Name: Szybkie i wydajne generowanie neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w formacie wielomianowej płytki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Poznaj szybką metodę różnicowania ludzkich komórek macierzystych pluripotencjalnych w neurony przy użyciu formatu wielomianowej płytki. Technika ta umożliwia efektywne generowanie neuronów w badaniach neurobiologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca została sfinansowana przez Max Planck Society.

1. Przygotowanie płytek pokrytych Matrigelem oraz pożywek
<ol>
 <li>Przygotowanie płytek powlekanych Matrigelem. Wykazano, że Matrigel jest preferowanym podłożem do przywierania różnicujących się ciałek zarodkowych (EB) oraz wspomaga efektywny wzrost neuronów z tych struktur10.
 <ol>
	 <li>Rozmrozić 10 ml Matrigelu przez noc na lodzie.</li>
	 <li>Następnego dnia rozcieńczyć galaretowaty Matrigel dwukrotnością objętości lodowatego DMEM/F-12 i przygotować alikwoty po 1 ml w schłodzonych probówkach stożkowych o pojemności 15 ml, które można przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C.</li>
 <li>Wybrać format płytki do różnicowania neuronalnego. Na przykład, jako punkt wyjścia, zaleca się przeprowadzenie pierwszej serii różnicowania w formacie 12 dołków. Wychłodzić cztery płytki 12-dołkowe w temperaturze 4 °C. Rozmrozić jedną alikwotę zamrożonego Matrigelu, dodając 9 ml schłodzonego DMEM/F-12, a następnie pipetować w górę i w dół, aż cały uprzednio rozcieńczony Matrigel zostanie rozmrożony i rozpuszczony.</li>
 <li>Następnie przenieść zawartość do nowej probówki 50 ml zawierającej 15 ml DMEM/F-12 na lodzie (końcowe rozcieńczenie Matrigelu: 1:75). Następnie dodać 0,5 ml rozcieńczonego Matrigelu do każdego dołka schłodzonych płytek 12-dołkowych. Owinąć płytki Parafilmem i pozostawić w temperaturze pokojowej przez noc.</li>
 <li>Następnego dnia przenieść płytki do temperatury 4 °C. Powlekane płytki można przechowywać przez kilka tygodni przed użyciem.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Pożywki</li>
</ol>
Pożywka do tworzenia EB (~15 ml potrzebnych do przeprowadzenia różnicowania w jednej płytce 96-dołkowej - patrz Tabela 1 oraz schemat na Rysunku 2): DMEM/F-12 z 0,4% (PVA) 1x N2 1x B27 0,05% BSA 20 ng/ml FGF2 10 μM Y-27632 1x PenStrepGln
Pożywka do różnicowania (~30 ml potrzebnych do przeprowadzenia różnicowania w jednej płytce 96-dołkowej, a następnie do formowania neuronów w jednej 12-dołkowej płytce powlekanej Matrigelem, patrz Tabela 1): DMEM/F-12 1x N2 1x B27 0,05% BSA 0,5 μM PD0325901 15 μM SB431542 0,5 μM Dorsomorfiny 1x PenStrepGln
2. Wymuszona indukcja ciał embrioidalnych (EB)
<ol>
 <li>Hodować hPSC w preferowanych warunkach bez użycia komórek karmiarek. My stosujemy pożywkę warunkowaną MEF na płytkach 6-dołkowych powlekanych Matrigel15. Jednak inne systemy hodowli, takie jak własne lub komercyjne pożywki zdefiniowane, również powinny być skuteczne. W momencie rozpoczynania eksperymentu z różnicowaniem hPSC powinny być subkonfluencyjne i aktywnie rosnąć.</li>
 <li>Mechanicznie usunąć spontanicznie zróżnicowane kolonie za pomocą sterylnego plastikowego końcówki pipety pod mikroskopem stereoskopowym.</li>
 <li>Przemyć pozostałe niezróżnicowane kolonie PBS, a następnie rozbić do pojedynczych komórek za pomocą Accutase zawierającego 1X Y-27632. Odwirować pojedyncze komórki przy 200 x g przez 2 min, zawiesić ponownie w małej objętości pożywki do formowania EB i oznaczyć miano komórek za pomocą hematocytometru.</li>
 <li>Dodać alikwot komórek do pozostałej pożywki do formowania EB, aby uzyskać miano od 40 000 do 80 000 komórek na ml.</li>
 <li>Za pomocą pipety wielokanałowej przenieść 100 μl na dołek do płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery V, co daje od 4 000 do 8 000 komórek na dołek. Wirować płytkę 96-dołkową w wirówce do płytek z koszyczkami wahadłowymi przy 400 x g przez 1 min, aby zebrać komórki na dnie dołków, a następnie przenieść do inkubatora do hodowli komórkowych. EB utworzą się w ciągu nocy, jak pokazano na Rysunku 1.</li>
</ol>
3. Indukcja neuroektodermy
<ol>
 <li>Następnego dnia (dzień 0) zebrać ciała embrionalne (EBs) z płytki 96V pod mikroskopem stereoskopowym i przenieść je w niewielkich objętościach do szalki bakteriologicznej o średnicy 3,5 cm zawierającej 2 ml pożywki różnicującej. Delikatnie wstrząsać szalką przez kilka sekund, aby wypłukać EBs.</li>
 <li>Do każdej studzienki płytki 96-dołkowej z półkolistym dnem (U-bottom) o ultra-niskim przywieraniu dodać 100 μl pożywki różnicującej. Pod mikroskopem stereoskopowym przenieść EBs w niewielkich objętościach z szalki do płukania do studzienek 96U (jedno EB na studzienkę). Umieścić płytkę 96U w inkubatorze do hodowli komórkowej na 4 dni, aby umożliwić formowanie się neuroektodermy.</li>
</ol>
4. Formowanie neuronów
<ol>
 <li>W dniu 4. przygotować naczynie do płukania zgodnie z krokiem 3.1, a dodatkowo zastąpić DMEM/F-12 w uprzednio ogrzanej płytce 12-dołkowej pokrytej Matrigelem pożywką do różnicowania (1 ml na dołek).</li>
 <li>Wysiewanie ciał embrioidalnych (EB)
 <ol>
	 <li>Zebrać EB z płytki 96U, przepłukać je w opisany wyżej sposób i ostrożnie wysiać pojedynczo do dołków płytki 12-dołkowej pokrytej Matrigelem (około 8 EB na dołek): EB powinny być równomiernie rozłożone w dołkach, aby umożliwić niezakłócony wzrost neuronów w kolejnych dniach (patrz obraz „day 5” na Rysunku 2).</li>
	 <li>Przed przeniesieniem płytki 12-dołkowej z powrotem do inkubatora pozwolić EB na luźne przytwierdzenie się przez około 10 min w temperaturze pokojowej (RT). Następnie ostrożnie przenieść płytkę 12-dołkową do inkubatora do hodowli komórkowych. Neurony będą wyrastać z wysianych EB w sposób radialny w ciągu następnych 4 dni, co pokazano na Rysunku 2 (obraz „day 8” po prawej stronie).</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
5. Tworzenie neuronów w formie monowarstw
<ol>
 <li>Jako alternatywę dla kroków z punktu 4), w 4. dniu procedury zebrać ciała embrioidalne (EBs) do szalki bakterii o średnicy 3,5 cm zawierającej 2 ml medium różnicującego, następnie przenieść EBs w niewielkiej objętości do szalki z PBS, a potem do kolejnej szalki zawierającej Accutase.</li>
 <li>Poddać trawieniu do uzyskania pojedynczych komórek, odwirować przy 200 x g przez 2 min, resuspendować w niewielkiej objętości medium różnicującego i oznaczyć miano komórek za pomocą hematocytometru. Dostosować miano do 1-2X106 komórek na ml, używając medium różnicującego (bez Y-27632).</li>
 <li>Wysiać komórki na uprzednio ogrzanej płytce 12-dołkowej pokrytej Matrigelem (1 ml na dołek) i przenieść do inkubatora do hodowli komórkowych. Formowanie się neuronów w postaci monowarstw zaobserwowano między 7. a 8. dniem (Rysunek 3C). Należy jednak zaznaczyć, że ten wariant procedury z monowarstwą nie został w pełni zoptymalizowany pod kątem przeżywalności komórek i najodpowiedniejszego podłoża.</li>
</ol>

<ol><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Koch, P., Opitz, T., Steinbeck, J. A., Ladewig, J., Brustle, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rosette-type%2C+self-renewing+human+ES+cell-derived+neural+stem+cell+with+potential+for+in+vitro+instruction+and+synaptic+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A rosette-type, self-renewing human ES cell-derived neural stem cell with potential for in vitro instruction and synaptic integration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3225-3230 (2009).</li>
<li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nat. Biotechnol. 27, 275-280 (2009).</li>
<li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+directed+differentiation+of+neural+crest+stem+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 25, 1468-1475 (2007).</li>
<li>Li, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+motoneurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Specification of motoneurons from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 23, 215-221 (2005).</li>
<li>Pera, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+human+embryonic+stem+cell+differentiation+by+BMP-2+and+its+antagonist+noggin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Regulation of human embryonic stem cell differentiation by BMP-2 and its antagonist noggin.</a> J. Cell Sci. 117, 1269-1280 (2004).</li>
<li>Smith, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Activin%2FNodal+signaling+promotes+specification+of+human+embryonic+stem+cells+into+neuroectoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm.</a> Dev. Biol. 313, 107-117 (2008).</li>
<li>Greber, B., Lehrach, H., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+early+fate+decisions+in+human+ES+cells+by+distinct+states+of+TGFbeta+pathway+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Control of early fate decisions in human ES cells by distinct states of TGFbeta pathway activity.</a> Stem Cells Dev. 17, 1065-1077 (2008).</li>
<li>Greber, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+signalling+inhibits+neural+induction+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">FGF signalling inhibits neural induction in human embryonic stem cells.</a> EMBO J. 30, 4874-4884 (2011).</li>
<li>Anderson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Familial+dysautonomia+is+caused+by+mutations+of+the+IKAP+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Familial dysautonomia is caused by mutations of the IKAP gene.</a> Am. J. Hum. Genet. 68, 753-758 (2001).</li>
<li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+pathogenesis+and+treatment+of+familial+dysautonomia+using+patient-specific+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs.</a> Nature. 461, 402-406 (2009).</li>
<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+human+embryonic+stem+cell+embryoid+body+homogeneity+and+cardiomyocyte+differentiation+from+a+novel+V-96+plate+aggregation+system+highlights+interline+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability.</a> Stem Cells. 25, 929-938 (2007).</li>
<li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).</li>
<li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).</li>
<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+system+for+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+that+eliminates+interline+variability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability.</a> PLoS One. 6, e18293(2011).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Większość protokołów różnicowania obejmujących tworzenie EB z hPSC, w tym nasza wcześniej opublikowana procedura10, opiera się na ręcznym lub wspomaganym enzymatycznie pozyskiwaniu hESC w formie agregatów, co nieuchronnie prowadzi do heterogeniczności rozmiarów EB. Fakt ten powoduje zmienność w wydajności różnicowania w przypadku niektórych linii komórkowych, co utrudnia systematyczne analizy, szczególnie w skali średniej przepustowości. Ponadto ręczna dyssekcja jest pracochłonna, co samo w sobie ogranicza ska...

hPSC, obejmujące pochodzące z embrionów ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) oraz indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC), są pluripotencjalne, co oznacza, że mogą dawać początek różnym liniom komórkowym in vitro 1-2. Do tej pory z hESC wyprowadzono liczne zróżnicowane typy komórek, co potwierdza tezę, że komórki te stanowią cenne narzędzia w badaniach naukowych i podejściach do przesiewu komórkowego, a także dają nadzieję na zastosowanie w terapiach komórkowych.
Protokoły różnicowania neuronalnego dla hESC są zazwyczaj złożone i czasochłonne, ponieważ często opierają się na wstępnym indukowaniu ogólnego przeznaczenia neuronalnego, a następnie na manualnej izolacji progenitorów neuronalnych i późniejszym różnicowaniu końcowym w konkretny, interesujący badacza typ neuronu3-6. W pewnym sensie ta złożoność nie jest zaskakująca i jest nieunikniona, biorąc pod uwagę, że tak zaawansowane protokoły kierowanego różnicowania mają tendencję do stopniowego naśladowania wczesnego rozwoju człowieka, który sam w sobie jest niezwykle złożony. Z drugiej strony może to częściowo odzwierciedlać nasz brak zrozumienia podstawowych procesów molekularnych, co skutkuje protokołami różnicowania, które wciąż są dalekie od pełnej optymalizacji.
W odniesieniu do konwersji niezróżnicowanych hPSCs w neuroektodermę, Pera et al. wykazali, że supresja sygnalizacji BMP / SMAD1/5/8 zwiększa indukcję neuronalną hESCs7. Ponadto wykazano, że inaktywacja sygnalizacji SMAD2/3 sprzyja tworzeniu neuroektodermy8. W związku z tym jednoczesna inaktywacja tych dwóch szlaków wykazuje tendencję do prowadzenia do bardziej efektywnej indukcji neuronalnej hPSCs4,9. Niedawno wykazaliśmy, że trzeci szlak sygnalizacyjny, FGF/ERK, służy jako silny represor najwcześniejszych etapów zaangażowania w kierunku neuroektodermy w hESCs. I odwrotnie, jednoczesna represja wszystkich trzech tych szlaków prowadzi do niemal homogenicznej konwersji hESCs w neuroektodermę w ciągu zaledwie czterech dni10. Następnie w ciągu ośmiu dni zaobserwowano wysoce efektywne różnicowanie terminalne w funkcjonalne neurony. Uzyskane neurony były prawdopodobnie neuronami sensorycznymi obwodowego układu nerwowego, co może częściowo wyjaśniać szybkość ich pochodzenia10. Defekty w utrzymaniu neuronów sensorycznych uznaje się za przyczynę niektórych ludzkich schorzeń, takich jak rodzinna dysautonomia11. Ta procedura różnicowania może stanowić przydatną podstawę do modelowania takich chorób w oparciu o technologię hiPSC12, do dalszej charakterystyki funkcjonalnej, a także do celów aplikacyjnych niewymagających konkretnego typu neuronów.
Jednak strategia różnicowania, którą pierwotnie zastosowaliśmy, polegała na tworzeniu ciałek zarodkowych (EB) z agregatów kolonii hESC10, co skutkowało znaczną heterogenicznością rozmiarów EB, a także zdawało się obniżać wydajność tworzenia neuronów w niektórych liniach komórkowych. Co więcej, ze względu na niejednolitość rozmiarów EB, możliwość systematycznego testowania wpływu dodatkowych czynników wzrostu lub małych cząsteczek w trakcie i po tworzeniu neuronów wydawała się być w pewnym stopniu zaburzona.
W niniejszym raporcie dostosowaliśmy naszą poprzednią procedurę do techniki o średniej przepustowości, opartej na wymuszonej agregacji, aby generować ciała embrionalne (EBs) w sposób ściśle kontrolowany pod względem wielkości, co wykazano również w innych kontekstach13. Następnie EBs wygenerowane w studzienkach w kształcie litery V płytek 96-dołkowych przeniesiono do płytek 96-dołkowych o kształcie litery U z ultra-niskim przytwieraniem, aby zainicjować tworzenie neuroektodermy w zawiesinie. Po czterech dniach EBs można było wysiać, co prowadziło do powstania terminalnie zróżnicowanych neuronów z wysoką wydajnością i jednorodnością. Alternatywnie, EBs z czwartego dnia poddano dysocjacji do pojedynczych komórek i wysiano w ten sposób, co zaowocowało powstaniem monowarstw ludzkich neuronów o niskiej gęstości. Spójne wyniki uzyskano do tej pory przy użyciu dwóch niezależnie wyprowadzonych linii hESC: HuES6 oraz NCL3.
Jako warunek wstępny, pomyślne tworzenie ciał embrioidalnych (EB) było ściśle zależne od zastosowania syntetycznego polimeru, alkoholu poliwinylowego (PVA), wraz z inhibitorem ROCK Y-27632, który jest znany z promowania przeżywalności hESC13-14. W rezultacie jednorodność EB utworzonych w płytkach 96-V została znacznie zwiększona w porównaniu do tworzenia EB jako kultur masowych w oparciu o techniki losowego rozdzielania. System ten zapewnia zatem znacznie lepszą platformę do tworzenia neuroektodermy w kulturze zawiesinowej, a następnie wysoce kontrolowanego różnicowania neuronów w warunkach adhezyjnych.

<table><tbody><tr><td>Matrigel HC</td><td>Becton Dickinson</td><td>354263</td><td>Szczegóły dotyczące obchodzenia się z odczynnikiem znajdują się w tekście</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Life Technologies</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>Poly(alkohol winylowy)</td><td>Sigma</td><td>363170</td><td>Rozpuścić w stężeniu 0,4% w DMEM/F-12 przy użyciu ultradźwiękowej kąpieli wodnej / unikać przegrzewania / można przechowywać w temperaturze 4 &amp;deg;C przez kilka tygodni</td></tr><tr><td>Suplement N2</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>100X, przechowywać w mrożonych alikwotach</td></tr><tr><td>Suplement B27</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010</td><td>50X, przechowywać w mrożonych alikwotach</td></tr><tr><td>Swojska albumina surowicza (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A1595</td><td>10% = 500X, przechowywać w mrożonych alikwotach</td></tr><tr><td>L-glutamina z penicyliną i streptomycyną</td><td>PAA</td><td>P11-013</td><td>Lub odpowiednik</td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Rozpuścić w stężeniu 10 &amp;mu;g/ml w 0,1% BSA / PBS = 1000X, przechowywać w mrożonych alikwotach</td></tr><tr><td>Inhibitor ROCK Y-27632 </td><td>abcamBiochemicals</td><td>Asc-129</td><td>Rozpuścić w stężeniu 10 mM w DMSO = 1000X, przechowywać w mrożonych alikwotach</td></tr><tr><td>PBS</td><td>PAA</td><td>H15-002</td><td>Lub odpowiednik</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>PAA</td><td>L11-007</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 96-dołkowe z dnem w kształcie litery V</td><td>Nunc</td><td>277143</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Axon Medchem</td><td>Axon 1408</td><td>Rozpuścić w stężeniu 0,5mM w DMSO = 1000X, przechowywać w mrożonych alikwotach</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>abcamBiochemicals</td><td>Asc-163</td><td>rozpuścić w stężeniu 15 mM w DMSO = 1000X, przechowywać w mrożonych alikwotach</td></tr><tr><td>Dorsomorfina</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200689</td><td>rozpuścić w stężeniu 0,5 mM w DMSO = 1000X, przechowywać w mrożonych alikwotach</td></tr><tr><td>Płytki 96-dołkowe z dnem w kształcie litery U o ultra-niskiej adhezji</td><td>Corning</td><td>7007</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko beta-III tubulinie (mysie)</td><td>Sigma</td><td>T8660</td><td>stosować w rozcieńczeniu 1:1000</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko beta-III tubulinie (królicze)</td><td>Covance</td><td>PRB-435P</td><td>stosować w rozcieńczeniu 1:2000</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko BRN3A (POU4F1)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8429</td><td>stosować w rozcieńczeniu 1:500</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela 1. &lt;/strong&gt; Specyficzne odczynniki i sprzęt.</td></tr></tbody></table>

szybka i wydajna generacja neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w formacie płyt wielodołkowych

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Istniejące protokoły generowania neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSCs) są często żmudne, ponieważ stanowią wieloetapowe procedury obejmujące izolację i ekspansję komórek prekursorowych neuronów przed końcowym różnicowaniem. W porównaniu z tymi czasochłonnymi podejściami odkryliśmy niedawno, że połączona inhibicja trzech szlaków sygnalizacyjnych: TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1 oraz FGF/ERK, promuje szybką indukcję neuroektodermy z hPSCs, a następnie bezpośrednie różnicowanie w funkcjonalne neurony. W niniejszej pracy dostosowaliśmy naszą procedurę do nowego formatu płytek wielodobunkowych, aby dodatkowo zwiększyć jej powtarzalność i uczynić ją kompatybilną z zastosowaniami o średniej przepustowości. Obejmuje ona cztery dni formowania neuroektodermy w formie pływających sfer (ciał embrionalnych), po których następują kolejne cztery dni różnicowania w neurony w warunkach adhezyjnych. Większość komórek uzyskanych za pomocą tego protokołu wydaje się być bipolarnymi neuronami sensorycznymi. Ponadto procedura jest wysoce wydajna, nie wymaga specjalistycznych umiejętności i opiera się na prostym, chemicznie zdefiniowanym medium z kosztowo efektywnymi małymi cząsteczkami. Dzięki tym cechom procedura ta może służyć jako użyteczna platforma do dalszych badań funkcjonalnych, a także do metod przesiewowych opartych na komórkach, wymagających ludzkich neuronów sensorycznych lub neuronów dowolnego typu.

W naszym poprzednim raporcie, zgodnie z wieloma innymi doniesieniami, ciała embroidalne (EBs) z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSCs) można było generować po prostu poprzez ponowne wysiewanie agregatów podczas rutynowego pasażowania hPSCs do naczyń o niskim stopniu przywierania10. Zazwyczaj skutkuje to szerokim rozkładem wielkości otrzymanych EBs (Ryc. 1C, góra). Kolejnym problemem wynikającym z tej metody jest tendencja EBs utrzymywanych w zawiesinie do agregowania się ze ...

Protokoły różnicowania neuronalnego pluripotencjalnych ludzkich komórek macierzystych (hPSCs) są często czasochłonne i wymagają zaawansowanych umiejętności w hodowli komórkowej. W niniejszej pracy dostosowaliśmy procedurę różnicowania opartą na małych cząsteczkach do formatu płytek wielodobojowych, co umożliwia prostą, szybką i wydajną generację ludzkich neuronów w sposób kontrolowany.

Szybka i wydajna generacja neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w formacie płyt wielodołkowych

Istniejące protokoły generowania neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSCs) są często uciążliwe, gdyż stanowią wieloetapowe procedury...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (H PSCs) w neurony z wykorzystaniem formatu płytek wielodawkowych. Cel ten osiąga się poprzez pobranie i wysianie zawiesiny pojedynczych komórek H PSCs do płytek 96-dołkowych z dnem w kształcie litery V, aby w ciągu nocy utworzyły ciała zarodkowe (EBS).Następnie EBS przenosi się do płytek w kształcie litery U o ultra-niskiej adhezji zawierających pożywkę różnicującą w celu indukcji formowania neuroektodermy. W dalszej kolejności EBS wysiewa się na płytki powlekane matrigelem, aby promować wzrost neuronów. Wyniki uzyskane za pomocą immunofluorescencji około ósmego dnia mogą wykazać obecność typowych markerów neuronalnych.Protokoły barwienia służące do różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w neurony są często skomplikowane i żmudne. Przez pewien przypadek natrafiliśmy na bardzo prostą procedurę otrzymywania neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.Z technicznego punktu widzenia główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod jest to, że jest ona łatwa do przeprowadzenia, szybka i kosztowo efektywna. Jednocześnie procedurę przedstawi dr MI Z z laboratorium. Przygotować pożywkę do formowania ciałek zarodkowych (EB) oraz pożywkę do różnicowania zgodnie z opisem w protokole pisemnym.Hodować ludzkie PSC w warunkach wolnych od komórek karmionek, np. w pożywce warunkowanej mT, na płytkach powlekanych Matrigel lub z zastosowaniem chemicznie zdefiniowanych systemów hodowli w warunkach aktywnego wzrostu poniżej pełnej konfluencji. Za pomocą stereomikroskopu i sterylnej plastikowej końcówki pipety mechanicznie usunąć spontanicznie zróżnicowane kolonie. Pozostałe niezróżnicowane kolonie przemyć PBS i użyć Accutane zawierającego 1x inhibitor ROCK w celu dysocjacji do pojedynczych komórek.Odwirować pojedyncze komórki przy 200 G przez dwie minuty, a następnie zawiesić je w niewielkiej objętości pożywki do tworzenia ciałek zarodkowych (EB). Za pomocą komory countingowej (hemocytometru) określić miano komórek. Dodać odpowiednią liczbę komórek do pozostałej pożywki do tworzenia EB, aby uzyskać miano w zakresie od 40 000 do 80 000 komórek na mililitr.Używając pipety wielokanałowej, przenieś 100 µL na każdą studzienkę płytki 96-dołkowej z okrągłym dnem, tak aby w każdej studzience znalazło się od 4 000 do 8 000 komórek. Wirowarką do płytek z ruchomymi koszyczkami odwiruj płytkę przy 400 G przez jedną minutę, aby zebrać wszystkie komórki na dnie studzienek. Przenieś komórki do inkubatora i pozostaw na noc w celu utworzenia EBS; następnego dnia sprawdź je pod mikroskopem stereoskopowym.Zebrać EBS i przenieść w niewielkiej objętości do 3,5 cm szalki bakteriologicznej zawierającej 2 ml pożywki różnicującej. Przemyć komórki, delikatnie obracając szalkę. Dodać 100 µl pożywki różnicującej do każdej studni płytki o ultra niskim przywiązaniu (ultra low attachment).Dół płytki 96-dołkowej pod mikroskopem stereoskopowym. Przenieś EBS w małych objętościach z naczynia do mycia do dołków 96 U. Inkubuj EBS przez cztery dni, aby umożliwić formowanie się neuroektodermy w czwartym dniu.Przemyj komórki w medium do różnicowania, a następnie wysiej je pojedynczo do dołków płytki wieloformatowej pokrytej matrigelem, np. płytki 12-dołkowej. Komórki powinny być równomiernie rozmieszczone w dołkach, aby umożliwić niezakłócony wzrost neuronów. Pozostaw EBS do luźnego przytwierdzenia się do matrigelu przez około 10 minut w temperaturze pokojowej.Następnie ostrożnie przenieś płytkę do inkubatora. W ciągu następnych czterech dni neurony będą wyrastać z wysianych EBS w sposób radialny. Wcześniej wykazaliśmy, że podobnie jak w wielu innych przypadkach, EBS z H PSCs można było wygenerować po prostu poprzez ponowne wysianie agregatów powstałych podczas rutynowego rozdzielania H HPCs do naczyń o niskim przywieraniu.Zazwyczaj skutkuje to szerokim rozkładem wielkości komórek. Kolejnym problemem jest tendencja ciał embrionalnych (EB) utrzymywanych w zawiesinie do agregowania się, co prowadzi do jeszcze większej heterogeniczności rozmiarów. Aby temu zapobiec, pojedyncze komórki hPSC wysiano do studzienek o niskim przywieraniu, co jednak nie doprowadziło do powstania ciał embrionalnych i spowodowało śmierć komórek. Jednakże połączenie cząsteczki wspomagającej przeżywalność komórek Y 2 7 6 3 2 z alkoholem poliwinylowym, który wykazuje działanie wspomagające formowanie EB z hESC, pozwoliło na powstanie ciał embrionalnych z zawiesin pojedynczych komórek hESC w ciągu nocy.Wygodnym rozwiązaniem było to, że rozmiary EB w tym wielopotytrowym formacie płytek można ściśle kontrolować poprzez osadzanie różnej liczby komórek w każdej studzience. W przeciwieństwie do stosowania konwencjonalnych technik, po przeniesieniu EB na płytki 96-dołkowe o ultra-niskim przywiązaniu, indukowano tworzenie neuroektodermy przy użyciu koktajlu małych cząsteczek składającego się z inhibitorów F-G-F-E-R-K-T-G, TGF beta SMA two oraz BP SMA one, co następnie pozwoliło na wysianie komórek na matrigelu w celu uzyskania neuronów. Inicjowanie tworzenia EB z około 8 000 komórek zapewniło najlepszą zdolność do różnicowania neuronalnego, która charakteryzuje się wyraźnymi wypustkami neuronalnymi wyrastającymi z wysianych EB.Zredukowana liczba nekrotycznych centrów EB po wysiewaniu oraz wysoka ekspresja markerów sensorycznych i panneuronalnych, takich jak B rrn three A i beta three tubulin. Ogólna wydajność różnicowania neuronalnego wydaje się być porównywalna z pierwotną procedurą, która do tej pory była stosowalna zarówno w przypadku HSC, jak i HI PSC. Trzy niezależne linie HPSC, w tym komórki HES oraz HIPS, zostały pomyślnie przetestowane w procedurze wielodołkowej, choć ogólnie nie można wykluczyć zmienności zależnej od linii komórkowej oraz różnic w wydajności różnicowania.Rysunek ten przedstawia rozdzielone pojedyncze komórki neuroektodermalne z czwartego dnia, które zostały wysiane jako pojedyncze komórki i pomyślnie zróżnicowane z wydajnością wynoszącą około 60%. Obsługa EBS na platformie multi titter wymaga początkowo pewnego przeszkolenia, ale po pewnym czasie okaże się, że jest to całkiem proste.

rapid-efficient-generation-neurons-from-human-pluripotent-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Szybkie i wydajne wytwarzanie neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w formacie płytki wielowierszowej

Opracowaliśmy protokół indukcji neuroblastów bezpośrednio z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych utrzymywanych w ściśle określonych warunkach z zastosowaniem małych cząsteczek, co umożliwia pozyskanie dużej ilości ludzkich progenitorów neuronalnych oraz typów komórek neuronalnych rozwijającego się OUN w celu regeneracji tkanki nerwowej.

Efektywne wyprowadzanie ludzkich progenitorów neuronalnych i neuronów z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z zastosowaniem indukcji małymi cząsteczkami

W niniejszym materiale przedstawiamy prosty i skuteczny protokół generowania ludzkich iPSC z 3-4 ml krwi obwodowej przy użyciu pojedynczego lentiwirusowego wektora reprogramującego. Reprogramowanie łatwo dostępnych komórek krwi daje nadzieję na przyspieszenie wykorzystania technologii iPSC poprzez udostępnienie jej szerszemu gronu badaczy.

Generowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z krwi obwodowej przy użyciu wektora lentiwirusowego STEMCCA

Film prezentuje metodę oddzielania i ponownego sadzenia ludzkich pluripotencjalnych neuronów pochodzących z komórek macierzystych za pomocą łagodnego enzymu proteolitycznego. Po filtracji i odwirowaniu neurony są ponownie powlekane na powlekanej płytce wielodołkowej w celu inkubacji, co sprzyja przyczepianiu i dojrzewaniu.

Replikacja zróżnicowanych neuronów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten film pokazuje proces różnicowania ciał embrionalnych (EB) w agregaty neuroepiteliczne i ich późniejszego podziału na komórki neuronalne i glejowe. Metoda ta pozwala na efektywne generowanie komórek neuronalnych i glejowych in vitro, które służą jako systemy testowe do badania toksyczności, a także oceny różnych szlaków zaangażowanych w neurotoksyczność.

Generowanie neuronów i komórek glejowych z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych ciał embrionalnych pochodzących z komórek macierzystych

Ten film opisuje metodę przygotowania szklanych szkiełek nakrywkowych pokrytych poliornityną i lamininą w celu zwiększenia adhezji i wzrostu nerwowych komórek macierzystych. Technika ta obejmuje sekwencyjne inkubacje i płukanie, ułatwiając tworzenie macierzy podporowej, która wspomaga wzrost i różnicowanie komórek neuronalnych, naśladując struktury znajdujące się w neuronach.

Generowanie neuronów piramidowych korowych z ludzkich nerwowych komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy naszą sprawdzoną metodę przeprogramowania ludzkich komórek somatycznych na wolne od transgenów ludzkie iPSC z wirusem Sendai, która wykazuje spójne wyniki i zwiększoną efektywność.

Wydajna generacja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich komórek somatycznych z wirusem Sendai

Dendrytyczne kolce neuronów piramidowych są miejscami najbardziej pobudzających synaps w korze mózgowej ssaków. Metoda ta opisuje ilościową analizę 3D morfologii kręgosłupa w ludzkich korowych piramidowych neuronach glutaminergicznym pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Trójwymiarowa kwantyfikacja kolców dendrytycznych z neuronów piramidowych pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Modyfikujemy i wdrażamy wcześniej opublikowany protokół opisujący szybkie, powtarzalne i efektywne różnicowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) w pobudzające neurony korowe12. W szczególności nasza modyfikacja pozwala na kontrolę gęstości komórek neuronalnych i wykorzystanie ich na układach mikroelektrod do pomiaru właściwości elektrofizjologicznych na poziomie sieci.

Szybkie różnicowanie neuronalne indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do pomiaru aktywności sieci na układach mikroelektrod

Organoidy mózgowe reprezentują nowy system modelowy do badania wczesnego rozwoju ludzkiego mózgu in vitro. Niniejszy artykuł zawiera szczegółową metodologię wydajnego generowania jednorodnych organoidów typu grzbietowego przodomózgowia z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, w tym krytyczne etapy charakterystyki i walidacji.

Generowanie standaryzowanych i powtarzalnych organoidów mózgowych typu przodomózgowia z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje szczegółową procedurę ponownego zawieszania i hodowli neuronów pochodzących z ludzkich komórek macierzystych, które wcześniej były odróżniane od progenitorów nerwowych in vitro przez wiele tygodni. Procedura ułatwia oparte na obrazowaniu testy neurytów, synaps i markerów neuronalnych o późnej ekspresji w formacie zgodnym z mikroskopią świetlną i badaniami przesiewowymi o wysokiej zawartości.

Powtórzenie po różnicowaniu ludzkich neuronów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych w celu przeprowadzenia badań przesiewowych neurytogenezy i dojrzewania synaps o wysokiej zawartości

Pokazujemy automatyzację indukowanych przez człowieka hodowli pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) i różnicowanie neuronów zgodne z automatycznym obrazowaniem i analizą.

Zautomatyzowana produkcja indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronów korowych i dopaminergicznych pochodzących z komórek macierzystych ze zintegrowanym monitorowaniem żywych komórek

Poznaj szybką metodę różnicowania ludzkich komórek macierzystych pluripotencjalnych w neurony przy użyciu formatu wielomianowej płytki. Technika ta umożliwia efektywne generowanie neuronów w badaniach neurobiologicznych.

Szybka i wydajna generacja neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w formacie płyt wielodołkowych

Przeglądaj więcej filmów