Przenoszenie wirusów roślinnych za pomocą mączlików

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest przenoszenie wirusów roślinnych za pomocą mączlików. Osiąga się to poprzez stworzenie i utrzymanie kolonii mączlików dostarczających w cotygodniowych odstępach czasu nowo wyklute dorosłe osobniki, które nie są zanieczyszczone innymi potencjalnymi wektorami i patogenami. Kolonie są utrzymywane poprzez regularne wprowadzanie mączlików na młode rośliny wolne od owadów, z których następnie powstają nowe dorosłe osobniki.

Po 17 do 20 dniach każdego tygodnia nowo wyklute osobniki dorosłe można przenieść na rośliny testowe w celu nabycia lub przeniesienia wirusa. Zazwyczaj uzyskuje się efektywność bliską 100%, a wskaźniki transmisji zazwyczaj zaczynają się od niskich wartości i rosną wraz z systematyczną optymalizacją. Najtrudniejszym aspektem wykorzystania mączlików do inokulacji wirusów jest hodowla mączlików w sposób wykluczający niepożądane patogeny i owady.

Patogeny, w szczególności grzyby powodujące zgniliznę korzeni oraz parcha liści, obniżają jakość roślin gospodarzy wirusa. Niepożądane owady, takie jak mączniki, mogą hamować reprodukcję mączlika oraz pogarszać kondycję rośliny gospodarza wirusa. Procedury zaprezentuje Heather Capa Bianco, technik z mojego laboratorium.

Kolonie mączlików należy utrzymywać w czystej i kontrolowanej pomieszczeniu wzrostowym. Kontrola wilgotności względnej, temperatury, fotoperiodu oraz natężenia światła jest niezbędna dla kolonii, która rozwija się z jaja do postaci dorosłej w ciągu 18 dni; należy zastosować następujące ustawienia. Temperaturę należy ustawić w zakresie od 26 do 30 °C, a wilgotność względna powinna wynosić idealnie od 30 do 50%. Jeśli wilgotność względna przekroczy 70%, prawdopodobnym problemem mogą stać się patogeny grzybowe atakujące owady i rośliny.

Idealny fotoperiod wynosi 14 godzin. Natężenie światła powinno być dość wysokie; świetlówki VHO mogą zapewnić od 800 do 1000 foot candles na poziomie korony roślin. Należy również ograniczyć dawki nawozów i podlewanie, aby zapobiec rozwojowi patogenów grzybowych oraz akumulacji soli. Klatki Whitely muszą zapewniać wentylację, łatwy dostęp oraz wystarczającą przestrzeń dla rosnącej populacji whitely.

Dobre wyniki uzyskano przy zastosowaniu organzy oraz siatki aluminiowej, jak również białej siatki ochronnej. Wybór gatunku rośliny jest istotnym aspektem. Po pierwsze, roślina powinna szybko rosnąć, ale nie może nadmiernie wypełnić komory. Po drugie, roślina musi być wystarczająco silna, aby utrzymać liczną populację owadów bez więdnięcia.

Z tych powodów odpowiednim wyborem roślin są odmiany karłowate lub krzewiaste. Po trzecie, roślina musi być albo podatna, albo odporna na stosowany wirus, w zależności od rodzaju hodowanej kolonii. Ponieważ kolonia może ulec załamaniu z powodu roztoczy, THP, dzikich mączników lub innych inwazyjnych owadów, wybrane odmiany muszą być uprawiane w środowisku chronionym w celu wykluczenia obecności innych owadów.

Pierwsze mączniki z nowej kolonii muszą być wolne od wirusów roślin, innych owadów oraz patogenów owadziej natury. Jeśli mączniki zostaną zebrane z pola, należy je hodować przez co najmniej osiem tygodni na roślinach, które w tym czasie nie są gospodarzami danego wirusa, kontrolując jednocześnie brak objawów chorobowych u roślin. Po uzyskaniu czystych mączników, należy wprowadzić od 20 do 100 osobników do klatki z roślinami za pomocą aspiratora lub delikatnie strząsając je z innej rośliny źródłowej.

W każdym tygodniu należy przygotować nową klatkę. Przez pierwsze trzy tygodnie do zasiedlenia nowej klatki należy wykorzystać mączniki na roślinach non-ST. Począwszy od czwartego tygodnia, do zasiedlenia kolejnej klatki należy wykorzystać młode dorosłe mączniki z klatki trzytygodniowej.

Podczas pierwszego tygodnia w klatce mączniki pszeniczne złożą jaja na spodniej stronie liści roślin. W drugim tygodniu pojawią się niedojrzałe osobniki mącznika, a część dorosłych osobników nadal będzie żywa. W trzecim tygodniu wykluje się wiele nowych dorosłych mączników, co powinno spowodować bardzo wyraźny wzrost populacji dorosłych osobników mącznika pszenicznego.

Te mączniki mogą być wykorzystane w eksperymentach z transmisją. W czwartym tygodniu osobniki dorosłe w wieku jednego tygodnia należy przenieść do nowej klatki. Starą klatkę należy usunąć, a znajdujące się w niej rośliny zutylizować. Precyzyjnie.

Delikatny transfer mszarzyków przeprowadza się za pomocą urządzenia aspiracyjnego i probówek zbiorczych; nigdy nie należy stosować gwałtownej aspiracji. Mszarzyki żerujące na roślinach są w nie wniknięte podczas karmienia i zostaną uszkodzone, jeśli zostaną gwałtownie odciągnięte, co czyni je bezużytecznymi. Aby zebrać mszarzyki, jedną ręką trzymaj żółtą plastikową osłonę wewnątrz klatki z kolonią, a drugą ręką wykonuj aspirację.

Delikatnie opukaj rośliny, aby pobudzić dorosłe mączniki do lotu. Mączniki zostaną zwabione na żółtą kartkę, gdzie będzie można je zebrać. Używając aspiratora i bardzo słabego ssania, przenieś nie więcej niż 20 mączników do każdej probówki zbiorczej.

Następnie należy lekko stuknąć fiolką, aby zdezorientować muchówki, i zamknąć ją korkiem z parafiny. Aby zapewnić skuteczną transmisję wirusa, należy przenieść od 15 do 40 młodych osobników dorosłych z roślin zainfekowanych wirusem na rośliny zdrowe, w zależności od rodzaju wirusa i rośliny żywiciela. Inne protokoły, takie jak przesiewanie pod kątem odporności, wymagają większych populacji startowych.

W tym przypadku należy potrząsnąć roślinami zainfekowanymi wirusem, na których znajdują się mączniki, nad roślinami przeznaczonymi do inokulacji. Po umieszczeniu mączników na roślinie zainfekowanej wirusem, należy pozostawić je do żerowania przez 48 do 72 godzin, aby nabyły wirusy przenoszone w sposób trwały. Dłuższy czas zazwyczaj nie zwiększa tempa transmisji w przypadku wirusów przenoszonych w sposób nietrwały lub półtrwały.

Krótszy okres dostępu do nabywania, od godziny do jednego dnia, będzie wystarczający dla eksperymentów wymagających nabywania z konkretnych liści. Można zastosować klatki zaciskowe; należy ustawić klatkę tak, aby spód liścia był dostępny, i nie używać więcej niż 10 samic mszarek niż 2,5 centymetra średnicy klatki, w przeciwnym razie wskaźnik transmisji spadnie z powodu przeludnienia. W przypadku inokulacji roślin należy dobrać odpowiednią klatkę, biorąc pod uwagę liczbę roślin.

Jedna roślina wymaga na przykład jedynie niewielkiej klatki, nieco większej od niej samej; w przypadku wielu roślin należy wybrać między mniejszą rurką z PVC, klatką ramową a większą klatką z aluminiową ramą. Im mniejsza przestrzeń wokół korony rośliny, tym lepiej. Po wprowadzeniu mączlików na nową roślinę czas potrzebny na inokulację zależy od wirusa i rośliny żywiciela.

Podobnie jak w przypadku nabywania wirusa, czas wymagany do jego transmisji zależy od sposobu przekazywania. Transmisja nieutrwalona wymaga znacznie krótszego czasu kontaktu niż transmisja półutrwalona lub utrwalona. Należy sprawdzić, czy mączniki podczas okresu dostępu do inokulacji badają roślinę lub się nią żywią.

Otwórz klatkę i obejrzyj spód kilku liści na każdej z roślin. W przypadku dłuższych okresów inokulacji okresowo i delikatnie poruszaj roślinami, aby zachęcić owady do ponownego rozprzestrzenienia się po roślinach.

Zwiększy to tempo transmisji poprzez przeciwdziałanie naturalnej tendencji mączlików do agregowania się pod koniec okresu inokulacji. Wyeliminuj mączliki za pomocą dwóch zastosowanych kolejno insektycydów. W pierwszej kolejności zastosuj insektycyd kontaktowy, taki jak mydło insektycydowe, aby szybko zwalczyć dorosłe osobniki mączlika.

Po drugie, należy zastosować systemiczny insektycyd, aby zwalczyć wszystkie mączniki pszeniczne, które pojawią się w kolejnych tygodniach. W przypadku pozostałych osobników dorosłych skutecznym wyborem są imidaklopryd lub piraksamina. Stosując te procedury, można rutynowo uzyskiwać wskaźniki transmisji wirusa na poziomie 100%. Tak wysokie wskaźniki transmisji są niezbędne podczas przesiewowej oceny roślin testowych pod kątem odporności na wirusy oraz pożądane przy ocenie skuteczności związków chemicznych w zakresie ich zdolności do hamowania transmisji wirusa.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat hodowli mączlików oraz ich wykorzystania do przenoszenia wirusów roślinnych. Procedury te mogą być stosowane w celach badawczych, w komercyjnym opracowywaniu roślin odpornych na wirusy lub w testowaniu związków pod kątem ich zdolności do hamowania transmisji wirusów.