,5 ml fosforanowego buforu solnego (PBS)</li>
 <li>Podgrzewać roztwór w łaźni wodnej o temperaturze 45 °C do momentu rozpuszczenia filmu lipidowego, okresowo mieszając na wortexie</li>
 <li>Przenieść roztwór lipidowy do fiolki o pojemności 7 ml</li>
 <li>Sonicować roztwór lipidowy przez 2 min przy amplitudzie 20%</li>
 <li>Podzielić roztwór do dwóch fiolek po 2,5 ml każda (pozostałe 0,5 ml odrzucić)</li>
 <li>Dodać 2,5 ml PBS do każdej fiolki</li>
 <li>Umieścić każdą fiolkę w łaźni lodowo-wodnej o temperaturze 0 °C</li>
 <li>Dodać 50 μl DDFP do każdej fiolki</li>
 <li>Sonicować każdą fiolkę w łaźni lodowo-wodnej, stosując następujące ustawienia: amplituda 25%, tryb impulsowy (10 s włączenia, 50 s przerwy), całkowity czas włączenia 60 s</li>
 <li>Przenieść roztwory PSNE do fiolek scyntylacyjnych o pojemności 20 ml</li>
 <li>Dodać 5 ml PBS do każdej fiolki, aby uzyskać końcową objętość 10 ml</li>
 <li>Złożyć ekstruder zgodnie z instrukcją producenta
 <ol>
 <li>Przepłukać każdą część wodą dejonizowaną</li>
 <li>Umieścić stalową płytkę podporową w centrum podstawy wspornika filtra</li>
 <li>Umieścić stalową siatkę na wierzchu stalowej płytki podporowej</li>
 <li>Za pomocą pęsety umieścić membranę odpływową ekstrudera (stroną błyszczącą do góry) na stalowej siatce</li>
 <li>Za pomocą pęsety umieścić filtr ekstrudera (stroną błyszczącą do góry) na membranie odpływowej</li>
 <li>Ostrożnie nałożyć małą uszczelkę O-ring na filtr, a następnie umieścić termobarel i górną część ekstrudera nad podstawą wspornika</li>
 <li>Najpierw częściowo dokręcić każdą nakrętkę motylkową, a następnie całkowicie dokręcić nakrętki ręcznie w sposób naprzemienny</li>
 <li>Podłączyć ekstruder do linii z azotem</li>
 <li>Aby przygotować ekstruder, pipetować 10 ml wody dejonizowanej do górnego otworu na próbkę, zamknąć otwarcie i dokręcić zawór odpowietrzający</li>
 <li>Powoli otworzyć linię z azotem, aby zwiększyć ciśnienie, wymuszając przepływ próbki przez membrany, a następnie zebrać próbkę z rurki wylotowej</li>
 <li>Po użyciu rozłożyć urządzenie w kolejności odwrotnej, przepłukać części ekstrudera wodą dejonizowaną i wyrzucić filtr membranowy oraz membranę odpływową</li>
 </ol>
 </li>
 <li>W przypadku kropli o rozmiarze 100 nm, wstępnie przygotować PSNE, ekstrudując 10 razy przez filtr 200 nm</li>
 <li>Ekstrudować PSNE 16 razy przez filtr 100 nm lub 200 nm, aby uzyskać wąski rozkład wielkości</li>
</ol>
2. Przygotowanie hydrożelu poliakrylamidowego zawierającego PSNE
<ol>
 <li>Przygotować 24% roztwór BSA, rozcieńczając 1,2 g proszku BSA w 5 ml wody dejonizowanej</li>
 <li>Przygotować 10% roztwór APS, rozcieńczając 0,1 g proszku APS w 1 ml wody dejonizowanej</li>
 <li>W następującej kolejności zmieszać w plastikowej komorze: 2,1 ml roztworu akryloamidu, 1,2 ml buforu Tris, 0,1 ml 10% APS, 4,5 ml 24% roztworu BSA oraz 3,6 ml wody dejonizowanej</li>
 <li>Podgrzać do 40 °C i pozostawić w próżni na 1 hr</li>
 <li>Dodać 480 μl PSNE i dokładnie wymieszać, delikatnie obracając plastikową komorę</li>
 <li>Dodać 12 μl TEMED i umieścić komorę w kąpieli wodnej o temperaturze 12 °C na 2 hr</li>
</ol>
3. Reprezentatywne wyniki
Schemat układu do eksperymentów ultradźwiękowych z wykorzystaniem fantomów z hydrożelu naśladującego tkankę przedstawiono na Rysunku 1. Niniejszy protokół pozwala na otrzymanie kropel perfluorowęglowodanów powlekanych lipidami o wąskim rozkładzie wielkości, które pozostają stabilne w roztworze przez co najmniej tydzień. Rozkład wielkości zmierzony za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (90Plus Particle Size Analyzer, Brookhaven Instruments, Holtsville, NY) przedstawiono na Rysunku 2 dla PSNE otrzymanych przy użyciu filtrów 100 i 200 nm. Efektywna średnica PSNE w czasie, zmierzona metodą dynamicznego rozpraszania światła, została zestawiona w Tabeli 1, co dowodzi, że PSNE są stabilne przez co najmniej tydzień. Obrazy PSNE w trybie B przed i po waporyzacji w hydrożelu poliakryloamidowym przedstawiono na Rysunku 3. Ponadto na Rysunku 4 pokazano zmianę chorobową powstałą w wyniku 15 s ogrzewania za pomocą HIFU w hydrożelu poliakryloamidowym zawierającym albuminę i PSNE. Asymetryczny kształt zmiany jest wynikiem ogrzewania przedogniskowego, które występuje z powodu obecności chmury pęcherzyków na drodze wiązki ultradźwiękowej. Należy zauważyć, że ogrzewanie przedogniskowe i powstawanie zmian wynikające z rozproszenia fal przez pęcherzyki można zminimalizować poprzez zmniejszenie transmitowanej mocy akustycznej.
<img src="/files/ftp_upload/4308/4308fig1.jpg" alt="Eksperyment z przetwornikiem HIFU z hydrożelem w zbiorniku z wodą w temperaturze 37°C; schemat konfiguracji symulacji tkanki." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
 Rysunek 1. Schematyczny rysunek konfiguracji eksperymentalnej dla doświadczeń ultradźwiękowych z wykorzystaniem hydrożeli imitujących tkankę.
<img src="/files/ftp_upload/4308/4308fig2.jpg" alt="Wykres rozkładu wielkości cząstek, średnica względem intensywności względnej, filtry 100/200 nm." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
 Rycina 2. Rozkład wielkości PSNE przeciskanego przez filtry 100 nm lub 200 nm, zmierzony metodą dynamicznego rozpraszania światła. Jednostki osi rzędnych opierają się na intensywności światła rozpraszanego przez cząstki o określonej wielkości w stosunku do całkowitej intensywności światła rozpraszanego przez próbkę.
<img src="/files/ftp_upload/4308/4308fig3.jpg" alt="Porównanie obrazowania ultradźwiękowego; panel B wyróżnia obszar strzałką wskazującą wykrytą strukturę." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
 Rycina 3. Obrazy w trybie B (a) przed i (b) po waporyzacji PSNE w hydrożelu poliakrylamidowym. Strzałka wskazuje obszar ogniskowania, w którym w wyniku waporyzacji PSNE powstała chmura pęcherzyków.
<img src="/files/ftp_upload/4308/4308fig4.jpg" alt="Obraz mikroskopowy eksperymentu zasiewania chmur; A) kontrola; B) zaobserwowany proces tworzenia chmur." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
 Rysunek 4. Obrazy hydrożelu poliakrylamidowego zawierającego albuminę i PSNE (a) przed oraz (b) po odparowaniu i sonikacji za pomocą HIFU, wykazujące powstanie zmiany w wyniku nagrzewania indukowanego ultradźwiękami. Częstotliwość centralna ultradźwięków wynosiła 3.3 MHz. Sygnał ultradźwiękowy składał się z początkowego impulsu o długości 30 cykli i mocy 6.4 W w celu odparowania PSNE, po którym natychmiast nastąpiło 15 s ciągłego promieniowania ultradźwiękowego o mocy 0.77 W. 
<table border="1">
 <tbody >
 <tr>
 <td rowspan="2">Dni po ekstruzji</td>
 <td colspan="2">Ekstruzja przez filtr 200 nm</td>
 <td colspan="2">Ekstruzja przez filtr 100 nm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Śr. średnica (nm)</td>
 <td>Odch. std. (nm)</td>
 <td>Śr. średnica (nm)</td>
 <td>Odch. std. (nm)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1</td>
 <td>182.9</td>
 <td>4.9</td>
 <td>118.0</td>
 <td>0.9</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>7</td>
 <td>177.7</td>
 <td>2.5</td>
 <td>124.8</td>
 <td>3.1</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tabela 1. Średnica średnia i odchylenie standardowe PSNE w pierwszym i siódmym dniu po ekstruzji z użyciem filtrów 100 nm i 200 nm.

<ol><li>Hynynen, K., Darkazanli, A., Unger, E., Schenck, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRI-guided+noninvasive+ultrasound+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Phys%22%5BJournal%5D)">MRI-guided noninvasive ultrasound surgery.</a> Med. Phys. 20, 107-115 (1993).</li>
<li>Baban, D. F., Seymour, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+tumour+vascular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Control of tumour vascular permeability.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 34, 109-119 (1998).</li>
<li>Maeda, H., Wu, J., Sawa, T., Matsumura, Y., Hori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+vascular+permeability+and+the+EPR+effect+in+macromolecular+therapeutics%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review.</a> J. Control. Release. 65, 271-284 (2000).</li>
<li>Schadlich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+accumulation+of+NIR+fluorescent+PEG-PLA+nanoparticles%3A+impact+of+particle+size+and+human+xenograft+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Tumor accumulation of NIR fluorescent PEG-PLA nanoparticles: impact of particle size and human xenograft tumor model.</a> ACS Nano. 5, 8710-8720 (2011).</li>
<li>Williams, R. Convertible perfluorocarbon droplets for cancer detection and therapy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilliams%2C+R+%222010+IEEE+Ultrasonics+Symposium%22">2010 IEEE Ultrasonics Symposium</a>. , (2010).</li>
<li>Martz, T. D., Sheeran, P. S., Bardin, D., Lee, A. P., Dayton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+manufacture+of+phase-change+perfluorocarbon+droplets+using+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Precision manufacture of phase-change perfluorocarbon droplets using microfluidics.</a> Ultrasound Med. Biol. 37, 1952-1957 (2011).</li>
<li>Giesecke, T., Hynynen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound-mediated+cavitation+thresholds+of+liquid+perfluorocarbon+droplets+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrasound-mediated cavitation thresholds of liquid perfluorocarbon droplets in vitro.</a> Ultrasound Med. Biol. 29, 1359-1365 (2003).</li>
<li>Sheeran, P. S., Luois, S., Dayton, P. A., Matsunaga, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formulation+and+Acoustic+Studies+of+a+New+Phase-Shift+Agent+for+Diagnostic+and+Therapeutic+Ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Formulation and Acoustic Studies of a New Phase-Shift Agent for Diagnostic and Therapeutic Ultrasound.</a> Langmuir. 27, 10412-10420 (2011).</li>
<li>Sheeran, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decafluorobutane+as+a+phase-change+contrast+agent+for+low-energy+extravascular+ultrasonic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Decafluorobutane as a phase-change contrast agent for low-energy extravascular ultrasonic imaging.</a> Ultrasound Med. Biol. 37, 1518-1530 (2011).</li>
<li>Zhang, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+Application+of+Phase-Shift+Nanoemulsion+in+High+Intensity+Focused+Ultrasound%3A+An+In+Vitro+Study+%5BDoctoral+%5D%22">The Application of Phase-Shift Nanoemulsion in High Intensity Focused Ultrasound: An In Vitro Study [Doctoral Dissertation]</a>. , (2011).</li>
<li>Allen, T. M., Hansen, C., Martin, F., Redemann, C., Yau-Young, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomes+containing+synthetic+lipid+derivatives+of+poly%28ethylene+glycol%29+show+prolonged+circulation+half-lives+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Liposomes containing synthetic lipid derivatives of poly(ethylene glycol) show prolonged circulation half-lives in vivo.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1066, 29-36 (1991).</li>
<li>Klibanov, A. L., Maruyama, K., Beckerleg, A. M., Torchilin, V. P., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+amphipathic+poly%28ethylene+glycol%29+5000+to+prolong+the+circulation+time+of+liposomes+depends+on+the+liposome+size+and+is+unfavorable+for+immunoliposome+binding+to+target%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Activity of amphipathic poly(ethylene glycol) 5000 to prolong the circulation time of liposomes depends on the liposome size and is unfavorable for immunoliposome binding to target.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1062, 142-148 (1991).</li>
<li>Klibanov, A. L., Maryama, K., Torchilin, V. P., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphipathic+polyethyleneglycols+effectively+prolong+the+circulation+time+of+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Amphipathic polyethyleneglycols effectively prolong the circulation time of liposomes.</a> FEBS Lett. 268, 235-237 (1990).</li>
<li>Gabizon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+circulation+time+and+enhanced+accumulation+in+malignant+exudates+of+Doxorubicin+encapsulated+in+polyethylene-glycol+coated+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Prolonged circulation time and enhanced accumulation in malignant exudates of Doxorubicin encapsulated in polyethylene-glycol coated liposomes.</a> Cancer Res. 54, 987-992 (1994).</li>
<li>Awasthi, V. D., Garcia, D., Goins, B. A., Philips, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulation+and+biodistribution+profiles+of+long-circulating+PEG-liposomes+of+various+sizes+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Circulation and biodistribution profiles of long-circulating PEG-liposomes of various sizes in rabbits.</a> Int. J. Pharm. 253, 121-132 (2003).</li>
<li>Zhang, P., Porter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+study+of+a+phase-shift+nanoemulsion%3A+a+potential+nucleation+agent+for+bubble-enhanced+HIFU+tumor+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">An in vitro study of a phase-shift nanoemulsion: a potential nucleation agent for bubble-enhanced HIFU tumor ablation.</a> Ultrasound Med. Biol. 36, 1856-1866 (2010).</li>
<li>Lafon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel+phantom+for+use+in+high-intensity+focused+ultrasound+dosimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gel phantom for use in high-intensity focused ultrasound dosimetry.</a> Ultrasound Med. Biol. 31, 1383-1389 (2005).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Skoncentrowane ultradźwięki o wysokiej intensywności (HIFU) są stosowane klinicznie do ablacji termicznej guzów.1 W celu wzmocnienia lokalnego nagrzewania i poprawy ablacji termicznej w guzach opracowano pokryte lipidami krople perfluorowęglowodorów, które mogą ulegać waporyzacji pod wpływem HIFU. Układ naczyniowy w wielu guzach wykazuje nadmierną przepuszczalność ze względu na ich szybki wzrost.2 Dzięki temu nanocząsteczki są w stanie przenikać przez fenestracje i pasywnie gromadzić się w guzach, c...

<table><tbody><tr><td>DPPC</td><td>Avanti Lipids, Alabaster, AL, USA</td><td>850355P</td><td>1,2-dipalmitylo-sn-glycero-3-fosfocholina</td></tr><tr><td>DSPE-PEG2000</td><td>Avanti Lipids, Alabaster, AL, USA</td><td>880120P</td><td>1,2-distearylo-sn-glycero-3-fosfo&amp;#8211;etanolamina-N-[metoksy(glikol polietylenowy)-2000] (sól amonowa)</td></tr><tr><td>DDFP</td><td>Fluoromed, Round Rock, TX, USA</td><td>CAS: 138495-42-8</td><td>Dodekafluoropentan (C&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;F&lt;sub&gt;12&lt;/sub&gt;)</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>P2194</td><td>Fosforanowy bufor solny</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>372978</td><td>Chloroform</td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>A9926</td><td>40% 19:1 akrylamid/bis-akrylamid</td></tr><tr><td>Tris buffer</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>T2694</td><td>1M, pH 8, chlorowodorek trizmy i zasada trizmy</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>A3059</td><td>Seryjna albumina wołowa</td></tr><tr><td>APS</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>A3678</td><td>Roztwór persiarczanu amonu</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>87689</td><td>N,N,N',N'-Tetrametyloetylenodiamina</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Sprzęt&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Sonicator (końcówka 3 mm)</td><td>Sonics Materials, Inc., Newtown, CT, USA</td><td>Vibra-Cell</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>Neslab EX-7</td><td></td></tr><tr><td>Ekstruder</td><td>Northern Lipids, Burnaby, BC, Canada</td><td>LIPEX</td><td></td></tr><tr><td>Filtry do ekstrudera</td><td>Whatman, Piscataway, NJ, USA</td><td>Nuclepore #110605 i #110606</td><td></td></tr><tr><td>Tarcza odpływowa ekstrudera</td><td>Sterlitech Corporation, Kent, WA, USA</td><td>#PETEDD25100</td><td></td></tr><tr><td>Komora plastikowa</td><td>U.S. Plastic Corporation, Lima, OH, USA</td><td>#55288, 1 3/16&quot;x1 3/16&quot;x2 7/16&quot;</td><td></td></tr></tbody></table>

synteza nanoemulsji przesunięcia fazowego o wąskim rozkładzie wielkości do akustycznej waporyzacji kropli i ablacji wspomaganej ultradźwiękami z wykorzystaniem pęcherzyków

Synthesis of Phase-shift Nanoemulsions with Narrow Size Distributions for Acoustic Droplet Vaporization and Bubble-enhanced Ultrasound-mediated Ablation

Skupiona ultradźwiękowa terapia wysokiej intensywności (HIFU) jest stosowana klinicznie do ablacji termicznej guzów. W celu wzmocnienia lokalnego nagrzewania i poprawy efektywności ablacji termicznej w guzach opracowano krople perfluorowęglowodorów pokryte lipidami, które mogą ulegać odparowaniu pod wpływem HIFU. Układ naczyniowy w wielu guzach wykazuje nieprawidłową przepuszczalność ze względu na ich szybki wzrost, co pozwala nanocząsteczkom przenikać przez fenestracje i pasywnie gromadzić się w obrębie nowotworu. Zatem kontrola rozmiaru kropel może prowadzić do ich lepszej akumulacji w guzach. W niniejszym raporcie opisano przygotowanie stabilnych kropel w nanoemulsji zmieniającej fazę (PSNE) o wąskim rozkładzie wielkości. PSNE syntetyzowano poprzez sonikację roztworu lipidów w obecności ciekłego perfluorowęglowodoru. Wąski rozkład wielkości uzyskano poprzez wielokrotną ekstruzję PSNE przy użyciu filtrów o rozmiarze porów 100 lub 200 nm. Rozkład wielkości mierzono przez okres 7 dni za pomocą dynamicznego rozpraszania światła. Do eksperymentów in vitro przygotowano hydrożele poliakryloamidowe zawierające PSNE. Krople PSNE w hydrożelach odparowano za pomocą ultradźwięków, a powstałe pęcherzyki wzmocniły lokalne nagrzewanie. Odparowane PSNE umożliwia szybsze nagrzewanie oraz redukuje intensywność ultradźwięków niezbędną do ablacji termicznej. W związku z tym oczekuje się, że PSNE wzmocni ablację termiczną w guzach, potencjalnie poprawiając wyniki terapeutyczne zabiegów ablacji termicznej wspomaganej HIFU.

Nanoemulsje przesunięcia fazowego (PSNE) mogą być waporyzowane przy użyciu wysokointensywnego skupionego ultradźwięku w celu wzmocnienia lokalnego ogrzewania i poprawy ablacji termicznej w guzach. W niniejszym raporcie opisano przygotowanie stabilnych PSNE o wąskim rozkładzie wielkości. Ponadto zademonstrowano wpływ waporyzowanych PSNE na ablację indukowaną ultradźwiękami w fantomach imitujących tkankę.

Synteza nanoemulsji przesunięcia fazowego o wąskim rozkładzie wielkości do akustycznej waporyzacji kropli i ablacji wspomaganej ultradźwiękami z wykorzystaniem pęcherzyków

Wysoko intensywny ultradźwięk skupiony (HIFU) jest stosowany w praktyce klinicznej do ablacji termicznej guzów. Aby zwiększyć lokalne nagrzewanie i poprawić efektywność ablacji termicznej w...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest obserwacja wpływu pęcherzyków generowanych akustycznie poprzez waporyzację nanoemulsji powlekanych lipidami na ablację wspomaganą ultradźwiękami. Osiąga się to najpierw poprzez rozproszenie nanoemulsji powlekanych lipidami w hydrożelach poliakrylamidowych obciążonych albuminą. W drugim kroku skupiający przetwornik wysyła do hydrożelu krótkie impulsy o wysokiej amplitudzie, które powodują lokalną waporyzację nanoemulsji w ognisku; następnie powstałe pęcherzyki są stale pobudzane ultradźwiękami, a promieniowana przez nie energia akustyczna jest szybko pochłaniana przez hydrożel, co przyspiesza tempo nagrzewania wspomaganego ultradźwiękami.Wyniki pokazują, że obecność pęcherzyków drastycznie skraca czas i zmniejsza energię potrzebną do podgrzania hydrożelu powyżej temperatury progowej denaturacji białek, co skutkuje szybszą i bardziej wydajną ablacją wspomaganą ultradźwiękami. Rozmiar nanoemulsji z przesunięciem fazowym jest krytycznym czynnikiem determinującym próg ciśnienia. W celu przeprowadzenia waporyzacji akustycznej opracowaliśmy protokół wytwarzania stabilnych nanoemulsji z przesunięciem fazowym o wąskim rozkładzie wielkości cząstek i dobrze określonych progach waporyzacji, a także system in vitro do oceny wpływu na ablację ośrodka ultradźwiękowego.Choć opisano układ in vitro, nanoemulsje fazowo-przejściowe są zaprojektowane tak, aby docierać do tkanek pozanaczyniowych i guzów litych za pomocą cząstek, które można odparować akustycznie. Powstałe pęcherzyki mogą być następnie wykorzystywane w zastosowaniach diagnostycznych lub terapeutycznych w leczeniu nowotworów. Aby rozpocząć procedurę przygotowania nanoemulsji fazowo-przejściowej (PSNE), najpierw wymieszaj lipidy, rozpuszczając 11 mg DPPC i 1,7 mg DSPE.Peg 2000 w chloroformie w szklanej kolbie okrągłodennej. Umieść kolbę okrągłodenną w kąpieli wodnej o temperaturze 50 °C w dygestorium i użyj strumienia argonu do odparowania rozpuszczalnika organicznego. Aby utworzyć suchy film lipidowy, umieść kolbę w eksykatore i pozostaw pod próżnią przez noc, aby osuszyć film lipidowy następnego ranka.Rehydratyzuj film lipidowy, dodając 5,5 milliliters PBS. Podgrzewaj roztwór w kąpieli wodnej o temperaturze 45 °C aż do rozpuszczenia filmu lipidowego. Przelej roztwór lipidowy do fiolki o pojemności siedmiu mililitrów, a następnie poddaj sonikacji za pomocą sonikatora głowicowego przez dwie minuty przy amplitudzie 20%.Rozdziel roztwór do dwóch probówek, po 2,5 mililitra do każdej. Pozostałe 0,5 mililitra należy odrzucić. Do każdej probówki dodaj 2,5 mililitra PBS, a następnie umieść obie probówki w łaźni lodowej o temperaturze zero stopni Celsjusza.Do każdej probówki dodaj 50 µL dokafluoropentanu (DDFP). To etap przygotowania mieszaniny lipidowej DDFP. Utrzymywanie próbek w kąpieli wodno-lodowej jest najbardziej krytycznym elementem tej procedury.Kąpiel wodno-lodowa jest stosowana w celu zapobiegania odparowywaniu ciekłego perfluorowęglowodoru. Podczas tego procesu każdą fiolkę w kąpieli wodno-lodowej poddaje się sonikacji przy następujących ustawieniach: amplituda 25%, tryb impulsowy, całkowity czas 60 sekund. Po sonikacji roztwór PSNE przenosi się do 20 mililitrowych fiolek scyntylacyjnych, dodając do każdej fiolki 5 mililitrów PBS, co daje objętość końcową 10 mililitrów na fiolkę.Zmontuj ekstruder zgodnie z instrukcjami producenta, aby go zaprzesić. Pipetuj 10 milliliters wody dejonizowanej do górnego otworu na próbkę. Zamknij otwór i dokręć zawór odpowietrzający.Powoli otwórz linię z azotem, aby zwiększyć ciśnienie i wymusić przepływ próbki przez membrany. Zbierz próbkę z rurki wylotowej, a następnie przeciskaj PSNE 16 razy przez filtr o rozmiarze 100 nanometrów lub 200 nanometrów, aby uzyskać wąski rozkład wielkości cząstek. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania hydrożelu z poliakryloamidu zawierającego PSNE.Najpierw przygotuj 24% roztwór albuminy surowicy bydlęcej (BSA), rozpuszczając 2,4 g proszku BSA w 10 ml wody dejonizowanej. Następnie przygotuj 10% roztwór raźnika amonowego (PS), rozpuszczając 1 g proszku PS w 10 ml wody dejonizowanej. Wymieszaj te odczynniki w plastikowej formie w następującej kolejności: 2,1 ml roztworu akryloamidu, 1,2 ml buforu Tris, 0,1 ml 10% roztworu PS, 4,5 ml 24% roztworu BSA oraz 3,6 ml wody dejonizowanej. Podgrzej roztwór do 40 °C w łaźni wodnej, a następnie poddaj działaniu próżni przez jedną godzinę w celu odgazowania cieczy.Jest to niezbędne, aby uniknąć niepożądanego tworzenia się pęcherzyków powietrza wewnątrz hydrożelu po godzinie. Wyjąć z próżni, dodać 480 µL zawiesiny PSNE i dokładnie wymieszać, delikatnie obracając plastikową komorę. W dygestorium dodać 12 µL tetraetylenodiaminy (TEMED) w celu polimeryzacji akryloamidu, a następnie umieścić komorę w kąpieli wodnej o temperaturze 12 °C na dwie godziny.Polimeryzacja jest procesem egzotermicznym, dlatego konieczne jest zastosowanie kąpieli chłodzącej, aby uniknąć odparowania PSE podczas polimeryzacji. Po spolimeryzowaniu akrylamidu ustawić przetwornik mocy o skupionej wiązce oraz sondę obrazującą w akrylowym zbiorniku wypełnionym odjonizowaną wodą DGA w taki sposób, aby płaszczyzna obrazowania pokrywała się z objętością ogniskową przetwornika. Następnie umieścić hydrożel poliakrylamidowy z załadowanym PSNE w ognisku przetwornika mocy, odparować PSNE wewnątrz hydrożelu za pomocą krótkich impulsów akustycznych, a następnie zastosować 15-sekundową ekspozycję falą ciągłą w celu ablacji wspomaganej pęcherzykami.W miarę denaturacji BSA hydrożel staje się nieprzezroczysty z powodu absorpcji ultradźwięków i generowania ciepła podczas monitorowania waporyzacji i tworzenia się pęcherzyków za pomocą diagnostycznego skanera ultradźwiękowego. Na tym przykładowym obrazie strzałka wskazuje obszar ogniskowy, w którym powstała chmura pęcherzyków w wyniku waporyzacji PSNE. Powtórz ekspozycję akustyczną w nowym miejscu w hydrożelu, zwiększając stężenie PSNE, aby porównać czas i objętość ablacji.Niniejszy protokół pozwala na otrzymanie kropli perfluorowęglowych powlekanych lipidami o wąskim rozkładzie wielkości. Przedstawiono tutaj rozkład wielkości zmierzony za pomocą dynamicznego rozpraszania światła dla PSNE otrzymanych przy użyciu filtrów o porach 100 i 200 nanometrów. Jednostki osi rzędnych opierają się na intensywności światła rozproszonego przez cząstki o danej wielkości w stosunku do całkowitej intensywności światła rozproszonego z próbki.Gdy średnica i odchylenie standardowe PSNE w pierwszym i siódmym dniu po ekstruzji przez filtry o rozmiarach 100 i 200 nanometrów są mierzone za pomocą dynamicznego rozpraszania światła, wyniki wykazują, że PSNE są stabilne przez co najmniej tydzień. Na tej rycinie przedstawiono obrazy w trybie B PSNE przed i po waporyzacji. W hydrożelu z poliakryloamidu strzałka wskazuje obszar ogniskowania, w którym w wyniku waporyzacji PSNE utworzyła się chmura pęcherzyków.Są to obrazy hydrożelu poliakrylamidowego zawierającego albuminę i PSNE przed oraz po waporyzacji i sonikacji za pomocą wysokointensywnego skupionego ultradźwięku (HiFu). Uszkodzenie powstaje w wyniku 15-sekundowego ogrzewania za pośrednictwem HiFu. Asymetryczny kształt uszkodzenia jest wynikiem ogrzewania przedogniskowego, które występuje z powodu obecności chmury pęcherzyków na drodze ultradźwięków. Ogrzewanie przedogniskowe oraz powstawanie uszkodzeń wynikających z rozproszenia przez pęcherzyki można zminimalizować poprzez zmniejszenie transmitowanej mocy akustycznej po ich powstaniu.Ta metoda wytwarzania stabilnych nanoemulsji z przesunięciem fazowym utoruje drogę badaczom w dziedzinie terapii wspomaganej ultradźwiękami do eksploracji ablacji HIFU wspomaganej pęcherzykami w guzach litych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak wytwarzać stabilne nanoemulsje z przesunięciem fazowym o wąskim rozkładzie rozmiarów oraz jak badać nukleację pęcherzyków i wzmocnioną ablację wspomaganą ultradźwiękami.

synthesis-phase-shift-nanoemulsions-with-narrow-size-distributions

Research

JoVE Journal

Engineering

Inżynieria

Synteza nanoemulsji przesuniętych fazowo o wąskim rozkładzie wielkości kropel do akustycznej parowania kropli i ulepszania ultradźwięków poprzez tworzenie pęcherzyków

Tutaj prezentujemy krok po kroku protokół dyspersji nanomateriałów w środowisku wodnym z charakterystyką w czasie rzeczywistym w celu określenia optymalnych warunków sonikacji, intensywności i czasu trwania dla poprawy stabilności i jednorodności dyspersji nanocząstek bez wpływu na integralność próbki.

Dyspersja nanomateriałów w środowisku wodnym: w kierunku optymalizacji protokołu

Ten protokół demonstruje kontrolowane zarodkowanie kawitacji w fantomach żelowych, poprzez jednoczesną ekspozycję zarówno na pulsacyjne światło laserowe bliskiej podczerwieni, jak i skoncentrowane ultradźwięki o wysokiej intensywności (HIFU). Aktywność kawitacyjna może być następnie wykorzystana do poprawy obrazowania i/lub zastosowań terapeutycznych HIFU.

Kontrolowane zarodkowanie kawitacji z nanocząstek plazmonicznego złota w celu wzmocnienia zastosowań ultradźwięków o wysokiej intensywności

Przedstawiono protokół manipulowania mikrocząstkami w kanale mikroprzepływowym z wzbudzeniem o podwójnej częstotliwości.

Manipulacja mikrocząstkami poprzez powierzchniowe fale akustyczne z wzbudzeniami o podwójnej częstotliwości

Prezentowany protokół eksperymentalny może być wykorzystany do wykonywania pomiarów aktywności kawitacyjnej w czasie rzeczywistym w urządzeniu do hodowli komórkowej w celu umożliwienia zbadania warunków wymaganych do skutecznego dostarczania leku i/lub innych efektów biologicznych.

Studiowanie terapii wzmocnionej kawitacją

Zaproponowano szybką i niezawodną technikę kontrolowania oscylacji kształtu pojedynczej, uwięzionej bańki akustycznej, która opiera się na technice koalescencji między dwoma bąbelkami. Oscylacje kształtu pęcherzyków w stanie ustalonym, kontrolowane symetrią umożliwiają analizę przepływu płynu generowanego w pobliżu granicy faz pęcherzyków.

Indukcja mikrostrumieniowania przez niesferyczne oscylacje pęcherzykowe w systemie lewitacji akustycznej

Ten protokół opisuje metodę generowania dużych ilości mikropęcherzyków dekafluorobutanu zamkniętych w lipidach za pomocą sonikacji końcówki sondy, a następnie kondensacji ich w nanokropelki z przesunięciem fazowym za pomocą wytłaczania wysokociśnieniowego i filtracji mechanicznej.

Produkcja nanokropelek dekafluorobutanu z filtrem membranowym z przesunięciem fazowym z wstępnie uformowanych mikropęcherzyków

Przedstawione protokoły mogą być użyte do scharakteryzowania reakcji znakowanych fluorescencyjnie mikropęcherzyków przeznaczonych do zastosowań związanych z dostarczaniem leków wyzwalanych ultradźwiękami, w tym ich mechanizmów aktywacji, jak również ich efektów biologicznych. W artykule omówiono szereg technik mikroskopii in vitro i in vivo wykonanych w celu uchwycenia odpowiednich długości i skal czasowych.

Wieloczasowe metody mikroskopowe do charakterystyki mikropęcherzyków znakowanych fluorescencyjnie do uwalniania leków wywołanego ultradźwiękami

W tym protokole opisane są metody syntezy i charakterystyki kropel porfiryny o wielomodalnej przemianie fazowej.

Synteza i charakterystyka multimodalnych kropelek porfiryny zmiennofazowej

Optycznie aktywowane nanokropelki perfluorocarbonu są obiecujące w zastosowaniach obrazowania poza układem naczyniowym. W tym artykule pokażemy, jak syntetyzować te cząstki, sieciować fantomy poliakrylamidu i modulować kropelki akustycznie, aby wzmocnić ich sygnał.

Formulacja i modulacja akustyczna optycznie odparowanych nanokropel perfluorowęglowodoru

Celem niniejszego eksperymentu jest określenie i kontrolowanie wielkości, kształtu oraz stabilności samoorganizujących się amfifili dyskotycznych w wodzie. W przypadku wodnych polimerów supramolekularnych osiągnięcie takiego poziomu kontroli jest bardzo trudne. Zastosowano strategię wykorzystującą zarówno oddziaływania odpychające, jak i przyciągające. Techniki eksperymentalne użyte do charakterystyki tego układu mają szerokie zastosowanie.

Kontrola rozmiaru, kształtu i stabilności polimerów supramolekularnych w wodzie

Poznaj metodę syntezy stabilnych nanoemulsji z przesunięciem fazowym o wąskim rozkładzie wielkości do akustycznego parowania kropelek i ablacji ultradźwiękowej wzmocnionej pęcherzykami w badaniach nad nowotworami.

Synteza nanoemulsji z przesunięciem fazowym o wąskim rozkładzie wielkości do akustycznej parowania kropelek i ablacji ultradźwiękowej wzmocnionej pęcherzykami (Wideo) | JoVE Journal

Synteza nanoemulsji przesunięcia fazowego o wąskim rozkładzie wielkości do akustycznej waporyzacji kropli i ablacji wspomaganej ultradźwiękami z wykorzystaniem pęcherzyków

Przeglądaj więcej filmów