Szybkie i wydajne generowanie neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w formacie wielomianowej płytki

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych lub H PSC w neurony przy użyciu formatu płytki z wieloma mianami. Osiąga się to poprzez zebranie i posiew jednokomórkowej zawiesiny H PSC w V dnie 96. Płytki studzienkowe do tworzenia ciał zarodkowych lub EBS przez noc.

Następnie EBS są przenoszone do ultra niskich płytek przyłączeniowych w kształcie litery U, zawierających pożywkę różnicującą w celu wywołania tworzenia neuroektodermy. Następnie EBS są powlekane na szalkach pokrytych matryżelem, aby promować wzrost neuronów. Wyniki, które wskazują na obecność typowych markerów neuronalnych około ósmego dnia za pomocą immunofluorescencji.

Protokoły barwienia służące do różnicowania ludzkich pre potencjalnych komórek macierzystych w neurony są często skomplikowane i żmudne. Trochę przypadkowo. Natknęliśmy się na bardzo prostą procedurę tworzenia neuronów z ludzkich komórek macierzystych.

Z technicznego punktu widzenia główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że jest łatwa do przeprowadzenia, szybka i opłacalna. W tym samym czasie zabieg zaprezentuje dr MI Z z laboratorium. Przygotować pożywkę do tworzenia EB i pożywkę różnicującą zgodnie z opisem w pisemnym protokole.

Hoduj h PSC w warunkach wolnych od karmienia, takich jak pożywka kondycjonowana metamfetaminą na płytkach pokrytych matryżelem lub przy użyciu chemicznie zdefiniowanych systemów hodowli w warunkach aktywnego wzrostu sub confluent. Za pomocą mikroskopu stereoskopowego ze sterylną plastikową końcówką pipety mechanicznie usuwa spontanicznie zróżnicowane kolonie. Umyj pozostałe niezróżnicowane kolonie PBS i użyj Accutane zawierającego jeden x inhibitor skał do trawienia do pojedynczych komórek.

Osadzać pojedyncze komórki przez odwirowanie przy 200 G przez dwie minuty, a następnie zawiesić Resus w małej objętości pożywki do tworzenia EB. Użyj hemocytometru, aby określić miano komórek. Dodaj dodatkowe komórki do pozostałej pożywki do tworzenia EB, aby uzyskać miano między 40 000 a 80 000 komórek na mililitr.

Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 100 mikrolitrów na dołek na dolną płytę 96 V, co daje od 4 000 do 8 000 komórek na dołek. Studnia. Obracać płytkę w wirówce z odchylaną płytką o stężeniu 400 G przez jedną minutę, aby zebrać wszystkie komórki na dnie studzienek. Przenieś komórki do inkubatora i pozwól EBS uformować się przez noc następnego dnia pod mikroskopem stereoskopowym.

Zbierz EBS i przenieś w małej objętości do 3,5-centymetrowego naczynia bakteryjnego zawierającego dwa mililitry różnicowania. Średni. Umyj komórki, delikatnie obracając naczynie. Dodaj 100 mikrolitrów pożywki różnicującej do każdego dołka bardzo niskiej nasadki.

Dolna 96-dołkowa płytka pod mikroskopem stereoskopowym. Przenieś EBS w małych ilościach z naczynia myjącego do studzienek 96 U. Inkubuj EBS przez cztery dni, aby umożliwić utworzenie neuroektodermy w czwartym dniu.

Umyć komórki w pożywce różnicującej i wysiewać je pojedynczo do dołków płytki wielomiareczkowej pokrytej matrżelem, takiej jak płytka 12-dołkowa. Komórki powinny być równomiernie rozmieszczone w studzienkach, aby umożliwić niezakłócony wzrost neuronów. Pozwól EBS luźno przyłączyć się do matrycy przez około 10 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie ostrożnie przenieś płytkę do inkubatora. Neurony wyrosną z platerowanego EBS w sposób promienisty w ciągu najbliższych czterech dni. Wcześniej wykazaliśmy, że podobnie jak wiele innych, EBS z H PSC można wytwarzać po prostu przez ponowne powlekanie, agregacje po rutynowym dzieleniu HPC H na naczynia o niskim przyłączeniu.

Zwykle powoduje to szeroki rozkład rozmiarów komórek. Innym problemem jest to, że EBS utrzymywane w zawiesinie mają tendencję do agregacji ze sobą, co prowadzi do jeszcze większej niejednorodności rozmiaru, aby obejść tę pojedynczą H PSC były umieszczane w dołkach o niskim przyłączeniu, co skutkowało brakiem tworzenia się EB i śmierci komórki. Jednak połączenie cząsteczki przetrwania komórki, Y 2 7 6 3 2 z alkoholem poliwinylowym, który, jak wykazano, zwiększa tworzenie EB z HSC, umożliwiło EBS tworzenie się z zawiesin HESC pojedynczych komórek w ciągu nocy.

Dogodnie, rozmiary EB w tym formacie płytki z wieloma miareczkami mogą być ściśle kontrolowane poprzez umieszczanie różnej liczby komórek w studzince. W przeciwieństwie do stosowania konwencjonalnych technik, po przeniesieniu EBS na płytki 96 U o bardzo niskim przyłączeniu, tworzenie neuroektodermy indukowano za pomocą koktajlu drobnocząsteczkowego składającego się z inhibitorów F-G-F-E-R-K-T-G, TGF beta SMA dwa i BP SMA jeden, które następnie pozwoliły na posiew komórek na matrycy w celu powstania neuronów. Zainicjowanie tworzenia EB z około 8 000 komórek dało najlepszą zdolność różnicowania neuronów, która charakteryzuje się wyraźnymi wyrostkami neuronalnymi z posianych ebs.

Zmniejszone martwicze centra EB po posiewie i wysoka ekspresja markerów czuciowych i panneuronalnych, takich jak tubulina B, rrn, trzy, A i beta trzy. Ogólna skuteczność różnicowania neuronów wydaje się być porównywalna z pierwotną procedurą, która do tej pory ma zastosowanie zarówno do HSC, jak i HI PSC. Trzy niezależne linie HPSC, komórki HES oraz HIPS, zostały pomyślnie przetestowane w procedurze wielodołkowej, przy czym generalnie nie można wykluczyć zmienności i efektywności różnicowania zależnej od linii komórkowej.

Ten rysunek przedstawia zdysocjowane w ciągu jednego dnia cztery komórki neuroektodermalne, które zostały posiane jako pojedyncze komórki i pomyślnie różnicowane z wydajnością około 60% Obsługa EBS na platformie z wieloma miareczkami wymaga na początku trochę treningu, ale po pewnym czasie zobaczysz, że jest to całkiem łatwe.