Ortotopowy przeszczep aorty u myszy do badań nad chorobami naczyniowymi
28 listopada 2012
Opisujemy technikę, w której fragment aorty brzusznej myszy jest przeszczepiany ortotopowo tuż poniżej tętnic nerkowych u biorcy allogenicznego lub syngenicznego. Technika ta może być przydatna w badaniach, w których za korzystne uznaje się przeszczepienie dużych tętnic o jednolitym rozmiarze.
Celem niniejszej procedury jest przeszczepienie aorty brzusznej myszy dawcy do allogenicznej myszy biorcy. Proces ten polega najpierw na pozyskaniu aorty dawcy, a następnie na przygotowaniu miejsca graftu u zwierzęcia biorcy.
Następnie aortę biorcy należy wypreparować i przekroić. Ostatnim krokiem jest wykonanie dwóch anastomoz naczyniowych typu koniec-koniec w celu implantacji aorty dawcy. W efekcie procedura ta może zostać wykorzystana do badania rozwoju naczyniowych powikłań potransplantacyjnych w allogenicznych kombinacjach szczepów.
Przewagą tej metody nad np. heterotopicznym przeszczepem serca jest łatwiejsze przeprowadzenie analizy morfometrycznej ze względu na jednolity rozmiar naczyń. Ponadto naczynie nie jest otoczone tkanką miąższową, w której mogą występować nacieki komórkowe i inne elementy utrudniające analizę generowanych danych. Zastosowanie tej techniki może być szczególnie użyteczne w obrazowaniu mechanizmów związanych z naczyniową chorobą po przeszczepieniu, która stanowi nierozwiązany problem w klinicznym transplantologicznie u ludzi.
Aby zminimalizować skutki stresu i maksymalnie zwiększyć rezerwy energetyczne, należy utrzymywać zwierzęta wtórnie w zoologicznym pomieszczeniu doświadczalnym przez co najmniej 72 godziny przed operacją. W dniu zabiegu należy umieścić metalową deskę operacyjną na podkładce grzewczej ustawionej na temperaturę od 35 do 38 °C. Następnie, po znieczuleniu, należy usunąć sierść z brzusznej strony brzucha zwierzęcia.
Używając taśmy laboratoryjnej, przymocuj zwierzę do stołu operacyjnego w pozycji rozczłonkowanej (spread eagle), a następnie trzykrotnie zdezynfekuj cały ogolony obszar ciała zwierzęcia środkiem dezynfekującym, a następnie etanolem, posługując się sterylnymi nożyczkami. Następnie wykonaj nacięcie przez ścianę ciała, aby odsłonić narządy jamy brzusznej. Za pomocą sterylnego patyczka bawełnianego odsuń narządy na bok, kładąc je na kawałku sterylnej gazy zwilżonej ciepłą solą fizjologiczną, odsłaniając główne naczynia krwionośne jamy brzusznej.
Następnie, bardzo ostrożnie, poprzez tępe oddzielenie, wypreparuj aortę brzuszną z otaczających tkanek, w tym z żyły głównej dolnej, a następnie ostrożnie unieś i zakauteryzuj tętnice lędźwiowe. Odcinek aorty przeznaczony do wycięcia powinien znajdować się poniżej naczyń nerkowych i powyżej rozwidlenia aorty na tętnice udowe. Po zidentyfikowaniu obszaru, zawiąż szew tuż poniżej tętnic nerkowych oraz kolejny tuż nad rozwidleniem.
Następnie za pomocą nożyczek należy przeciąć aortę, po czym bardzo ostrożnie przytrzymać jeden koniec naczynia i wkraplać sól fizjologiczną z heparyną tak, aby przepływała przez naczynie pod wpływem grawitacji. Następnie, manipulując końcami naczynia w jak najmniejszym stopniu, należy wyjąć graft i niezwłocznie umieścić go w pojemniku z lodowatą solą fizjologiczną.
Po podaniu zwierzęciu biorcy znieczulenia i leków przeciwbólowych, ogolić brzuszną stronę brzucha, zgodnie z pokazanym schematem. Do oczu nałożyć maść okulistyczną z gentamycyną, aby zapobiec ich wysychaniu, a następnie zdezynfekować brzuch w sposób zaprezentowany, aby zapewnić odpowiednią sterylność. Następnie wykonać cięcie w linii pośrodkowej przez skórę i ścianę ciała w etapach.
Następnie wprowadź rozieracz, aby utrzymać nacięcie brzuszne w pozycji otwartej, kierując zespół śrub w stronę tylnej części zwierzęcia, tak aby główna część zacisku nie przeszkadzała. Następnie połóż nasączoną solą fizjologiczną sterylną gazę na jelitach. Następnie, delikatnie przytrzymując gazę palcem wewnątrz.
Wsuń sterylny patyczek bawełniany pod jelita i delikatnie je odchyl tak, aby spoczywały na gazie. Połóż kolejny kawałek sterylnej gazy na jelitach i zwilż go solą fizjologiczną. Po delikatnym usunięciu tkanki tłuszczowej pokrywającej ATA oraz żyłę główną dolną, użyj pęsety, aby ostrożnie oddzielić aortę podnerkową od żyły głównej dolnej.
Następnie oczyść obszar wystarczająco duży, aby zapewnić miejsce na dwa klamry, oraz odsłoń odpowiedni odcinek naczynia, aby po podziale pozostał fragment, do którego będzie można przyszyć przeszczep. Należy pamiętać, że czarną nić chirurgiczną można wykorzystać do kontrolowania naciągu naczynia. Podczas preparowania należy zwracać uwagę na odgałęzienia naczyń, koagulując je w razie potrzeby za pomocą kauteryzatora o niskiej temperaturze.
Następnie należy założyć jeden zacisk naczyniowy tuż poniżej tętnicy nerkowej oraz drugi zacisk naczyniowy tuż nad rozwidleniem. Następnie przecina się aortę. W tym przypadku cięcie wykonano bliżej rozwidlenia, ponieważ naczynie boczne zostało wypalone koagulatorem w pobliżu środka między dwoma zaciskami, co czyni to miejsce nieodpowiednim do wykonania anastomozy; końce aorty zazwyczaj się cofają, pozostawiając przerwę o szerokości około pięciu milimetrów.
Sprawdzić hemostazę. Jeśli zaciski działają prawidłowo, po przecięciu powinno wyciekać jedynie niewielka ilość krwi. Następnie wypłukać przecięte końce aorty solą fizjologiczną z heparyną, a potem osuszyć nadmiar roztworu za pomocą tamponu.
Następnie przymocuj przeszczep w odpowiednim miejscu, stosując po trzy szwy przerywane na każdym końcu. Potem zaszyj jedną stronę anastomozy na każdym końcu i dopełnij pozostałą część, stosując od siedmiu do ośmiu szwów przerywanych. W przypadku preferowania szwu ciągłego, należy zadbać o to, aby ściany naczynia pozostały rozluźnione i aby nie doprowadzić do zwężenia w miejscu anastomozy.
Teraz ostrożnie zdejmij zacisk z końca czaszkowego aorty i sprawdź, czy wzdłuż linii szwów nie występują wycieki. Następnie, delikatnie uciskając aortę powyżej miejsca anastomozy zwilżonym aplikatorem watowym, zdejmij drugi zacisk. Kilka razy lekko uciśnij i zwolnij aortę, aby upewnić się, że naczynie jest drożne. Przeszczep zostanie natychmiast ukrwiony, a widoczne powinno być tętno.
Następnie należy usunąć gazę zakrywającą jelita i przesunąć je z powrotem na miejsce, zachowując ich prawidłową orientację anatomiczną i unikając skręcenia. Do zamknięcia warstwy mięśniowej należy użyć szwy Vicryl 5-0, a następnie zamknąć skórę szwem Prolene 5-0 lub 6-0. Przed zakończeniem znieczulenia mysz należy poddać podskórnemu leczeniu karprofenem w celu wzmocnienia analgezji, a następnie podać myszy od 0,5 do 0,8 ml soli fizjologicznej tą samą drogą.
Na koniec umieść mysz w ogrzewanej klatce w celu rekonwalescencji i uważnie monitoruj zwierzę. W 12. i 24. godzinie po operacji podaj zwierzęciu odpowiednio podskórnie buprenorfinę i karprofen. Na pierwszej rycinie przedstawiono przeszczep aorty.
Należy zwrócić uwagę na linie szwów wskazane tutaj białymi strzałkami. Przedstawiono typowy eksperyment, w którym przeżywalność biorców śledzono przez okres 56 dni. Grupa kontrolna składała się z myszy biorców szczepu C 57 BL six by FVB typu dzikiego, którym przeszczepiono aortę brzuszną.
Grupa doświadczalna składała się z biorców C 57 BL six x FVB z niedoborem ekspresji hemooksygenazy 1. Ten nokaut prowadzi do zakrzepicy przeszczepów w ciągu 24 godzin. Co istotne, skutkowało to śmiercią wszystkich biorców.
Ostatnia rycina przedstawia pomiary echoa żyły głównej dolnej, żyły wątrobowej i aorty brzusznej u zwierzęcia zdrowego oraz u biorcy przeszczepu. Należy zauważyć, że przeszczep jest drożny i wygląda podobnie do aorty u zwierzęcia bez przeszczepu. Jak Państwo widzieli, tkanki są bardzo delikatne i małe, dlatego należy pamiętać, że procedura ta jest umiejętnością nabytą, w związku z czym wymagana jest znaczna ilość ćwiczeń, zanim będzie można ją wykonywać pomyślnie i rutynowo po opanowaniu techniki.
Przy prawidłowym wykonaniu technikę tę można przeprowadzić w ciągu jednej godziny.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje technikę ortotopowego przeszczepienia fragmentu aorty brzusznej od myszy dawcy do myszy biorcy. Metoda ta jest szczególnie użyteczna w badaniu rozwoju naczyniowych powikłań po przeszczepie.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Techniki transplantacji
- Biologia naczyniowa
- Modele mysie
Wstęp
- Przeszczepy dużych tętnic mogą dostarczyć wiedzy na temat chorób naczyniowych.
- Zrozumienie powikłań po przeszczepie jest kluczowe dla poprawy wyników transplantacji.
- Modele allogeniczne i syngeniczne pomagają w badaniu odpowiedzi immunologicznych.
- Technika ta pozwala na uzyskanie jednolitej wielkości przeszczepu, co zwiększa spójność eksperymentalną.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody transplantacji aorty brzusznej u myszy.
- Ułatwienie prowadzenia badań nad chorobami naczyniowymi po transplantacji.
- Zbadanie wpływu różnych kombinacji szczepów w transplantacjach allogenicznych.
Zastosowane metody
- Pobieranie aorty brzusznej od myszy dawcy.
- Przygotowanie miejsca przeszczepu u myszy biorcy.
- Disekcja i podział natywnej aorty biorcy.
- Wykonanie anastomozy naczyniowej typu koniec-koniec w celu implantacji aorty dawcy.
Główne wyniki
- Technika ta pozwala na skuteczne przeszczepienie aorty brzusznej.
- Model ten umożliwia badanie chorób naczyniowych występujących po transplantacji.
- Zastosowanie różnych kombinacji szczepów pozwala na poznanie mechanizmów odpowiedzi immunologicznej.
- Metoda ta zapewnia jednolitość rozmiaru przeszczepu na potrzeby eksperymentalne.
Wnioski
- Ta technika transplantacji jest cenna w badaniach naczyniowych.
- Stanowi ona platformę do badania powikłań potreplantacyjnych.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać tę metodę w celu lepszego zrozumienia biologii naczyń.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ortotopowy przeszczep aorty u myszy stanowi solidny model przedkliniczny do badania mechanizmów naczyniowej choroby po przeszczepie, która jest głównym wyzwaniem w transplantologii narządów litego. Model ten umożliwia ilościową analizę morfometryczną oraz bezpośrednie porównanie naczyń przeszczepionych i natywnych, co zwiększa wiarygodność prognostyczną w badaniach nad biologią naczyń. Jego powtarzalność oraz możliwości kontrolne sprawiają, że jest on cenny w fazie wczesnych odkryć oraz w ograniczaniu ryzyka mechanistycznego w projektach badawczych nad chorobami naczyniowymi.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie mechanizmów uszkodzenia i naprawy naczyń krwionośnych istotnych dla patologii transplantacji.
- Wspiera walidację funkcjonalną celów genetycznych lub farmakologicznych zaangażowanych w hiperplazję intimy.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez umożliwienie bezpośredniego porównania odpowiedzi allogenicznych i syngenicznych.
- Zapewnia kontrolowany system do badań opartych na hipotezach dotyczących progresji chorób naczyniowych.
Przesiewy i opracowanie testów
- Ustanawia powtarzalną platformę in vivo do oceny potencjalnych interwencji ukierunkowanych na przebudowę naczyniową.
- Zapewnia ilościowe wyniki morfometryczne do standaryzowanej oceny punktów końcowych choroby.
- Umożliwia opracowanie testów w kierunku patologii naczyniowej po transplantacji z wykorzystaniem jednolitych rozmiarów i anatomii naczyń.
- Ułatwia przesiewowe badanie modeli genetycznych lub środków terapeutycznych w kontrolowanym kontekście naczyniowym.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodny z mechanizmami istotnymi dla choroby obserwowanymi w ludzkiej waskulopatii po przeszczepieniu.
- Zapewnia ciągłość od wyników na etapie odkrywania do przedklinicznej walidacji interwencji naczyniowych.
- Wspiera dostosowany do ryzyka rozwój kandydatów terapeutycznych celujących w powikłania naczyniowe.
- Umożliwia opracowanie translacyjnych biomarkerów poprzez bezpośrednią analizę tkankową i obrazowanie.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Model ten łączy wczesny etap odkryć, walidację celu oraz ocenę przedkliniczną w badaniach nad chorobami naczyniowymi, szczególnie w kontekście transplantacji.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia testowanie hipotez dotyczących uszkodzeń naczyń, odpowiedzi immunologicznej oraz mechanizmów naprawczych.
- Przesiewy: Zapewnia standaryzowany, powtarzalny test do oceny interwencji i modyfikacji genetycznych.
- Analityka: Umożliwia ilościowe pomiary morfometryczne i odczyty oparte na obrazowaniu w celu rzetelnego porównania danych.
- Badania translacyjne: Wspiera dopasowanie do punktów końcowych w badaniach nad waskulopatią po przeszczepie.
- Ponowne wykorzystanie w organizacji: Oferuje wielokrotnego użytku, skalowalną platformę do różnorodnych badań nad chorobami naczyniowymi.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w modelowaniu chorób naczyniowych.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację w obrębie kohort doświadczalnych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go w przypadku terapeutyków celowanych w naczynia krwionośne.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów w oparciu o analizę ryzyka w zakresie powikłań naczyniowych związanych z transplantacją.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga zaawansowanej wiedzy i przeszkolenia z zakresu mikrochirurgii w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Wymaga specjalistycznych narzędzi chirurgicznych oraz infrastruktury obrazowej do analizy morfometrycznej.
- Konieczna jest rygorystyczna standaryzacja protokołów chirurgicznych i analitycznych pomiędzy zespołami.
- Można potrzebować adaptacji metody dla różnych szczepów myszy lub różnych tło genetycznych.
- Ograniczenia praktyczne obejmują krzywą uczenia się technik oraz kwestie dobrostanu zwierząt.
