Izolowanie pierwotnych komórek melanocytopodobnych z serca myszy

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie żywotnych komórek serca przypominających melanocyty z serca myszy. Jest to realizowane poprzez pobranie serc od uśpionych myszy, a następnie posiekanie organów i dysocjację komórek za pomocą trawienia enzymatycznego oraz agitacji mechanicznej.

Następnie zawiesinę komórek wiruje się w wirówce, a osad zawierający kardiomiocyty i komórki melanocyto-podobne resuspendsuje. Ostatnim krokiem jest wysianie i hodowla. Tak wyizolowane kardiologiczne komórki melanocyto-podobne mogą być wykorzystane w badaniach nad łatkami komórkowymi lub w analizie mikromacierzy w odpowiedzi na stresory patofizjologiczne w celu oceny pobudliwości komórkowej lub stanu transkryptomu.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami przeznaczonymi do izolacji i hodowli kardiomiocytów jest to, że pozwala ona na wyizolowanie wielu komórek przypominających kardiomiocyty. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy odkryliśmy nową populację komórek w sercu myszy i chcieliśmy zbadać ich fizjologię. Na początek należy przygotować dwa zestawy wysterylizowanych narzędzi chirurgicznych: jeden do wycinania serc, a drugi do rozdrabniania tkanki.

Następnie należy przygotować suplementy do pożywki, jednak wstrzymać się z ich dodaniem do pożywki hodowlanej aż do momentu bezpośrednio poprzedzającego wysiew komórek. Po przygotowaniu pożywki hodowlanej przefiltrować ją w celu sterylizacji roztworu, pracując w dygestorze do hodowli tkankowych, a następnie przechowywać pożywkę w temperaturze czterech stopni Celsius. Przygotować roztwór DNA's one, dodając 0,05 g DNA's one do 100 ml DPBS z 10% FBS oraz antybiotykami.

Następnie przygotuj 0,5% roztwór trypsyny, dodając 0,5 g trypsyny do 100 ml DPBS z antybiotykami. Na koniec zgromadź pozostały sprzęt niezbędny do przeprowadzenia procedury, w tym szalki Petriego, stożkowe probówki o pojemności 50 ml, sitka komórkowe o oczkach 40 µm, DPBS z antybiotykami oraz naczynia hodowlane o średnicy 60 mm i 35 mm. Po eutanazji noworodków myszy w stadiach P0 do P2, przemyj ich klatkę piersiową alkoholem i umieść je w naczyniu P2 o średnicy 10 cm z DPBS. Pracując pod mikroskopem stereoskopowym, ostrożnie otwórz jamę klatki piersiowej i wyjmij całe serce wraz z przylegającymi przedsionkami.

Przemyj serca w DPBS i przenieś je do nowej szalki Petriego o średnicy 10 centymetrów. Przenieś szalkę Petriego z wyciętymi sercami do komory z laminarnym przepływem powietrza i w kolejnych krokach przestrzegaj zasad sterylności. Najpierw przemyj serca trzykrotnie w sterylnym DPBS z dodatkiem antybiotyków.

Umieść serca w 60 milimetrowej szalce hodowlanej i dodaj od sześciu do ośmiu mililitrów 0,5% roztworu trypsyny. Następnie potnij serca na małe kawałki i inkubuj je w temperaturze 37°C przez 30 minut. Po zakończeniu inkubacji przenieś powstałą zawiesinę z szalki do sterylnej 10 mililitrowej probówki stożkowej.

Używając sterylnej pipety o objętości 10 mililitrów, szybko, lecz delikatnie wymieszaj roztwór od 30 do 50 razy, a następnie przefiltruj otrzymaną zawiesinę przez sito komórkowe o oczkach 40 mikronów do nowej, czystej probówki stożkowej o objętości 50 mililitrów. Po wirowaniu delikatnie odessaj naddatek i resuspenduj pozostały osad w sześciu do ośmiu mililitrach sterylnego DPBS. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy.

Po trzecim płukaniu następującym po wirowaniu, ostrożnie odlej lub odessij roztwór piorący i resuspenduj osad w sześciu mililitrach suplementowanej pożywki hodowlanej. Następnie pobierz resuspendingowany roztwór do sterylnej pipety transferowej i przenieś komórki do szalki o średnicy 35 milimetrów. Pobierz izolowane komórki serca od trzech nowonarodzonych myszy po inkubacji przez noc, odessij pożywkę hodowlaną wraz z wszelkimi nieprzylegającymi komórkami, a następnie przepłucz płytki raz za pomocą DPBS, dodaj do płytek świeżą pożywkę i wymień pożywkę.

Komórki wyizolowane z serc noworodkowych lub embrionalnych można utrzymywać w hodowli przez maksymalnie trzy tygodnie, dokonując pasażowania co dwa dni, podczas gdy komórki wyizolowane z serc dorosłych można utrzymywać w hodowli przez maksymalnie 10 dni. Aby wyizolować komórki podobne do melanocytów z serca dorosłej myszy, najpierw przemyj wycięte serca w sterylnym DPBS z dodatkiem antybiotyków w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Delikatnie ściśnij serce zakrzywioną pęsetą anatomiczną, aby usunąć pozostałą krew, a następnie ponownie opłucz serce w DPBS.

Następnie usuń przedsionki oraz pierścień przedsionkowo-komorowy z serc i umieść wycięte preparaty tkanki w naczyniu o średnicy 35 mm. Pokrój serca na małe kawałki, używając zakrzywionych nożyczek i pęsety. Dodaj do naczynia od sześciu do ośmiu mililitrów 0,5% roztworu trypsyny i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 45 do 60 minut.

Po inkubacji powtórz kroki przedstawione wcześniej, aby uzyskać zawiesinę komórek serca dorosłych i przeprowadzić wysiew, tak jak poprzednio. W tym przykładzie biała strzałka wskazuje melanocyt serca na obu panelach. Należy zauważyć, że bez pomocy markera fluorescencyjnego trudno jest zidentyfikować melanocyt serca i odróżnić go od miocytów przedsionkowych przytwierdzonych do naczynia; jasnoniebieska grot strzałki wskazuje komórki przedsionkowe, które nie są dobrze przytwierdzone do naczynia pokazanego tutaj, przedstawiającego zdrowe melanocyty serca wyizolowane z serca noworodka myszy.

Wykształciły one rozległe wypustki dendrytyczne i ściśle przypominają melanocyty skórne. Po opanowaniu ta technika może zostać przeprowadzona w ciągu kilku godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak izolować żywe komórki melanocytów z serca.

Będzie to odpowiednie do analizy fizjologicznej i molekularnej.