Name: Delecje genów w całym genomie u Streptococcus sanguinis metodą wysokoprzepustowej reakcji PCR (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 7 s
Description: Poznaj metodę delecji genów w całym genomie u Streptococcus sanguinis przy użyciu wysokoprzepustowej PCR. Technika ta umożliwia szybkie tworzenie mutacji i badanie funkcji genów bakteryjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca została sfinansowana z grantów R01DE018138 z National Institutes of Health (PX) oraz częściowo z programu Virginia Commonwealth University Presidential Research Incentive Program (PRIP) 144602-3 (PX). Dziękujemy dr. Lei Chen, dr. Yuetan Dou oraz dr. Xiaojing Wang za pomoc w tworzeniu mutantów w całym genomie. Dziękujemy również DNA Core Facility na Virginia Commonwealth University za sekwencjonowanie DNA.

1. Projektowanie starterów
<ol>
	<li>Startery są projektowane przy użyciu wewnętrznych skryptów w oparciu o sekwencję genomu S. sanguinis SK36. Zaprojektowano trzy zestawy starterów: F1/R1, F2/R2 oraz F3/R3, odpowiednio do amplifikacji sekwencji 1-kb powyżej genu docelowego, genu aphA-3 kodującego białko oporności na kanamycynę (Kmr)3 oraz sekwencji 1-kb poniżej genu docelowego (Rysunek 1). Spośród tych starterów, F1 i R3 zostały zaprojektowane za pomocą ePrimer3 w pakiecie programów EMBOSS (<a href="http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html" target="_blank">http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html</a>) w celu amplifikacji regionów flankujących powyżej lub poniżej genu docelowego. Startery specyficzne dla genu, R1 i F3, zaprojektowano na podstawie sekwencji 5' i 3' genu docelowego. Startery R1 i F3 zawierają na końcach 5' sekwencje adapterów o długości 25-bp, które są komplementarne do genu aphA-3. Temperatury topnienia każdego startera zostały zaplanowane tak, aby były jak najbliższe 60 °C, co umożliwia zastosowanie jednolitej temperatury przyłączania dla wszystkich reakcji PCR w formacie 96-dołkowym.</li>
	<li>Startery F1, R1, F3 i R3 są syntetyzowane na płytkach 96-dołkowych zgodnie z zamówieniem genów. Każda płytka zawiera jeden typ starterów w tej samej kolejności genów. Rozcieńczyć startery na roboczej płytce 96-dołkowej do stężenia końcowego 10 μM do amplifikacji PCR, używając pipety wielokanałowej.</li>
</ol>
2. Wysokoprzepustowa amplifikacja i puryfikacja PCR
<ol>
	<li>W celu wysokoprzepustowej amplifikacji fragmentów o długości 1 kb powyżej lub poniżej docelowych genów S. sanguinis, przygotować na lodzie w 15-ml probówce stożkowej mieszaninę PCR zawierającą 1640 μl ddH2O, 250 μl 10x High Fidelity PCR Buffer, 200 μl mieszaniny 10 mM dNTP, 100 μl 50 mM MgSO4, 100 μl genomic DNA S. sanguinis SK36 o stężeniu 10 ng/ μl oraz 10 μl polimerazy Platinum Taq DNA polymerase high fidelity, a następnie przenieść 23 μl mieszaniny do każdego dołka 96-dołkowej płytki PCR za pomocą pipety wielokanałowej. Przenieść 1 μl każdego startera F1 i R1 (lub F3 i R3) z 10 μM płytek ze starterami roboczymi na płytkę PCR, używając pipety wielokanałowej. Uszczelnić płytkę PCR i przeprowadzić amplifikację w temperaturze 94 °C przez 1 min oraz 30 cykli: 94 °C przez 30 s, 54 °C przez 30 s i 68 °C przez 1,5 min.</li>
	<li>Przygotować 1% żel agarozowy zawierający bromek etydyny z 48 dołkami dopasowanymi do nakładania pipetą wielokanałową. Wymieszać 4 μl produktu PCR z 1 μl 5x DNA loading buffer na płytce 96-dołkowej i nanieść próbki na żel agarozowy za pomocą 10-μl pipety wielokanałowej. Przeprowadzić elektroforezę przy 135 V przez 30 min. Przeanalizować prążki na żelu za pomocą systemu dokumentacji i analizy UVP.</li>
	<li>Oczyścić produkty PCR za pomocą zestawu PureLink 96 PCR purification kit metodą wirowania zgodnie z instrukcją producenta. W celu elucji DNA dodać 40 μl sterylnego ddH2O do dołka płytki wiążącej.</li>
	<li>Losowo wybrać kilka oczyszczonych amplikonów z płytki, aby sprawdzić stężenia DNA za pomocą spektrofotometru NanoDrop. Dostosować stężenie amplikonów na płytce do poziomu ~10 ng/μl.</li>
	<li>Plazmid zawierający kasetę Kmr poddać trawieniu enzymem EcoRI w celu uzyskania matrycy PCR. Strawiony plazmid oczyścić za pomocą zestawu QIAquick PCR purification kit i dostosować stężenie liniowego DNA plazmidowego do końcowego stężenia 10 ng/μl. Przygotować 25 μl mieszaniny do amplifikacji kasety Kmr, zawierającej 16,4 μl ddH2O, 2,5 μl 10x High Fidelity PCR Buffer, 2 μl mieszaniny 10 mM dNTP, 1 μl 50 mM Mg SO4, 1 μl 10 μM F2, 1 μl 10 μM R2, 1 μl liniowego DNA plazmidowego i 0,1 μl polimerazy Platinum Taq DNA polymerase high fidelity. Przeprowadzić amplifikację PCR w 94 °C przez 1 min oraz 30 cykli: 94 °C przez 30 s, 55 °C przez 30 s i 68 °C przez 1 min. Przeanalizować produkt PCR za pomocą elektroforezy w 1% żelu agarozowym. Połączyć większą ilość amplikonów kasety Kmr z 10 indywidualnych reakcji PCR, oczyszczonych za pomocą zestawu QIAquick PCR purification kit. Dostosować stężenie amplikonu do 10 ng/μl.</li>
	<li>Aby uzyskać końcowy liniowy rekombinowany amplikon PCR, połączyć trzy amplikony PCR w ilości 1 μl każdego (w niemal równomolarnych ilościach) w jednym dołku płytki PCR jako matrycę PCR. Dodać pozostałe komponenty PCR, w tym 14,4 μl ddH2O, 2,5 μl 10x High Fidelity PCR Buffer, 2 μl mieszaniny 10 mM dNTP, 1 μl 50 mM Mg SO4, 1 μl 10 μM F1, 1 μl 10 μM R3 oraz 0,1 μl polimerazy Platinum Taq DNA polymerase high fidelity. Amplifikację PCR przeprowadzić w 94 °C przez 2 min, 30 cykli: 94 °C przez 30 s, 55 °C przez 30 s i 68 °C przez 3,5 min, a na koniec 68 °C przez 4 min.</li>
	<li>Przeanalizować amplikony PCR w żelu agarozowym. Oczyścić i zmierzyć stężenie amplikonów PCR zgodnie z opisem powyżej. Zamrozić rekombinowane amplikony PCR w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
3. Przygotowanie komórek kompetentnych
<ol>
	<li>Przygotowuje się bulion Todda-Hewitta, dostosowując pH do 7,6 za pomocą 10 N NaOH, podgrzewając do wrzenia, a następnie schładzając do temperatury pokojowej i sterylizując za pomocą filtra polistyrenowego 0,22 μm4. Do 11,7 ml bulionu Todda-Hewitta w stożkowej probówce 15-ml dodaje się 300 μl inaktywowanej termicznie surowicy koni (stężenie końcowe 2,5%), aby przygotować medium TH+HS. Medium TH+HS rozdziela się na aalikwoty po 2 ml i 10 ml w probówkach.</li>
	<li>Do 2 ml medium TH+HS szczepia się 5 μl mrożonego w -80 °C szczepu S. sanguinis SK36 i inkubuje kulturę przez noc w szczelnie zamkniętej probówce w temperaturze 37 °C, jednocześnie przeprowadzonej wstępną inkubację probówki z 10 ml medium TH+HS.</li>
	<li>Po inkubacji nocnej przenosi się 50 μl kultury do 10 ml medium TH+HS i inkubuje probówkę w 37 °C przez 3 h (do uzyskania OD660 na poziomie 0,07-0,08), a następnie niezwłocznie wykorzystuje do transformacji.</li>
</ol>
4. Transformacja komórek i selekcja antybiotykowa
<ol>
	<li>Do probówek Eppendorf umieszczonych w bloku 96-dołkowym dodać 2 μl peptydu stymulującego kompetencję (CSP) szczepu S. sanguinis SK36 (70 ng) oraz 2 μl liniowego rekombinowanego amplikonu PCR (~50 ng), a następnie podgrzać je do 37 °C. Do każdej probówki przenieść 330 μl kultury SK36 inkubowanej przez 3 h. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 h. W próbce kontrolnej DNA zastąpić sterylną wodą destylowaną ddH2O.</li>
	<li>Umieścić blok na lodzie i rozsiać po 100 μl każdej transformacji na płytki z agarem BHI (brain heart infusion) z dodatkiem 500 μg/ml kanamycyny. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 2 d w warunkach mikroaerobowych.</li>
</ol>
5. Potwierdzenie mutacji i przechowywanie
<ol>
	<li>Dla każdego mutanta zastępującego należy losowo wybrać 2 pojedyncze kolonie, zaszczepić kolonię do 5 ml pożywki BHI zawierającej 500 μg/ml kanamycyny i inkubować szczepionkę w warunkach mikroaerobowych przez noc w temperaturze 37 °C. Każdą kulturę należy krio konserwować w 30% glicerolu w temperaturze -80 °C</li>
	<li>Aby sprawdzić, czy mutant zawiera oczekiwaną wymianę genu, należy przeprowadzić PCR kolonii dla każdego mutanta z użyciem starterów F1 i R3 w 96-dołkowej płytce PCR. Jako matryca DNA w 25-μl reakcji amplifikacji PCR stosuje się około 1-μl nocnej kultury z pojedynczej kolonii. PCR przeprowadza się w 94 °C przez 5 min, następnie 35 cykli: 94 °C przez 30 s, 55 °C przez 30 s i 68 °C przez 3,5 min, a na koniec 68 °C przez 4 min.</li>
	<li>Aby precyzyjnie zidentyfikować mutanty z podwójnym prążkiem lub zanieczyszczone amplikony PCR, należy poddać amplikony PCR elektroforezie przez 4 h na żelu agarozowym 2% o długości &gt;12 cm z barwieniem bromkiem etydyny. W tych warunkach elektroforezy na żelu agarozowym wyraźnie identyfikowano wszystkie amplikony różniące się o ≥ 100 bp. W przypadku gdy przewiduje się, że prążki powstałe z amplifikacji kasety Kmr i genu typu dzikiego będą różnić się o &lt; 100 bp, stosuje się wewnętrzny starter T1, aby ustalić, czy gen typu dzikiego jest wykrywalny za pomocą PCR.</li>
	<li>W celu dalszego potwierdzenia delecji amplikony są oczyszczane za pomocą zestawu PureLink 96 PCR purification kit i sekwencjonowane z użyciem startera P1, który wiąże się z kasetą Kmr. Należy zachować tylko poprawne mutanty potwierdzone sekwencjonowaniem.</li>
</ol>

<ol><li>Sassetti, C. M., Boyd, D. H., Rubin, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+required+for+mycobacterial+growth+defined+by+high+density+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genes required for mycobacterial growth defined by high density mutagenesis.</a> Mol. Microbiol. 48, 77-84 (2003).</li>
<li>Kobayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+Bacillus+subtilis+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Essential Bacillus subtilis genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4678-4683 (2003).</li>
<li>Trieu-Cuot, P., Courvalin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+of+the+Streptococcus+faecalis+plasmid+gene+encoding+the+3%275%22-aminoglycoside+phosphotransferase+type+III%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence of the Streptococcus faecalis plasmid gene encoding the 3'5"-aminoglycoside phosphotransferase type III.</a> Gene. 23, 331-341 (1983).</li>
<li>Paik, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+virulence+determinants+for+endocarditis+in+Streptococcus+sanguinis+by+signature-tagged+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Identification of virulence determinants for endocarditis in Streptococcus sanguinis by signature-tagged mutagenesis.</a> Infect. Immun. 73, 6064-6074 (2005).</li>
<li>Lukomski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonpolar+inactivation+of+the+hypervariable+streptococcal+inhibitor+of+complement+gene+%28sic%29+in+serotype+M1+Streptococcus+pyogenes+significantly+decreases+mouse+mucosal+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Nonpolar inactivation of the hypervariable streptococcal inhibitor of complement gene (sic) in serotype M1 Streptococcus pyogenes significantly decreases mouse mucosal colonization.</a> Infect. Immun. 68, 535-542 (2000).</li>
<li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame%2C+single-gene+knockout+mutants%3A+the+Keio+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Mol. Syst. Biol. 2, (2006).</li>
<li>de Berardinis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complete+collection+of+single-gene+deletion+mutants+of+Acinetobacter+baylyi+ADP1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1.</a> Mol. Syst. Biol. 4, 174(2008).</li>
<li>Rodriguez, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+and+molecular+characterization+of+genetic+competence+in+Streptococcus+sanguinis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Oral.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Physiological and molecular characterization of genetic competence in Streptococcus sanguinis.</a> Mol. Oral. Microbiol. 26, 99-116 (2011).</li>
<li>Perry, D., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+Streptococcus+mutans+Infect%5BTitle%5D)+AND+%22Immun%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of Streptococcus mutans Infect.</a> Immun. 32, 1295-1297 (1981).</li>
<li>Pakula, R., Walczak, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+nature+of+competence+of+transformable+streptococci%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">On the nature of competence of transformable streptococci.</a> J. Gen. Microbiol. 31, 125-133 (1963).</li>
<li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).</li>
<li>Xu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+essential+gene+identification+in+Streptococcus+sanguinis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Genome-wide essential gene identification in Streptococcus sanguinis.</a> Sci. Rep. 1, (2011).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Aby zminimalizować możliwe efekty polarne wynikające z zastąpienia wybranego genu egzogennym genem oporności na antybiotyki w obrębie sąsiednich genów, podczas wstępnego projektowania starterów podejmuje się dwa kroki. W przypadku większości usuwanych genów, startery R1 i F3 są projektowane tak, aby usunąć region kodujący od 6 bp po kodonie start do 30 bp przed kodonem stop. Ostatnie 30 par zasad zostaje zachowanych, aby chronić potencjalną sekwencję wiązania rybosomu wykorzystywaną przez sąsiedni gen położony poniżej. Z...

<table><tbody><tr><td>Starter F2</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>TGACTAACTAGGAGGAATAAATG&lt;br/&gt;GCTAAAATGAGAATAT</td></tr><tr><td>Starter R2</td><td>ibid</td><td></td><td>CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA&lt;br/&gt;CAATTCATCCAGT</td></tr><tr><td>Starter F2p</td><td>ibid</td><td></td><td>GATAAACCCAGCGAACCATTTGA</td></tr><tr><td>Starter P1</td><td>ibid</td><td></td><td>GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA</td></tr><tr><td>Starter P2</td><td>ibid</td><td></td><td>GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC</td></tr><tr><td>Starter 5' koniec_R1_seq</td><td>ibid</td><td></td><td>GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA</td></tr><tr><td>Starter 5' koniec_F3_seq</td><td>ibid</td><td></td><td>GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG</td></tr><tr><td>Starter 5' koniec_R1p_seq</td><td>ibid</td><td></td><td>CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC</td></tr><tr><td>CSP</td><td>Synprep</td><td></td><td>Sekwencja:NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH</td></tr><tr><td>Polimeraza DNA</td><td>Invitrogen</td><td>11304-102</td><td>Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs Inc</td><td>R0101S</td><td>Enzym restrykcyjny</td></tr><tr><td>Agar</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01185</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Promega</td><td>V3125</td><td></td></tr><tr><td>BHI</td><td>BD Biosciences</td><td>237500</td><td>Pożywka Brain Heart Infusion</td></tr><tr><td>Surowica konia</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3007403</td><td>Surowica konia</td></tr><tr><td>Km</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td>Kanamycyna</td></tr><tr><td>Bulion TH</td><td>BD Biosciences</td><td>249240</td><td>Bulion Todd Hewitt</td></tr><tr><td>PureLink 96</td><td>Invitrogen</td><td>K310096</td><td>Zestaw do oczyszczania produktów PCR PureLink 96</td></tr><tr><td>QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>Zestaw do oczyszczania produktów PCR QIAquick</td></tr><tr><td>Filtr</td><td>Corning</td><td>431117</td><td>Filtr polistyrenowy 0.22 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>System Anoxomat</td><td>Mart Microbiology b.v.</td><td>Anoxomat Mark II</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka laboratoryjna</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004377</td><td>Rotor do mikropłytek Sorvall Legend RT Plus</td></tr><tr><td>Dokumentacja żeli</td><td>UVP LLC</td><td>BioDoc-It 210</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-690-625D</td><td>Isotemp</td></tr><tr><td>Labnet's Gel XL</td><td>Labnet</td><td>E0160</td><td>Labnet's Gel XL</td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Eppendorf</td><td>22621408</td><td>Mikrowirówka 5415 R</td></tr><tr><td>Pipety wielokanałowe</td><td>Thermo Scientfic</td><td>4661040, 4661020</td><td>Finnpipette F1</td></tr><tr><td>Termocykler</td><td>Applied Biosystems Inc.</td><td>N805-0200</td><td>System PCR GeneAmp 9700</td></tr></tbody></table>

delecje genów w całym genomie streptococcus sanguinis za pomocą wysokoprzepustowej pcr

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Mutageneza transpozonna oraz delecja pojedynczego genu to dwie metody stosowane do knockoutu genów w całym genomie bakterii 1,2. Chociaż mutageneza transpozonna jest mniej czasochłonna, tańsza i nie wymaga pełnych informacji o genomie, metoda ta posiada dwie słabości: (1) możliwość wystąpienia zróżnicowanych mutantów w mieszanej bibliotece mutantów, co prowadzi do kontrselekcji mutantów o obniżonej konkurencyjności oraz (2) możliwość częściowej inaktywacji genów, w wyniku której geny nie tracą całkowicie swojej funkcji po insercji transpozonu. Analiza delecji pojedynczego genu może zrekompensować wady związane z mutagenezą transpoznonną. Aby zwiększyć wydajność delecji pojedynczych genów w całym genomie, podjęto próbę opracowania wysokoprzepustowej techniki delecji pojedynczych genów w całym genomie, wykorzystując Streptococcus sanguinis jako organizm modelowy. Każda konstrukcja do delecji genu w genomie S. sanguinis została zaprojektowana tak, aby obejmowała obszar 1-kb powyżej (upstream) docelowego genu, gen aphA-3 kodujący białko oporności na kanamycynę oraz obszar 1-kb poniżej (downstream) docelowego genu. Trzy zestawy starterów F1/R1, F2/R2 i F3/R3 zostały odpowiednio zaprojektowane i zsyntetyzowane w formacie płytek 96-dołkowych w celu amplifikacji PCR tych trzech komponentów każdej konstrukcji delecyjnej. Startery R1 i F3 zawierają na końcach 5' sekwencje o długości 25-bp, które są komplementarne do regionów genu aphA-3. Wielkoskalowa amplifikacja PCR genu aphA-3 jest przeprowadzana jednorazowo w celu stworzenia wszystkich konstrukcji do delecji pojedynczych genów. Promotor genu aphA-3 został początkowo pominięty, aby zminimalizować potencjalny efekt polarny kasety kanamycynowej. W celu stworzenia konstrukcji delecyjnych genów przeprowadzono wysokoprzepustową amplifikację PCR i oczyszczanie w formacie płytek 96-dołkowych. Liniowy rekombinowany amplikon PCR dla każdej delecji genu zostanie utworzony poprzez cztery reakcje PCR z wykorzystaniem polimerazy DNA o wysokiej wierności (high-fidelity). Początkowa wykładnicza faza wzrostu S. sanguinis hodowanych w pożywce Todd Hewitt uzupełnionej o 2,5% inaktywowanej surowicy końskiej jest wykorzystywana do zwiększenia kompetencji w celu transformacji rekombinowanych konstrukcji PCR. W tych warunkach do 20% komórek S. sanguinis może zostać przekształconych przy użyciu ~50 ng DNA. Dzięki temu podejściu ostatecznie uzyskano 2 048 mutantów z delecją pojedynczego genu spośród 2 270 genów w S. sanguinis, z wyłączeniem czterech otwartych ramek odczytu (ORF) genów zawartych całkowicie w innych ORF w S. sanguinis SK36 oraz 218 potencjalnych genów niezbędnych. Technika tworzenia konstrukcji do delecji genów jest wysokoprzepustowa i może być łatwo stosowana w delecjach pojedynczych genów w całym genomie dla każdych bakterii podatnych na transformację.

Po amplifikacji PCR z użyciem starterów F1 i R1 oraz F3 i R3, uzyskano odpowiednio około 1-kb regiony powyżej i poniżej każdego genu S. sanguinis w formacie 96-dołkowym (Ryc. 2A). W zastosowanych warunkach PCR i przy użyciu zaprojektowanych starterów, w każdej reakcji PCR z genomowego DNA S. sanguinis amplifikowano specyficzny produkt. Wynik ten wskazał, że startery były wysoce specyficzne dla celów w S. sanguinis. Poprzez ponowną amplifikację PCR z użyciem starterów F1 i R3 or...

Opracowano wydajną metodę wprowadzania pojedynczych mutacji genowych w całym genomie, wykorzystując Streptococcus sanguinis jako organizm modelowy. Metoda ta została osiągnięta dzięki zastosowaniu wysokoprzepustowych reakcji PCR rekombinacyjnego oraz transformacji.

Delecje genów w całym genomie Streptococcus sanguinis za pomocą wysokoprzepustowej PCR

Mutageneza transposonowa oraz delecja pojedynczego genu to dwie metody stosowane w genomowym wyłączaniu genów u bakterii 1,2. Chociaż mutageneza transposonowa jest...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przeprowadzenie genomowych delecji pojedynczych genów w szczepie streptococcus sanguine za pomocą wysokoprzepustowego PCR. Osiąga się to poprzez uzyskanie w pierwszej kolejności trzech amplikonów w drodze wysokoprzepustowej amplifikacji PCR, obejmujących gen oporności na antybiotyk oraz sekwencje DNA położone powyżej (upstream) i poniżej (downstream) genu docelowego. Drugim krokiem jest otrzymanie liniowego rekombinowanego amplikonu PCR z wykorzystaniem trzech amplikonów PCR jako matryc.Następnie przygotowuje się kompetentne komórki s sanguine. Ostatnim krokiem jest transformacja liniowego rekombinowanego amplikonu PCR do kompetentnych komórek s sanguineous. Ostatecznie do weryfikacji poprawnych mutantów wykorzystuje się amplifikację PCR kolon A oraz sekwencjonowanie DNA.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi wyczerpanymi metodami, takimi jak knockout z użyciem plazmidu samobójczego, jest możliwość bezpośredniego tworzenia mutantów z delecjami w całym genomie przy użyciu wysokoprzepustowości. Startery PCR można zaprojektować i zsyntetyzować zgodnie z opisem w protokole pisemnym, wykorzystując wewnętrzne skrypty oparte na sekwencji g

genome-wide-gene-deletions-streptococcus-sanguinis-high-throughput

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Usunięcia genów na całym genomie w Streptococcus sanguinis przez PCR wysoko przepustowe

Systematyczne, wielkoskalowe przesiewy syntetycznych interakcji genetycznych (gen-gen lub epistaza) mogą być wykorzystywane do badania redundancji genetycznej i wzajemnych powiązań między szlakami sygnałowymi. W niniejszej pracy opisujemy opracowaną przez nas technologię wysokoprzepustowych ilościowych przesiewów macierzy syntetycznych interakcji genetycznych, nazwaną eSGA, służącą do wyjaśniania relacji epistatycznych i badania sieci interakcji genetycznych w Escherichia coli.

Mapowanie bakteryjnych sieci funkcjonalnych i szlaków w Escherichia Coli z wykorzystaniem syntetycznych macierzy genetycznych

Metoda Green Monster umożliwia szybkie tworzenie wielokrotnych delecji oznakowanych genem reporterowym kodującym zielone białko fluorescencyjne. Metoda ta opiera się na przeprowadzaniu szczepów drożdży przez powtarzalne cykle seksualnego sortowania delecji oraz wzbogacania komórek posiadających więcej delekcji na podstawie fluorescencji.

Proces Green Monster w celu generowania szczepów drożdży z wielokrotnymi delecjami genów

Źródło: Tomás, J. M., et al. Generowanie mutantów zerowych w celu wyjaśnienia roli glikozylotransferaz bakteryjnych w ruchliwości bakterii. J. Vis. Exp. (2022).Ten film pokazuje zależną od inicjatora amplifikację plazmidu samobójczego u E. coli. Plazmid, który jest nosicielem genu oporności na antybiotyki, replikuje się tylko w obecności białka inicjującego kodowanego przez gospodarza. Po elektroporacji i inkubacji w pożywce regeneracyjnej, mieszaninę umieszcza się na agarze zawierającym...

Amplifikacja plazmidu samobójczego w gospodarzu bakteryjnym

CRISPR/Cas9 to solidny system do wywoływania zakłóceń w genach i elementach genetycznych. W tym miejscu opisujemy protokół skutecznego tworzenia delecji genomowych w liniach komórkowych ssaków przy użyciu CRISPR/Cas9.

Generowanie delecji genomowych w liniach komórkowych ssaków za pomocą CRISPR/Cas9

Eksperymentalne potwierdzenie aktywności wzmacniacza najlepiej podejść poprzez analizę utraty funkcji. Przedstawiono tutaj skuteczny protokół, który wykorzystuje delecję za pośrednictwem CRISPR/Cas9 do badania specyficznej dla alleli regulacji transkrypcji genów w komórkach F1 ES, które zawierają genom hybrydowy (Mus musculus129 x Mus castaneus).

Generowanie delecji monoallelicznych za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w celu zbadania funkcji wzmacniacza w embrionalnych komórkach macierzystych myszy

Ten manuskrypt opisuje dupleksowy cyfrowy test PCR, który może być używany do jednoczesnego ilościowego oznaczania Enterococcus spp. i markerów genetycznych HF183 jako wskaźników ogólnego i związanego z człowiekiem zanieczyszczenia kałem w wodach rekreacyjnych.

Dupleksowy cyfrowy test PCR do jednoczesnej kwantyfikacji Enterococcus spp. i ludzkiego markera HF183 związanego z kałem w wodzie

Opisujemy łatwą, szybką i stosunkowo tanią metodę generowania zaburzonych genami szczepów Streptococcus mutans; technika ta może być dostosowana do generowania zaburzonych genami szczepów różnych gatunków.

Wytwarzanie szczepu Streptococcus mutans z zaburzeniami genetycznymi bez klonowania genów

Tutaj prezentujemy protokół użycia istniejących wcześniej konstruktów delecji kasety oporności na antybiotyki jako podstawy do tworzenia mutantów delecyjnych w innych szczepach E. coli. Takie mutacje delecji mogą być mobilizowane i wprowadzane do odpowiedniego locus szczepu biorcy za pomocą transdukcji bakteriofaga P1.

Wytwarzanie delecji genów w Escherichia coli przez transdukcję P1 z kasetami oporności na antybiotyki podlegającymi akcyzie

Opisana tutaj jest prosta metoda oczyszczania produktu genowego u Streptococcus mutans. Technika ta może być korzystna w oczyszczaniu białek, zwłaszcza białek błonowych i białek o dużej masie cząsteczkowej, i może być stosowana z różnymi innymi gatunkami bakterii.

Oczyszczanie białka o wysokiej masie cząsteczkowej w Streptococcus mutans

Opisana tutaj jest metoda celowanej, bezznacznikowej delecji genu w Chlamydia trachomatis przy użyciu mutagenezy wymiany alleli w kasecie floksowanej, FLAEM.

Bezmarkerowa delecja genu przez mutagenezę wymiany alleli w kasecie floksowanej w Chlamydia trachomatis

Tutaj opisujemy budowę mutantów zerowych Aeromonas w określonych glikozylotransferazach lub regionach zawierających glikozylotransferazy, testy ruchliwości i oczyszczanie wici przeprowadzone w celu ustalenia udziału i funkcji kodowanych przez nie enzymów w biosyntezie glikanu, a także rolę tego glikanu w patogenezie bakterii.

Generowanie mutantów zerowych w celu wyjaśnienia roli glikozylotransferaz bakteryjnych w ruchliwości bakterii

Poznaj metodę delecji genów w całym genomie u Streptococcus sanguinis przy użyciu wysokoprzepustowej PCR. Technika ta umożliwia szybkie tworzenie mutacji i badanie funkcji genów bakteryjnych.

Delecje genów w całym genomie Streptococcus sanguinis za pomocą wysokoprzepustowej PCR

Przeglądaj więcej filmów