Delecje genów w całym genomie Streptococcus sanguinis za pomocą wysokoprzepustowej PCR

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przeprowadzenie genomowych delecji pojedynczych genów w szczepie streptococcus sanguine za pomocą wysokoprzepustowego PCR. Osiąga się to poprzez uzyskanie w pierwszej kolejności trzech amplikonów w drodze wysokoprzepustowej amplifikacji PCR, obejmujących gen oporności na antybiotyk oraz sekwencje DNA położone powyżej (upstream) i poniżej (downstream) genu docelowego. Drugim krokiem jest otrzymanie liniowego rekombinowanego amplikonu PCR z wykorzystaniem trzech amplikonów PCR jako matryc.

Następnie przygotowuje się kompetentne komórki s sanguine. Ostatnim krokiem jest transformacja liniowego rekombinowanego amplikonu PCR do kompetentnych komórek s sanguineous. Ostatecznie do weryfikacji poprawnych mutantów wykorzystuje się amplifikację PCR kolon A oraz sekwencjonowanie DNA.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi wyczerpanymi metodami, takimi jak knockout z użyciem plazmidu samobójczego, jest możliwość bezpośredniego tworzenia mutantów z delecjami w całym genomie przy użyciu wysokoprzepustowości. Startery PCR można zaprojektować i zsyntetyzować zgodnie z opisem w protokole pisemnym, wykorzystując wewnętrzne skrypty oparte na sekwencji genomu Streptococcus sanguineus SK 36. Zaprojektowano trzy zestawy starterów do amplifikacji sekwencji o długości jednego kilobazy powyżej genu docelowego, kodującej białko oporności na kanamycynę sekwencji genu A PHA 3 oraz sekwencji o długości jednego kilobazy poniżej genu docelowego.

Startery specyficzne dla genu. R1 oraz F3 zostały zaprojektowane na podstawie sekwencji 5' i 3' genu docelowego w celu wysokoprzepustowej amplifikacji regionu 1 kb powyżej lub poniżej genów docelowych s sanguine. W pierwszej kolejności należy przygotować mieszaninę reakcyjną PCR na lodzie w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.

Należy zapoznać się z tekstem w celu sprawdzenia składników mieszaniny PCR zawierającej genomowy DNA s sanguineous; należy przenieść 23 µL mieszaniny do każdej studzienki płytki PCR 96-dołkowej, używając pipety wielokanałowej. W celu uzyskania sekwencji powyżej miejsca docelowego genu należy przenieść po 1 µL starterów F1 i R1 z płytek z pracującymi starterami o stężeniu 10 µM na płytkę PCR, używając pipety wielokanałowej. Należy postąpić analogicznie ze starterami F3 i R3, aby przeprowadzić amplifikację sekwencji poniżej miejsca docelowego genu. Płytkę PCR należy szczelnie zamknąć i przeprowadzić amplifikację w temperaturze 94 °C przez 1 minutę, a następnie wykonać 30 cykli w temperaturze 94 °C przez 30 sekund.

54 °C przez 30 sekund i 68 °C przez 1,5 minuty. Po amplifikacji przygotować 1% żel agarozy zawierający odpowiedni bromek z 48 dołkami dopasowanymi do ładowania za pomocą pipety wielokanałowej. Wymieszać cztery µL produktu PCR z jednym µL 5X buforu do ładowania DNA.

Na płytce 96-dołkowej nanieś próbki na żel agarozowy, używając wielokanałowej pipety 10 µL. Przeprowadź elektroforezę przy napięciu 135 V przez 30 minut. Przeanalizuj prążki na żelu za pomocą systemu dokumentacji i analizy UVP.

Produkty PCR należy oczyścić za pomocą zestawu PureLink 96 PCR Purification Kit, stosując wirowanie zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi elucji DNA. Do każdej studni płyty wiążącej należy dodać 40 µL sterylnej wody podwójnie destylowanej. Z płyty należy losowo wybrać kilka oczyszczonych amplikonów w celu sprawdzenia stężenia DNA.

Za pomocą spektrofotometru NanoDrop należy dostosować stężenie amplikonów na płytce do wartości około 10 ng/µL. Następnie należy użyć restryktazy EcoRI do trawienia plazmidu zawierającego kasetę oporności na kanamycynę, aby mógł on służyć jako matryca PCR. Przetrawiony plazmid należy oczyścić za pomocą zestawu QIAquick PCR Purification Kit i dostosować stężenie linearnego DNA plazmidowego do końcowego stężenia 10 ng/µL.

Przygotować 25 µL mieszaniny PCR dla amplikonu kasety oporności na kanamycynę, zawierającej primery F two oraz R two, zgodnie z listą w procedurze pisemnej. Po obejrzeniu tego filmu należy przeprowadzić amplifikację PCR zgodnie z instrukcją podaną tutaj. Aby zbadać produkt PCR, należy wykonać elektroforezę w żelu agarozowym o stężeniu 1%.

Następnie połącz pulę amplikonów kasety oporności na kanamycynę od 10 osobników po oczyszczaniu PCR. Dostosuj stężenie amplikonu do 10 ng/µL. Jedynym najtrudniejszym aspektem tej procedury jest uzyskanie końcowego, liniowo kompetentnego produktu PCR z jego trzech produktów PCR.

Aby zapewnić sukces, trzy aplikanty PCR są dostosowywane do niemal równych ilości. Połączyć po jednym mikrolitrze z trzech roztworów PCR o stężeniu 10 nanogram per mikrolitr w jednej płytce PCR, dodając jednocześnie matrycę PCR. Następnie przygotować mieszaninę PCR, zawierającą trzy primery F1 i R, zgodnie z opisem w procedurze pisemnej.

Następnie przeprowadź amplifikację PCR próbek. Przeanalizuj produkty amplifikacji PCR na żelu agarozowym po ich oczyszczeniu i ilościowym oznaczeniu. Podobnie jak wcześniej, zamroź połączone produkty amplifikacji PCR w temperaturze -20 °C.

Na początek przygotować pożywkę Todd Hewitta z surowicą konią zgodnie z instrukcjami zawartymi w procedurze pisemnej dołączonej do tego filmu; odmierzyć 2 mL pożywki oraz 10 mL pożywki do dwóch stożkowych probówek o pojemności 15 mL. Do 2 mL pożywki zaszczepić 5 µL rozmrożonego szczepu s. sanguine SK 36, który był mrożony w temperaturze -80 °C. Inkubować szczelnie zamkniętą kulturę przez noc w temperaturze 37 °C.

Należy również przeprowadzić preinkubację probówki z 10 ml pożywki w tych samych warunkach po inkubacji nocnej. Przenieść 50 µL hodowli do probówki z 10 ml pożywki. Inkubować probówkę w temperaturze 37 °C przez trzy godziny.

Bezpośrednio po inkubacji, dodaj 2 µL peptydu stymulującego kompetencję SK 36 o stężeniu 70 ng/mL oraz 2 µL liniowego rekombinowanego amplikonu PCR do probówek na bloku 96-dołkowym i podgrzej je wstępnie do 37 °C. Przenieś 330 µL kultury SK 36 inkubowanej przez trzy godziny do każdej probówki. W celu kontroli zastąp DNA sterylną wodą dwukrotnie destylowaną.

Inkubuj probówki w temperaturze 37°C przez jedną godzinę po inkubacji. Umieść blok na lodzie, a następnie rozsiej 100 µL z każdej transformacji na płytki z agarem BHI (brain heart infusion) zawierającym 500 µg/mL kanamycyny. Inkubuj płytki w temperaturze 37°C przez dwa dni w warunkach mikroaerobowych. Dla każdego mutanta zastępczego wybierz losowo dwie pojedyncze kolonie i zaszczep każdą kolonię do 5 mL bulionu BHI zawierającego 500 µg/mL kanamycyny. Inkubuj każdy szczep przez noc w temperaturze 37°C w warunkach mikroaerobowych.

Kriokonserwuj każdą kulturę w 30% glicerolu w temperaturze -80°C. Aby sprawdzić, czy mutant zawiera oczekiwaną substytucję genu, przeprowadź koloniową PCR dla każdego mutanta, używając starterów F1 i R3 na 96-dołkowej płytce PCR.

Użyć około 1 µL kultury nocnej z każdej pojedynczej kolonii jako matrycy DNA w 25 µL reakcji amplifikacji PCR. Przeprowadzić amplifikację PCR w celu potwierdzenia zastąpienia genu mutantem, aby precyzyjnie zidentyfikować mutanty z podwójnym prążkiem lub zanieczyszczone amplikony PCR. Analizować amplikon PCR za pomocą elektroforezy w żelu przez cztery godziny na żelu o długości powyżej 12 cm.

Żel agarozowy 2% z barwieniem bromkiem etydyny w tych warunkach elektroforezy żelowej. Można wyraźnie zidentyfikować wszystkie amplikony o różnicy wynoszącej 100 par zasad lub więcej. Alternatywnie, gdy przewiduje się, że prążki powstałe w wyniku amplifikacji kasety oporności na kanamycynę oraz genu typu dzikiego będą różnić się o mniej niż 100 par zasad, należy zastosować wewnętrzny starter T1 genu docelowego, aby ustalić, czy gen typu dzikiego można wykryć za pomocą PCR.

Aby dodatkowo potwierdzić delecję, należy oczyścić amplikony za pomocą zestawu do oczyszczania PCR Pure Link 96 i przeprowadzić sekwencjonowanie z użyciem startera P1, który wiąże się z kasetą oporności na kanamycynę; należy zachować tylko prawidłowe mutanty potwierdzone sekwencjonowaniem po amplifikacji PCR z użyciem starterów F1 i R1 dla sekwencji powyżej (upstream) oraz F3 i R3 dla sekwencji poniżej (downstream). W formacie 96-dołkowym, przy zastosowaniu określonych warunków PCR i zaprojektowanych starterów, uzyskano około jednej kilobazy sekwencji powyżej i poniżej każdego genu s sanguineous.

W każdej reakcji PCR z genomowego DNA s. sanguineous amplifikowano specyficzny produkt, co wskazało na wysoką specyficzność starterów względem celów s. sanguine, potwierdzoną poprzez reamplifikację PCR z wykorzystaniem starterów F1 i R3 oraz trzech amplikonów jako matryc DNA. Z zastosowaniem wysokiej przepustowości stworzono linearne rekombinowane konstrukty PCR. Na płytce 96-dołkowej przygotowano konstrukty składające się z regionu powyżej każdego genu docelowego, kasety cany oraz regionu poniżej każdego genu docelowego w tej kolejności; następnie rekombinowane konstrukty PCR przetransformowano do s. sanguine SK 36 i wyselekcjonowano za pomocą cany na płytkach z agarem BHI.

W większości transformacji, po dwudniowej inkubacji w warunkach mikroaerobowych, na każdej płytce uzyskano ponad 1000 kolonii. Podczas amplifikacji PCR tych kolonii z wykorzystaniem starterów F1 i R3, w przypadku prób usuwania potencjalnych genów niezbędnych, w elektroforezie żelowej zaobserwowano pojedynczy prążek DNA odpowiadający oczekiwanej wielkości mutanta. W większości transformacji mających na celu usunięcie niektórych genów niezbędnych nie powinny pojawić się żadne kolonie.

Niemniej jednak, po transformacji uzyskano kolonie, a następnie przeprowadzono amplifikację PCR tych kolonii z użyciem starterów F1 i R, w wyniku której w elektroforezie żelowej pojawiły się trzy prążki na żelu NA 2D, odpowiadające oczekiwanemu rozmiarowi mutanta oraz rozmiarowi typu dzikiego. W przypadku niektórych mutantów oczekiwany rozmiar amplikonu PCR dla mutanta i typu dzikiego był zbyt zbliżony, aby można było je rozdzielić za pomocą długiego żelu agarozy. W takim przypadku, w oparciu o sekwencję genu typu dzikiego, zaprojektowano wewnętrzny starter T one dla genu docelowego.

Reakcję PCR przeprowadzono z użyciem wewnętrznego primera T one oraz primera F1. Jako szczep kontrolny dodatni w tej reakcji PCR wykorzystano typ dziki SK 36. Jeśli w przypadku mutanta za pomocą primera wewnętrznego namnożono prążek o oczekiwanym rozmiarze, gen został zidentyfikowany jako gen esencjalny.

Ponieważ obecność kasety kanamycynowej u mutanta została wcześniej potwierdzona poprzez sekwencjonowanie DNA z użyciem startera P1, na podstawie niniejszego protokołu zebrano 2048 mutantów genów nieessentialnych S. sanguineous. Wykluczono te cztery otwarte ramki odczytu, które znajdowały się w całości w obrębie innych otwartych ramek odczytu.

W warunkach eksperymentalnych zidentyfikowano 218 genów niezbędnych do przeżycia s sanguine. Po obejrzeniu tych materiałów wideo powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić analizę genów w skali całego genomu z wykorzystaniem wysokoprzepustowego PCR.