Symultaniczne rejestrowanie wewnątrzkomórkowe lędźwiowego motoneuronu oraz siły generowanej przez jego jednostkę motoryczną u dorosłej myszy in vivo

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie właściwości elektrofizjologicznych i kurczliwych pojedynczej jednostki motorycznej myszy poprzez przeprowadzenie wewnątrzkomórkowych pomiarów neuronów ruchowych in vivo. W tym celu w pierwszej kolejności odsłania się rdzeń kręgowy oraz wybrany mięsień. Następnie do ścięgna mięśnia mocuje się przetwornik siły.

Następnie neuron ruchowy jest stymulowany za pomocą elektrody wewnątrzkomórkowej, co powoduje skurcz rejestrowanej jednostki motorycznej. W rezultacie właściwości elektrofizjologiczne neuronu ruchowego mogą zostać scharakteryzowane jednocześnie z właściwościami skurczowymi jego jednostki motorycznej. Wizualna prezentacja tej techniki jest kluczowa, ponieważ etapy mikrochirurgiczne są bardzo trudne do opanowania ze względu na niewielki rozmiar zwierzęcia.

Aby rozpocząć procedurę, znieczul mysz, wstrzykując dootrzewnowo pentobarbital sodu lub mieszankę ketaminy i ksylazyny. Upewnij się, że mysz nie wykazuje odruchu wycofywania łapy po uciśnięciu palca. Następnie wykonaj nacięcie nad tchawicą za pomocą tępych nożyczek i odsunie skórę na obie strony.

Następnie rozdziel gruczoł ślinowy za pomocą tępych pęsety. Aby odsłonić dwa cienkie mięśnie pokrywające tchawicę, rozsuń oba mięśnie, odsłaniając tchawicę. Użyj do tego pęsety Dumont nr 7.

Przesuń dwie nici jedwabnej szwy chirurgicznej 4-0 pod tchawicą. Następnie wykonaj cięcie poprzeczne tchawicy pomiędzy dwoma pierścieniami chrzęstnymi. Należy jednak uważać, aby nie przeciąć tchawicy całkowicie.

Następnie wprowadź rurkę intubacyjną do tchawicy. Zabezpiecz obie strony otworu wprowadzenia, zawiązując nad nim szwy. Po tym etapie podłącz rurkę intubacyjną do respiratora dla myszy oraz kapnografu.

Następnie podłącz respirator do czystego tlenu za pomocą worka amortyzującego. Dostosuj parametry respiratora w taki sposób, aby mysz nie walczyła z wentylacją mechaniczną, a ciśnienie parcjalne dwutlenku węgla w powietrzu wydychanym pozostawało stabilne w granicach 4–5%. W tym kroku odsłoń żyłę szyjną po jednej stronie szyi, stosując techniki tępej dyssekcji.

Żyła szyjna dzieli się na dwa główne pnie: żyłę twarzową przednią i tylną. Ostrożnie oddziel żyłę od otaczającej ją tkanki łącznej. Następnie przesuń dwie nici jedwabne 6-0 pod żyłą, rozmieszczając je w jak największej odległości od siebie wzdłuż jej długości.

Następnie należy założyć mały klips naczyniowy na bliższym odcinku żyły i podwiązać jej odcinek dalszy. Za pomocą bardzo drobnych nożyczek irydowych wykonuje się niewielkie cięcie poprzeczne w żyle. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie przeciąć żyły całkowicie.

Następnie wprowadź wypełniony cewnik o rozmiarze 1 French do otworu, aż do klipsa naczyniowego utrzymującego żyłę i cewnik razem. Ostrożnie usuń klips naczyniowy. Następnie przesuń cewnik o kilka kolejnych milimetrów do wnętrza żyły. Zabezpiecz cewnik, wiążąc go szwami po obu stronach miejsca wprowadzenia.

Następnie jeden z cewników należy połączyć ze strzykawką lub pompą strzykawkową w celu podawania dodatkowych dawek środków znieczulających, takich jak pentobarbital sodu lub ketamina z ksylazyną. Procedurę powtarza się dla kolejnej żyły, a drugi cewnik podłącza do pompy strzykawkowej w celu powolnej infuzji dożylnej 4% roztworu glukozy zawierającego 1% wodorowęglanu sodu i 14% plasmonu. Na koniec skórę w okolicy szyi zamyka się szwem za pomocą igły.

Następnie ułożyć mysz w pozycji brzusznej. Teraz wykonać nacięcie od górnej części uda do ścięgna Achillesa. Oddzielić skórę od leżących poniżej mięśni, uważając, aby nie uszkodzić naczyń krwionośnych.

Następnie zidentyfikuj przednią krawędź mięśnia dwugłowego uda, która przejawia się jako biała linia biegnąca wzdłuż uda. Następnie ostrożnie wykonaj nacięcie wzdłuż tej linii od kolana aż do kości biodrowej. Rozsuń mięśnie, aby odsłonić nerw kulszowy znajdujący się pod mięśniem dwugłowym uda.

Ostrożnie wypreparuj i usuń mięsień dwugłowy uda. Aby odsłonić nerw kulszowy i mięśnie trójgłowe łydki, zidentyfikuj nerw piszczelowy znajdujący się pomiędzy wspólnym nerwem strzałkowym a nerwem skórnym łydki. Spośród różnych gałęzi nerwu piszczelowego zidentyfikuj gałęzie unerwiające mięsień trójgłowy łydki, odróżniając je od gałęzi biegnących głębiej.

Używając nici jedwabnej OTT o grubości ośmiu, zwiąż wszystkie gałązki nerwu piszczelowego, pozostawiając nienaruszone gałązki unerwiające mięsień trójgłowy łydki. Przetnij nerw piszczelowy w jak największej odległości od węzła. Zidentyfikuj kręgi T 13 i L 1, przyjmując, że T 13 jest ostatnim kręgiem, do którego przytwierdzone są żebra.

Następnie unieruchom kręgosłup za pomocą klamer kręgowych do rdzenia kręgowego Cunninghama po obu stronach T 13 i L 1. Należy uważać, aby nie ucisnąć rdzenia kręgowego, lecz zastosować niewielkie napięcie wzdłuż osi podłużnej. Upewnij się, że kręgosłup jest dobrze zabezpieczony, delikatnie dociskając go pęsetą.

Używając precyzyjnych kleszczyków R, usuń wyrostki kolczyste, a następnie blaszki łukowe na wysokości T 13 i L 1, aby odsłonić rdzeń kręgowy. Następnie umieść wykonaną na zamówienie plastikową kąpiel, aby otoczyła rdzeń kręgowy. Po tym czasie przymocuj kąpiel w tym miejscu, używając nici jedwabnej 4-0.

Na koniec należy upewnić się, że komora jest wodoszczelna, uszczelniając ją uszczelniaczem szybkowiążącym. Po wyschnięciu uszczelniacza należy usunąć watę pokrywającą rdzeń kręgowy i napełnić komorę olejem mineralnym. Użyj kolejnego zacisku kręgowego, aby przymocować wyrostek kolczysty w odcinku krzyżowym.

Aby ustabilizować tylny region zwierzęcia, należy użyć trzeciego zacisku do unieruchomienia prawej kończyny tylnej i stawu skokowego, zginając kolano pod kątem 90 stopni oraz staw skokowy pod kątem 90 stopni. Usunąć gazę zakrywającą obszar kończyny tylnej. Wypreparować ścięgno Achillesa z otaczających go tkanek.

Wyciąć mięsień trójgłowy z otaczających go tkanek w możliwie największym stopniu, używając nawleczonej igły. Przeciągnąć jedwabną nić chirurgiczną o rozmiarze 6/0 przez ścięgno Achillesa i zawiązać potrójny węzeł wokół ścięgna. Następnie umieścić przetwornik siły blisko węzła.

Następnie przymocuj ścięgno do przetwornika siły za pomocą jedwabnej nici i odetnij jego część dystalną. W kolejnym kroku wprowadź dwa druty ze stali nierdzewnej pod powięź mięśni triceps surae. Druty te są podłączone do pozakomórkowego wzmacniacza prądu przemiennego (AC).

W celu rejestracji EMG umieść nerw mięśnia trójgłowego łydki na katodzie elektrody hakowej, tak aby anoda dotykała sąsiedniego mięśnia. Następnie stymuluj nerw mięśnia trójgłowego łydki za pomocą prostokątnych impulsów o czasie trwania 50 microsecond i rosnącym natężeniu przy niskiej częstotliwości, aż do zaobserwowania maksymalnej amplitudy skurczu. Następnie stymuluj nerw mięśnia trójgłowego łydki za pomocą prostokątnych impulsów o czasie trwania 50 microsecond i rosnącym natężeniu przy niskiej częstotliwości, aż do zaobserwowania maksymalnej amplitudy skurczu.

Ryciny te pokazują, jak zidentyfikować motoneuron z grupy mięśnia trójgłowego ramienia. Po penetracji przy niskiej intensywności stymulacji, dopiero przy wyższej intensywności można zaobserwować jednosynaptyczny EPSP. EPSP może być wystarczająco duży, aby wywołać ortotropowy potencjał czynnościowy przy jeszcze wyższej intensywności stymulacji, zgodnie z prawem wszystko albo nic.

Kolcz nadprzewodzący pojawia się z krótszą latencją niż monosynaptyczny EPSP. Jeśli przez mikroelektrodę zostanie wprowadzony prąd wystarczający do wywołania kolca, w mięśniu można zarejestrować aktywność EMG po krótkim opóźnieniu, po której następuje drgnięcie mięśnia.

Po zidentyfikowaniu neuronu ruchowego można określić jego właściwości elektrofizjologiczne. Na przykład, niniejsza rycina obrazuje, w jaki sposób można zmierzyć oporność wejściową, wykorzystując hiperpolaryzujące i depolaryzujące impulsy prądu oraz wykreślając zmiany potencjału błonowego w zależności od ilości wstrzykniętego prądu. Właściwości kurczliwe jednostki ruchowej można również badać, stosując różne protokoły stymulacji.

Na przykład relację siła-częstotliwość można uzyskać poprzez wstrzykiwanie krótkich impulsów prądu o różnych częstotliwościach do neuronu ruchowego. Następnie można nanieść siłę w stanie ustalonym na wykres w funkcji częstotliwości impulsów prądu, aby otrzymać sigmoidalną krzywą siła-częstotliwość. Po opanowaniu techniki chirurgicznej, część tej procedury może zostać wykonana w trzy godziny, jeśli zostanie przeprowadzona prawidłowo.