Name: Izolowanie pierwotnych komórek podobnych do melanocytów z serca myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Naucz się izolować pierwotne komórki podobne do melanocytów z serca myszy metodą enzymatycznego trawienia i hodowli. Technika ta umożliwia badanie ich roli w arytmii przedsionkowej oraz analizę ekscytowalności komórkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez National Institutes of Health w ramach przyznania funduszy R01 HL105734 dla V.V.P. M.D.L. jest wspierany, w części, przez National Institutes of Health Research Career Award K08 HL094748. V.V.P. jest Innowacyjnym Badaczem American Heart Association, wspieranym przez grant 11IRG900384.

1. Przygotowanie niezbędnych roztworów i sprzętu
<ol>
	<li>W pierwszej kolejności należy wysterylizować narzędzia chirurgiczne (pincety proste, pincety zakrzywione, nożyczki proste i nożyczki zakrzywione), autoklawując je przez 15 min w temperaturze 121 °C. Należy przygotować 2 zestawy narzędzi, z których jeden posłuży do wycinania serc, a drugi do rozdrabniania tkanki.</li>
	<li>Rozpuścić jedną saszetkę pożywki MCDB153 w 900 ml sterylnej, filtrowanej wody i mieszać powoli aż do całkowitego rozpuszczenia proszku. Dodać 1,2 g wodorowęglanu sodu lub 15,7 ml roztworu wodorowęglanu sodu [7,5% w/v] na każdy litr końcowej objętości przygotowywanej pożywki i mieszać do czasu rozpuszczenia. Dostosować pH do wartości 7,2, dodając 1 N HCl lub 1 N NaOH, a następnie przelać pożywkę przez filtr nakrętkowy o rozmiarze 0,2 μm w warunkach sterylnych w komorze laminarnej (szafce bezpieczeństwa biologicznego). Następnie zebrać pożywkę i przechowywać ją w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować suplementy do dodania do pożywki hodowlanej (Lista Materiałów). Suplementy należy dodać do pożywki bezpośrednio przed jej wykorzystaniem do wysiewu komórek.</li>
	<li>Przygotować DPBS z 10% FBS oraz antybiotykami (penicyliną i streptomycyną).</li>
	<li>Następnie przygotować 0,25% roztwór trypsyny, dodając 0,25 g trypsyny (trzustka bydlęca, aktywność &#62; 2 500 jednostek USP/mg, ultrapure; USB) do 100 ml DPBS z antybiotykami (penicyliną i streptomycyną).</li>
	<li>Pozostały sprzęt niezbędny do wykonania tej procedury obejmuje stereomikroskop, szalki Petriego (10 cm), probówki stożkowe 50 ml, sita komórkowe 40 μm, DPBS z antybiotykami, naczynia hodowlane 60 mm oraz naczynia hodowlane 35 mm.</li>
</ol>
2. Izolowanie serc z noworodków myszy
<ol>
	<li>W pierwszej kolejności należy pozyskać noworodki myszy w wieku od P0 do P2 (n=6 do 8). Zaleca się użycie szczeniąt uzyskanych poprzez krzyżowanie homozygotycznych samic Dct-Cre z samcami heterozygotycznymi pod kątem allelu R26R:EYFP lub allelu Z/EG w celu oznakowania komórek melanocytopodobnych. Zarówno myszy R26R:EYFP, jak i Z/EG są dostępne w Jackson Laboratories (numery katalogowe odpowiednio 006148 i 003920).</li>
	<li>Następnie należy poddać noworodki myszy eutanazji, przetrzeć ich klatki piersiowe wacikiem nasączonym alkoholem, a następnie umieścić je w 10-cm czalce Petriego&#160;z DPBS.</li>
	<li>Za pomocą wysterylizowanych pęset i nożyczek należy naciąć skórę nad klatką piersiową i mostkiem, a następnie ostrożnie otworzyć klatkę piersiową pod stereomikroskopem. Serca noworodków myszy są bardzo małe, dlatego należy zachować ostrożność, aby usunąć całe serce wraz z przylgniętymi przedsionkami.</li>
	<li>Serca należy wypłukać w DPBS, a następnie przenieść do nowej 10-cm czalki Petriego&#160;.</li>
</ol>
3. Trawienie enzymatyczne
<ol>
	<li>Przenieś szalkę Petriego z wyciętymi sercami do komory z laminarnym przepływem powietrza (kabiny biologicznej), a następnie wykonaj poniższe kroki, stosując wewnątrz niej techniki sterylne.</li>
	<li>Najpierw trzykrotnie przemyj serca sterylnym roztworem DPBS z dodatkiem antybiotyków.</li>
	<li>Umieść serca (n=6-8) w 60-mm naczyniu hodowlanym i dodaj do naczynia 6-8 ml 0,5% roztworu trypsyny.</li>
	<li>Następnie pokrój serca na małe kawałki (o rozmiarze poniżej 1 mm) i inkubuj je w temperaturze 37 °C przez 30 min w atmosferze 5% CO2).</li>
	<li>Po zakończeniu okresu inkubacji przelej powstały zawiesinę tkanki serca i trypsyny z naczynia do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Następnie, używając sterylnej pipety 10 ml, szybko, lecz delikatnie, rozbij zawiesinę w probówce stożkowej 50 ml poprzez 30-50 krotne pipetowanie.</li>
	<li>Przefiltruj otrzymany roztwór przez sitko komórkowe 40-μm do nowej, czystej probówki stożkowej 50 ml, aby zebrać filtrat.</li>
	<li>Następnie odwiruj probówkę 50 ml w wirówce stołowej przy 240 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej. Następnie delikatnie odessij supernatant i resuspenduj pozostały osad w 6-8 ml sterylnego DPBS. Powtórz ten krok jeszcze 2 razy. Ten etap pozwala na osadzenie miocytów przedsionkowych i melanocytów serca, ale nie powoduje osiadania fibroblastów, ponieważ są one mniejsze i pozostają w supernatancie.</li>
</ol>
4. Wysiewanie komórek przypominających melanocyty serca
<ol>
	<li>Po trzecim płukaniu po wirowaniu należy ostrożnie odlać lub odessać roztwór płuczący (DPBS), a następnie zawiesić osad w 6 ml pożywki hodowlanej MCDB z dodatkiem suplementów.</li>
	<li>Następnie należy pobrać zawiesinę do sterylnej pipety transferowej i przenieść komórki do naczynia o średnicy 35 mm lub do studni płytki 6-dołkowej, łącząc wyizolowane komórki serca z 3 noworodków mysich w jednym naczyniu 35 mm lub jednej studni.</li>
	<li>Naczynia należy inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2, odessać pożywkę wraz z nieprzytwierdzonymi komórkami, a następnie raz przepłukać płytki roztworem DPBS. Następnie do płytek należy dodać świeżą pożywkę i wymieniać ją co 2 dni. Komórki wyizolowane z serc noworodków lub embrionów można utrzymywać w hodowli do 3 tygodni, natomiast komórki wyizolowane z serc dorosłych osobników można utrzymywać w hodowli do 10 dni.</li>
</ol>
5. Izolowanie komórek podobnych do melanocytów serca z serca dorosłej myszy
<ol>
	<li>W pierwszej kolejności, po podaniu myszom 100 U heparyny drogą doszpikową i ich eutanazji, należy wyciąć serca z dojrzałych myszy (wiek 3-4 tygodnie, n=3) poprzez sternotomię w linii środkowej. Do eutanazji myszy w tej procedurze zaleca się stosowanie pentobarbitalu, jednak lek ten nie jest dostępny we wszystkich lokalizacjach.</li>
	<li>Następnie, w komorze z laminarnym przepływem powietrza (dygestorium mikrobiologicznym), należy przemyć wycięte serca w sterylnym DPBS z dodatkiem antybiotyków. Serca należy lekko ścisnąć zakrzywioną pęsetą chirurgiczną, aby usunąć z nich resztki krwi, a następnie raz jeszcze opłukać je w DPBS.</li>
	<li>Należy usunąć z serc przedsionki oraz pierścień przedsionkowo-komorowy (struktury te zawierają komórki podobne do melanocytów), a wycięte próbki tkanki umieścić w szalce o średnicy 35 mm.</li>
	<li>Serca należy pociąć na małe kawałki za pomocą zakrzywionych nożyczek i pęsety, a następnie dodać do szalki 6-8 ml 0,5% roztworu trypsyny. Następnie szalki należy inkubować w temperaturze 37 °C przez 45-60 min.</li>
	<li>Teraz należy postępować zgodnie z krokami opisanej powyżej procedury, zaczynając od punktu 3.6.</li>
</ol>

<ol><li>Hornyak, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitf+dosage+as+a+primary+determinant+of+melanocyte+survival+after+ultraviolet+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Melanoma+Res%22%5BJournal%5D)">Mitf dosage as a primary determinant of melanocyte survival after ultraviolet irradiation.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 22, 307-318 (2009).</li>
<li>Yonetani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+immature+melanoblasts+and+their+ability+to+repopulate+melanocyte+stem+cells+in+the+hair+follicle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of immature melanoblasts and their ability to repopulate melanocyte stem cells in the hair follicle.</a> J. Invest. Dermatol. 128, 408-420 (2008).</li>
<li>Levin, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanocyte-like+cells+in+the+heart+and+pulmonary+veins+contribute+to+atrial+arrhythmia+triggers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Melanocyte-like cells in the heart and pulmonary veins contribute to atrial arrhythmia triggers.</a> J. Clin. Invest. 119, 3420-3436 (2009).</li>
<li>Patel, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+insights+in+the+cellular+basis+of+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Cardiovasc.+Ther%22%5BJournal%5D)">Novel insights in the cellular basis of atrial fibrillation.</a> Expert Rev. Cardiovasc. Ther. 8, 907-915 (2010).</li>
<li>Sviderskaya, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+neurons+and+melanocytes+induced+from+immortal+lines+of+postnatal+neural+crest-like+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Functional neurons and melanocytes induced from immortal lines of postnatal neural crest-like stem cells.</a> FASEB J. 23, 3179-3192 (2009).</li>
<li>Sviderskaya, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P16Ink4a+in+melanocyte+senescence+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer.+Inst%22%5BJournal%5D)">P16Ink4a in melanocyte senescence and differentiation.</a> J. Natl. Cancer. Inst. 94, 446-454 (2002).</li>
<li>Cook, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+melanoblasts+in+culture%3A+Expression+of+BRN2+and+synergistic+regulation+by+fibroblast+growth+factor-2%2C+stem+cell+factor%2C+and+endothelin-3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Human melanoblasts in culture: Expression of BRN2 and synergistic regulation by fibroblast growth factor-2, stem cell factor, and endothelin-3.</a> J. Invest. Dermatol. 121, 1150-1159 (2002).</li>
<li>Fang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+conditions+for+the+generation+of+melanocytes+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Defining the conditions for the generation of melanocytes from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 24, 1668-1677 (2006).</li>
<li>Brito, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timeline+and+distribution+of+melanocyte+precursors+in+the+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Melanoma+Res%22%5BJournal%5D)">Timeline and distribution of melanocyte precursors in the mouse heart.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 21, 464-470 (2008).</li>
<li>Yajima, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+of+heart+melanocytes+is+specified+and+the+level+of+pigmentation+in+the+heart+may+correlate+with+coat+color%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Melanoma+Res%22%5BJournal%5D)">The isolation of heart melanocytes is specified and the level of pigmentation in the heart may correlate with coat color.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 21, 471-476 (2008).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Melanocyty serca występują w obszarach anatomicznych serca, które powszechnie stanowią źródła wyzwalające arytmię przedsionkową. Regiony te obejmują żyły płucne, pierścień przedsionkowo-komorowy, tylną ścianę lewego przedsionka oraz otwór owalny (Rycyna 4). Aby zrozumieć rolę tych komórek w arytmogenezie, opracowujemy techniki ich izolacji oraz badania nad ich fizjologią. Uznaliśmy jednak, że udoskonalenie tej metody w celu uzyskania zdrowszych i większych ilości melanocytów serca pozwoli na dalsze badan...

Niedawno zidentyfikowaliśmy w sercach myszy i ludzi nową populację komórek, które wykazują ekspresję enzymów syntezy melaniny i morfologicznie przypominają melanocyty skórne. Komórki te nazwaliśmy „melanocytami sercowymi” i stwierdziliśmy, że występują one w lokalizacjach anatomicznych, z których u ludzi często wywodzą się wyzwalacze arytmii przedsionkowej. Wykazaliśmy również, że melanocyty sercowe przyczyniają się do powstawania arytmii przedsionkowych u myszy z delecją linii zarodkowej genu Dct. Melanocyty sercowe są rzadko rozmieszczone w przedsionku myszy, gdzie stanowią mniej niż 0,1% wszystkich komórek przedsionkowych. Aby zbadać właściwości elektryczne i biologiczne melanocytów sercowych, opracowaliśmy procedurę ich izolacji z serca myszy przy użyciu specyficznych dla melanocytów markerów indukowanych przez Cre. Nasza pierwotna procedura została opracowana na podstawie metod stosowanych do izolacji noworodkowych kardiomiocytów mysich i pozwalała na uzyskanie bardzo niewielkiej liczby komórek odpowiednich do rejestracji metodą patch-clamp lub analizy PCR. Jednakże, aby poprawić stan i żywotność melanocytów sercowych na potrzeby bardziej szczegółowych analiz elektrofizjologicznych lub badań biochemicznych, opracowaliśmy udoskonaloną procedurę na podstawie metod zaprojektowanych do izolacji melanocytów skórnych. Procedura opisana i zaprezentowana w niniejszym przeglądzie ma tę zaletę, że pozwala uzyskać zdrowsze melanocyty sercowe, które mogą być wysiewane jako czysta populacja lub wraz z kardiomiocytami.

<table><tbody><tr><td>MCDB 153</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7403</td><td>Rozpuścić w wodzie</td></tr><tr><td>DPBS, bez wapnia i magnezu</td><td>Invitrogen</td><td>14190136</td><td>Stężenie zapasu: 1x&lt;br/&gt; Stężenie robocze: 1x</td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15140163</td><td>Stężenie zapasu: 100x&lt;br/&gt; Stężenie robocze: 1x</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Life Technology</td><td>Certyfikowana</td><td>Stężenie robocze: 4%</td></tr><tr><td>TPA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585</td><td>Rozpuścić w DMSO&lt;br/&gt;Stężenie zapasu: 3.2 &amp;mu;M&lt;br/&gt;Stężenie robocze: 32 nM</td></tr><tr><td>Transferryna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8158</td><td>Rozpuścić w DPBS&lt;br/&gt;Stężenie zapasu: 0.1 mg/ml&lt;br/&gt;Stężenie robocze: 1 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Dibutyrylowy cykliczny AMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0627</td><td>Rozpuścić w DPBS&lt;br/&gt;Stężenie zapasu: 0.5 mM&lt;br/&gt;Stężenie robocze: 5 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td>Rozpuścić w 10 mM kwasie octowym&lt;br/&gt;Stężenie zapasu: 1 mg/ml&lt;br/&gt;Stężenie robocze: 5 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Podstawowy FGF</td><td>BD Biosciences</td><td>354060</td><td>Rozpuścić w wodzie&lt;br/&gt;Stężenie zapasu: 4 ng/&amp;mu;l&lt;br/&gt;Stężenie robocze: 4 ng/ml</td></tr></tbody></table>

izolowanie pierwotnych komórek melanocytopodobnych z serca myszy

Isolating Primary Melanocyte-like Cells from the Mouse Heart

Zidentyfikowaliśmy nową populację komórek melanocytopodobnych (znanych również jako melanocyty serca) w sercach myszy i ludzi, które przyczyniają się do wyzwalania arytmii przedsionkowej u myszy. Aby zbadać właściwości elektryczne i biologiczne melanocytów serca, opracowaliśmy procedurę ich izolacji z serc myszy, wyprowadzoną z metod zaprojektowanych do izolacji neonatalnych kardiomiocytów mysich. W celu uzyskania zdrowszych melanocytów serca, odpowiednich do bardziej rozległych badań metodą patch clamp lub badań biochemicznych, opracowaliśmy udoskonaloną procedurę izolacji i wysiewania melanocytów serca, opartą na metodach pierwotnie zaprojektowanych do izolacji melanocytów skórnych. Udoskonalona procedura jest zaprezentowana w niniejszym opracowaniu i pozwala na uzyskanie większej liczby zdrowych komórek melanocytopodobnych, które mogą być wysiewane jako czysta populacja lub wraz z kardiomiocytami.

Protokół opisany w niniejszym artykule jest ulepszoną techniką w porównaniu do wcześniej opublikowanej przez nas metody izolacji melanocytów serca z serca mysiego. Procedura ta wykorzystuje markery fluorescencyjne sterowane specyficzną dla enzymów syntezy melaniny rekombinazą Cre w celu znakowania komórek przypominających melanocyty serca. Podczas pracy ze świeżo izolowanymi komórkami zarodkowymi lub noworodkowymi istotne jest zastosowanie markera do znakowania melanocytów serca, ponieważ różnice morfologiczne odróżniają...

W niniejszym protokole zidentyfikowaliśmy nową populację komórek melanocytopodobnych (znanych również jako melanocyty serca) w sercach myszy i ludzi, które przyczyniają się do wyzwalania arytmii przedsionkowej u myszy.&#160;

Izolowanie pierwotnych komórek melanocytopodobnych z serca myszy

Zidentyfikowaliśmy nową populację komórek melanocyto-podobnych (znanych również jako melanocyty serca) w sercach myszy i ludzi, które przyczyniają się do przedsionkowej...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie żywotnych komórek serca przypominających melanocyty z serca myszy. Jest to realizowane poprzez pobranie serc od uśpionych myszy, a następnie posiekanie organów i dysocjację komórek za pomocą trawienia enzymatycznego oraz agitacji mechanicznej.Następnie zawiesinę komórek wiruje się w wirówce, a osad zawierający kardiomiocyty i komórki melanocyto-podobne resuspendsuje. Ostatnim krokiem jest wysianie i hodowla. Tak wyizolowane kardiologiczne komórki melanocyto-podobne mogą być wykorzystane w badaniach nad łatkami komórkowymi lub w analizie mikromacierzy w odpowiedzi na stresory patofizjologiczne w celu oceny pobudliwości komórkowej lub stanu transkryptomu.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami przeznaczonymi do izolacji i hodowli kardiomiocytów jest to, że pozwala ona na wyizolowanie wielu komórek przypominających kardiomiocyty. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy odkryliśmy nową populację komórek w sercu myszy i chcieliśmy zbadać ich fizjologię. Na początek należy przygotować dwa zestawy wysterylizowanych narzędzi chirurgicznych: jeden do wycinania serc, a drugi do rozdrabniania tkanki.Następnie należy przygotować suplementy do pożywki, jednak wstrzymać się z ich dodaniem do pożywki hodowlanej aż do momentu bezpośrednio poprzedzającego wysiew komórek. Po przygotowaniu pożywki hodowlanej przefiltrować ją w celu sterylizacji roztworu, pracując w dygestorze do hodowli tkankowych, a następnie przechowywać pożywkę w temperaturze czterech stopni Celsius. Przygotować roztwór DNA's one, dodając 0,05 g DNA's one do 100 ml DPBS z 10% FBS oraz antybiotykami.Następnie przygotuj 0,5% roztwór trypsyny, dodając 0,5 g trypsyny do 100 ml DPBS z antybiotykami. Na koniec zgromadź pozostały sprzęt niezbędny do przeprowadzenia procedury, w tym szalki Petriego, stożkowe probówki o pojemności 50 ml, sitka komórkowe o oczkach 40 µm, DPBS z antybiotykami oraz naczynia hodowlane o średnicy 60 mm i 35 mm. Po eutanazji noworodków myszy w stadiach P0 do P2, przemyj ich klatkę piersiową alkoholem i umieść je w naczyniu P2 o średnicy 10 cm z DPBS. Pracując pod mikroskopem stereoskopowym, ostrożnie otwórz jamę klatki piersiowej i wyjmij całe serce wraz z przylegającymi przedsionkami.Przemyj serca w DPBS i przenieś je do nowej szalki Petriego o średnicy 10 centymetrów. Przenieś szalkę Petriego z wyciętymi sercami do komory z laminarnym przepływem powietrza i w kolejnych krokach przestrzegaj zasad sterylności. Najpierw przemyj serca trzykrotnie w sterylnym DPBS z dodatkiem antybiotyków.Umieść serca w 60 milimetrowej szalce hodowlanej i dodaj od sześciu do ośmiu mililitrów 0,5% roztworu trypsyny. Następnie potnij serca na małe kawałki i inkubuj je w temperaturze 37°C przez 30 minut. Po zakończeniu inkubacji przenieś powstałą zawiesinę z szalki do sterylnej 10 mililitrowej probówki stożkowej.Używając sterylnej pipety o objętości 10 mililitrów, szybko, lecz delikatnie wymieszaj roztwór od 30 do 50 razy, a następnie przefiltruj otrzymaną zawiesinę przez sito komórkowe o oczkach 40 mikronów do nowej, czystej probówki stożkowej o objętości 50 mililitrów. Po wirowaniu delikatnie odessaj naddatek i resuspenduj pozostały osad w sześciu do ośmiu mililitrach sterylnego DPBS. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy.Po trzecim płukaniu następującym po wirowaniu, ostrożnie odlej lub odessij roztwór piorący i resuspenduj osad w sześciu mililitrach suplementowanej pożywki hodowlanej. Następnie pobierz resuspendingowany roztwór do sterylnej pipety transferowej i przenieś komórki do szalki o średnicy 35 milimetrów. Pobierz izolowane komórki serca od trzech nowonarodzonych myszy po inkubacji przez noc, odessij pożywkę hodowlaną wraz z wszelkimi nieprzylegającymi komórkami, a następnie przepłucz płytki raz za pomocą DPBS, dodaj do płytek świeżą pożywkę i wymień pożywkę.Komórki wyizolowane z serc noworodkowych lub embrionalnych można utrzymywać w hodowli przez maksymalnie trzy tygodnie, dokonując pasażowania co dwa dni, podczas gdy komórki wyizolowane z serc dorosłych można utrzymywać w hodowli przez maksymalnie 10 dni. Aby wyizolować komórki podobne do melanocytów z serca dorosłej myszy, najpierw przemyj wycięte serca w sterylnym DPBS z dodatkiem antybiotyków w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Delikatnie ściśnij serce zakrzywioną pęsetą anatomiczną, aby usunąć pozostałą krew, a następnie ponownie opłucz serce w DPBS.Następnie usuń przedsionki oraz pierścień przedsionkowo-komorowy z serc i umieść wycięte preparaty tkanki w naczyniu o średnicy 35 mm. Pokrój serca na małe kawałki, używając zakrzywionych nożyczek i pęsety. Dodaj do naczynia od sześciu do ośmiu mililitrów 0,5% roztworu trypsyny i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 45 do 60 minut.Po inkubacji powtórz kroki przedstawione wcześniej, aby uzyskać zawiesinę komórek serca dorosłych i przeprowadzić wysiew, tak jak poprzednio. W tym przykładzie biała strzałka wskazuje melanocyt serca na obu panelach. Należy zauważyć, że bez pomocy markera fluorescencyjnego trudno jest zidentyfikować melanocyt serca i odróżnić go od miocytów przedsionkowych przytwierdzonych do naczynia; jasnoniebieska grot strzałki wskazuje komórki przedsionkowe, które nie są dobrze przytwierdzone do naczynia pokazanego tutaj, przedstawiającego zdrowe melanocyty serca wyizolowane z serca noworodka myszy.Wykształciły one rozległe wypustki dendrytyczne i ściśle przypominają melanocyty skórne. Po opanowaniu ta technika może zostać przeprowadzona w ciągu kilku godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak izolować żywe komórki melanocytów z serca.Będzie to odpowiednie do analizy fizjologicznej i molekularnej.

isolating-primary-melanocyte-like-cells-from-the-mouse-heart

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolowanie komórek podobnych do melanocytów pierwotnych z serca mysiego

Ten film opisuje szybką metodę jednoczesnego izolowania i hodowli melanocytów i fibroblastów ze skóry pourodzeniowego szczeniaka myszy. Komórki te mogą być utrzymywane i manipulowane in vitro w celu badania biologii komórek skóry, gojenia się ran i czerniaka.

Szybka hodowla pierwotnych mysich melanocytów i fibroblastów: Izolowanie melanocytów i fibroblastów z próbki całej mysiej skóry

Pojedyncze kardiomiocyty od myszy typu dzikiego i zmutowanych mogą być izolowane z serca w celu zbadania ich kurczliwości i przejściowych stanów wapnia. Pozwala to na scharakteryzowanie udziału dysfunkcji komórkowej w dysfunkcji serca z dowolnej przyczyny.

Izolacja i analiza fizjologiczna kardiomiocytów myszy

Opisujemy niezawodną metodę izolacji kardiomiocytów dorosłych myszy. Protokół ten daje spójny wynik dla hodowli funkcjonalnych dorosłych kardiomiocytów od różnych genetycznie zmodyfikowanych myszy.

Izolacja i hodowla kardiomiocytów dorosłych myszy do sygnalizacji komórkowej i przerostu serca in vitro

Idealnym modelem do badania biologii dorosłych komórek macierzystych jest mieszek włosowy myszy. W tym miejscu przedstawiamy protokół izolacji różnych populacji mieszków włosowych, komórek macierzystych i keratynocytów naskórka, wykorzystujący trawienie enzymatyczne skóry grzbietowej myszy, a następnie analizę FACS.

Izolowanie komórek macierzystych mieszków włosowych i keratynocytów naskórka z grzbietowej skóry myszy

Ten protokół opisuje krok po kroku metodę powtarzalnej izolacji i długoterminowej hodowli kardiomiocytów dorosłych myszy o wysokiej wydajności, czystości i żywotności.

Izolacja, hodowla i transdukcja kardiomiocytów dorosłych myszy

Ogólnym celem tego artykułu jest ujednolicenie protokołu izolacji, charakterystyki i różnicowania komórek macierzystych serca (CSC) od serca dorosłej myszy. W tym miejscu opisujemy metodę wirowania w gradimencie gęstości w celu wyizolowania mysich CSC oraz opracowane metody hodowli CSC, proliferacji i różnicowania do kardiomiocytów.

Izolacja, charakterystyka i różnicowanie sercowych komórek macierzystych z serca dorosłej myszy

Ten protokół przedstawia szybką metodę jednoczesnego generowania kultur melanocytów i fibroblastów ze skóry myszy w wieku 0-4 dni. Te pierwotne kultury mogą być utrzymywane i manipulowane in vitro w celu badania różnych fizjologicznie istotnych procesów, w tym biologii komórek skóry, pigmentacji, gojenia się ran i czerniaka.

Szybkie generowanie pierwotnych mysich kultur melanocytów i fibroblastów

Opracowaliśmy prostąmetodę izolowania wysokiej jakości pojedynczych komórek serca myszy za pomocą techniki perfuzji antegrade. Metoda ta nie zawiera metody Langendorffa i jest przydatna do izolowania miocytów komorowych i przedsionkowych lub komórek śródmiąższowych, takich jak fibroblasty serca lub komórki progenitorowe.

Metoda perfuzji antegrade do izolacji kardiomiocytów od myszy

Złotym standardem w kardiologii dla komórkowych i molekularnych eksperymentów funkcjonalnych są kardiomiocyty. W artykule opisano adaptacje techniki innej niż Langendorff do izolowania kardiomiocytów myszy.

Prosta i skuteczna metoda konsekwentnego izolowania kardiomiocytów myszy

Tutaj prezentujemy protokół opisujący przygotowanie jąder komórkowych. Po mikrodysekcji i enzymatycznej dysocjacji tkanki serca na pojedyncze komórki, komórki progenitorowe zamrożono, a następnie wyizolowano czyste żywe komórki, które wykorzystano do sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra i testu pojedynczego jądra dla chromatyny dostępnej dla transpozazy z wysokoprzepustowymi analizami sekwencjonowania.

Izolacja jąder z komórek progenitorowych serca myszy w celu profilowania epigenomu i ekspresji genów w rozdzielczości pojedynczej komórki

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół izolowania komórek Müllera glejowych siatkówki od oczu myszy. Protokół rozpoczyna się od enukleacji i sekcji oczu myszy, po której następuje izolacja, wysiew i hodowla komórek Müllera.

Izolacja pierwotnych komórek glejowych Müllera siatkówki myszy

Naucz się izolować pierwotne komórki podobne do melanocytów z serca myszy metodą enzymatycznego trawienia i hodowli. Technika ta umożliwia badanie ich roli w arytmii przedsionkowej oraz analizę ekscytowalności komórkowej.

Izolowanie pierwotnych komórek melanocytopodobnych z serca myszy

Przeglądaj więcej filmów