Name: Ilościowy pomiar odpowiedzi immunologicznej i snu u Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Poznaj metodę ilościowego pomiaru odpowiedzi immunologicznej i snu u Drosophila. Technika obejmuje rejestrację aktywności lokomotorycznej, pomiar obciążenia bakteryjnego oraz wykrywanie aktywności NFκB za pomocą reportera lucyferazy w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca była finansowana przez National Science Foundation w ramach grantu nr #IOS-1025627 oraz przez National Institutes of Health w ramach grantu nr #1R21NS078582-01 przyznanego J.A.W.

Niniejszy protokół wykorzystuje dwa układy (Rysunek 1) do uzyskania czterech różnych odczytów pobranych od much poddanych infekcji bakteryjnej. Wyniki te obejmują: 1) zachowania związane ze snem i czuwaniem; 2) przeżywalność; 3) miano bakterii w organizmie muchy; oraz 4) pomiar aktywności reportera NFκB in vivo w czasie rzeczywistym. W połączeniu z narzędziami genetycznymi dostępnymi u Drosophila, pomiary te pozwalają na mechanistyczne zrozumienie molekularnego związku między funkcją odpornościową a zachowaniem.
1. Pomiar aktywności lokomotorycznej i snu u much
<ol>
	<li>Układ wykorzystywany do pomiaru aktywności lokomotorycznej i snu u much, obejmujący system monitorowania aktywności Drosophila (DAM2, Trikinetics), inkubatory, ciemnię oraz sposób przygotowania zwierząt doświadczalnych i probówek do pomiaru aktywności, został opisany wcześniej6. W niniejszej pracy zastosowano to samo podejście z niewielkimi modyfikacjami.
	<ol class="lalpha">
		<li>Oświetlenie inkubatora jest sterowane przez sam inkubator. Dlatego ważne jest zsynchronizowanie ustawień czasu w komputerze i inkubatorach.</li>
		<li>Probówki do pomiaru aktywności są czyszczone w celu ponownego użycia poprzez gotowanie na płycie grzejnej w wodzie dejonizowanej. Podczas pierwszego gotowania dodaje się niewielką ilość detergentu, a następnie probówki są dokładnie płukane i gotowane dwukrotnie. Jeśli do zatykania probówek użyto przędzy, zużyte probówki (zawierające pożywkę, wosk, muchę i przędzę) można czyścić bez uprzedniego usuwania przędzy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przed rozpoczęciem eksperymentu należy umieścić hodowle zawierające muchy w późnym stadium poczwarki w inkubatorach na trzy do czterech dni, aby zaadaptowały się do eksperymentalnego oświetlenia i innych warunków środowiskowych. Do pomiaru zachowań związanych ze snem powszechnie stosuje się warunki cyklu światło:ciemność lub warunki stałe. W tym przykładzie muchy są aklimatyzowane do stałego światła, aby wyeliminować wpływ zegara okołodobowego na odpowiedź immunologiczną i zachowanie2,7,8. Zgodnie z opisem na Rysunku 1A, należy umieścić muchy w wieku 1-4 dni w monitorach aktywności Trikinetics DAM2 zgodnie z opisem6 i prowadzić pomiary przez minimum trzy dni przed infekcją.</li>
</ol>
2. Zakażanie much patogennym szczepem bakterii
<ol>
	<li>Opisany tutaj protokół jest specyficzny dla S. marcescens, których hodowla i utrzymanie są łatwe. Protokoły dotyczące długoterminowego przechowywania i warunków hodowli dla innych gatunków bakterii będą się różnić. S. marcescens przechowuje się w 15-50% glicerolu w temperaturze -80 °C. Aby przygotować próbki do długoterminowego przechowywania, w probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml wymieszaj 2 objętości nocnej hodowli bakteryjnej (O.D. 600 = 0,5 - 1,0) z 1 objętością autoklawowanego 50% glicerolu. Przyniesie to końcowe stężenie glicerolu wynoszące 17%. Probówki należy przechowywać w temperaturze -80 °C. Aby przygotować krótkoterminowe źródło bakterii do użytku, zeskrob zamrożony stok sterylnym końcem pipety 200 μl i wykonaj posiew metodą smugową (streak plate) w trzech kierunkach na płytce z agarem LB. Inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37 °C, aby uzyskać izolowane kolonie. Płytkę przechowuj w temperaturze 4 °C. 
	Na jeden dzień przed planowaną infekcją pobierz pojedynczą kolonię z płytki z agarem LB sterylnym końcem pipety 200 μl i zanurz końcówkę w probówce z 5 ml medium LB. Hoduj bakterie przez noc lub do 16 h w inkubatorze z wytrząsarką w temperaturze 37 °C przy 250 rpm, aż osiągną fazę wzrostu wykładniczego. Zmierz stężenie za pomocą spektrofotometru przy OD600. Stężenie w tej fazie mieści się w zakresie od 0,5 do 1. Jeśli stężenie jest zbyt wysokie, wykonaj subkulturę bakterii i hoduj je przez kolejne kilka godzin, aby uzyskać optymalne stężenie. Procedurę wykonuj w pobliżu źródła płomienia. Niektóre szczepy bakteryjne są zmodyfikowane pod kątem oporności na antybiotyki i są hodowane oraz selekcjonowane z dodatkiem odpowiedniego antybiotyku do medium. S. marcescens (ATCC #8100) nie są oporne na antybiotyki, dlatego są hodowane w sterylnym medium bez antybiotyku. Aby zweryfikować technikę sterylną, wykonaj kulturę pozorowaną (mock culture) bez bakterii jako kontrolę. 
	Roztwór do infekcji much zawiera bakterie (rozcieńczone do OD600=0,1) i 1% barwnika spożywczego (Brilliant Blue FCF) w PBS. Przygotuj roztwór do kontroli wstrzykiwania, dodając równą ilość medium LB, jaka została użyta w roztworze do infekcji, oraz 1% niebieskiego barwnika spożywczego w PBS. Roztwory przechowuj na lodzie.</li>
	<li>Przygotuj szklane igły do wstrzykiwania much. Wyciągnij kapilary szklane (o.d. = 1 mm, i.d. = 0,58 mm, WPI) do cienkiej końcówki za pomocą wyciągarki do mikropipet (Narishige). Pod mikroskopem stereoskopowym, używając precyzyjnej pęsety, odłam końcówkę igły tak, aby otwór był wystarczająco duży, by wypełnić go płynem do wstrzykiwania poprzez zassanie strzykawką, ale jednocześnie na tyle mały, aby zminimalizować uszkodzenia muchy podczas procesu wstrzykiwania. Po odłamaniu końcówka powinna mieć rozmiar około 40-50 μm. Szklana igła jest przymocowana do plastikowej strzykawki o pojemności 3 cc za pomocą odcinka rurki. Przepływ medium do wstrzykiwania jest kontrolowany ręcznie poprzez przykładanie nadciśnienia lub ssanie strzykawką. Unikaj zanieczyszczenia gumowej rurki płynem do wstrzykiwania, ponieważ zestaw ze strzykawką jest używany zarówno do infekcji, jak i do wstrzykiwań kontrolnych.</li>
	<li>Znieczul muchy, umieszczając je na podkładce z CO2. CO2 jest przepuszczany przez szczelny pojemnik z wodą, aby nawilżyć podkładkę i zredukować elektryczność statyczną, która może utrudniać manipulację muchami na podkładce. Wstrzyknij preparat, wprowadzając szklaną igłę w obszar nad scutellum na grzbietowej stronie klatki piersiowej. Przeniesienie medium do wnętrza muchy jest weryfikowane za pomocą barwnika spożywczego – muchy stają się niebieskie w miarę rozprzestrzeniania się barwnika w organizmie. Dawkę bakterii, którą otrzymują muchy, można określić ilościowo zgodnie z opisem w Sekcji 3 poniżej. Niektóre schematy eksperymentalne obejmują grupę kontrolną, która otrzymuje uraz aseptyczny poprzez wstrzyknięcie PBS z barwnikiem spożywczym, ale bez bakterii.</li>
</ol>
3. Oznaczenie ładunku bakteryjnego
Jednym ze sposobów oceny odpowiedzi immunologicznej na infekcję bakteryjną jest oznaczenie ładunku bakteryjnego po zakażeniu. D. melanogaster stanowi doskonały model do wyznaczania tego parametru, ponieważ cała mucha może zostać poddana homogenizacji w celu oszacowania całkowitej liczby bakterii w organizmie. Podstawą tego protokołu jest fakt, że podczas wzrostu na podłożu stałym, takim jak agar w bulionie Luria (LB) na szalce Petriego (szalka LB), pojedyncza bakteria tworzy widoczną, odróżnialną kolonię. W związku z tym, poprzez homogenizację zakażonych much w płynnym podłożu LB, przygotowanie rozcieńczeń seryjnych homogenatu i wysianie rozcieńczonego homogenatu na szalki LB, można oznaczyć liczbę komórek bakteryjnych zakażających muchę. W celu weryfikacji, czy infekcja nie została zanieczyszczona innymi gatunkami bakterii, należy zastosować grupę kontrolną much wstrzykniętych PBS i barwnikiem spożywczym, ale bez bakterii. W tym przypadku na płytce z agarem LB nie powinny pojawić się żadne kolonie.
<ol>
	<li>Przed przystąpieniem do właściwego etapu homogenizacji należy wysterylizować w autoklawie wszystkie materiały, które będą wykorzystywane w tej procedurze. Dotyczy to końcówek do pipety 200 μl przeciętych nożyczkami, pożywek LB oraz tłuczków używanych do homogenizacji. Płytki należy przygotować, wlewając wysterylizowane w autoklawie podłoże LB/agar do sterylnych szalek Petriego o średnicy 10 cm co najmniej 1 dzień przed homogenizacją much.</li>
	<li>Muchy należy znieczulić, zebrać do probówek mikrocentryfugowych o pojemności 1,5 ml i przechowywać probówki w lodzie.</li>
	<li>Homogenizację należy przeprowadzać w pobliżu płomienia, aby zapobiec kontaminacji. Zaleca się wykonanie homogenizacji kontrolnej z użyciem much niezinfekowanych, szczególnie w przypadku stosowania szczepów bakteryjnych takich jak S. marcescens, które nie są oporne na antybiotyki. Należy homogenizować minimum 2 grupy po 10 much w każdym wariancie doświadczalnym. Liczbę much użytych do jednego homogenatu określa badacz. Niektóre grupy stosowały jedną muchę na homogenat, co jest przydatne do oceny zmienności obciążenia bakteryjnego między poszczególnymi muchami8, podczas gdy inne stosowały od 3 do 10 much na homogenat w celu porównania genotypów lub warunków doświadczalnych9-12.
	<ol class="lalpha">
		<li>Do każdej probówki mikrocentryfugowej zawierającej muchy należy dodać 400 μl pożywki LB i przeprowadzić homogenizację za pomocą małego motoru z tłuczkiem (Kontes).</li>
		<li>Używając wysterylizowanych, przeciętych końcówek do pipety, należy wykonać rozcieńczenie szeregowe homogenatu w stosunku 1:10, dodając 20 μl homogenizowanego podłoża LB/bakteryjnego do probówki mikrocentryfugowej 1,5 μl zawierającej 180 μl pożywki LB. Przecięcie końcówek do pipety zapobiega ich zatykaniu przez szczątki much i zapewnia przeniesienie odpowiedniej objętości.</li>
		<li>Współczynnik rozcieńczenia określa się empirycznie i zależy on od genotypu muchy, zastosowanego szczepu bakteryjnego oraz warunków doświadczalnych. Dla much typu dzikiego zainfekowanych S. marcescens należy stosować rozcieńczenia 1:102 lub 1:103 dla much homogenizowanych bezpośrednio po infekcji oraz rozcieńczenia 1:104 lub 1:105 dla much homogenizowanych 24 hr po infekcji.</li>
		<li>Należy nanieść 100 μl podłoża LB/bakteryjnego z probówek mikrocentryfugowych zawierających ostateczne rozcieńczenie i rozprowadzić podłoże na płytce LB za pomocą szklanych kulek (VWR), aby zapewnić równomierny rozkład.</li>
		<li>Szklane kulki należy wyrzucić do 100% roztworu EtOH. Płytki LB należy umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C na noc.</li>
		<li>W ramach opcjonalnego kroku można użyć systemu obrazowania ze światłem widzialnym w celu uzyskania obrazu płytek LB (FluorChem 8900; Alpha Innotech). Liczbę kolonii należy zliczyć bezpośrednio na płytce lub na podstawie obrazu płytki, korzystając z narzędzia do liczenia w oprogramowaniu Photoshop (Adobe Photoshop CS3).</li>
		<li>Liczbę jednostek tworzących kolonie (CFU) na jedną muchę oblicza się według wzoru: [n /(N *D *v)]*V; gdzie n = liczba kolonii wyrosłych na płytce LB; N = liczba much połączonych w jednej probówce mikrocentryfugowej; D = współczynnik rozcieńczenia; v = objętość roztworu rozniesionego na każdą płytkę; V = początkowa objętość homogenatu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Ocena snu i czasu przeżycia po infekcji
<ol>
	<li>W przypadku much, które nie są pobierane do pomiaru ładunku bakteryjnego, kontynuuj monitorowanie zachowania przez kolejne 7-10 dni. Czas przeżycia zależy od genotypu muchy, warunków środowiskowych oraz gatunku bakterii użytych do infekcji.</li>
	<li>Po około 10 dniach zakończ eksperyment, pobierz i przetwórz dane behawioralne zgodnie z wcześniejszym opisem6. Do analizy parametrów snu wykorzystywane jest specjalistyczne oprogramowanie Insomniac2, oparte na środowisku Matlab. Należy pamiętać o wyeliminowaniu martwych much z analizy behawioralnej. Zazwyczaj ogranicza to analizy do pierwszego dnia po infekcji, w zależności od rodzaju infekcji i genotypu muchy. Śmierć w teście jest sygnalizowana momentem, w którym wszystkie zliczenia aktywności spadają do zera. Aby ułatwić analizę przeżywalności, do przetwarzania surowych plików danych z systemu Trikinetics DAM używa się Drosonex – specjalistycznego oprogramowania napisanego w języku Microsoft Visual C++ 6.0. Oprogramowanie to generuje pliki Excel zawierające czas przeżycia każdej muchy (w godzinach), kompiluje dane o aktywności ze wszystkich monitorów w jednym arkuszu oraz raportuje procent przeżywających much w czasie zgodnie z ustawieniami użytkownika. Pliki Excel są zaprojektowane tak, aby można było je zintegrować z innymi pakietami oprogramowania statystycznego w celu dalszej analizy.</li>
</ol>
5. Pomiar aktywności NFκB podczas infekcji z użyciem testu reporterowego lucyferazy
Transgeniczne muchy κB-luc wykorzystane w tym teście zostały wygenerowane wcześniej, zgodnie z opisem w Kuo et al., 20102. W skrócie, reporter κB-luc zawiera 8 powtórzeń sekwencji wiążącej NFκB, które zostały wstawione do promotora powyżej ramki odczytu lucyferazy.
<ol>
	<li>Dostosuj muchy do eksperymentalnych warunków oświetlenia zgodnie z opisem w sekcji 1.2. W tym przykładzie muchy κB-luc w wieku 1-4 dni są utrzymywane w fiolkach zawierających pożywkę z 5% sacharozy i 2% agaru i umieszczane w stałym świetle (LL) przez 2 dni, aby osiągnęły ten sam wiek co pozostałe muchy w momencie infekcji.</li>
	<li>Przygotuj mikropłytkę 96-dołkową dla much. Każdy dołek zawiera 2 warstwy pożywki (Rysunek 2); warstwa wierzchnia zawiera lucyferynę, która jest substratem lucyferazy. Do każdego dołka dodaj 300 μl roztworu 5% sacharozy i 2% agaru i pozostaw do stężenia. Następnie do każdego dołka dodaj 50 μl warstwy wierzchniej zawierającej 5% sacharozy, 1% agaru i 2 mM lucyferyny (Gold BioTechnology, Inc.). Stężenia lucyferyny stosowane do pomiaru aktywności reportera u Drosophila różniły się w literaturze i wynosiły nawet 100 μM13. Wymagane stężenie można określić empirycznie. Pomiędzy nakładaniem warstw pożywki przykryj płytkę gęstą tkaniną z siatki, aby ułatwić suszenie przy zachowaniu sterylności. Należy pozostawić płytkę do całkowitego wyschnięcia, nawet do jednej godziny, aby zapobiec przyklejaniu się much do kropel kondensatu. Ponieważ lucyferyna jest światłoczuła, należy unikać wystawiania płytek na światło bardziej niż jest to konieczne.</li>
	<li>Nałóż przezroczystą folię klejącą (Top-Seal-A; Perkin Elmer) na mikropłytkę 96-dołkową i wykonaj perforacje za pomocą cienkiej igły, robiąc 2 otwory na dołek. Otwory te będą nie tylko umożliwiać wymianę powietrza w każdym dołku, ale także pozwolą na znieczulanie much indywidualnie. Za pomocą ostrego ostrza i linijki wykonaj nacięcia między każdą kolumną. Umożliwi to łatwe wprowadzanie i usuwanie much w grupach po 8 osobników. 
	Aby wprowadzić muchy do mikropłytki, wyjmij fiolki z inkubatora i znieczul muchy na podkładce z CO2. Wprowadzaj muchy pojedynczo do każdego dołka, kolumna po kolumnie. Jeśli mucha przypadkowo przyklei się do folii uszczelniającej, pozostaw ją w spokoju, ponieważ często są one w stanie uwolnić się bez ingerencji. Wróć z mikropłytką do inkubatora w warunkach LL na 8-24 h, aby muchy zaadaptowały się do nowego środowiska i skonsumowały substrat lucyferyny.</li>
	<li>Wyhoduj bakterie S. marcescens i przygotuj roztwór do infekcji zgodnie z powyższym opisem.</li>
	<li>Znieczul muchy, używając końcówki mikropipety podłączonej do linii CO2 niskiego ciśnienia. Umieść końcówkę mikropipety bezpośrednio nad otworami wentylacyjnymi wykonanymi dla każdego dołka. Zachowaj ostrożność, aby ciśnienie CO2 było wystarczająco wysokie, by znieczulić muchę, ale na tyle niskie, by uniknąć jej zranienia. Przenoś pojedynczo każdą muchę w grupach po osiem na podkładkę z CO2 i zainfekuj zgodnie z powyższym opisem. Po infekcji zwróć każdą muchę do jej pierwotnego dołka i ponownie zamknij mikropłytkę.</li>
	<li>Zmierz luminescencję (licznik luminescencji i scyntylacji TopCount-NXT; Perkin-Elmer). Licznik luminescencji TopCount posiada kasetę ładunkową na płytki, która umożliwia zaprogramowane i zautomatyzowane odczyty w sposób ciągły w żądanych odstępach czasu przez dowolny okres (zazwyczaj do pięciu dni). Funkcja ta nie jest dostępna we wszystkich instrumentach, dlatego gromadzenie danych w eksperymentach przeprowadzanych na innych urządzeniach może być rzadsze. Licznik luminescencji znajduje się w pomieszczeniu z kontrolowaną temperaturą i harmonogramem oświetlenia. Podczas ładowania płytek do kasety, układaj płytki z muchami pomiędzy przezroczystymi płytkami pustymi, aby zapewnić muchom dostęp do światła. Zaprogramuj luminometr zgodnie ze specyfikacją producenta, aby zbierać odczyty co godzinę przez minimum 24 h. W tym przykładzie detektory są zaprogramowane tak, aby odczytywać każdy dołek przez 10 s i wyrażać wynik jako liczbę impulsów (jednostki arbitralne) na sekundę. Wartość ta jest uśredniana z 3 odczytów na dołek. Wyeksportuj pliki danych do arkusza kalkulacyjnego i przeprowadź standardową analizę, przedstawiając wyniki luminescencji na wykresie.</li>
</ol>

<ol><li>Majde, J. A., Krueger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Links+between+the+innate+immune+system+and+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Allergy+Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Links between the innate immune system and sleep.</a> J. Allergy Clin. Immunol. 116, 1188-1198 (2005).</li>
<li>Kuo, T. H., Pike, D. H., Beizaeipour, Z., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep+triggered+by+an+immune+response+in+Drosophila+is+regulated+by+the+circadian+clock+and+requires+the+NFkappaB+Relish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sleep triggered by an immune response in Drosophila is regulated by the circadian clock and requires the NFkappaB Relish.</a> BMC Neurosci. 11, 1471-2202 (2010).</li>
<li>Preston, B. T., Capellini, I., McNamara, P., Barton, R. A., Nunn, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parasite+resistance+and+the+adaptive+significance+of+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evol+Biol%22%5BJournal%5D)">Parasite resistance and the adaptive significance of sleep.</a> BMC Evol Biol. 9, 7(2009).</li>
<li>Imeri, L., Opp, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+%28and+why%29+the+immune+system+makes+us+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">How (and why) the immune system makes us sleep.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10, 199-210 (2009).</li>
<li>Ayres, J. S., Schneider, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Signaling+Protease+Required+for+Melanization+in+Drosophila+Affects+Resistance+and+Tolerance+of+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A Signaling Protease Required for Melanization in Drosophila Affects Resistance and Tolerance of Infections.</a> PLoS Biol. 6, e305(2008).</li>
<li>Chiu, J. C., Low, K. H., Pike, D. H., Yildirim, E., Edery, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+Locomotor+Activity+to+Study+Circadian+Rhythms+and+Sleep+Parameters+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila.</a> J. Vis. Exp. (43), e2157(2010).</li>
<li>Lee, J. E., Edery, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+Regulation+in+the+Ability+of+Drosophila+to+Combat+Pathogenic+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Circadian Regulation in the Ability of Drosophila to Combat Pathogenic Infections.</a> Curr. Biol. 18, 195-199 (2008).</li>
<li>Stone, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+circadian+clock+protein+timeless+regulates+phagocytosis+of+bacteria+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">The circadian clock protein timeless regulates phagocytosis of bacteria in Drosophila.</a> PLoS Pathog. 8, e1002445(2012).</li>
<li>Hill-Burns, E. M., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-linked+variation+in+immune+response+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">X-linked variation in immune response in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 183, 1477-1491 (2009).</li>
<li>Short, S. M., Lazzaro, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Female+and+male+genetic+contributions+to+post-mating+immune+defence+in+female+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Female and male genetic contributions to post-mating immune defence in female Drosophila melanogaster.</a> Proc. Biol. Sci. 277, 3649-3657 (2010).</li>
<li>Williams, J. A., Sathyanarayanan, S., Hendricks, J. C., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+sleep+and+the+immune+response+in+Drosophila%3A+a+role+for+the+NFkappaB+relish%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep%22%5BJournal%5D)">Interaction between sleep and the immune response in Drosophila: a role for the NFkappaB relish.</a> Sleep. 30, 389-400 (2007).</li>
<li>Ramsden, S., Cheung, Y. Y., Seroude, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+the+Drosophila+immune+response+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of the Drosophila immune response during aging.</a> Aging Cell. 7, 225-236 (2008).</li>
<li>Williams, J. A., Su, H. S., Bernards, A., Field, J., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+circadian+output+in+Drosophila+mediated+by+neurofibromatosis-1+and+Ras%2FMAPK%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A circadian output in Drosophila mediated by neurofibromatosis-1 and Ras/MAPK.</a> Science. 293, 2251-2256 (2001).</li>
<li>Hedengren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relish%2C+a+central+factor+in+the+control+of+humoral+but+not+cellular+immunity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Relish, a central factor in the control of humoral but not cellular immunity in Drosophila.</a> Mol. Cell. 4, 827-837 (1999).</li>
<li>Leulier, F., Rodriguez, A., Khush, R. S., Abrams, J. M., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+caspase+Dredd+is+required+to+resist+gram-negative+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">The Drosophila caspase Dredd is required to resist gram-negative bacterial infection.</a> EMBO Rep. 1, 353-358 (2000).</li>
<li>Wu, L. P., Choe, K. -M., Lu, Y., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Immunity%3A+Genes+on+the+Third+Chromosome+Required+for+the+Response+to+Bacterial+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Drosophila Immunity: Genes on the Third Chromosome Required for the Response to Bacterial Infection.</a> Genetics. 159, 189-199 (2001).</li>
<li>Dionne, M. S., Ghori, N., Schneider, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+is+a+genetically+tractable+model+host+for+Mycobacterium+marinum%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster is a genetically tractable model host for Mycobacterium marinum.</a> Infect. Immun. 71, 3540-3550 (2003).</li>
<li>Romeo, Y., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+immunity%3A+methods+for+monitoring+the+activity+of+Toll+and+Imd+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila immunity: methods for monitoring the activity of Toll and Imd signaling pathways.</a> Methods Mol. Biol. 415, 379-394 (2008).</li>
<li>Lu, Y., Wu, L. P., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antibacterial+arm+of+the+Drosophila+innate+immune+response+requires+an+I%7Bkappa%7DB+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The antibacterial arm of the Drosophila innate immune response requires an I{kappa}B kinase.</a> Genes Dev. 15, 104-110 (2001).</li>
<li>Koh, K., Evans, J. M., Hendricks, J. C., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+model+for+age-associated+changes+in+sleep%3Awake+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A Drosophila model for age-associated changes in sleep:wake cycles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 13843-13847 (2006).</li>
<li>Bushey, D., Hughes, K. A., Tononi, G., Cirelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep%2C+aging%2C+and+lifespan+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sleep, aging, and lifespan in Drosophila.</a> BMC Neurosci. 11, 1471-2202 (2010).</li>
<li>Allee, W. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAllee%2C+WC+%22The+social+life+of+animals%22">The social life of animals</a>. , W.W. Norton & Company, Inc. (1938).</li>
<li>Stanewsky, R., Jamison, C. F., Plautz, J. D., Kay, S. A., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+circadian-regulated+elements+contribute+to+cycling+period+gene+expression+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Multiple circadian-regulated elements contribute to cycling period gene expression in Drosophila.</a> Embo. J. 16, 5006-5018 (1997).</li>
<li>Levine, J. D., Funes, P., Dowse, H. B., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+analysis+of+behavioral+and+molecular+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Signal analysis of behavioral and molecular cycles.</a> BMC Neurosci. 3, 1(2002).</li>
<li>Ayres, J. S., Schneider, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+anorexia+in+resistance+and+tolerance+to+infections+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of anorexia in resistance and tolerance to infections in Drosophila.</a> PLoS Biol. 7, e1000150(2009).</li>
<li>Plautz, J. D., Kaneko, M., Hall, J. C., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+photoreceptive+circadian+clocks+throughout+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Independent photoreceptive circadian clocks throughout Drosophila.</a> Science. 278, 1632-1635 (1997).</li>
<li>Huber, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep+homeostasis+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep%22%5BJournal%5D)">Sleep homeostasis in Drosophila melanogaster.</a> Sleep. 27, 628-639 (2004).</li>
<li>Zimmerman, J. E., Raizen, D. M., Maycock, M. H., Maislin, G., Pack, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+video+method+to+study+Drosophila+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep%22%5BJournal%5D)">A video method to study Drosophila sleep.</a> Sleep. 31, 1587-1598 (2008).</li>
<li>Toth, L. A., Rehg, J. E., Webster, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain+differences+in+sleep+and+other+pathophysiological+sequelae+of+influenza+virus+infection+in+naive+and+immunized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Strain differences in sleep and other pathophysiological sequelae of influenza virus infection in naive and immunized mice.</a> J. Neuroimmunol. 58, 89-99 (1995).</li>
<li>Hendricks, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rest+in+Drosophila+is+a+sleep-like+state%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rest in Drosophila is a sleep-like state.</a> Neuron. 25, 129-138 (2000).</li>
<li>Wu, M. N., Koh, K., Yue, Z., Joiner, W. J., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+for+sleep+and+circadian+mutants+reveals+mechanisms+underlying+regulation+of+sleep+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep%22%5BJournal%5D)">A genetic screen for sleep and circadian mutants reveals mechanisms underlying regulation of sleep in Drosophila.</a> Sleep. 31, 465-472 (2008).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Niniejszy protokół opisuje podejście do badania związku między zachowaniem, w szczególności snem, a parametrami odpowiedzi immunologicznej. Parametry te obejmują obciążenie bakteryjne, przeżywalność oraz aktywność NFκB mierzoną za pomocą reportera lucyferazy in vivo. Wspólnie parametry te dostarczają informacji o tym, jak skutecznie mucha potrafi zwalczyć infekcję. Obciążenie bakteryjne i przeżywalność są parametrami odpowiedzi immunologicznej, których pomiar w przypadku Drosophila jest prosty. Mutanty ...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Sprzęt&lt;/strong&gt; </td></tr><tr><td>Inkubatory</td><td>Percival Scientific, Inc.</td><td>I30BLLC8&lt;br/&gt; I36VLC8</td><td>Odpowiedni jest każdy inkubator zdolny do realizacji zaprogramowanych harmonogramów oświetlenia i temperatury.</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; Monitory aktywności</td><td>Trikinetics Inc., Waltham, MA</td><td>DAM2</td><td>Jak opisano w innym miejscu&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;, system ten wymaga interfejsu komputerowego, oprogramowania oraz innych akcesoriów.</td></tr><tr><td>Szklane probówki Pyrex</td><td>Trikinetics Inc., Waltham, MA</td><td>PGT-5x65</td><td></td></tr><tr><td>Mikropłytkowy licznik scyntylacyjny i luminescencyjny</td><td>Perkin Elmer</td><td>TopCount NXT&lt;br/&gt; 12 detektorów</td><td>Do tego typu testu reporterowego można użyć każdego czytnika mikropłytek zdolnego do detekcji luminescencji. TopCount posiada wiele detektorów i automatyczny stoker; może być zaprogramowany do ciągłego odczytu z wielu płytek.</td></tr><tr><td>FluorChem 8900</td><td>Alpha Innotech</td><td></td><td>Obrazowanie kultur bakteryjnych jest opcjonalne; wystarczający jest każdy cyfrowy system obrazowania z możliwością rejestracji światła widzialnego.</td></tr><tr><td>Wyciągacz mikropipet</td><td>Tritech Research, Inc.</td><td>Narishige PC-10</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Materiały i odczynniki&lt;/strong&gt; </td></tr><tr><td>Kapilary szklane borokrzemowe</td><td>World Precision Instrument Inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 3 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>BD 305482</td><td></td></tr><tr><td>Igły do strzykawek</td><td>Fisher Scientific</td><td>BD 305196</td><td>18 G – należy odciąć końcówkę igły, aby zapobiec uszkodzeniu rurki.</td></tr><tr><td>Rurka silikonowa, i.d. (0.030&quot;) o.d. (0.065&quot;) grubość ścianki (0.018&quot;)</td><td>VWR</td><td>60985-706</td><td>Używana do mocowania szklanych igieł kapilarnych do strzykawki</td></tr><tr><td>Kurek trójdrożny</td><td>American Pharmaseal Company</td><td>K75</td><td></td></tr><tr><td>Silnik bezprzewodowy do moździerza z pestkiem Kontes</td><td>Fisher Scientific</td><td>K749540-0000</td><td></td></tr><tr><td>Moździerz z pestkiem Kontes</td><td>Fisher Scientific</td><td>K749521-1590</td><td></td></tr><tr><td>Kulki szklane 3mm</td><td>VWR</td><td>26396-630</td><td></td></tr><tr><td>Mikropłytka Microlite 1+</td><td>Thermo Scientific</td><td>7571</td><td>Należy wybrać płytki 96-dołkowe odpowiednie do luminescencji – muszą być nieprzezroczyste.</td></tr><tr><td>TopSeal-A: mikropłytki 96-dołkowe</td><td>PerkinElmer</td><td>6005185</td><td>Przylepna folia uszczelniająca do mikropłytek</td></tr><tr><td>Sól potasowa D-lucyferyny</td><td>Gold BioTechnology, Inc.</td><td>LUCNA</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Oprogramowanie&lt;/strong&gt; </td></tr><tr><td>Insomniac2</td><td>Dostępne na prośbę do autorów</td><td>własne; napisane przez dr Lesley Ashmore (Westminster College)</td><td>Oprogramowanie oparte na Matlabie, rutynowo używane do analizy snu&lt;sup&gt;2,6,11&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Drosonex</td><td>Dostępne na prośbę do autorów</td><td>własne; napisane przez Thomasa Coradettiego (Sidewalk Software)</td><td>Program PC MSVC6 używany do analizy przeżywalności na podstawie surowych plików danych zebranych za pomocą systemu Trikinetics</td></tr><tr><td>Photoshop CS3</td><td>Adobe</td><td></td><td>Przydatny do wyznaczania liczby jtk/płytkę z obrazów cyfrowych (opcjonalnie)</td></tr></tbody></table>

ilościowy pomiar odpowiedzi immunologicznej i snu u drosophila

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Złożona interakcja między odpowiedzią immunologiczną a zachowaniem gospodarza została opisana u szerokiego spektrum gatunków. Nadmierna senność, w szczególności, jest znana jako reakcja na infekcję u ssaków 1, a ostatnio opisano ją również u Drosophila melanogaster2. Powszechnie przyjmuje się, że sen jest korzystny dla gospodarza podczas infekcji i jest istotny dla utrzymania sprawnego układu odpornościowego3,4. Jednak dowody eksperymentalne wspierające tę hipotezę są ograniczone4, a funkcja nadmiernego snu podczas odpowiedzi immunologicznej pozostaje niejasna. W celu rozwiązania tego złożonego problemu zastosowaliśmy podejście multidyscyplinarne i przeprowadziliśmy badania na prostym genetycznym modelu systemowym, jakim jest muszka owocowa Drosophila melanogaster. Wykorzystujemy standardowy test do pomiaru zachowań lokomotorycznych i snu u much, wykazując, w jaki sposób test ten służy do pomiaru zachowania much zainfekowanych patogennym szczepem bakterii. Test ten jest również przydatny do monitorowania czasu przeżycia poszczególnych much podczas infekcji. Dodatkowe miary funkcji immunologicznych obejmują zdolność much do eliminacji infekcji oraz aktywację NFκB, kluczowego czynnika transkrypcyjnego, który jest centralny dla wrodzonej odpowiedzi immunologicznej u Drosophila. Zarówno przeżywalność, jak i eliminacja bakterii podczas infekcji są wspólnie wskaźnikami oporności i tolerancji na infekcję. Oporność odnosi się do zdolności much do eliminacji infekcji, podczas gdy tolerancja jest definiowana jako zdolność gospodarza do ograniczania uszkodzeń spowodowanych infekcją, a tym samym do przetrwania mimo wysokiego poziomu patogenu w organizmie5. Monitorowanie aktywności NFκB w czasie rzeczywistym podczas infekcji pozwala zrozumieć molekularny mechanizm przeżycia w trakcie infekcji. Wykorzystanie Drosophila w tych prostych testach ułatwia analizy genetyczne i molekularne snu oraz odpowiedzi immunologicznej, a także badanie wzajemnego wpływu tych dwóch złożonych systemów.

<ol>
	<li>Infekcja sprzyja senności. W tym przykładzie muchy typu dzikiego Canton-S (CS) oraz muchy mutanty pozbawione genu NFκB, Relish (RelE20) 14, zostały umieszczone w dwóch monitorach aktywności DAM2 (n=32 dla każdego genotypu) i zainfekowane zgodnie z powyższym opisem. Muchy utrzymywano w stałym oświetleniu, aby wyeliminować wpływ zegara okołodobowego na zachowanie i infekcję2,7,8. Mutanty RelE20 zostały izogenizowane do CS zgodnie z wcześniejszym opisem11. ...

Aby zrozumieć związek między odpowiedzią immunologiczną a zachowaniem, opisujemy metodę pomiaru aktywności lokomotorycznej Drosophila podczas infekcji bakteryjnej, a także zdolność much do wywołania odpowiedzi immunologicznej poprzez monitorowanie przeżywalności, obciążenia bakteryjnego oraz aktywności w czasie rzeczywistym kluczowego regulatora odporności wrodzonej, NFκB.

Ilościowy pomiar odpowiedzi immunologicznej i snu u Drosophila

W szerokim zakresie gatunków opisano złożoną interakcję między odpowiedzią immunologiczną a zachowaniem gospodarza. W szczególności wiadomo, że nadmierna senność...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ocena snu oraz funkcji odpornościowej u muszki owocówki drosophila. W pierwszym etapie osiąga się to poprzez rejestrację aktywności lokomotorycznej zainfekowanych much w celu pomiaru snu, a w drugim kroku, po infekcji, muchy są homogenizowane, rozcieńczane i wysiewane na płytki z agarem LB. Liczba wyrosłych jednostek tworzących kolonie wskazuje na zdolność much do eliminacji infekcji.Następnie zainfekowane muchy wykazujące ekspresję transgenu zawierającego reporter lukcyferazy NF kappa b przenosi się na płytkę 96-dołkową zawierającą lucyferynę, która jest substratem lukcyferazy. Pomiar aktywności lukcyferazy kappa b w czasie rzeczywistym wskazuje na aktywację szlaku sygnalizacyjnego NF kappa B podczas infekcji, co łącznie wpływa na przeżywalność w trakcie snu. Eliminacja bakterii oraz aktywność reportera NF KB są pomiarami dostarczającymi wglądu mechanistycznego w molekularny związek między funkcją odpornościową a zachowaniem.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ opanowanie spójności w ręcznym zakażaniu much wymaga czasu i praktyki. Główną zaletą opisanej techniki lucyferazowej w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak QPCR, jest możliwość ciągłego pomiaru aktywności NF Kappa B w czasie rzeczywistym w żywych muchach. Należy rozpocząć od inkubacji kultur drosophila w późnym stadium poczwarki przez trzy do czterech dni, aby osobniki dorosłe zaadaptowały się do warunków środowiskowych.W tym miejscu muchy umieszcza się pod stałym oświetleniem, aby wyeliminować wpływ zegara okołodobowego na odpowiedź immunologiczną i zachowanie. Następnie do monitorów aktywności przenosi się muchy w wieku od jednego do czterech dni. Monitory rejestrują ich aktywność przez minimum trzy dni przed infekcją, w tym jeden dzień bezpośrednio poprzedzający planowane zakażenie.Za pomocą sterylnej końcówki pipety pobierz pojedynczą kolonię z płytki SIA i zanurz końcówkę w probówce zawierającej pięć mililitrów pożywki LB, aby zweryfikować poprawność techniki sterylnej. Należy pamiętać o przygotowaniu kontrolnej hodowli pozorowanej bez bakterii. Inkubuj bakterie przez noc, aż następnego dnia osiągną fazę wzrostu wykładniczego.Zmierz absorbancję hodowli przy 600 nanometrach. Jako próbę ślepą wykorzystaj drugą kulturę Q vet. Hodowla jest gotowa, gdy stężenie wynosi od 0,5 do 1 jednostki absorbancji; w przeciwnym razie przedłuż czas inkubacji w razie potrzeby.Teraz należy przygotować roztwór bakteryjny do zakażenia much. Rozcieńcz bakterie w PBS do oczekiwanej absorbancji 0,1 przy 600 nanometrach. Następnie dodaj barwnik spożywczy jako kontrolę wstrzyknięcia.Wypłucz bakterie pożywką LB. Przechowuj oba roztwory w lodzie. Następnie, używając wyciągacza do mikropipet, wykonaj igły wstrzykujące z cienką końcówką pod mikroskopem stereoskopowym.Użyj precyzyjnej pęsety, aby odłamać końcówkę każdej igły w taki sposób, aby otwór był wystarczająco duży, by umożliwić zasysanie płynu do wstrzyknięcia, a jednocześnie na tyle mały, aby zminimalizować obrażenia muchy. Przymocuj szklaną igłę do plastikowej strzykawki o pojemności 3 cc za pomocą odcinka rurki. Przepływ medium wstrzykiwanego jest kontrolowany ręcznie.Należy unikać zanieczyszczenia gumowego wężyka płynem do iniekcji, ponieważ aparat ze strzykawką jest używany zarówno do iniekcji zakaźnych, jak i kontrolnych. Przepływ medium do iniekcji należy zweryfikować za pomocą chusteczki Kimwipe. Dwiema kluczowymi kwestiami dla powodzenia iniekcji są zastosowanie optymalnego rozmiaru igły oraz szczelne połączenie między igłą a strzykawką.Po pełnym przygotowaniu systemu do iniekcji, znieczulone muchy przy użyciu minimalnego przepływu dwutlenku węgla; postępuj sprawnie, aby żadna z much nie była znieczulona dłużej niż pięć minut. Następnie wykonaj iniekcję, wprowadzając szklaną igłę w obszar nad sklerytami grzbietnej części klatki piersiowej. Przenikanie medium iniekcyjnego do organizmu muchy jest potwierdzane przez barwnik spożywczy, który staje się widoczny w miarę rozprzestrzeniania się wstrzykniętego roztworu.Przed rozpoczęciem należy upewnić się, że wszystkie materiały wykorzystywane w tej procedurze zostały poddane autoklawowaniu co najmniej dzień wcześniej. Przygotować szalki Petriego o średnicy 10 cm z pożywką agarową LV. W dniu eksperymentu znieczulić muchy i umieścić je w probówkach do wirowania o pojemności 1,5 ml.Przygotuj co najmniej dwie grupy po 10 much każda dla każdego warunku eksperymentalnego. Przygotuj również grupę kontrolną much niezakażonych, szczególnie w przypadku użycia szczepu bakteryjnego bez oporności na antybiotyki. Wszystkie napełnione probówki przechowuj w lodzie.Następnie do każdej probówki z muchami należy dodać 400 µL pożywki LB. Muchy należy zhomogenizować za pomocą małego pestika, wykonując tę czynność w pobliżu płomienia, aby zapobiec kontaminacji. Teraz, używając przyciętych końcówek pipet, należy wykonać seryjne rozcieńczenia homogenatu w stosunku 1:10 w objętościach 200 µL.Jeśli homogenat zostanie przygotowany bezpośrednio po infekcji sia, należy wykonać rozcieńczenia do 1:1000, natomiast w przypadku homogenatu pobranego 24 godziny po infekcji, należy wykonać rozcieńczenia do 1:100 000. Następnie należy zasiać dwa największe rozcieńczenia na płytkach 10 cm, używając szklanych kulek w celu zapewnienia równomiernego rozkładu, a następnie inkubować płytki przez noc. Następnego dnia należy policzyć liczbę kolonii na płytce poprzez bezpośrednią obserwację lub za pomocą oprogramowania do liczenia kolonii.Następnie oblicz liczbę jednostek tworzących kolonie na jedną muchę. W tym badaniu wykorzystuje się w odpowiednim czasie muchy transgeniczne niosące reporter lukcyferazy kappa b. Badanie wymaga również hodowli bakterii, takich jak SCIA, przygotowanych do wstrzyknięcia zgodnie z opisem w poprzedniej sekcji.Zaadaptuj muchy do eksperymentalnych warunków oświetlenia. W tym przykładzie muchy kappa b luciferase w wieku od jednego do czterech dni są utrzymywane w fiolkach zawierających pożywkę złożoną z 5% sacharozy i 2% agaru, a następnie umieszczone w stałym świetle przez dwa dni. Następnie przygotuj mikropłytkę 96-dołkową dla much.Napełnij każde wgłębienie dwiema warstwami pożywki. Najpierw warstwą średnią, dodając do każdego wgłębienia 300 µL roztworu 5% sacharozy i 2% agaru. Przykryj płytkę gęstą tkaniną z siatki i pozostaw do całkowitego wyschnięcia na maksymalnie jedną godzinę.Następnie do każdej studzienki dodaj 50 µL warstwy wierzchniej zawierającej 5% sacharozy, 1% agaru oraz 2 mM Lucifera. Ze względu na światłoczułość Lucifera, pozwól płytce wyschnąć w ciemności i w dalszej części procedury ogranicz ekspozycję płytki na światło.Po ostygnięciu agaru przykryć płytkę przezroczystą folią samoprzylepną. Następnie za pomocą cienkiej igły wykonać dwa otwory w folii nad każdą dołkiem. Otwory te umożliwiają wymianę powietrza oraz znieczulenie gazowe.Następnie, aby ułatwić wprowadzanie much, należy za pomocą ostrego ostrza i linijki wykonać nacięcia pomiędzy poszczególnymi kolumnami. Muchy należy znieczulić dwutlenkiem węgla i przenosić pojedynczo do każdego dołka, kolumna po kolumnie. Jeśli mucha przyklei się do folii, należy dać jej możliwość samodzielnego uwolnienia się przed interwencją.Wróć płytkę z mikrowydziałami do inkubatora z ciągłym oświetleniem na okres od ośmiu do 24 godzin. W celu znieczulenia much uwięzionych w wydziale, użyj końcówki mikropipety podłączonej do linii z dwutlenkiem węgla o niskim ciśnieniu. Upewnij się, że gaz znajduje się pod bezpiecznie niskim ciśnieniem, i umieść końcówkę mikropipety bezpośrednio nad otworami wentylacyjnymi, aby znieczulać muchy indywidualnie w grupach po osiem.Przenieś każdą muchę na podkładkę z CO2 i zainfekuj je bakteriami jak poprzednio. Następnie zwróć każdą muchę do pierwotnej studzienki i ponownie zamknij mikropłytkę. Zmierz luminescencję każdej muchy za pomocą luminometru znajdującego się w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze, zgodnie z określonym harmonogramem oświetlenia.Włóż płytki do kasety ładującej, upewniając się, że płytki zawierające muchy znajdują się pomiędzy czystymi, pustymi płytkami. Zaprogramuj luminometr zgodnie ze specyfikacją producenta i dokonuj pomiarów co godzinę przez minimum 24 godziny. W tym przykładzie detektory zostały zaprogramowane tak, aby odczytywać każdą studzienkę przez 10 sekund.Po zakończeniu eksportuj pliki danych do arkusza kalkulacyjnego i przeprowadź standardową analizę, przedstawiając wyniki na wykresach. Można przeanalizować przykładowe dane. Średnia liczba zliczeń na sekundę została obliczona z trzech pomiarów na każdą studzienkę.Muszki typu dzikiego Canton S oraz muszki mutanty relish. E 20 z brakującym genem NF kappa B umieszczono w dwóch monitorach aktywności w stałym świetle i zainfekowano sia. W tym przykładzie infekcja stymulowała sen.Wyraźnie stwierdzono, że mutanty relish E 20 wykazywały krótszy czas snu po infekcji niż muchy kontrolne Canton s. Zgodnie z wcześniejszymi ustaleniami, mutanty relish E 20 szybciej ulegały infekcji w porównaniu z muchami typu dzikiego.Większość much przeżyła wstrzyknięcie w grupie kontrolnej aseptycznej, co wskazuje, że muchy padły w wyniku infekcji, a nie z powodu urazu powstałego podczas wstrzyknięcia. Ze względu na to, że mutanty relish ginęły bardzo szybko, do wykazania ilości bakterii po infekcji wykorzystano wyłącznie muchy szczepu Canton S. Sia nadal namnażała się w organizmie muchy 24 godziny po infekcji.Aktywność reportera lucyferazy wykazała duże zróżnicowanie między poszczególnymi muchami oraz między poszczególnymi punktami danych. Chociaż sygnał pochodzi ze wszystkich tkanek w organizmie muchy, nie oczekuje się, że każda tkanka będzie emitować taką samą ilość sygnału, a widoczność tkanki dla detektora zmienia się wraz z ruchem muchy. W tym przykładzie muchy zostały zainfekowane i porównane z grupą kontrolną poddaną odpowiednim zabiegom.Muchy, które padły, zostały wykluczone z analizy w obrębie grupy. Aktywność reportera lucyferazy Kappa b stale rośnie po infekcji. Aktywność reportera lucyferazy Kappa b rosła również stale po urazie aseptycznym.Szczytowa aktywność wystąpiła około 12 godziny zarówno po urazie, jak i po infekcji. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak ilościowo oceniać funkcję immunologiczną i sen u SSO po infekcji. Możemy mierzyć sen, przeżywalność, czas, eliminację bakterii oraz aktywność w czasie rzeczywistym raportera transkrypcyjnego un copy.

quantitative-measurement-immune-response-sleep

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ilościowe pomiary odpowiedzi immunologicznej i snu u Drosophila

Opisujemy procedury rejestracji dobowych rytmów aktywności lokomocyjnej Drosophila oraz późniejszej analizy danych. Rytmy aktywności lokomocyjnej są wiarygodnym behawioralnym wskaźnikiem zegarów okołodobowych zwierząt i są wykorzystywane jako standardowy odczyt funkcji zegara podczas badania mutantów okołodobowych lub analizowania wpływu środowiska na regulację systemu okołodobowego.

Oznaczanie aktywności lokomotorycznej w celu badania rytmów okołodobowych i parametrów snu u Drosophila

W tym filmie demonstrujemy technikę pomiaru obciążenia bakteriami E. coli po wstrzyknięciu E. coli do klatki piersiowej Drosophila melanogaster.

Pomiar obciążenia bakteryjnego E. coli u Drosophila melanogaster po zakażeniu E. coli

Tutaj opisujemy metodę szybkiego i dokładnego pomiaru wydajności lotu u Drosophila, umożliwiając wysokoprzepustowe badania przesiewowe.

Ulepszona metoda dokładnego i szybkiego pomiaru charakterystyki lotu u Drosophila

Tutaj prezentujemy protokół do ilościowego określenia unikania osób zestresowanych. Ten paradygmat jest potężny, ale przyjazny dla użytkownika i może być wykorzystany do oceny wpływu genów i środowiska na jeden rodzaj interakcji społecznych u Drosophila melanogaster.

Prosty test do ilościowego oznaczania unikania społecznego u Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster to wybitny organizm modelowy do badania wrodzonego układu odpornościowego oraz fizjologicznych konsekwencji infekcji i chorób. Protokół ten opisuje, w jaki sposób dostarczyć D. melanogaster solidne i ilościowo powtarzalne infekcje bakteryjne, a następnie jak zmierzyć nasilenie infekcji i określić ilościowo odpowiedź immunologiczną gospodarza.

Ogólnoustrojowe infekcje bakteryjne i fenotypy obrony immunologicznej u Drosophila melanogaster

Ten raport opisuje metodę pomiaru aktywności larw Drosophila za pomocą TriKinetics Drosophila Activity Monitor. Urządzenie wykorzystuje wiązki podczerwieni do wykrywania ruchów do 16 pojedynczych zwierząt. Dane mogą być analizowane w celu przedstawienia parametrów ruchu, w tym szybkości i pozycji zwierząt w komorach testowych.

Pomiar aktywności larw w monitorze aktywności Drosophila

Ten protokół opisuje metody doustnego wystawiania i zarażania muszki owocowej Drosophila melanogaster patogenami bakteryjnymi, a także mierzenia liczby zakaźnych bakterii wydalanych po infekcji jelitowej. Dalej opisujemy wpływ mutantów immunologicznych na przeżywalność much po zakażeniu bakteryjnym jamy ustnej.

Zakażenie bakteryjne jamy ustnej i wydalanie u Drosophila melanogaster

Ten protokół opisuje test fagocytozy in vivo u dorosłych Drosophila melanogaster w celu ilościowego określenia rozpoznawania fagocytów i usuwania infekcji mikrobiologicznych.

Ocena komórkowej odpowiedzi immunologicznej muszki owocowej, Drosophila melanogaster, przy użyciu testu fagocytozy in vivo

Deprywacja snu to potężne narzędzie do badania funkcji i regulacji snu. Opisujemy protokół pozbawiania snu Drosophila za pomocą aparatu do neutralizacji snu oraz określania zakresu snu z odbicia wywołanego deprywacją.

Aparat do niwelowania snu: wysoce skuteczna metoda pozbawiania snu Drosophila

Prezentowany jest protokół wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków w celu poprawy snu poprzez monitorowanie zachowania podczas snu muszek owocowych w starszym modelu Drosophila.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków małocząsteczkowych w kierunku zaburzeń snu związanych z wiekiem przy użyciu Drosophila melanogaster

Ten protokół zapewnia ramy do oceny zmian zachowania wywołanych stresem u Drosophila melanogaster. Łączenie uzupełniających się testów umożliwia ilościową ocenę aktywności, eksploracji i podejmowania decyzji dla poszczególnych much. Podejście to jest elastyczne i może być dostosowane do szerokiej gamy badań dotyczących biologii stresu, metabolizmu i funkcji neurobehawioralnych.

Multimodalowe fenotypowanie behawioralne stanów przypominających depresję indukowanych stresem u Drosophila melanogaster

Poznaj metodę ilościowego pomiaru odpowiedzi immunologicznej i snu u Drosophila. Technika obejmuje rejestrację aktywności lokomotorycznej, pomiar obciążenia bakteryjnego oraz wykrywanie aktywności NFκB za pomocą reportera lucyferazy w czasie rzeczywistym.

Ilościowy pomiar odpowiedzi immunologicznej i snu u Drosophila

Przeglądaj więcej filmów