Name: Ortotopowy przeszczep aorty u myszy w celu zbadania choroby naczyniowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Poznaj technikę ortotopowego przeszczepu aorty brzusznej u myszy do badania chorób naczyniowych po transplantacji. Metoda zapewnia jednolitą wielkość przeszczepu i umożliwia precyzyjną analizę morfometryczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była finansowana ze środków podstawowych zasobów NIH P30 O'Brien center (DK 079337).

1. Przygotowanie przedoperacyjne
<ol>
	<li>Procedury chirurgiczne, niezależnie od tego, jak starannie są przeprowadzane, powodują znaczny stres. Aby zminimalizować skutki takiego stresu i zmaksymalizować rezerwy organizmu, zwierzęta powinny przebywać w wiryarium przez co najmniej 72 hr przed zabiegiem10,11.</li>
	<li>Narzędzia chirurgiczne, gaza i tampony muszą być sterylne. Stosowanie sterylnych rękawiczek nie jest konieczne, pod warunkiem że tylko końcówki instrumentów dotykają szwów lub pola operacyjnego.</li>
	<li>W celu hemostazy kluczowe jest, aby nacisk zacisków był minimalny i niezbędny. Uszkodzenie naczynia spowodowane nadmiernym naciskiem lub gwałtownym obchodzeniem się z tkanką spowoduje zakrzepicę, co prowadzi do paraliżu tylnych kończyn, niedokrwienia jelit i śmierci w ciągu 24 hr. Stwierdzono, że zastosowanie zacisków o nacisku nieprzekraczającym 2 gm/cm2 eliminuje ten problem. Zaciski te wymieniono w Tabeli 1. Nacisk zacisków jest podany w specyfikacjach instrumentów produkowanych przez wysokiej jakości producentów narzędzi chirurgicznych. Zaobserwowano, że tanie zaciski lub zaciski jednorazowe uniwersalnie wywierają zbyt duży nacisk.</li>
	<li>Lokalizacja naczyń obocznych, a także wzajemne położenie aorty brzusznej i żyły głównej dolnej (IVC) są zależne od szczepu. Można również napotkać niewielkie różnice między poszczególnymi myszami, szczególnie w lokalizacji naczyń obocznych.</li>
</ol>
2. Operacja dawcy
<ol>
	<li>Myszy można znieczulić izofluranem (indukcja 1,5-2,5 %, podtrzymanie 1,0 % w powietrzu) lub pentobarbitalem (55-65 mg/kg). Pentobarbital narzuca ograniczenie czasowe (do 1,5 h), ale daje chirurgowi możliwość obracania zwierzęcia w celu lepszego dostępu, jeśli jest to wymagane. Czas znieczulenia można wydłużyć do 2 h, aplikując w razie potrzeby 2-3 krople środka znieczulającego na jelito lub wątrobę w trakcie operacji. Ketamina/ksylazyna (100 mg/kg masy ciała dla ketaminy i 7 mg/kg dla ksylazyny, ip) może być również stosowana przez doświadczonych chirurgów, którzy są w stanie zakończyć procedurę w ciągu 1 do 1,5 h, jednak ma ona węższy bezpieczny zakres dawek. W USA stosowanie pentobarbitalu stało się w ostatnich latach bardziej problematyczne ze względu na niedobory dostaw. Niezbędne jest monitorowanie głębokości znieczulenia, aby upewnić się, że jest ono wystarczające. Odruch uciskania palca u nogi jest najlepszym wskaźnikiem odpowiedniej głębokości, lecz należy również zwracać uwagę na częstotliwość oddychania oraz inne ruchy.</li>
	<li>Po indukcji znieczulenia należy użyć żelu depilacyjnego lub golarki, aby usunąć sierść z brzusznej strony brzucha.</li>
	<li>Umieść zwierzę na stole operacyjnym, używając taśmy laboratoryjnej, aby utrzymać je w pozycji z rozstawionymi kończynami. Metalowy stół operacyjny umożliwia zastosowanie pod nim mata grzewczej w celu zapewnienia stabilności temperatury podczas operacji. Temperaturę maty grzewczej, która jest urządzeniem klasy konsumenckiej do użytku domowego, kontrolujemy ręcznie. Temperaturę utrzymuje się w zakresie 35-38°. Metalowy stół operacyjny jest również łatwy do sterylizacji pomiędzy zabiegami.</li>
	<li>Zdezynfekuj obszar za pomocą środka odkażającego, takiego jak chlorheksydyna, a następnie przemyj etanolem. Powtórz tę procedurę trzy razy, aby zapewnić odpowiednią dezynfekcję. Pozwoli to również usunąć wszelkie pozostałe odcięte fragmenty sierści, jeśli są obecne.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek wykonaj nacięcie przez ścianę ciała, aby odsłonić trzewia jamy brzusznej.</li>
	<li>Używając patyczka watnego, odsuń trzewia na bok, aby odsłonić główne naczynia krwionośne brzucha. Trzewia umieszcza się na kawałku gazy nasączonej ciepłym roztworem soli fizjologicznej, aby utrzymać ich wilgotność.</li>
	<li>Stosując rozwarstwianie tępym narzędziem, bardzo ostrożnie wypreparuj aortę brzuszną z otaczających ją tkanek. Zachowaj szczególną ostrożność podczas oddzielania naczynia od żyły głównej dolnej. Wystąpią jedna lub więcej odgałęzień, takich jak tętnica lędźwiowa, które należy ostrożnie unieść i wypalić. Wypreparowany odcinek aorty powinien znajdować się poniżej naczyń nerkowych i powyżej rozwidlenia aorty na tętnice udowe. Odcinek ten może służyć jako materiał donora dla maksymalnie dwóch biorców, w zależności od liczby naczyń odgałęziających i wielkości zwierzęcia donora.</li>
	<li>Zawieź szew tuż poniżej tętnic nerkowych oraz kolejny tuż powyżej rozwidlenia. Za pomocą nożyczek przetnij aortę, a następnie całkowicie wypłucz przeszczep roztworem soli fizjologicznej zawierającym 200 U/ml heparyny. Bardzo ostrożnie przytrzymaj jeden koniec naczynia i powoli wlewaj roztwór soli fizjologicznej tak, aby przepływał przez naczynie siłą grawitacji. Nie dopuść do przedostania się pęcherzyków powietrza do naczynia. Końcówki naczynia należy dotykać jak najmniej, w przeciwnym razie może dojść do uszkodzenia intimy, co w późniejszym czasie spowoduje zakrzepicę. Usuń naczynie z pola operacyjnego i natychmiast umieść je w pojemniku z lodowatą solą fizjologiczną. Pozostaw zwierzę donora do upuszczenia krwi.</li>
</ol>
3. Operacja u biorcy
<ol>
	<li>Zanurz zwierzę w narkozie zgodnie z powyższą procedurą i nałóż żel depilacyjny lub użyj golarki, aby usunąć sierść z brzucha. Bezpośrednio przed nacięciem podajemy dawkę buprenorfiny podskórnie w ilości 0.1 mg/kg w celu zapewnienia analgezji.</li>
	<li>Zamocuj zwierzę na polu operacyjnym za pomocą taśmy laboratoryjnej. Zwierzę musi zostać umieszczone na ciepłym stole operacyjnym, co pomoże utrzymać temperaturę ciała podczas zabiegu.</li>
	<li>Nałóż do oczu maść oftalmiczną z gentamycyną, aby zapobiec ich wysychaniu.</li>
	<li>Zdezynfekuj brzuch, a następnie przemyj go etanolem. Powtórz tę procedurę trzy razy, aby zapewnić odpowiednią dezynfekcję.</li>
	<li>Przed przejściem do kolejnego kroku ponownie sprawdź głębokość znieczulenia.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie w linii pośrodkowej skóry i ściany ciała w dwóch etapach, uważając, aby nie uszkodzić tkanek znajdujących się poniżej.</li>
	<li>Wprowadź rozwieracz, aby utrzymać otwarte nacięcie brzuszne. Skieruj zestaw śrub w stronę tylnej części ciała, aby główna część zacisku nie przeszkadzała w pracy.</li>
	<li>Zmocz kwadrat sterylnej gazy solą fizjologiczną i połóż go na jelitach. Opierając palec delikatnie o gazę, wprowadź patyczek watny pod jelita i ostrożnie odsuń jelita na bok, tak aby spoczywały na gazie. Weź kolejny kawałek gazy, połóż go na jelitach i zmocz solą fizjologiczną.</li>
	<li>Usuń wszelką tkankę tłuszczową pokrywającą aortę i żyłę główną dolną (IVC). Czyń to delikatnie; IVC jest bardzo krucha.</li>
	<li>Za pomocą pęsety ostrożnie oddziel aortę podnerkową od IVC. Oczyść obszar wystarczająco duży, aby zmieściły się dwa zaciski z odpowiednim odcinkiem naczynia pomiędzy nimi, tak aby po podziale pozostało wystarczająco dużo naczynia do przyszycia przeszczepu. Podczas preparowania szukaj odgałęzień naczyń; jeśli to konieczne, koaguluj je kauteryzatorem o niskiej temperaturze.</li>
	<li>Załóż zacisk naczyniowy tuż poniżej tętnicy nerkowej oraz drugi tuż nad rozwidleniem.</li>
	<li>Przetnij aortę. Końce aorty zazwyczaj się cofają, pozostawiając przestrzeń około 5 mm. Sprawdź hemostazę. Jeśli zaciski działają prawidłowo, po przecięciu powinna wydostać się tylko niewielka ilość krwi. Jeśli krwawienie trwa, sprawdź zaciski, aby upewnić się, że nic im nie przeszkadza. Należy pamiętać, że żaden fragment aorty nie jest usuwany; zostaje ona jedynie podzielona.</li>
	<li>Przepłucz przecięte końce solą fizjologiczną z heparyną (200 U/ml), a następnie usuń nadmiar roztworu za pomocą tamponu.</li>
	<li>Zamocuj przeszczep w miejscu za pomocą trzech szwów przerywanych na każdym końcu. Przyszyj najpierw jedną stronę anastomozy na każdym końcu, a następnie uzupełnij resztę szwem ciągłym lub kolejnymi szwami przerywanymi. Wystarczające jest zastosowanie siedmiu do ośmiu szwów przerywanych. W przypadku stosowania szwu ciągłego upewnij się, że ściany naczyń pozostają rozluźnione i nie powodujesz zwężenia w miejscu anastomozy.</li>
	<li>Ostrożnie zdejmij zacisk z końca kranialnego i sprawdź, czy nie ma przecieków w liniach szwów. Niewielkie przesiąkanie jest dopuszczalne, pod warunkiem że ustąpi w ciągu około minuty. Jeśli wyciek jest większy, można zastosować pojedynczy szew w celu zatamowania krwawienia.</li>
	<li>Delikatnie uciśnij aortę powyżej miejsca anastomozy zwilżonym aplikatorem watnym, a następnie zdejmij drugi zacisk. Kilkukrotnie delikatnie uciśnij i puść, sprawdzając, czy aorta wydaje się drożna. Przeszczep zostanie natychmiast ukrwiony, a widoczne powinno być tętno.</li>
	<li>Usuń gazę pokrywającą jelita i przesuń je z powrotem na miejsce. Unikaj skręcenia jelit i zachowaj prawidłową orientację anatomiczną.</li>
	<li>Zamknij warstwę mięśniową, używając nici 5-0 Vicryl.</li>
	<li>Zamknij skórę, używając nici 5-0 lub 6-0 prolene.</li>
	<li>Przed zakończeniem znieczulenia podaj myszy podskórnie karprofen w dawce 5 mg/kg, aby wzmocnić analgezję.</li>
	<li>Podaj myszy podskórnie 0.5-0.8 ml soli fizjologicznej.</li>
	<li>Umieść mysz w ogrzewanej klatce w celu rekonwalescencji. Monitoruj ją uważnie podczas wybudzania, aby upewnić się, że przebiega ono prawidłowo. 2-3 h po operacji mysz powinna zachowywać się stosunkowo normalnie. W 12 h po zabiegu podaj zwierzęciu buprenorfinę podskórnie w dawce 2 mg/kg w celu zapewnienia analgezji. Jeśli w dowolnym momencie zwierzę przyjmie wymuszoną pozycję (zgarbienie), wydaje dźwięki lub wykazuje ograniczony zakres ruchu, zbadaj przyczynę problemu. Jeśli nie można ustalić i wyeliminować jednoznacznej przyczyny, zwierzę należy uśpić zgodnie z protokołami instytucjonalnymi. Po 24 h zwierzę powinno otrzymać kolejną dawkę karprofenu podskórnie w ilości 5 mg/kg. Paraliż kończyn tylnych wskazuje na niepowodzenie anastomozy lub wystąpienie zakrzepu; w takiej sytuacji zwierzę należy uśpić.</li>
</ol>

<ol><li>Sun, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+surgical+technique+for+the+establishment+of+a+murine+model+of+aortic+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Microsurgery%22%5BJournal%5D)">Improved surgical technique for the establishment of a murine model of aortic transplantation.</a> Microsurgery. 18, 368-371 (1998).</li>
<li>Dambrin, C., Calise, D., Pieraggi, M. T., Thiers, J. C., Thomsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+aortic+transplantation+in+mice%3A+a+new+model+of+allograft+arteriosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Heart+Lung+Transpl%22%5BJournal%5D)">Orthotopic aortic transplantation in mice: a new model of allograft arteriosclerosis.</a> J. Heart Lung Transpl. 18, 946-951 (1999).</li>
<li>Calise, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+aortic+transplantation+in+rodents+by+the+sleeve+technique%3A+a+model+system+for+the+study+of+graft+vascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Transpl.+Proc%22%5BJournal%5D)">Orthotopic aortic transplantation in rodents by the sleeve technique: a model system for the study of graft vascular disease.</a> Transpl. Proc. 33, 2369-2370 (2001).</li>
<li>Thomsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orthotopic+aortic+graft+mouse+model+to+study+the+immunopathology+of+chronic+vascular+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Transpl.+Proc%22%5BJournal%5D)">An orthotopic aortic graft mouse model to study the immunopathology of chronic vascular rejection.</a> Transpl. Proc. 34, 2833-2835 (2002).</li>
<li>Benza, R. L., George, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aortic+graft+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Heart+Lung+Transpl%22%5BJournal%5D)">Aortic graft transplantation in mice.</a> J. Heart Lung Transpl. 21, 1319-1321 (2002).</li>
<li>Chereshnev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+heterotopic+aortic+arch+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+surgical+research%22%5BJournal%5D)">Mouse model of heterotopic aortic arch transplantation.</a> The Journal of surgical research. 111, 171-176 (2003).</li>
<li>Cho, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+surgical+technique+for+heterotopic+aortic+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Korean+Med.+Sci%22%5BJournal%5D)">Improved surgical technique for heterotopic aortic transplantation in mice.</a> J. Korean Med. Sci. 22, 12-15 (2007).</li>
<li>Zhong, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+transplantation+in+mice%3A+current+status+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Microsurgery%22%5BJournal%5D)">Organ transplantation in mice: current status and future prospects.</a> Microsurgery. 19, 52-55 (1999).</li>
<li>George, J. F., Pinderski, L. J., Litovsky, S., Kirklin, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+mice+and+men%3A+mouse+models+and+the+molecular+mechanisms+of+post-transplant+coronary+artery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Heart+Lung+Transpl%22%5BJournal%5D)">Of mice and men: mouse models and the molecular mechanisms of post-transplant coronary artery disease.</a> J. Heart Lung Transpl. 24, 2003-2014 (2005).</li>
<li>Gorska, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+in+laboratory+animal+research+for+experimental+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Sci+Monit%22%5BJournal%5D)">Principles in laboratory animal research for experimental purposes.</a> Med Sci Monit. 6, 171-180 (2000).</li>
<li>Landi, M. S., Kreider, J. W., Lang, C. M., Bullock, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+shipping+on+the+immune+function+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Vet.+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of shipping on the immune function in mice.</a> Am. J. Vet. Res. 43, 1654-1657 (1982).</li>
<li>Sun, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+surgical+technique+for+the+establishment+of+a+murine+model+of+aortic+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Microsurgery%22%5BJournal%5D)">Improved surgical technique for the establishment of a murine model of aortic transplantation.</a> Microsurgery. 18, 368-371 (1998).</li>
<li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+monoxide+rescues+heme+oxygenase-1-deficient+mice+from+arterial+thrombosis+in+allogeneic+aortic+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Carbon monoxide rescues heme oxygenase-1-deficient mice from arterial thrombosis in allogeneic aortic transplantation.</a> Am. J. Pathol. 175, 422-429 (2009).</li>
<li>Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+transplantation+in+congenic+strains+of+mice.+Transpl%5BTitle%5D)+AND+%22Proc%22%5BJournal%5D)">Heart transplantation in congenic strains of mice. Transpl.</a> Proc. 5, 733-735 (1973).</li>
<li>Chang, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+anastomosis+using+controlled+phase+transitions+in+poloxamer+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Vascular anastomosis using controlled phase transitions in poloxamer gels.</a> Nature medicine. 17, 1147-1152 (2011).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Modele mysie w transplantacji aorty oferują szereg zalet, ponieważ myszy są bardzo dobrze zdefiniowane immunogenetycznie9,12,13 i można je łatwo modyfikować w celu zmiany ekspresji specyficznych genów, jeśli jest to pożądane. Jak wspomniano we wstępie, chirurgia naczyniowa u myszy jest trudniejsza niż w większości modeli ze względu na rozmiar naczyń. Nawet duże tętnice, takie jak aorta, mają zazwyczaj średnicę wewnętrzną nie większą niż 100-200 μm, więc manipulowanie tymi naczyniami wymaga znacznych umiejętnoś...

<table><tbody><tr><td>Klemmy naczyniowe</td><td>Fine Science Tools</td><td>00396-01 (Rozmiar B-1)</td><td></td></tr><tr><td>Pincety Dumont</td><td>Fine Science Tools</td><td>11293-00</td><td></td></tr><tr><td>Nici mikrochirurgiczne z igłą 10-0</td><td>AROSurgical</td><td>TK-107038</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki proste</td><td>Roboz Surgical Instrument Co.</td><td>RS-5620</td><td></td></tr><tr><td>Kauteryzator niskotemperaturowy</td><td>Beaver-Visitec International</td><td>8441000</td><td></td></tr><tr><td>Hak samopodtrzymujący</td><td>World Precision Instruments</td><td>14240</td><td></td></tr></tbody></table>

ortotopowy przeszczep aorty u myszy do badań nad chorobami naczyniowymi

Orthotopic Aortic Transplantation in Mice for the Study of Vascular Disease

Procedury naczyniowe obejmujące anastomozy u myszy są powszechnie uważane za trudne i w dużym stopniu zależne od umiejętności poszczególnych chirurgów. Jest to w dużej mierze prawda, jednak istnieje szereg istotnych zasad, które mogą zmniejszyć trudność tych zabiegów i zwiększyć ich powtarzalność. Ortotopowy przeszczep aorty jest doskonałą procedurą do nauki tych zasad, ponieważ obejmuje tylko dwie anastomozy koniec-do-końca, ale wymaga dobrej techniki szycia i odpowiedniego obchodzenia się z naczyniami, aby zapewnić stały sukces. Procedura ta rozpoczyna się od pobrania odcinka aorty brzusznej od zwierzęcia dawcy, a następnie od przecięcia natywnej aorty u biorcy. Pobraną aortę umieszcza się następnie między przeciętymi końcami aorty biorcy i przyszywa za pomocą anastomoz koniec-do-końca. Pomyślne osiągnięcie tego celu wymaga wysokiego stopnia koncentracji, odpowiednich narzędzi, pewnej ręki oraz świadomości tego, jak łatwo można uszkodzić naczynia krwionośne myszy, co prowadzi do zakrzepicy. Nauka tych kluczowych zasad zajmuje większość czasu osób początkujących podczas nauki mikrochirurgii u małych gryzoni. W całym niniejszym protokole odwołujemy się do tych ważnych punktów. Model ten może być wykorzystany do badania chorób naczyniowych w różnych systemach eksperymentalnych1-8. W przedstawionym tutaj kontekście jest on najczęściej stosowany do badania naczyniowych powikłań potransplantacyjnych, częstego długoterminowego powikłania po przeszczepieniu narządów litego, w którym w obrębie allograftu dochodzi do hiperplazji intimy. Główną zaletą tego modelu jest to, że ułatwia on ilościowe analizy morfometryczne, a przeszczepione naczynie znajduje się bezpośrednio obok naczynia endogennego, które może służyć jako dodatkowa kontrola9. Technika opisana tutaj jest najczęściej stosowana u myszy o masie 18-25 gramów. Większość naszego doświadczenia zgromadziliśmy, pracując ze szczepami C57BL/6J, BALB/cJ oraz C3H/HeJ.

Rysunek 1 przedstawia przeszczep aorty. Białe strzałki wskazują linie szwów. Przejezdny przeszczep wykazuje widoczne tętno. Rysunek 2 obrazuje typowy eksperyment, w którym monitorowano przeżywalność biorców przez okres 56 dni. Jedna grupa składała się z myszy biorców typu dzikiego (C57BL/6 x FVB) z przeszczepioną aortą BALB/c. Druga grupa, oznaczona jako „KO”, składa się z biorców (C57BL/6 x FVB) z niedoborem ekspresji hemooksygenazy-1, co prowadzi do zakrzepicy przeszczepów w ciągu 24 h...

Opisujemy technikę, w której fragment aorty brzusznej myszy jest przeszczepiany ortotopowo tuż poniżej tętnic nerkowych u biorcy allogenicznego lub syngenicznego. Technika ta może być przydatna w badaniach, w których za korzystne uznaje się przeszczepienie dużych tętnic o jednolitym rozmiarze.

Ortotopowy przeszczep aorty u myszy do badań nad chorobami naczyniowymi

Procedury naczyniowe obejmujące anastomozy u myszy są powszechnie uważane za trudne i w dużym stopniu zależne od umiejętności poszczególnych chirurgów. ...

Celem niniejszej procedury jest przeszczepienie aorty brzusznej myszy dawcy do allogenicznej myszy biorcy. Proces ten polega najpierw na pozyskaniu aorty dawcy, a następnie na przygotowaniu miejsca graftu u zwierzęcia biorcy.Następnie aortę biorcy należy wypreparować i przekroić. Ostatnim krokiem jest wykonanie dwóch anastomoz naczyniowych typu koniec-koniec w celu implantacji aorty dawcy. W efekcie procedura ta może zostać wykorzystana do badania rozwoju naczyniowych powikłań potransplantacyjnych w allogenicznych kombinacjach szczepów.Przewagą tej metody nad np. heterotopicznym przeszczepem serca jest łatwiejsze przeprowadzenie analizy morfometrycznej ze względu na jednolity rozmiar naczyń. Ponadto naczynie nie jest otoczone tkanką miąższową, w której mogą występować nacieki komórkowe i inne elementy utrudniające analizę generowanych danych. Zastosowanie tej techniki może być szczególnie użyteczne w obrazowaniu mechanizmów związanych z naczyniową chorobą po przeszczepieniu, która stanowi nierozwiązany problem w klinicznym transplantologicznie u ludzi.Aby zminimalizować skutki stresu i maksymalnie zwiększyć rezerwy energetyczne, należy utrzymywać zwierzęta wtórnie w zoologicznym pomieszczeniu doświadczalnym przez co najmniej 72 godziny przed operacją. W dniu zabiegu należy umieścić metalową deskę operacyjną na podkładce grzewczej ustawionej na temperaturę od 35 do 38 °C. Następnie, po znieczuleniu, należy usunąć sierść z brzusznej strony brzucha zwierzęcia.Używając taśmy laboratoryjnej, przymocuj zwierzę do stołu operacyjnego w pozycji rozczłonkowanej (spread eagle), a następnie trzykrotnie zdezynfekuj cały ogolony obszar ciała zwierzęcia środkiem dezynfekującym, a następnie etanolem, posługując się sterylnymi nożyczkami. Następnie wykonaj nacięcie przez ścianę ciała, aby odsłonić narządy jamy brzusznej. Za pomocą sterylnego patyczka bawełnianego odsuń narządy na bok, kładąc je na kawałku sterylnej gazy zwilżonej ciepłą solą fizjologiczną, odsłaniając główne naczynia krwionośne jamy brzusznej.Następnie, bardzo ostrożnie, poprzez tępe oddzielenie, wypreparuj aortę brzuszną z otaczających tkanek, w tym z żyły głównej dolnej, a następnie ostrożnie unieś i zakauteryzuj tętnice lędźwiowe. Odcinek aorty przeznaczony do wycięcia powinien znajdować się poniżej naczyń nerkowych i powyżej rozwidlenia aorty na tętnice udowe. Po zidentyfikowaniu obszaru, zawiąż szew tuż poniżej tętnic nerkowych oraz kolejny tuż nad rozwidleniem.Następnie za pomocą nożyczek należy przeciąć aortę, po czym bardzo ostrożnie przytrzymać jeden koniec naczynia i wkraplać sól fizjologiczną z heparyną tak, aby przepływała przez naczynie pod wpływem grawitacji. Następnie, manipulując końcami naczynia w jak najmniejszym stopniu, należy wyjąć graft i niezwłocznie umieścić go w pojemniku z lodowatą solą fizjologiczną.Po podaniu zwierzęciu biorcy znieczulenia i leków przeciwbólowych, ogolić brzuszną stronę brzucha, zgodnie z pokazanym schematem. Do oczu nałożyć maść okulistyczną z gentamycyną, aby zapobiec ich wysychaniu, a następnie zdezynfekować brzuch w sposób zaprezentowany, aby zapewnić odpowiednią sterylność. Następnie wykonać cięcie w linii pośrodkowej przez skórę i ścianę ciała w etapach.Następnie wprowadź rozieracz, aby utrzymać nacięcie brzuszne w pozycji otwartej, kierując zespół śrub w stronę tylnej części zwierzęcia, tak aby główna część zacisku nie przeszkadzała. Następnie połóż nasączoną solą fizjologiczną sterylną gazę na jelitach. Następnie, delikatnie przytrzymując gazę palcem wewnątrz.Wsuń sterylny patyczek bawełniany pod jelita i delikatnie je odchyl tak, aby spoczywały na gazie. Połóż kolejny kawałek sterylnej gazy na jelitach i zwilż go solą fizjologiczną. Po delikatnym usunięciu tkanki tłuszczowej pokrywającej ATA oraz żyłę główną dolną, użyj pęsety, aby ostrożnie oddzielić aortę podnerkową od żyły głównej dolnej.Następnie oczyść obszar wystarczająco duży, aby zapewnić miejsce na dwa klamry, oraz odsłoń odpowiedni odcinek naczynia, aby po podziale pozostał fragment, do którego będzie można przyszyć przeszczep. Należy pamiętać, że czarną nić chirurgiczną można wykorzystać do kontrolowania naciągu naczynia. Podczas preparowania należy zwracać uwagę na odgałęzienia naczyń, koagulując je w razie potrzeby za pomocą kauteryzatora o niskiej temperaturze.Następnie należy założyć jeden zacisk naczyniowy tuż poniżej tętnicy nerkowej oraz drugi zacisk naczyniowy tuż nad rozwidleniem. Następnie przecina się aortę. W tym przypadku cięcie wykonano bliżej rozwidlenia, ponieważ naczynie boczne zostało wypalone koagulatorem w pobliżu środka między dwoma zaciskami, co czyni to miejsce nieodpowiednim do wykonania anastomozy; końce aorty zazwyczaj się cofają, pozostawiając przerwę o szerokości około pięciu milimetrów.Sprawdzić hemostazę. Jeśli zaciski działają prawidłowo, po przecięciu powinno wyciekać jedynie niewielka ilość krwi. Następnie wypłukać przecięte końce aorty solą fizjologiczną z heparyną, a potem osuszyć nadmiar roztworu za pomocą tamponu.Następnie przymocuj przeszczep w odpowiednim miejscu, stosując po trzy szwy przerywane na każdym końcu. Potem zaszyj jedną stronę anastomozy na każdym końcu i dopełnij pozostałą część, stosując od siedmiu do ośmiu szwów przerywanych. W przypadku preferowania szwu ciągłego, należy zadbać o to, aby ściany naczynia pozostały rozluźnione i aby nie doprowadzić do zwężenia w miejscu anastomozy.Teraz ostrożnie zdejmij zacisk z końca czaszkowego aorty i sprawdź, czy wzdłuż linii szwów nie występują wycieki. Następnie, delikatnie uciskając aortę powyżej miejsca anastomozy zwilżonym aplikatorem watowym, zdejmij drugi zacisk. Kilka razy lekko uciśnij i zwolnij aortę, aby upewnić się, że naczynie jest drożne. Przeszczep zostanie natychmiast ukrwiony, a widoczne powinno być tętno.Następnie należy usunąć gazę zakrywającą jelita i przesunąć je z powrotem na miejsce, zachowując ich prawidłową orientację anatomiczną i unikając skręcenia. Do zamknięcia warstwy mięśniowej należy użyć szwy Vicryl 5-0, a następnie zamknąć skórę szwem Prolene 5-0 lub 6-0. Przed zakończeniem znieczulenia mysz należy poddać podskórnemu leczeniu karprofenem w celu wzmocnienia analgezji, a następnie podać myszy od 0,5 do 0,8 ml soli fizjologicznej tą samą drogą.Na koniec umieść mysz w ogrzewanej klatce w celu rekonwalescencji i uważnie monitoruj zwierzę. W 12. i 24. godzinie po operacji podaj zwierzęciu odpowiednio podskórnie buprenorfinę i karprofen. Na pierwszej rycinie przedstawiono przeszczep aorty.Należy zwrócić uwagę na linie szwów wskazane tutaj białymi strzałkami. Przedstawiono typowy eksperyment, w którym przeżywalność biorców śledzono przez okres 56 dni. Grupa kontrolna składała się z myszy biorców szczepu C 57 BL six by FVB typu dzikiego, którym przeszczepiono aortę brzuszną.Grupa doświadczalna składała się z biorców C 57 BL six x FVB z niedoborem ekspresji hemooksygenazy 1. Ten nokaut prowadzi do zakrzepicy przeszczepów w ciągu 24 godzin. Co istotne, skutkowało to śmiercią wszystkich biorców.Ostatnia rycina przedstawia pomiary echoa żyły głównej dolnej, żyły wątrobowej i aorty brzusznej u zwierzęcia zdrowego oraz u biorcy przeszczepu. Należy zauważyć, że przeszczep jest drożny i wygląda podobnie do aorty u zwierzęcia bez przeszczepu. Jak Państwo widzieli, tkanki są bardzo delikatne i małe, dlatego należy pamiętać, że procedura ta jest umiejętnością nabytą, w związku z czym wymagana jest znaczna ilość ćwiczeń, zanim będzie można ją wykonywać pomyślnie i rutynowo po opanowaniu techniki.Przy prawidłowym wykonaniu technikę tę można przeprowadzić w ciągu jednej godziny.

orthotopic-aortic-transplantation-mice-for-study-vascular

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ortotopiczna przeszczepioność aorty u myszy w badaniach nad chorobami naczyniowymi

W niniejszym filmie zaprezentowano model ortotopowego przeszczepu aorty jako prosty model do badania rozwoju waskulopatii przeszczepu (TVP) u szczurów. <br...

Ortotopowy przeszczep aorty: model szczurzy do badania rozwoju przewlekłej waskulopatii

Ten film demonstruje metodę generowania modelu interpozycji aorty myszy do badania odrzucenia naczyniowego wywołanego alloimmunologicznie. Po umieszczeniu znieczulonej myszy dawcy w pozycji leżącej, aorta podnerkowa brzuszna (IAA) jest starannie izolowana od otaczających struktur. Rozgałęzione naczynia są podwiązane, a oba końce IAA są zaciśnięte, aby zapobiec przepływowi krwi przed resekcją. Następnie dawca IAA jest wszczepiany allogenicznej myszy biorcy, a przepływ krwi jest przywracany przez...

Mysi model interpozycji aorty do badania odrzucenia naczyniowego wywołanego alloimmunologicznie

Opisujemy protokoły dla naszych modeli miażdżycy przeszczepów myszy (GA), które polegają na wprowadzeniu segmentu naczynia myszy do biorcy tego samego szczepu wsobnego. Poprzez krzyżowanie wsteczne dodatkowych zmian genetycznych z dawcą naczynia, model może ocenić wpływ określonych genów na GA.

Modele myszy do miażdżycy przeszczepów

Opisujemy protokół szczepienia interpozycji aorty u myszy. Celem protokołu jest dostarczenie modelu, za pomocą którego można badać procesy patologiczne i strategie terapeutyczne związane z reakcjami alloimmunologicznymi w tętnicach i wynikającymi z nich zmianami tętniczymi, które przyczyniają się do niewydolności przeszczepu narządu.

Mysi model odrzucenia naczyniowego indukowanego alloimmunologicznie i miażdżycy tętnic po przeszczepie

Aby zbadać łączoną allotransplantację narządów litych i unaczynionych kompozytów, opisujemy nowy heterotopowy model przeszczepu en bloc ściany klatki piersiowej, grasicy i serca u myszy przy użyciu techniki mankietu szyjki macicy bez szwów.

Nowatorski model mikrochirurgiczny do heterotopowego, en bloc ściany klatki piersiowej, grasicy i przeszczepu serca u myszy

Ten nowatorski model do ortotopowego przeszczepu kończyn tylnych u myszy, wykorzystujący technikę mankietu bez szwów do zespolenia supermikronaczyniowego, stanowi potężne narzędzie do mechanistycznych badań immunologicznych in vivo związanych z unaczynioną allotransplantacją kompozytową (VCA).

Ortotopowy przeszczep kończyn tylnych u myszy

Prezentujemy model ortotopowego przeszczepu aorty przy użyciu techniki rękawowej u myszy. Jest to bardzo szybka metoda zespolenia, która może być stosowana w badaniach nad chorobami naczyniowymi.

Zastosowanie techniki rękawowej w mysim modelu przeszczepu aorty - film instruktażowy

Tutaj prezentujemy protokół heterotopowego przeszczepu aorty u myszy przy użyciu techniki mankietu bez szwów w mysim modelu szyjki macicy. Model ten może być wykorzystany do badania patologii leżącej u podstaw przewlekłej waskulopatii przeszczepu allogenicznego (CAV) i może pomóc w ocenie nowych środków terapeutycznych w celu zapobiegania jej powstawaniu.

Mysi model przeszczepu aorty szyjnej przy użyciu zmodyfikowanej techniki mankietu bez szwów

Pokazano nowatorską technikę rekonstrukcji obwodu krwi w heterotopowym modelu przeszczepu serca myszy w jamie brzusznej.

Rekonstrukcja obwodu krwi w modelu przeszczepu serca myszy w jamie brzusznej

Modele transplantacji serca u myszy stanowią cenne narzędzia badawcze do badania immunologii transplantacyjnej. Niniejszy protokół szczegółowo opisuje heterotopowy przeszczep serca szyjki macicy u myszy, który polega na umieszczeniu mankietów na wspólnej tętnicy szyjnej biorcy i pniu tętnicy płucnej dawcy, aby umożliwić laminarny przepływ krwi.

Heterotopowy przeszczep szyjki macicy u myszy z wykorzystaniem mankietów naczyniowych

Ten protokół przedstawia uproszczoną technikę anastomozy szwu końcowo-bocznego do przeszczepu serca szyjnego u myszy, zapewniając solidny i możliwy do powtórzenia model do badania immunologii przeszczepów.

Przeszczepienie heterotopowe serca mysiego w okolicy szyjnej z zastosowaniem techniki anastomozy końca z boku w celu badania immunologii przeszczepów

Poznaj technikę ortotopowego przeszczepu aorty brzusznej u myszy do badania chorób naczyniowych po transplantacji. Metoda zapewnia jednolitą wielkość przeszczepu i umożliwia precyzyjną analizę morfometryczną.

Ortotopowy przeszczep aorty u myszy do badań nad chorobami naczyniowymi

Przeglądaj więcej filmów