płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe (BAL) do badań; Uzyskanie odpowiedniej wydajności próbki

Ogólnym celem niniejszej procedury jest bezpieczne i skuteczne przeprowadzenie płukania oskrzelowo-pęcherzykowego. Osiąga się to w pierwszej kolejności poprzez zapewnienie bezpieczeństwa, współpracy i komfortu wybranych osób badanych, zgodnie z jasno określonymi kryteriami włączenia i wykluczenia.

Wykonuje się również kontrole i obserwacje przedproceduralne. Następnie, po wejściu do gabinetu bronchoskopii i sprawdzeniu całego sprzętu, pacjentowi podaje się znieczulenie miejscowe oraz oferuje sedację świadomą. Następnie, po intubacji strun głosowych, bronchoskop wprowadza się do odpowiedniej pozycji w obrębie dolnego płata prawego (RML).

Zapewnia to uzyskanie odpowiedniej objętości płynu z BAL. Na koniec płyn z BAL pobiera się za pomocą delikatnego ssania ręcznego, a następnie niezwłocznie transportuje w lodzie do natychmiastowej obróbki laboratoryjnej. Ostatecznie technika ta pozwala na pozyskanie komórek i zachowanie ich żywotności, co ułatwia wzrost komórek w hodowli ex vivo.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami stosowanymi przez lekarzy pulmonologów i intensywnej terapii, często określanych jako płukanie oskrzeli, płukanie pęcherzykowo-oskrzeli lub płukanie pęcherzyków płucnych, których celem jest uzyskanie korzyści diagnostycznych lub terapeutycznych, jest zastosowanie łagodnego ręcznego odsysania wprowadzonej cieczy. Rozwiązanie to ma na celu maksymalizację objętości odzyskanego płynu z pęcherzyków płucnych oraz wywarcie minimalnej siły ścinającej na nabłonek migawkowy, aby zachować strukturę i funkcję komórek w płynie pęcherzykowym. Procedura płukania pęcherzykowo-oskrzeli jest wykonywana w trybie jednodniowym, z odpowiednią kontrolą przed i po zabiegu zgodnie ze standardową polityką szpitalną, w tym z zapewnieniem, że pisemny formularz zgody został prawidłowo podpisany i opatrzony datą.

Po przybyciu z badanym spotyka się pielęgniarka ds. badań oddechowych, która następnie przeprowadza wszystkie niezbędne kontrole przedzabiegowe, w tym sprawdzenie, czy badany pościł przez minimum cztery godziny w przypadku pokarmów stałych i dwie godziny w przypadku płynów. Jeśli badany spełnia wszystkie wymagane kryteria, przebiera się w koszulę szpitalną, a następnie wykonuje się obserwacje przedzabiegowe, obejmujące pomiary ciśnienia tętniczego, tętna i saturacji tlenowej. W idealnym przypadku w lewą dłoń wprowadza się kaniulę o małej średnicy.

Pacjent pozostanie w pomieszczeniu C2 aż do końca okresu rekonwalescencji po zabiegu. Następnie zostaje on przeniesiony do gabinetu bronchoskopii, w którym obecny jest doświadczony bronchoskopista specjalizujący się w badaniach pulmonologicznych. Następnie do pacjenta podłączany jest sprzęt monitorujący.

Zestaw ten obejmuje trójoprowadzeniowe EKG, manometr A, rys. o oraz pulsoksymetr. Wsparcie anestezjologiczne nie jest wymagane. Przed wprowadzeniem bronchoskopu wszystkim ochotnikom zakłada się kaniulę nosową; tlen jest podawany z przepływem do czterech litrów na minutę, jeśli saturacja spadnie poniżej 96%.

Na tym etapie operator przeprowadza kontrole wstępne bronchoskopu. Obejmuje to sprawdzenie skuteczności ssania poprzez aspirację sterylnej soli fizjologicznej. Gdy operator upewni się, że bronchoskop działa optymalnie, podaje znieczulenie miejscowe do przewodów nosowych i błony śluzowej jamy ustnej badanego, stosując odpowiednio instill agel oraz Xylocaine.

Jeśli sedacja jest wskazana i została poproszona przez badanego, podaje się odpowiednią dawkę midazolamu dożylnie. Jak przy wszystkich procedurach z zastosowaniem znieczulenia, należy mieć natychmiastowy dostęp do odpowiedniego środka odwracającego działanie leku. Dodatkowo należy upewnić się, że pod ręką znajduje się sprzęt do resuscytacji.

Badany zostaje zaintubowany przez nos. Jeśli nie jest to możliwe, można przeprowadzić intubację przez usta, pod warunkiem zastosowania odpowiedniego klocka nadgardlnego. Po przejściu przez struny głosowe podaje się znieczulenie miejscowe w ilości od czterech do sześciu mililitrów 4% lidokainy.

Następnie podaje się znieczulenie błon śluzowych, wykorzystując dwie mililitrowe alikwoty 2% lidokainy w obrębie kąta głównego, na rozdzielnicy dolnego i środkowego płata prawego (RML) oraz u wejścia do RML. Na koniec bronchoskop zostaje wprowadzony do środkowego płata prawego i idealnie ustawiony w segmencie przyśrodkowym w bezpiecznej, dystalnej pozycji. Należy wykonać tzw. test mrugnięcia (wink test) za pomocą przycisku ssania, aby upewnić się, że bronchoskop nie znajduje się w zbyt dystalnym położeniu, co mogłoby spowodować zapadnięcie się dróg oddechowych.

Cztery strzykawki o pojemności 60 ml są wstępnie napełnione ogrzaną, sterylną solą fizjologiczną w objętościach: jedna 60 ml, dwie po 50 ml oraz jedna 40 ml. Gdy pacjent i bronchoskopista są gotowi, asystent bronchoskopii podaje pierwszą strzykawkę soli fizjologicznej. Podczas gdy bronchoskopista utrzymuje pozycję w prawym płacie środkowym (RML), asystent wykonuje delikatne odsysanie ręczne, używając tego samego portu i strzykawki.

Następnie procedurę powtarza się trzykrotnie, używając kolejno każdej z strzykawek, przy czym w tej konkretnej technice stosuje się maksymalną objętość 200 mililitrów. Odzyskany płyn z BAL jest delikatnie wypuszczany do plastikowych pojemników, które mogą być uprzednio silikonizowane i umieszczone na kruszącym się lodzie. Silikonizacja hamuje przyleganie komórek i maksymalizuje ich odzysk. Płyn z BAL wydaje się mętny pod światło, z widocznymi na powierzchni pęcherzykami mydlanymi, które tworzą białka i surfaktanty.

Na koniec bronchoskop jest powoli i całkowicie wycofywany. Podmiot zostaje przekazany do monitorowanego okresu rekonwalescencji, a płyn z BAL jest bezzwłocznie transportowany w lodzie. W przypadku natychmiastowej obróbki próbki, należy pozwolić podmiotowi na rekonwalescencję przez maksymalnie cztery godziny pod opieką pielęgniarki specjalizującej się w badaniach nad układem oddechowym.

W tym czasie należy pozwolić badanemu na odpoczynek, jednak nie wolno mu jeść ani pić przez co najmniej 60 minut po zabiegu. Ma to na celu zmniejszenie ryzyka aspiracji, po uprzedniej ocenie bezpieczeństwa zdolności połykania. Obserwacje pozabiegowe są monitorowane i rejestrowane.

Przed wypisem z placówki przeprowadzane jest badanie kliniczne. Pacjent zostaje również poinformowany o częstych działaniach niepożądanych i otrzymuje numer kontaktowy na wypadek wystąpienia istotnych skutków ubocznych. Od jednego do pięciu dni po zabiegu lekarz lub pielęgniarka przeprowadza wizytę kontrolną z pacjentem.

Może to odbyć się telefonicznie lub osobiście. Po przybyciu do laboratorium badawczego wszystkie manipulacje należy wykonywać na mokrym lodzie, jeśli jest to możliwe.

Najpierw należy zmierzyć objętość płynu z przemywania bronchoalveolarnego. Następnie płyn należy przefiltrować przez podwójną warstwę sterylnej gazy, aby usunąć zatory śluzowe, a filtrat zebrać do sterylnych probówek do wirowania o pojemności 50 mililitrów. Komórki należy osadzić poprzez wirowanie przy 500 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 5 do 10 minut.

Usunąć supernatant i przemyć 50 mililitrami zimnej soli fizjologicznej. Powtórzyć wirowanie. Ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej objętości pożywki hodowlanej.

Zazwyczaj dwa mililitry zapewniają odpowiednią gęstość komórek do odliczania. Następnie należy przeprowadzić liczenie komórek przy użyciu hemosytometru i błękitu trypanowego zgodnie ze standardowymi procedurami, a następnie dostosować gęstość zawiesiny komórkowej do 1 × 10⁶ komórek na mililitr poprzez dodanie odpowiedniej objętości pożywki. Następnie należy przenieść jeden mililitr zawiesiny komórkowej do każdego dołka płytki 24-dołkowej.

Inkubuj komórki w płytce wielodołkowej w temperaturze 37°C przez trzy godziny, aby umożliwić przyleganie makrofagów przed pracą z limfocytami. Po trzech godzinach inkubacji medium hodowlane należy delikatnie pipetować w górę i w dół trzy razy, a następnie zebrać. Medium to zawiera limfocyty oraz makrofagi nieprzylegające i może być wykorzystane do oceny funkcji limfocytów.

Może być również stosowane w kolejnych etapach oczyszczania w badaniach nad makrofagami. Po trzech godzinach inkubacji ostrożnie odessać medium i zastąpić je świeżą, ciepłą pożywką bez antybiotyków; w tym momencie makrofagi przylegają do płytki do hodowli tkanek. Komórki BAL zostały odwirowane na szkiełko mikroskopowe za pomocą wirówki cytokologicznej Thermo Shandin i zabarwione różnicującym barwnikiem jądrowym w celu ujawnienia typów komórek.

Większość komórek to makrofagi, takie jak komórka oznaczona literą M, lecz sporadycznie widoczne są również neutrofile oznaczone literą N oraz limfocyty oznaczone literą L. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dokładną wiedzę na temat bezpiecznego i efektywnego przeprowadzania bronchoskopii oraz pobierania BAL w celach badawczych przy użyciu tej techniki, w tym w szczególności w zakresie prawidłowej anestezji nasady języka i tylnej części gardła, sprawdzania sprawności ssania bronchoskopu oraz wykluczenia nieszczelności powietrza przed procedurą, a także wyboru najbardziej odpowiedniej gałęzi podsegmentalnej prawego płata środkowego. Operatorzy powinni konsekwentnie pobierać ponad 100 ml BAL od badanych, u których występują minimalne działania niepożądane.