Ilościowy pomiar odpowiedzi immunologicznej i snu u Drosophila

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ocena snu i funkcji immunologicznych u drosophila. Osiąga się to najpierw poprzez rejestrowanie aktywności lokomotorycznej zakażonych much w celu zmierzenia snu i przeżycia jako drugi krok po homogenizacji muchówek infekcyjnych, rozcieńczeniu i rozprowadzeniu na płytkach agarowych LB. Liczba jednostek tworzących kolonie, które rosną, wskazuje na zdolność much do usunięcia infekcji.

Następnie zakażone muchy wykazujące ekspresję transgenu zawierającego reporter lucyferazy NF kappa b dodaje się do 96-dołkowej płytki zawierającej lucyferian, substrat lucyferazy. Pomiar lucyferazy kappa b w czasie rzeczywistym wskazuje na aktywację szlaku sygnałowego NF kappa B podczas infekcji, całkowity wynik przeżycia podczas snu. Klirens bakteryjny i aktywność reporterowa NF KB to pomiary, które zapewniają mechanistyczny wgląd w molekularne powiązanie między funkcją immunologiczną a zachowaniem.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie lub zmagają się z tym, ponieważ potrzeba czasu i praktyki, aby nauczyć się ręcznie infekować muchy z konsekwencją. Główną przewagą techniki opisanej przez Lucyfera w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak QPCR, jest to, że aktywność NF Kappa B może być mierzona w sposób ciągły w czasie rzeczywistym u żywych ludzi. Muchy Rozpoczynają się od inkubacji kultur drosophila w późnych czasach szkolnych przez trzy do czterech dni, aby dorosłe osobniki przystosowały się do warunków środowiskowych.

Tutaj muchy są umieszczane w stałym świetle, aby wyeliminować wpływ zegara okołodobowego na odpowiedź immunologiczną i zachowanie. Następnie do aktywności dołącza jedno- lub czterodniowe dziecko. Monitory rejestrują swoją aktywność przez co najmniej trzy dni przed infekcją, dzień przed planowaną infekcją.

Wybierz pojedynczą kolonię SIA za pomocą sterylnej końcówki pipety i zanurz końcówkę w probówce hodowlanej zawierającej pięć mililitrów pożywki LB, aby zweryfikować sterylną technikę. Nie zapomnij zrobić próbnej kultury kontrolnej bez bakterii. Hoduj bakterie przez noc, aż osiągną fazę wzrostu wykładniczego Następnego dnia.

Zmierz absorbancję kultury przy 600 nanometrach. Dołącz drugiego weterynarza Q jako puste miejsce. Jest gotowy, gdy stężenie wynosi od 0,5 do jednej jednostki absorbancji subkultury lub w razie potrzeby wydłuż czas hodowli.

Teraz przygotuj roztwór bakteryjny, aby zainfekować muchy. Rozcieńczyć bakterie PBS do oczekiwanej absorbancji 0,1 przy 600 nanometrach. Następnie dodać barwnik spożywczy do kontroli wstrzyknięcia.

Zastąp bakterie podłożem LB. Oba roztwory należy przechowywać na lodzie. Następnie, za pomocą ściągacza do mikropipet, wykonaj igły iniekcyjne z cienką końcówką pod mikroskopem preparacyjnym.

Za pomocą cienkich kleszczyków odłamać końcówkę każdej igły, tak aby otwór był wystarczająco duży, aby można go było wypełnić płynem iniekcyjnym za pomocą odsysania, ale także wystarczająco mały, aby zminimalizować uszkodzenie muchy. Za pomocą strzykawki przymocować szklaną igłę do plastikowej strzykawki o pojemności trzech cm3 z rurką. Przepływ medium iniekcyjnego jest sterowany ręcznie.

Należy unikać zanieczyszczania gumowej rurki płynem do wstrzykiwań, ponieważ aparat strzykawkowy jest używany zarówno do wstrzykiwań zakaźnych, jak i kontrolnych. Sprawdzić przepływ pożywki iniekcyjnej za pomocą chusteczki Kim. Dwa kluczowe elementy udanego wstrzyknięcia to użycie optymalnego rozmiaru igły i bezpieczne uszczelnienie między igłą a strzykawką.

Gdy system iniekcyjny jest w pełni przygotowany, znieczulij muchy za pomocą minimalnego przepływu dwutlenku węgla, postępuj szybko, aby żadna mucha nie była znieczulona dłużej niż pięć minut. Teraz wstrzyknij muchy, wbijając szklaną igłę w obszar powyżej skośnego tellum grzbietowej klatki piersiowej. Przenikanie pożywki do wstrzykiwań do muchy jest weryfikowane przez barwnik spożywczy, który można zobaczyć w miarę rozprzestrzeniania się wstrzykniętego roztworu.

Przed rozpoczęciem upewnij się, że wszystkie materiały użyte do tej procedury zostały również autoklawowane co najmniej dzień wcześniej. Przygotuj 10-centymetrowe szalki Petriego z podłożem agarowym LV. W dniu eksperymentu znieczulić i umieścić muchy w 1,5 mililitrowych probówkach wirówkowych.

Przygotować co najmniej dwie grupy po 10 much każda na warunki doświadczalne. Przygotuj również grupę kontrolną much bez infekcji, zwłaszcza w przypadku stosowania szczepu bakteryjnego bez oporności na antybiotyki. Przechowuj wszystkie załadowane probówki na lodzie.

Następnie dodaj 400 mikrolitrów pożywki LB do każdej rurki załadowanej muchą. Homogenizuj muchy za pomocą małego pestki i rób to w pobliżu płomienia, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Teraz za pomocą odciętych końcówek pipet seryjnie rozcieńczyć homogenat przez współczynnik 10 w objętości 200 mikrolitrów.

Jeśli homogenat zostanie wykonany natychmiast po zakażeniu sia, należy rozcieńczyć do 1 do 1000, ale przez 24 godziny, po zakażeniu homogenat do 1 do 100 000. Następne nasiona, największe dwa dilu na 10-centymetrowych płytkach za pomocą szklanych kulek, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie, inkubować płytki przez noc. Następnego dnia policz liczbę rodzin na talerzu poprzez bezpośrednią obserwację lub za pomocą oprogramowania do liczenia kolonii.

Następnie oblicz liczbę jednostek tworzących kolonie na muchę. W teście tym wykorzystuje się muszki transgeniczne przenoszące reporter lucyferazy kappa b w odpowiednim czasie. Test wymaga również hodowli bakterii, takich jak SCIA, przygotowanych do wstrzyknięcia, jak opisano w poprzednim rozdziale.

Dostosuj muchy do eksperymentalnych warunków oświetleniowych. W tym przykładzie od jednej do czterech dni muchy lucyferazy kappa b są umieszczane w fiolkach zawierających 5% sacharozy, 2% pożywki agarowej i umieszczane w stałym świetle przez dwa dni. Teraz przygotuj mikropłytkę 96 dołków dla much.

Napełnij każdą studzienkę dwiema warstwami jedzenia. Najpierw pożywka, dodaj do każdego 300 mikrolitrów 5% sacharozy, 2% roztworu agaru. Dobrze przykryj talerz ściereczką o drobnych oczkach i pozostaw talerz do całkowitego wyschnięcia na okres do godziny.

Następnie dodaj 50 mikrolitrów wierzchniej warstwy do każdej studzienki zawierającej 5% sacharozy, 1% agaru i dwóch milimolowych Lucyferów. Ponieważ Lucyfer jest wrażliwy na światło, pozwól płytce wyschnąć w ciemności i idź do przodu. Zminimalizuj ekspozycję płyty na światło.

Gdy agar ostygnie, przykryj płytkę przezroczystą folią samoprzylepną. Następnie za pomocą cienkiej igły przebij folię dwukrotnie nad każdym dołkiem. Otwory te umożliwiają wymianę powietrza i znieczulenie gazowe.

Następnie, aby ułatwić ładowanie w locie, użyj ostrego ostrza i prostej krawędzi, aby wprowadzić nacięcie między każdą kolumną. Znieczulij muchy dwutlenkiem węgla i ładuj je pojedynczo do każdej studzienki kolumna po kolumnie. Jeśli mucha przyklei się do folii, daj jej możliwość uwolnienia się przed interwencją.

Umieść płytkę mikrodołkową z powrotem w inkubatorze pod stałym światłem przez osiem do 24 godzin. Aby znieczulić dobrze związane muchy, użyj końcówki mikropipety przymocowanej do niskociśnieniowego przewodu dwutlenku węgla. Upewnij się, że gaz ma nieszkodliwie niskie ciśnienie i umieść końcówkę mikropipety bezpośrednio nad otworami wentylacyjnymi, aby znieczulić muchę w grupach po osiem indywidualnie.

Przenieś każdą muchę na podkładkę CO2 i zainfekuj je bakteriami, tak jak poprzednio. Następnie włóż każdą muchę z powrotem do pierwotnego dołka i ponownie zamknij mikropłytkę. Zmierz luminescencję w każdej muchy za pomocą luminometru umieszczonego w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze zgodnie z określonym harmonogramem oświetlenia.

Załaduj talerze do kasety do układania w stosy, upewniając się, że płytki zawierające muchy są ułożone między przezroczystymi pustymi płytkami. Zaprogramuj luminometr zgodnie ze specyfikacją producenta i zbieraj odczyty co godzinę przez minimum 24 godziny. W tym przykładzie detektory są zaprogramowane tak, aby odczytywały każdą studzienkę przez 10 sekund.

Po zakończeniu wyeksportuj pliki danych do arkusza kalkulacyjnego i wykonaj standardową analizę, przedstawiając wyniki na wykresie. Przykładowe dane mogą być analizowane. Rabaty na sekundę uśrednione z trzech odczytów na odwiert.

Canton S dziki typ lata i smakuje. Zmutowane muchy E 20 pozbawione genu NF kappa B załadowano do dwóch monitorów aktywności w ciągłym świetle i zainfekowano sia. W tym przykładzie infekcja sprzyjała zasypianiu.

Było jasne, że mutanty E 20 odczuwały mniej snu niż Canton s. Muchy kontrolne po zakażeniu. Zgodnie z wcześniejszymi odkryciami, mutanty E 20 również szybko uległy infekcji w porównaniu z muchami typu dzikiego.

Większość much przeżyła wstrzyknięcie aseptycznej kontroli, co wskazuje, że muchy uległy infekcji, a nie urazowi spowodowanemu wstrzyknięciem. Ponieważ mutanty smakowite umierały tak szybko, tylko muchy Cantona zostały użyte do wykazania obciążenia bakteryjnego po infekcji. Sia nadal namnażała się w muszce 24 godziny po zakażeniu.

Aktywność reporterska Lucyfera wykazała dużą zmienność między poszczególnymi muchami i między sukcesami punktów danych. Chociaż sygnał pochodzi ze wszystkich tkanek w muszce, nie oczekuje się, że każda tkanka będzie emitować taką samą ilość sygnału, a widoczność tkanki dla detektora będzie się zmieniać wraz z ruchem muchy. W tym przykładzie muchy zostały zainfekowane i porównane z grupą kontrolną.

Muchy, które padły, zostały wykluczone z analizy w całej grupie much. Aktywność reportera Kappa b Lucyferazy stale wzrasta po zakażeniu. Aktywność reportera Kappa b Lucyferazy również stale wzrastała po aseptycznym urazie.

Szczytowa aktywność wynosiła około 12 godzin zarówno po urazie, jak i po infekcji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak określić ilościowo funkcję immunologiczną i sen w SSO po infekcji. Możemy mierzyć sen, przeżycie, czas, klirens bakteryjny i aktywność w czasie rzeczywistym reportera transkrypcji bez kopii.