Nowoczesna metoda hodowli i spolaryzowanej stymulacji eksplantów ludzkiej błony śluzowej jelita

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest odwzorowanie warunków in vivo dla stymulacji błony śluzowej jelit człowieka. Osiąga się to poprzez przyklejenie cylindra (tzw. cave cylinder) do strony apikalnej tkanki, aby zapobiec kontaktowi bodźca z powierzchnią bazolateralną. W drugim kroku stosuje się bodziec, co pozwoli na analizę wywołanej odpowiedzi immunologicznej.

Następnie bodziec jest usuwany z powierzchni apikalnej tkanki, aby zachować jej żywotność przez okres od 24 do 36 godzin. Uzyskane wyniki mogą wykazać zróżnicowane efekty różnych szczepów probiotycznych na podstawie danych immunohistochemicznych, wydzielania cytokin, analizy profilu i tak dalej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak komora ASIC, jest możliwość jednoczesnej analizy do 20 warunków.

Pozwala to na wydłużenie czasu hodowli do 36 godzin, a także zapewnia wystarczającą ilość materiału do różnych analiz odczytowych, takich jak analiza DNA/RNA, immunohistochemia, sekrecja cytokin itp. Chociaż model ten może dostarczyć cennych informacji w dziedzinie probiotyków, może być również wykorzystany w innych technologiach oraz do badania działania innych immunomodulatorów, takich jak leki biologiczne, leki przeciwzapalne i inne. Tkanka błony śluzowej jelita od osób zdrowych lub z chorobą zapalną jelit musi zostać pobrana podczas operacji.

Po wycięciu preparatu należy go szybko przenieść do laboratorium, utrzymując go w niskiej temperaturze w buforze HBSS z dodatkiem penstrepu. Następnie należy rozpocząć od przemycia tkanki buforem i usunięcia wszelkich materiałów krezkowych. W kolejnym kroku, zachowując tkankę w buforze HBSS, należy oddzielić warstwę śluzówki od błony podśluzowej, używając sterylnych nożyczek i pincety.

W szalce Petriego nie jest konieczne całkowite zanurzenie tkanki, jednak należy jak najrzadziej dotykać powierzchni śluzówkowej pęsetą. Następnie należy pociąć śluzówkę na paski o szerokości co najmniej jednego centymetra i jak największej długości, używając dwóch sterylnych skalpeli w sposób przypominający krojenie żywności. Po pocięciu należy delikatnie przemyć i oczyścić śluzówkę w HBSS wolnym od wapnia i magnezu.

Na koniec rozłóż paski błony śluzowej na szalce Petriego stronami apikalnymi do góry. Zacznij od przygotowania świeżego TIS DMEM. Następnie nalej do 10 centymetrowej szalki Petriego około 30 mililitrów F-B-S-N-A i całkowicie zanurz w roztworze kratkę żelazną.

Pozostaw płytkę otwartą i umieść na niej plastikowe cylindry. Przykrycie. Następnie nabierz trzy µL kleju chirurgicznego do pipety i ostrożnie nanieś klej na jedną z krawędzi plastikowego cylindra, trzymając go mocno pęsetą. Następnie delikatnie ustaw cylinder na stronie apikalnej błony śluzowej, jak najbliżej krawędzi jednego z pasków, aż klej wyschnie.

Do centralnej studni płytki tkankowej wlej od 850 do 1000 µL pożywki, a następnie oprzyj żelazną kratkę o krawędzie centralnej studni płytki. Używając dwóch skalpeli, odetnij nadmiar tkanki z brzegów cylindra. Następnie ostrożnie podnieś cylinder z przytwierdzoną tkanką i umieść stronę bazolateralną tkanki na żelaznej kratce w centrum płytki.

Następnie przystąp do stymulacji tkanki. Nanieś odpowiednie bodźce na środek plastikowego cylindra w pożądanym stężeniu. Nie dotykaj końcówką pipety cylindra ani powierzchni śluzówkowej i równomiernie pokryj powierzchnię wewnątrz cylindra.

Następnie inkubuj tkankę przez maksymalnie trzy godziny. Inkubacja dłuższa niż trzy godziny jest również możliwa przy zastosowaniu mniejszej objętości roztworu stymulującego. Po inkubacji usuń stymulację z powierzchni apikalnej tkanki, ale nie zastępuj jej świeżą pożywką.

Dodanie pożywki doprowadziłoby do uduszenia tkanki. Teraz napełnij słoik tlenowy tlenem 100% pod ciśnieniem jednej atmosfery na 24 godziny czasu hodowli. Zawsze zachowaj ostrożność podczas obsługi butli z tlenem i upewnij się, że została ona prawidłowo zamknięta po użyciu.

Po 24-godzinnej hodowli stymulacyjnej, za pomocą skalpela ostrożnie wyjmij cylinder z tkanki, delikatnie zdrapując klej. Następnie, w przypadku analiz IHC lub immunofluorescencji, utrwal tkankę. W przypadku analizy ekspresji genów lub białek, zamroź tkankę gwałtownie w ciekłym azocie.

Następnie pobierz pożywkę z podstawy i boków do profilowania wydzielania cytokin. Po tym kroku przenieś pożywkę do probówki do wirowania i oddziel zanieczyszczenia zgodnie z opisanym protokołem. Zdrowa błona śluzowa jelita ludzkiego oraz błona śluzowa z IBD były hodowane przez co najmniej 24 godziny w celu zachowania żywotności tkanek.

Było to możliwe tylko wtedy, gdy co najmniej 85% czasu hodowli upłynęło w środowisku bogatym w tlen. Tradycyjnie hodowana śluzówka nie radzi sobie tak dobrze. Zdrową tkankę stymulowano następnie pro zapalną inwazyjną salmonellą.

Dwie godziny po inokulacji widoczne było już zniszczenie górnej warstwy nabłonka w porównaniu z grupami kontrolnymi. Po 24 godzinach degeneracja stała się dość rozległa. Szczegółowe omówienie zastosowań eksperymentalnych wraz z opublikowanymi wynikami znajduje się w opracowanym manuskrypcie.

Technika ta utorowała drogę badaczom pracującym w dziedzinie gastroenterologii do badania interakcji między gospodarzem a mikrobami w przewodzie pokarmowym. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak utrzymywać ludzką błonę śluzową jelita w hodowli oraz jak stymulować ją miejscowo. Należy pamiętać, że praca z próbkami pochodzenia ludzkiego może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać niezbędnych środków ostrożności.