Name: Przenoszenie wirusów roślinnych za pomocą mączlików (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-08T08:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Poznaj metody hodowli mączlików Bemisia tabaci do przenoszenia wirusów roślinnych w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych. Osiągnij niemal 100% skuteczność transmisji wirusów do roślin testowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Utrzymanie kolonii mączlika
<ol>
	<li>Warunki środowiskowe: Kolonie mszarzycy białej powinny być utrzymywane w kontrolowanej komorze wzrostowej. Kontrola wilgotności względnej, temperatury, fotoperiodu i natężenia światła jest niezbędna dla optymalnego wzrostu kolonii (Rycina 1). Temperatura 28 °C, wilgotność względna 30-50% oraz 14-godzinny fotoperiod pozwolą na rozwinięcie kolonii od jaja do pojawienia się osobników dorosłych w ciągu 18 dni (czas ten różni się w zależności od rośliny żywiciela). Wilgotność względna powinna być utrzymywana poniżej 70%, aby zapobiec rozwojowi grzybowych patogenów owadów i roślin. Należy ograniczyć dawki nawozów i podlewanie, aby zapobiec rozwojowi patogenów grzybowych i akumulacji soli. Natężenie światła dla kolonii powinno być dość wysokie. Lampy fluorescencyjne VHO użyte w wystarczającej liczbie, aby wygenerować około 800-1 000 ft candles na wysokości korony, są odpowiednie dla większości roślin (t.j. bawełny, fasoli zwyczajnej, fasoli lima, pomidora). Czystość jest niezbędna w kolonii mszarzycy białej w celu utrzymania optymalnych warunków hodowlanych.</li>
	<li>Klatki dla kolonii: Mszarzyce białe powinny być utrzymywane na roślinach w klatkach, a nie luzem w komorze wzrostowej. Klatki mogą być wykonane z różnych materiałów, ale muszą zapewniać: wentylację, łatwy dostęp, możliwość zapobiegania ucieczce lub infiltracji mszarzycy białej oraz mieć wystarczający rozmiar, aby pomieścić odpowiednią liczbę roślin niezbędną do wygenerowania potrzebnej populacji mszarzycy. Dobre wyniki uzyskano stosując organzę wraz z ekranem aluminiowym (dla wzmocnienia), a także siatki odporne na mszarzyce białe (patrz tabela konkretnego sprzętu i materiałów).</li>
	<li>Przygotowanie roślin dla kolonii: Wybór gatunku rośliny jest ważnym aspektem podczas zakładania kolonii mszarzycy białej. Roślina powinna być w stanie utrzymać wysoką populację owadów bez obumierania. Roślina wybrana dla kolonii niewirusowej powinna być nieżywicielem dla wirusa lub wirusów, które mają być transmitowane, aby uniknąć kontaminacji w kolonii, a w przypadku utrzymywania kolonii wirusowej, musi być ona żywicielem wirusa. Rośliny powinny rosnąć dość szybko, aby umożliwić pojawienie się nowych osobników dorosłych w ciągu 18 dni od wprowadzenia do kolonii, ale nie tak szybko, aby przerosły klatki w ciągu czterech tygodni. Zaleca się odmiany roślin karłowate, krzewiaste lub balkonowe, ponieważ często wytwarzają one powierzchnię liści podobną do odmian wyższych, ale bez wydłużania pędów.</li>
	<li>Bardzo ważne jest hodowanie roślin dla kolonii w szklarniach w klatkach, które wykluczają obecność mszarzycy białej i innych owadów. Użycie roślin zainfekowanych mszarzycyca białą, tripsami lub roztoczami przed ich wprowadzeniem do kolonii może doprowadzić do upadku kolonii. Rośliny zainfekowane mogą być również zakażone wirusami przenoszonymi przez owady, co zakłóci badania nad transmisją wirusów.</li>
</ol>
2. Zakładanie kolonii mączlików
<ol>
	<li>Załóż kolonię po raz pierwszy, wykorzystując czyste mączniki białinki – wolne od wirusów roślinnych, innych owadów oraz patogenów owadów. Można je pozyskać od współpracowników lub z terenu. W przypadku osobników zebranych w terenie, mączniki powinny być hodowane przez co najmniej 8 tygodni na roślinach niebędących żywicielami danego wirusa roślinnego; należy sprawdzić brak objawów u roślin, aby upewnić się, że owady są wolne od wirusów roślinnych.</li>
	<li>Tydzień 1: Wprowadź czyste mączniki białinki do pierwszej klatki z roślinami. Owady można wprowadzić poprzez aspirację określonej liczby osobników lub przez delikatne strząsanie mączników z innej rośliny źródłowej, w zależności od wymagań dotyczących kolonii. W ciągu 1. tygodnia mączniki składają jaja na spodniej stronie liści roślin. Przybliżoną liczebność populacji dla każdego wylotu można przewidzieć na podstawie liczby dorosłych osobników wykorzystanych do składania jaj oraz średniej liczby jaj składanych przez samicę mącznika białinki na danej roślinie żywicielskiej.</li>
	<li>Tydzień 2: Rozpocznij hodowlę w kolejnej klatce, wprowadzając mączniki na nowe rośliny żywicielskie w celu złożenia jaj. Rośliny w klatce założonej w 1. tygodniu będą miały jaja oraz niektóre niedojrzałe stadia mączników na spodniej stronie liści (Rysunek 2). Część dorosłych mączników wprowadzonych w 1. tygodniu nadal będzie żywa.</li>
	<li>Tydzień 3: Rozpocznij hodowlę w trzeciej klatce, wprowadzając mączniki na nowe rośliny w celu złożenia jaj. Rośliny w klatce założonej w 1. tygodniu będą miały zarówno stadia niedojrzałe, jak i wiele nowo wylęgłych dorosłych mączników, a populacja dorosłych osobników powinna wyraźnie wzrosnąć. Rośliny w klatce założonej w 2. tygodniu będą miały wiele jaj oraz niedojrzałe stadia mączników na spodniej stronie liści.</li>
	<li>Tydzień 4: Rozpocznij hodowlę w czwartej klatce, wprowadzając mączniki na nowe rośliny w celu złożenia jaj. Rośliny w klatce założonej w 1. tygodniu będą miały wiele dorosłych mączników, które wylęgły około tydzień wcześniej. Rośliny w klatce założonej w 2. tygodniu będą miały wiele nowo wylęgłych dorosłych mączników, co powinno skutkować bardzo wyraźnym wzrostem populacji. Rośliny w klatce założonej w 3. tygodniu będą miały wiele jaj oraz niedojrzałe stadia mączników na spodniej stronie liści.</li>
	<li>Co tydzień po pierwszych 4 tygodniach: W każdym tygodniu zakładaj nową klatkę, przenosząc dorosłe mączniki z najstarszej z czterech klatek (klatki założonej w 1. tygodniu) na nowe rośliny w nowej, czystej klatce. Starą klatkę należy usunąć, a rośliny z niej zutylizować. Mączniki te są w przybliżeniu w 1. tygodniu po wylęgu. W przypadku kolonii przenoszącej wirusa, mączniki te będą przekazywać wirusa nowym roślinom, a jednocześnie składać jaja dla następnego pokolenia.</li>
	<li>Zaplanuj eksperymenty dotyczące transmisji tak, aby wykorzystać mączniki, które wylęgną się w klatce z trzeciego tygodnia. Jeśli potrzeba więcej mączników, można zwiększyć liczbę roślin i dodać więcej owadów do klatki z 1. tygodnia, aby zwiększyć populację.</li>
</ol>
3. Metoda inokulacji roślin testowych
<ol>
	<li>Aby zapewnić wysoką efektywność przenoszenia: 1) Z białych much należy obchodzić się jak najdelikatniej, aby zapobiec uszkodzeniom owadów, co obniżyłoby wskaźniki przenoszenia; 2) Musi być dostępna odpowiednia powierzchnia liści, aby białe muchy mogły przeprowadzić próbkowanie lub żerować. Wydłużenie czasu nabywania lub zwiększenie liczby roślin gospodarzy do nabywania może zwiększyć niskie wskaźniki zakaźności w roślinach testowych z powodu zagęszczenia w okresie nabywania lub inokulacji.</li>
	<li>Zbiór białych much. Poniższa procedura dotyczy zbioru i przenoszenia precyzyjnej liczby białych much wymaganych do celów doświadczalnych. Aby przenieść duże liczby białych much, co jest konieczne na przykład podczas przesiewania pod kątem odporności, wystarczy delikatnie potrząsnąć roślinami zainfekowanymi białymi muchami nad roślinami testowymi lub zainfekowanymi wirusem gospodarzami do nabywania (a później nad roślinami testowymi). Należy pamiętać, aby potrząsać roślinami w wielu miejscach, aby zminimalizować efekty agregacji.</li>
	<li>Nowo wyklute dorosłe białe muchy (1-3 dni po wykluciu) są bardzo aktywne i często żerują, dlatego wykazują najwyższe wskaźniki przenoszenia 4. Starsze białe muchy nadal przenoszą wirusa, ale z niższą częstotliwością. W celu uzyskania wysokich wskaźników przenoszenia należy zastosować wiele białych much na roślinę testową (15-40 na roślinę), ponieważ stosunek 1 białej muchy na roślinę często prowadzi do nieakceptowalnie niskich wskaźników przenoszenia3,4. Liczba potrzebnych owadów zależy od wirusa oraz gatunku rośliny do nabywania i rośliny testowej.</li>
	<li>Przygotować urządzenia do aspiracji oraz probówki zbiorcze. (Rycina 3)</li>
	<li>Jedną ręką przytrzymać żółtą plastikową kartkę wewnątrz klatki z kolonią białych much przeznaczonych do zbioru. Delikatnie opukać rośliny, aby zachęcić dorosłe białe muchy do lotu. Białe muchy zostaną przyciągnięte przez żółtą kartkę i przelecą z rośliny na kartkę, skąd można je zebrać za pomocą aspiratora i bardzo delikatnego podmuchu powietrza. Nigdy nie należy aspirować białych much żerujących na roślinach. Podczas żerowania ich styléty są wbitę w roślinę, więc odrywanie ich od roślin spowoduje złamanie stylétów, co uniemożliwi im nabywanie lub przenoszenie wirusa (Rycina 4).</li>
	<li>Zebrać około 20 dorosłych białych much do jednej probówki zbiorczej, aby zminimalizować uszkodzenia fizyczne owadów wynikające z wielokrotnej aspiracji (Rycina 5).</li>
	<li>Aby zmienić probówkę zbiorczą, należy delikatnie opukać probówkę o twardą powierzchnię i zamknąć ją Parafilmem w czasie, gdy białe muchy są zdezorientowane po opukiwaniu.</li>
	<li>Założyć nową probówkę zbiorczą na aspirator i powtarzać czynność do zebrania wymaganej liczby białych much. Białe muchy mogą pozostawać w probówkach zbiorczych w temperaturze pokojowej przez kilka godzin.</li>
	<li>Nabywanie. Białe muchy umieszcza się na roślinie zainfekowanej wirusem i pozwala im żerować na zainfekowanych roślinach przez 48-72 h. Okresy nabywania dłuższe niż 72 h zazwyczaj nie zwiększają wskaźników przenoszenia. W przypadku wirusów przenoszonych w sposób nieutrwalony lub półutrwalony, odpowiednie okresy dostępu do nabywania wynoszą odpowiednio 1 h i kilka godzin (Tabela 1). Najlepsze wyniki uzyskuje się, gdy białe muchy mają swobodny dostęp do roślin w klatkach, które ograniczają owady do jednej rośliny lub wielu roślin. Jednak niektóre eksperymenty wymagają nabywania z konkretnych liści, w których przypadku można zastosować klatki zaciskowe. Przy stosowaniu klatek zaciskowych ważne jest uwzględnienie preferencji białych much do żerowania na spodniej stronie liści. Ponadto zagęszczenie białych much w klatkach zaciskowych może obniżyć wskaźniki przenoszenia – akceptowalne wskaźniki przenoszenia osiągnięto przy zastosowaniu 10 samic białych much na klatkę zaciskową o średnicy 2,5 cm.</li>
	<li>Inokulacja. Przygotować klatkę odpowiednią do rozmiaru inokulacji i umieścić w niej rośliny testowe. Jeśli inokulowana ma być tylko jedna roślina, należy rozważyć klatkę dla pojedynczej rośliny. Jeśli inokulowanych ma być więcej niż jedna roślina, należy rozważyć małą klatkę z ramą z PVC&#160;/workiem z organzy lub klatkę aluminiową (Rycina 6). Rozmiar klatki używanej do inokulacji powinien być nieco większy od rozmiaru rośliny (roślin) do inokulacji. Wyższe wskaźniki przenoszenia uzyskuje się, gdy białe muchy są trzymane blisko korony rośliny i nie mają zbyt dużo wolnej przestrzeni.</li>
	<li>Zbiór białych much z gospodarzy do nabywania zależy od potrzeb eksperymentu. Jeśli wymagana jest mała liczba owadów, należy aspirować białe muchy w opisany wyżej sposób. Umieścić probówki zbiorcze z białymi muchami wewnątrz klatki w pobliżu roślin i zdjąć zakrętkę (Rycina 7). Otworzyć probówkę i wypuścić białe muchy lub odwrócić i delikatnie opukać probówkę, aby uwolnić owady. Jeśli wymagana jest duża liczba owadów, należy po prostu przenieść rośliny do nabywania z białymi muchami do klatek, w których znajdują się rośliny testowe, i delikatnie strzepnąć białe muchy z rośliny gospodarza. W obu typach wprowadzania należy pamiętać o rozmieszczeniu białych much na roślinach, aby zminimalizować agregację i zapewnić jednorodną inokulację.</li>
	<li>Pozostawić białe muchy na próbkowanie lub żerowanie przez odpowiedni czas, który ponownie zależy od wirusa, a w pewnym stopniu od rośliny gospodarza (Tabela 1).</li>
	<li>Sprawdzić białe muchy przynajmniej raz podczas okresu dostępu do inokulacji, aby upewnić się, że białe muchy próbkują lub żerują, otwierając klatkę i odwracając niektóre liście na każdej roślinie.</li>
	<li>W przypadku dłuższych okresów dostępu do inokulacji należy delikatnie poruszyć rośliny (używając patyczka bambusowego lub odpowiednika), aby musnąć wierzchołki roślin i zachęcić białe muchy do ponownego rozmieszczenia się na roślinach. Ponowne rozmieszczenie białych much pomaga zapewnić wyższy wskaźnik przenoszenia poprzez przeciwdziałanie naturalnej tendencji białych much do agregacji.</li>
	<li>Zakończenie. Okres dostępu do inokulacji kończy się poprzez zabicie białych much za pomocą zatwierdzonych środków chemicznych. Należy zastosować dwa insektycydy jeden po drugim: insektycyd kontaktowy, aby szybko zabić dorosłe białe muchy, oraz insektycyd systemiczny, aby zabić białe muchy, które rozwiną się w kolejnych tygodniach oraz te, które uniknęły działania insektycydu kontaktowego (Rycina 8). Z dobrym skutkiem stosowano insektycyd kontaktowy, taki jak mydło owadobójcze, oraz insektycydy systemiczne, takie jak imidaklopryd lub pymetrozyna.</li>
</ol>

<ol><li>Antignus, Y., Mor, N., Ben Joseph, R., Lapidot, M., Cohen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UV+absorbing+plastic+sheets+protect+crops+from+insect+pests+and+from+virus+diseases+vectored+by+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Entomol%22%5BJournal%5D)">UV absorbing plastic sheets protect crops from insect pests and from virus diseases vectored by insects.</a> Environ. Entomol. 25, 919-924 (1996).</li>
<li>Cohen, S. Epidemiology of whitefly-transmitted viruses. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCohen%2C+S+%22Whiteflies%3A+Their+Bionomics%2C+Pest+Status+and+Management%22">Whiteflies: Their Bionomics, Pest Status and Management</a>. Gerling, D. , Intercept. 211-225 (1990).</li>
<li>Cohen, S., Antignus, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomato+yellow+leaf+curl+virus%2C+a+whitefly-borne+geminivirus+of+tomatoes%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Dis.+Vector+Res%22%5BJournal%5D)">Tomato yellow leaf curl virus, a whitefly-borne geminivirus of tomatoes.</a> Adv. Dis. Vector Res. 10, 259-288 (1994).</li>
<li>Csizinszky, A., Schuster, D. J., Polston, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+UV-reflective+mulches+on+tomato+yields+and+on+the+silverleaf+whitefly%5BTitle%5D)+AND+%22HortSci%22%5BJournal%5D)">Effect of UV-reflective mulches on tomato yields and on the silverleaf whitefly.</a> HortSci. 34, 911-914 (1999).</li>
<li>De Barro, P. J., Liu, S. -S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bemisia+tabaci%3A+A+statement+of+species+status%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Bemisia tabaci: A statement of species status.</a> Annu. Rev. Entomol. 56, 1-19 (2011).</li>
<li>Duffus, J. E. Whitefly-borne viruses. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDuffus%2C+JE+%22Bemisia%3A+1995+Taxonomy%2C+Biology%2C+Damage%2C+Control+and+Management%22">Bemisia: 1995 Taxonomy, Biology, Damage, Control and Management</a>. Gerling, D., Mayer, R. , Intercept Limited. United Kingdom. 255-288 (1996).</li>
<li>Lapidot, M. Screening for TYLCV-resistant plants using whitefly-mediated inoculation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLapidot%2C+M+%22Tomato+Yellow+Leaf+Curl+Virus+Disease%22">Tomato Yellow Leaf Curl Virus Disease</a>. Czosnek, H. , 329-342 (2007).</li>
<li>Lapidot, M., Friedmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breeding+for+resistance+to+whitefly-transmitted+geminviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Appl.+Biol%22%5BJournal%5D)">Breeding for resistance to whitefly-transmitted geminviruses.</a> Ann. Appl. Biol. 140, 109-117 (2002).</li>
<li>Lapidot, M., Polston, J. E. Biology and epidemiology of Bemisia-vectored viruses. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLapidot%2C+M+%22Bemisia%3A+Bionomics+and+Management+of+a+Global+Pest%22">Bemisia: Bionomics and Management of a Global Pest</a>. Stansly, P. A., Naranjo, S. E. , Springer. 227-231 (2010).</li>
<li>Navas-Castillo, J., Fiallo-Olive, E., Sanchez-Campos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+virus+diseases+transmitted+by+whiteflies%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Phytopathol%22%5BJournal%5D)">Emerging virus diseases transmitted by whiteflies.</a> Annu. Rev. Phytopathol. 49, 219-248 (2011).</li>
<li>Ng, J. C. K., Falk, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-vector+interactions+mediating+nonpersistent+and+semipersistent+transmission+of+plant+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Phytopathol%22%5BJournal%5D)">Virus-vector interactions mediating nonpersistent and semipersistent transmission of plant viruses.</a> Ann. Rev. Phytopathol. 44, 212-21 (2006).</li>
<li>Polston, J. E., Cohen, L., Sherwood, T. A., Ben-Joseph, R., Lapidot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capsicum+species%3A+Symptomless+hosts+and+reservoirs+of+Tomato+yellow+leaf+curl+virus+%28TYLCV%29%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Capsicum species: Symptomless hosts and reservoirs of Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV).</a> Phytopathology. 96, 447-452 (2006).</li>
<li>Polston, J. E., Hiebert, E., McGovern, R. J., Stansly, P. A., Schuster, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+range+of+Tomato+mottle+virus%2C+a+new+geminivirus+infecting+tomato+in+Florida%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Dis%22%5BJournal%5D)">Host range of Tomato mottle virus, a new geminivirus infecting tomato in Florida.</a> Plant Dis. 77, 1181-1184 (1993).</li>
<li>Polston, J. E., Sherwood, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pymetrozine+interferes+with+transmission+of+Tomato+yellow+leaf+curl+virus+by+the+whitefly+Bemisia+tabaci+%28Hemiptera%3A+Aleyrodidae%5BTitle%5D)+AND+%22Phytoparasitica%22%5BJournal%5D)">Pymetrozine interferes with transmission of Tomato yellow leaf curl virus by the whitefly Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae.</a> Phytoparasitica. 31, 490-498 (2003).</li>
<li>Schuster, D. J., Thompson, S., Ortega, L. D., Polston, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+evaluation+of+products+to+reduce+settling+of+sweetpotato+whitefly+adults%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Econ.+Ento%22%5BJournal%5D)">Laboratory evaluation of products to reduce settling of sweetpotato whitefly adults.</a> J. Econ. Ento. 102, 1482-1489 (2009).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Virus+Taxonomy%2C+Ninth+Report+of+the+International+Committee+on+Taxonomy+of+Viruses%22">Virus Taxonomy, Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses</a>. King, A. M. Q., Adams, M. J., Carstons, E. B., Lefkowitz, E. J. , Elvesvier, Academic Press. (2012).</li>
<li>Wintermantel, W. M. Transmission efficiency and epidemiology of Criniviruses. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWintermantel%2C+WM+%22Bemisia%3A+Bionomics+and+Management+of+a+Global+Pest%22">Bemisia: Bionomics and Management of a Global Pest</a>. Stansly, P. A., Naranjo, S. E. , Springer. 319-332 (2010).</li>
<li>Yang, Y., Sherwood, T. A., Patte, C. P., Hiebert, E., Polston, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Tomato+yellow+leaf+curl+virus+%28TYLCV%29+Rep+gene+sequences+to+engineer+TYLCV+resistance+in+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Use of Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) Rep gene sequences to engineer TYLCV resistance in tomato.</a> Phytopathology. 94, 490-496 (2004).</li>
<li>Zehnder, G. W., Yao, C., Murphy, J. F., Sikora, E. R., Kloepper, J. W., Schuster, D. J., Polston, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbe-Induced+Resistance+Against+Pathogens+and+Herbivores%3A+Evidence+of+Effectiveness+in+Agriculture%5BTitle%5D)+AND+%22Induced+Plant+Defenses+Against+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Microbe-Induced Resistance Against Pathogens and Herbivores: Evidence of Effectiveness in Agriculture.</a> Induced Plant Defenses Against Pathogens. , APS Press. St. Paul, MN. 335-355 (1999).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Metody opisane w niniejszym opracowaniu zostały opracowane na przestrzeni dwóch dekad i opierają się na podstawowych informacjach dostarczonych przez liczne badania nad transmisją, zachowaniem i biologią mączlików. Ze względu na dużą liczbę publikacji, niniejszy tekst odwołuje się głównie do przeglądów literatury oraz kilku wybranych publikacji specyficznych, aby zilustrować rodzaj danych wykorzystanych do opracowania tej techniki. W tej procedurze niezwykle ważne jest delikatne obchodzenie się z mączlikami, ponieważ uszkodzenia odnóży i czułków mogą prowadzić do nieprawidłowych zachowań i obniżenia wskaźników transmisji. Zbieranie owadów za pomocą odkurzaczy i innych mechanicznych urządzeń ssących nigdy nie przyniosło dobrych rezultatów. Kolejnym czynnikiem warunkującym sukces jest konieczność określenia dla każdej kombinacji rośliny żywiciela i wirusa liczby mączlików niezbędnej do uzyskania 100% transmisji na rośliny testowe. Taki optymalny stosunek należy ustalić tylko raz. Najlepsze wyniki uzyskano przy użyciu młodych osobników dorosłych (1-3 dni po wyjściu z poczwarki), ponieważ wykazują one najwyższe wskaźniki transmisji. Można stosować starsze osobniki dorosłe, jednak wymagana będzie ich większa liczba, aby zrekompensować niższy poziom transmisji. Znane jest, że samice transmitują wirusy częściej niż samce, ponieważ żerują częściej. Zazwyczaj nie warto jednak poświęcać czasu na rozdzielanie płci w celu przeprowadzenia transmisji. Procedurę tę można w wielu sposób zmodyfikować, aby dostosować ją do zasobów i potrzeb badacza.
Podczas pracy z wieloma wirusami najlepiej utrzymywać jedną kolonię mączlików hodowanych na roślinach niebędących żywicielami danego wirusa. Mączliki te można zebrać i przenieść na rośliny zainfekowane wirusem w celu nabycia patogenu, a następnie po nabyciu przenieść je ponownie na rośliny testowe. Rośliny przeznaczone do kolonii powinny być uprawiane w szklarniach, w klatkach, aby zapobiec wprowadzeniu mączlików, które mogłyby zainfekować je innym wirusem. Porażenie tych roślin przez roztocza, wiciarki i inne szkodniki roślin może pogorszyć stan zdrowia kolonii i doprowadzić do jej upadku. Wreszcie, podlewanie roślin kolonii musi być wykonywane z należytą starannością. Rośliny te są poddane ekstremalnemu stresowi z powodu żerowania tak licznej populacji mączlików oraz warunków oświetleniowych niższych niż normalne. Grzyby powodujące gnicie korzeni, które są wprowadzane wraz z torfem w podłożach bezglebowych, mogą stać się problemem, jeśli rośliny zostaną choć raz przelane. Wstępne potraktowanie roślin opryskiem doglebowym fungicydu może wyeliminować niektóre z tych problemów.
Choć przenoszenie wirusów roślinnych przez mączliki może być czasochłonne i wymagać cennych zasobów (takich jak pomieszczenia do uprawy), jest ono niezbędne w przypadku niektórych wirusów, dla których nie dysponujemy innymi metodami transmisji. Jest to również cenny sposób przesiewania roślin pod kątem odporności na wirusy, ponieważ wykorzystuje ten sam typ przenoszenia, któremu rośliny w polu będą musiały stawić opór. Stosowanie bardziej sztucznych metod transmisji nie zawsze przynosi najlepszych rezultatów w ocenie zasobów genoplazmy pod kątem odporności na wirusy.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Nazwa przedmiotu&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Firma&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Nr katalogowy&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Uwagi (opcjonalnie)&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Siatka chroniąca przed mącznikiem</td><td>Klayman Meteor Ltd. Petah Tikva 49130, Izrael</td><td>---</td><td>Siatka przeciw owadom BioNet 50 mesh Antivirus</td></tr><tr><td>Siatka chroniąca przed mącznikiem</td><td>Hummert International (www.hummert.com)</td><td>27-4050-1 - 27-4062-1</td><td>Siatka przeciw owadom BioNet 50 mesh Antivirus</td></tr><tr><td>Urządzenia do zbierania mączników</td><td>BioQuip</td><td>1135A</td><td>Można je również wykonać z pipet kropelkujących, elastycznych rurek plastikowych, plastikowych adapterów próżniowych i gazy</td></tr><tr><td>Fiolki do zbierania</td><td>BioQuip</td><td>8909</td><td>Stosowane fiolki zależą od rodzaju użytego aspiratora.</td></tr><tr><td>Żółte karty plastikowe</td><td>dowolna firma</td><td>---</td><td>Zastosować można każdą jaskrawożółtą kartę plastikową, dostępną w wielu punktach sprzedaży.</td></tr><tr><td>Klatki dla mączników</td><td>---</td><td>---</td><td>Nie są one dostępne w sprzedaży i muszą zostać wykonane samodzielnie. Dobrze sprawdzają się klatki o wymiarach 60 cm x 60 cm x 60 cm. Preferujemy konstrukcje wykonane z aluminiowej siatki okiennej, organdyny nylonowej i plastiku winylowego, z ramą wykonaną z aluminiowych profili okiennych. Drzwi są przymocowane za pomocą zawiasów taśmowych i uszczelnione listwami uszczelniającymi; góry klatek wykonano z plastiku winylowego. Klatki można również wykonać z: 1) pleksiglasu sklejonego na krawędziach, z wentylacją zapewnioną przez wycięte w ściankach otwory osłonięte siatką; 2) dużych worków z organdyny nylonowej, organzy lub siatki chroniącej przed mącznikami 50 mesh, z wewnętrznymi wspornikami z rurek i złączek PVC dociętych na odpowiednią długość i zmontowanych wewnątrz worków; 3) ram drewnianych oraz organdyny nylonowej, organzy lub siatki chroniącej przed mącznikami 50 mesh.</td></tr></tbody></table>

przenoszenie wirusów roślinnych za pomocą mączlików

Transmitting Plant Viruses Using Whiteflies

Mączliki, Hemiptera: Aleyrodidae, Bemisia tabaci, stanowiące kompleks gatunków nierozróżnialnych morfologicznie5, są wektorami wielu wirusów roślin. Kilka rodzajów tych przenoszonych przez mączliki wirusów roślin (Begomovirus, Carlavirus, Crinivirus, Ipomovirus, Torradovirus) obejmuje kilkaset gatunków pojawiających się i ekonomicznie istotnych patogenów ważnych upraw spożywczych i włóknistych (przegląd w9,10,16). Wirusy te nie replikują się w wektorze, a mimo to są łatwo przenoszone z rośliny na roślinę przez dorosłe mączliki za pomocą różnych mechanizmów (przegląd w2,6,7,9,10,11,17). W przypadku większości tych wirusów do akwizycji i inokulacji wymagane jest żerowanie mączlika, podczas gdy dla innych wystarczy samo nakłuwanie tkanki. Wiele z tych wirusów nie może być lub nie może być łatwo przenoszonych w inny sposób. W związku z tym utrzymanie kultur wirusów, charakterystyka biologiczna i molekularna (identyfikacja zakresu gospodarzy i objawów)3,13 oraz ekologia2,12 wymagają przenoszenia wirusów na gospodarzy eksperymentalnych przy użyciu mączlika jako wektora. Ponadto opracowywanie nowych podejść do zarządzania, takich jak ocena nowych środków chemicznych14 lub związków15, nowe metody agrotechniczne1,4,19 czy selekcja i hodowla odmian odpornych7,8,18, wymaga wykorzystania mączlików do transmisji wirusów. Wykorzystanie transmisji wirusów roślin przez mączliki do selekcji i opracowywania odmian odpornych w programach hodowlanych jest szczególnie wymagające7. Efektywna selekcja i przesiewanie w kierunku odporności wymaga użycia dużej liczby roślin oraz konieczności inokulacji 100% z nich, aby odnaleźć nieliczne genotypy posiadające geny odporności. Badania te wymagają bardzo dużych liczb mączlików przenoszących wirusy, często kilka razy w roku.
Opisane tutaj utrzymywanie mączlików pozwala na uzyskanie setek lub tysięcy dorosłych osobników na roślinach każdego tygodnia, przez cały rok, bez ryzyka zanieczyszczenia innymi wirusami roślinnymi. Aby co tydzień wprowadzać je do kolonii mączlików, należy przygotować rośliny wolne zarówno od mączlików, jak i wirusów. Hodowle mączlików muszą być wolne od patogenów, pasożytów i parazytoidów, które mogłyby ograniczyć populację mączlików i/lub zmniejszyć wydajność transmisji wirusa. Kolonie wytworzone w opisany sposób można szybko skalować w celu zwiększenia lub zmniejszenia liczebności populacji w zależności od potrzeb, a także dostosować do preferencji pokarmowych mączlika w oparciu o roślinę żywicielską wirusa.
Można utrzymywać dwa podstawowe typy kolonii mączlików: kolonię niewirusową oraz kolonię wirusową. Kolonia niewirusowa składa się z mączlików hodowanych na roślinach wolnych od wirusów i zapewnia cotygodniową dostępność owadów, które mogą być wykorzystane do przenoszenia wirusów z różnych kultur. Kolonia wirusowa, składająca się z mączlików hodowanych na roślinach zainfekowanych wirusem, zapewnia cotygodniową dostępność owadów, które nabyły wirusa, co eliminuje jeden etap w procesie transmisji wirusa.

Opisane metody zakładania i utrzymywania kolonii mączników, a także manipulacji w celu przenoszenia wirusów roślin, zostały z powodzeniem zastosowane w wielu badaniach4,11,12,14 oraz w wielu innych nieprzytoczonych opracowaniach. Stosując te metody w przypadku wirusów przenoszonych trwale, rutynowo uzyskiwaliśmy pożądaną wydajność transmisji na poziomie 100% w celu selekcji pod kątem odporności, przesiewania insektycydów pod kątem ich zdolności do zakłócania transmisji (oraz oceny związków indukujących odporność)13,14,17,18 (Rysunek 9). Procedury opisane w niniejszym materiale mogą być i były adaptowane do wielu lokalizacji, zarówno w publicznych, jak i prywatnych placówkach badawczych.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Rodzaj transmisji</td>
			<td>Okres dostępu do pozyskiwania danych (godzina)</td>
			<td>Okres dostępu do inokulacji (godzina)</td>
			<td>Ref.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Niepersistencyjny</td>
			<td>1</td>
			<td>2-24</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>półtrwałe</td>
			<td>6-24</td>
			<td>8-24</td>
			<td>10, 16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Utrwalony</td>
			<td>48-72</td>
			<td>48-72</td>
			<td>3, 6, 8, 9</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Szacowane czasy, które mogą być wykorzystane do uzyskania wysokich wskaźników transmisji wirusów o różnych typach relacji z kompleksami gatunków wektorów Bemisia tabaci. Szacowane czasy opierają się na opublikowanych minimalnych czasach wymaganych dla 80-100% transmisji i zostały w niektórych przypadkach zmodyfikowane, aby uwzględnić okresy utajenia oraz różnice między populacjami mączlików, wirusami i roślinami żywicielskimi.
<img alt="Konfiguracja komory wzrostu roślin do badań w kontrolowanym środowisku." src="/files/ftp_upload/4332/4332fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Przykład kolonii białych much przenoszących wirusa. Ta sala wzrostu zawiera klatki z roślinami zainfekowanymi begomowirusem i opanowanymi przez białych much przenoszących wirusa.
<img alt="Cykl życiowy mączlika, schemat; stadium larwalne i imago na liściu rośliny do badania entomologicznego." src="/files/ftp_upload/4332/4332fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Po lewej: stadia niedojrzałe mączlika, Bemisia tabaci klada MEAM sensu De Barro6 około 1 tygodnia po wykluciu oraz po prawej: dorosły mączlik, skuteczny wektor wielu wirusów roślin.
<img alt="Układ filtracji próżniowej z przewodami i kolbą do eksperymentu z separacją laboratoryjną." fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4332/4332fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4332/4332fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Rodzaje urządzeń kolekcjonujących, które mogą być wykorzystane do odłowu mączników do transmisji wirusów roślinnych.
<img alt="Analiza fotosyntezy roślin z wykorzystaniem spektroskopii, żółtych płytek filtracyjnych i zestawu do wymiany gazowej." src="/files/ftp_upload/4332/4332fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Po lewej: Żółta plastikowa karta użyta do zbierania dorosłych mączników, pokazująca mączniki gotowe do zebrania. Po prawej: Zbieranie mączników z żółtej plastikowej karty. Mączniki są widoczne na karcie jako małe białe/szare kropki.
<img alt="Próbkowanie owadów przy użyciu urządzenia ssącego na roślinach; ustawienie i metoda eksperymentu entomologicznego." src="/files/ftp_upload/4332/4332fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Motylki zebrane metodą aspiracji (20 w fiolce) z kolonii przygotowanej do akwizycji lub inokulacji.
<img alt="Eksperyment wzrostu roślin; A: testowanie okrywy roślinnej, B: siewka w słoiku, C-D: konfiguracja komory wilgotnościowej." fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4332/4332fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4332/4332fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6. Górna lewa część: Klatki dla pojedynczych roślin wykorzystywane do pozyskiwania lub inokulacji. Górna prawa część: Większe klatki wykonane z rur PVC i organzy. Dolna część: Klatki z aluminium/siatki oraz organzy w szklarni, zawierające rośliny przeznaczone dla kolonii mączlików.
<img alt="Układ eksperymentu fotosyntezy roślin; pomiar wymiany gazowej; badania naukowe." src="/files/ftp_upload/4332/4332fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7. Przenoszenie mączników do jednej rośliny w celu inokulacji (lub nabycia).
<img alt="Eksperyment wzrostu roślin, użycie pipety, ustawienie szklarni, aplikacja roztworu odżywczego." src="/files/ftp_upload/4332/4332fig8.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8. Dodanie systemicznego insektycydu metodą drencowania w celu zakończenia okresu dostępu dla inokulacji mączczykami.
<img alt="Porównanie wzrostu roślin, badanie modyfikacji genetycznej, eksperyment, siewki pomidora, warunki polowe." src="/files/ftp_upload/4332/4332fig9.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 9"> 
Rycina 9. Rośliny polowe poddawane ocenie w kierunku odporności na Tomato yellow leaf curl virus. Wszystkie rośliny zostały zaszczepione jako 5-tygodniowe siewki, a następnie przesadzone w pole w celu przeprowadzenia oceny. Rośliny na pierwszym planie stanowią odporną linię plazmową, natomiast rośliny w tle stanowią linię plazmową podatną.

Poprawa naszego zrozumienia i zdolności do zwalczania wielu wirusów roślin przenoszonych przez owady wymaga wykorzystania wektorów. Przenoszenie wirusów roślin przez owady jest interakcją tritroficzną, a zatem wymaga manipulacji owadami, wirusem i rośliną. Wektory muszą być hodowane w dużych ilościach i manipulowane w taki sposób, aby zapewnić wysoką skuteczność przenoszenia na rośliny testowe. Przedstawiono podstawy hodowli i manipulacji mączczykiem, Bemisa tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae), wektorem wirusów roślin należących do kilku pojawiających się rodzajów wirusów roślin, reprezentujących dużą liczbę wirusów o znaczeniu gospodarczym.

Przenoszenie wirusów roślinnych za pomocą mączlików

Mączliki, Hemiptera: Aleyrodidae, Bemisia tabaci, kompleks gatunków nierozróżnialnych morfologicznie, są wektorami wielu wirusów roślinnych. Kilka ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest przenoszenie wirusów roślinnych za pomocą mączlików. Osiąga się to poprzez stworzenie i utrzymanie kolonii mączlików dostarczających w cotygodniowych odstępach czasu nowo wyklute dorosłe osobniki, które nie są zanieczyszczone innymi potencjalnymi wektorami i patogenami. Kolonie są utrzymywane poprzez regularne wprowadzanie mączlików na młode rośliny wolne od owadów, z których następnie powstają nowe dorosłe osobniki.Po 17 do 20 dniach każdego tygodnia nowo wyklute osobniki dorosłe można przenieść na rośliny testowe w celu nabycia lub przeniesienia wirusa. Zazwyczaj uzyskuje się efektywność bliską 100%, a wskaźniki transmisji zazwyczaj zaczynają się od niskich wartości i rosną wraz z systematyczną optymalizacją. Najtrudniejszym aspektem wykorzystania mączlików do inokulacji wirusów jest hodowla mączlików w sposób wykluczający niepożądane patogeny i owady.Patogeny, w szczególności grzyby powodujące zgniliznę korzeni oraz parcha liści, obniżają jakość roślin gospodarzy wirusa. Niepożądane owady, takie jak mączniki, mogą hamować reprodukcję mączlika oraz pogarszać kondycję rośliny gospodarza wirusa. Procedury zaprezentuje Heather Capa Bianco, technik z mojego laboratorium.Kolonie mączlików należy utrzymywać w czystej i kontrolowanej pomieszczeniu wzrostowym. Kontrola wilgotności względnej, temperatury, fotoperiodu oraz natężenia światła jest niezbędna dla kolonii, która rozwija się z jaja do postaci dorosłej w ciągu 18 dni; należy zastosować następujące ustawienia. Temperaturę należy ustawić w zakresie od 26 do 30 °C, a wilgotność względna powinna wynosić idealnie od 30 do 50%. Jeśli wilgotność względna przekroczy 70%, prawdopodobnym problemem mogą stać się patogeny grzybowe atakujące owady i rośliny.Idealny fotoperiod wynosi 14 godzin. Natężenie światła powinno być dość wysokie; świetlówki VHO mogą zapewnić od 800 do 1000 foot candles na poziomie korony roślin. Należy również ograniczyć dawki nawozów i podlewanie, aby zapobiec rozwojowi patogenów grzybowych oraz akumulacji soli. Klatki Whitely muszą zapewniać wentylację, łatwy dostęp oraz wystarczającą przestrzeń dla rosnącej populacji whitely.Dobre wyniki uzyskano przy zastosowaniu organzy oraz siatki aluminiowej, jak również białej siatki ochronnej. Wybór gatunku rośliny jest istotnym aspektem. Po pierwsze, roślina powinna szybko rosnąć, ale nie może nadmiernie wypełnić komory. Po drugie, roślina musi być wystarczająco silna, aby utrzymać liczną populację owadów bez więdnięcia.Z tych powodów odpowiednim wyborem roślin są odmiany karłowate lub krzewiaste. Po trzecie, roślina musi być albo podatna, albo odporna na stosowany wirus, w zależności od rodzaju hodowanej kolonii. Ponieważ kolonia może ulec załamaniu z powodu roztoczy, THP, dzikich mączników lub innych inwazyjnych owadów, wybrane odmiany muszą być uprawiane w środowisku chronionym w celu wykluczenia obecności innych owadów.Pierwsze mączniki z nowej kolonii muszą być wolne od wirusów roślin, innych owadów oraz patogenów owadziej natury. Jeśli mączniki zostaną zebrane z pola, należy je hodować przez co najmniej osiem tygodni na roślinach, które w tym czasie nie są gospodarzami danego wirusa, kontrolując jednocześnie brak objawów chorobowych u roślin. Po uzyskaniu czystych mączników, należy wprowadzić od 20 do 100 osobników do klatki z roślinami za pomocą aspiratora lub delikatnie strząsając je z innej rośliny źródłowej.W każdym tygodniu należy przygotować nową klatkę. Przez pierwsze trzy tygodnie do zasiedlenia nowej klatki należy wykorzystać mączniki na roślinach non-ST. Począwszy od czwartego tygodnia, do zasiedlenia kolejnej klatki należy wykorzystać młode dorosłe mączniki z klatki trzytygodniowej.Podczas pierwszego tygodnia w klatce mączniki pszeniczne złożą jaja na spodniej stronie liści roślin. W drugim tygodniu pojawią się niedojrzałe osobniki mącznika, a część dorosłych osobników nadal będzie żywa. W trzecim tygodniu wykluje się wiele nowych dorosłych mączników, co powinno spowodować bardzo wyraźny wzrost populacji dorosłych osobników mącznika pszenicznego.Te mączniki mogą być wykorzystane w eksperymentach z transmisją. W czwartym tygodniu osobniki dorosłe w wieku jednego tygodnia należy przenieść do nowej klatki. Starą klatkę należy usunąć, a znajdujące się w niej rośliny zutylizować. Precyzyjnie.Delikatny transfer mszarzyków przeprowadza się za pomocą urządzenia aspiracyjnego i probówek zbiorczych; nigdy nie należy stosować gwałtownej aspiracji. Mszarzyki żerujące na roślinach są w nie wniknięte podczas karmienia i zostaną uszkodzone, jeśli zostaną gwałtownie odciągnięte, co czyni je bezużytecznymi. Aby zebrać mszarzyki, jedną ręką trzymaj żółtą plastikową osłonę wewnątrz klatki z kolonią, a drugą ręką wykonuj aspirację.Delikatnie opukaj rośliny, aby pobudzić dorosłe mączniki do lotu. Mączniki zostaną zwabione na żółtą kartkę, gdzie będzie można je zebrać. Używając aspiratora i bardzo słabego ssania, przenieś nie więcej niż 20 mączników do każdej probówki zbiorczej.Następnie należy lekko stuknąć fiolką, aby zdezorientować muchówki, i zamknąć ją korkiem z parafiny. Aby zapewnić skuteczną transmisję wirusa, należy przenieść od 15 do 40 młodych osobników dorosłych z roślin zainfekowanych wirusem na rośliny zdrowe, w zależności od rodzaju wirusa i rośliny żywiciela. Inne protokoły, takie jak przesiewanie pod kątem odporności, wymagają większych populacji startowych.W tym przypadku należy potrząsnąć roślinami zainfekowanymi wirusem, na których znajdują się mączniki, nad roślinami przeznaczonymi do inokulacji. Po umieszczeniu mączników na roślinie zainfekowanej wirusem, należy pozostawić je do żerowania przez 48 do 72 godzin, aby nabyły wirusy przenoszone w sposób trwały. Dłuższy czas zazwyczaj nie zwiększa tempa transmisji w przypadku wirusów przenoszonych w sposób nietrwały lub półtrwały.Krótszy okres dostępu do nabywania, od godziny do jednego dnia, będzie wystarczający dla eksperymentów wymagających nabywania z konkretnych liści. Można zastosować klatki zaciskowe; należy ustawić klatkę tak, aby spód liścia był dostępny, i nie używać więcej niż 10 samic mszarek niż 2,5 centymetra średnicy klatki, w przeciwnym razie wskaźnik transmisji spadnie z powodu przeludnienia. W przypadku inokulacji roślin należy dobrać odpowiednią klatkę, biorąc pod uwagę liczbę roślin.Jedna roślina wymaga na przykład jedynie niewielkiej klatki, nieco większej od niej samej; w przypadku wielu roślin należy wybrać między mniejszą rurką z PVC, klatką ramową a większą klatką z aluminiową ramą. Im mniejsza przestrzeń wokół korony rośliny, tym lepiej. Po wprowadzeniu mączlików na nową roślinę czas potrzebny na inokulację zależy od wirusa i rośliny żywiciela.Podobnie jak w przypadku nabywania wirusa, czas wymagany do jego transmisji zależy od sposobu przekazywania. Transmisja nieutrwalona wymaga znacznie krótszego czasu kontaktu niż transmisja półutrwalona lub utrwalona. Należy sprawdzić, czy mączniki podczas okresu dostępu do inokulacji badają roślinę lub się nią żywią.Otwórz klatkę i obejrzyj spód kilku liści na każdej z roślin. W przypadku dłuższych okresów inokulacji okresowo i delikatnie poruszaj roślinami, aby zachęcić owady do ponownego rozprzestrzenienia się po roślinach.Zwiększy to tempo transmisji poprzez przeciwdziałanie naturalnej tendencji mączlików do agregowania się pod koniec okresu inokulacji. Wyeliminuj mączliki za pomocą dwóch zastosowanych kolejno insektycydów. W pierwszej kolejności zastosuj insektycyd kontaktowy, taki jak mydło insektycydowe, aby szybko zwalczyć dorosłe osobniki mączlika.Po drugie, należy zastosować systemiczny insektycyd, aby zwalczyć wszystkie mączniki pszeniczne, które pojawią się w kolejnych tygodniach. W przypadku pozostałych osobników dorosłych skutecznym wyborem są imidaklopryd lub piraksamina. Stosując te procedury, można rutynowo uzyskiwać wskaźniki transmisji wirusa na poziomie 100%. Tak wysokie wskaźniki transmisji są niezbędne podczas przesiewowej oceny roślin testowych pod kątem odporności na wirusy oraz pożądane przy ocenie skuteczności związków chemicznych w zakresie ich zdolności do hamowania transmisji wirusa.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat hodowli mączlików oraz ich wykorzystania do przenoszenia wirusów roślinnych. Procedury te mogą być stosowane w celach badawczych, w komercyjnym opracowywaniu roślin odpornych na wirusy lub w testowaniu związków pod kątem ich zdolności do hamowania transmisji wirusów.

transmitting-plant-viruses-using-whiteflies

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przenoszenie wirusów roślinnych przez mszyce

Mszyce są skutecznymi wektorami wirusów roślinnych. Mikroiniekcja wirusa do mszycy, procedura którą zaprezentujemy dzisiaj, jest techniką pozwalającą badaczom na wstrzykiwanie wirusa bezpośrednio do hemocelu mszycy, z pominięciem jelita, które stanowi jedną z dwóch głównych barier w cyrkulacyjnym przekazywaniu wirusa. Ta sama technika jest również stosowana do wstrzykiwania dsRNA w celu wywołania RNAi.

Badanie fizjologicznych barier transmisji wirusów u mszyc z wykorzystaniem mikroiniekcji

Opisujemy tutaj prostą metodę fluorescencji in situ (FISH) do lokalizacji wirusów i bakterii w tkankach owadów i roślin. Protokół ten można rozszerzyć o wizualizację mRNA w całych ujęciach i przekrojach mikroskopowych.

Fluorescencyjne hybrydyzacje in situ (FISH) do lokalizacji wirusów i bakterii endosymbiotycznych w tkankach roślinnych i owadzich

Tutaj prezentujemy protokół do rozmnażania komórek Homalodisca vitripennis i HoCV-1 in vitro. Pożywkę usunięto z kultur dodatnich w stosunku do HoCV-1 i ekstrahowano RNA co 24 godziny przez 168 godzin. Przeżywalność komórek określono ilościowo za pomocą barwienia błękitem trypanowym. Całe cząsteczki wirusa zostały wyekstrahowane po zakażeniu. Wyekstrahowany RNA oznaczono ilościowo metodą qRT-PCR.

Namnażanie wirusa Homalodisca coagulata-01 za pośrednictwem hodowli komórkowej Homalodisca vitripennis

Tutaj prezentujemy protokół do zbadania rozkładu tkanki gospodarza, sposobu transmisji i wpływu na dopasowanie gospodarza densowirusa w obrębie gatunku lepidoptera, robaka bawełnianego. Protokół ten może być również wykorzystany do badania interakcji między innymi wirusami przenoszonymi drogą pokarmową a ich owadzimi gospodarzami.

Protokoły badania rozmieszczenia tkanki gospodarza, trybu transmisji i wpływu na kondycję gospodarza densowirusa w robaku bawełnianym

Tutaj prezentujemy protokół izolacji endosymbiontów z mączlika Bemisia tabaci poprzez preparację i filtrację. Po amplifikacji próbki DNA nadają się do późniejszego sekwencjonowania i badania mutualizmu między endosymbiontami a mączlikiem.

Metody ekstrakcji endosymbiontów z mączlika Bemisia tabaci

Ten artykuł przedstawia protokół szybkiego testu identyfikacyjnego dla Bemisia tabaci opartego na technologii amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli (LAMP). Protokół wymaga minimalnego przeszkolenia laboratoryjnego i dlatego może być wdrażany na miejscu w punktach wejścia dla importu roślin, takich jak porty morskie i lotnicze.

Test amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli (LAMP) do szybkiej identyfikacji Bemisia tabaci

Opisujemy metodę immunofluorescencji i ilościowego PCR do lokalizacji i kwantyfikacji begomowirusów w tkankach owadów. Protokół immunofluorescencji może być stosowany do kolokalizacji białek wirusowych i wektorowych. Ilościowy protokół PCR można rozszerzyć w celu ilościowego oznaczania wirusów w całych ciałach mączlika i roślinach zakażonych wirusem.

Lokalizacja i kwantyfikacja begomowirusów w tkankach mączlika metodą immunofluorescencji i ilościowego PCR

Przedstawiono protokół iniekcji (agroiniekcji) oparty na Agrobacterium do inokulacji wirusa mozaiki czyńca i klonów wirusa mozaiki trzciny cukrowej do siewek kukurydzy. Inokulacja w ten sposób prowadzi do infekcji wirusowej, wywołanego przez wirusa wyciszenia genów markerowych i nadekspresji wirusa GFP.

Bezpośrednia agroinokulacja siewek kukurydzy przez wstrzyknięcie rekombinowanym wirusem mozaiki wyczyńca i zakaźnymi klonami wirusa mozaiki wyczyńca cukrowego

Ten protokół immunofluorescencyjnego znakowania zarówno białek wirusa roślinnego, jak i białek wektorów owadów w wyciętych jelitach owadów może być używany do badania interakcji między wirusem a owadami-wektorami, funkcji białek owadów i mechanizmów molekularnych leżących u podstaw transmisji wirusa.

Znakowanie immunofluorescencyjne białek wektorów wirusów roślinnych i owadów w jelitach pluskwiaka

Ten protokół pokazuje, jak używać gospodarza roślinnego do wykrywania białek ślinowych skoczka i wirusów roślinnych uwalnianych przez wektory skoczków.

Wykrywanie wirusa i białek ślinowych wektora skoczka liściowego w żywicielu rośliny

Opisujemy metodę skutecznego zbierania mierzalnych hemolimfów od małych stawonogów do późniejszej analizy.

Precyzyjna i wymierna metoda zbierania hemolimfy z małych stawonogów

Poznaj metody hodowli mączlików Bemisia tabaci do przenoszenia wirusów roślinnych w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych. Osiągnij niemal 100% skuteczność transmisji wirusów do roślin testowych.

Przenoszenie wirusów roślinnych za pomocą mączlików

Przeglądaj więcej filmów