Name: Nowatorska metoda hodowli i spolaryzowanej stymulacji eksplantatów błony śluzowej jelit człowieka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Poznaj nowatorską metodę hodowli eksplantatów błony śluzowej jelit człowieka z zachowaniem polaryzacji tkanek. Technika umożliwia analizę odpowiedzi immunologicznych na stymulację przez 24–36 godzin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Erice Mileti za doskonałe wsparcie techniczne oraz dr. Antonio Di Sabatino za udostępnienie komór tlenowych.
Finansowanie: Niniejsza praca została sfinansowana z grantów w ramach 7. programu ramowego UE (IBDase, ERC: Dendroworld) oraz Fondazione Cariplo dla MR, a także ze wsparcia międzynarodowej sieci szkoleniowej Marie Curie (Cross-Talk, umowa o grant nr: 21553-2) dla KT.

1. Pozyskiwanie i przygotowanie tkanki
<ol>
	<li>Tkankę (zdrową błonę śluzową lub błonę śluzową z IBD) pobiera się podczas operacji. Po wycięciu preparatu należy go jak najszybciej przenieść do laboratorium, przechowując go w buforze HBSS wolnym od Ca++/Mg++, uzupełnionym o Pen/Strep, w temperaturze 4 °C lub w lodzie.</li>
</ol>
*Wielkość preparatu zależy od dostępności tkanki: pobrana część tkanki jest ściśle tym, co nie jest wymagane do postawienia diagnozy, i może znacznie różnić się u osób zdrowych oraz pacjentów z IBD. Tkanka zdrowa jest wycinana u pacjentów poddawanych operacjom z powodu raka jelita grubego.
<ol start="2">
	<li>Delikatnie opłucz tkankę i oczyść ją ze wszystkich materiałów krezkowych. Oddziel warstwę błony śluzowej od błony podśluzowej za pomocą sterylnych nożyczek i pęsety, utrzymując tkankę w buforze HBSS w szalce Petriego (niekoniecznie w pełnym zanurzeniu). Unikaj częstego dotykania pęsetą powierzchni śluzówki.</li>
	<li>Potnij błonę śluzową w pasy o szerokości co najmniej 1 cm i możliwie największej długości. Użyj dwóch sterylnych skalpeli, prowadząc cięcie w sposób analogiczny do krojenia pokarmu.</li>
	<li>Delikatnie opłucz oczyszczoną błonę śluzową w buforze HBSS i rozłóż ją w szalce Petriego stroną apikalną do góry.</li>
</ol>
2. Montowanie tkanki
<ol>
	<li>Przygotować świeżą pożywkę (tisDMEM). Należy użyć DMEM uzupełnionego o glutaminę (2 mM) i NaPyr (1 mM), a w momencie użycia dodać 15% FBS-Na (płodowa surowica bydlęca – Ameryka Północna), 1% ITS-X oraz 200 ng/ml EGF.</li>
	<li>Napełnić 10 cm płytkę Petri pozostałą częścią FBS-Na (użyć około 30 ml, tak aby siatki metalowe były całkowicie zanurzone) i zanurzyć w niej siatki metalowe. Pozostawić płytkę otwartą i oprzeć na jej brzegu plastikowe cylindry.</li>
</ol>
*Siatki metalowe są wykonane z żelaza. Oczka są kwadratowe o boku 0.5 mm.
<ol start="3">
	<li>Pobierz 3 μl kleju chirurgicznego za pomocą pipety 10 lub 20 μl. Nanieś go ostrożnie na jedną z krawędzi plastikowego cylindra, trzymając go stabilnie pęsetą.</li>
	<li>Delikatnie umieść cylinder na stronie apikalnej błony śluzowej, jak najbliżej jednej z krawędzi paska.</li>
	<li>Aby klej zdążył trwale przytwierdzić cylinder do tkanki, przygotuj płytkę do hodowli organów z centralną studnią: wlej 850 μl-1 ml pożywki do środkowej studni i oprzyj metalową siatkę na krawędziach centralnej studni płytki.</li>
	<li>Odetnij nadmiar tkanki z krawędzi cylindra, używając dwóch sterylnych skalpeli, analogicznie jak poprzednio.</li>
	<li>Delikatnie unieś cylinder z przytwierdzoną tkanką i umieść stronę bazolateralną na metalowej siatce w centrum płytki.</li>
</ol>
3. Stymulacja
<ol>
	<li>Użyć wybranych bodźców w preferowanym stężeniu.</li>
	<li>Nanieść odpowiednią objętość na środek plastikowego cylindra, nie dotykając pipetą cylindra ani powierzchni błony śluzowej. Upewnić się, że wybrana objętość równomiernie pokrywa powierzchnię wewnątrz cylindra. Wskazane objętości: 
	Duży plastikowy cylinder: 200 μl 
	Średni plastikowy cylinder: 100 μl 
	Mały plastikowy cylinder: 50 μl</li>
	<li>Inkubować do 3 hr w konwencjonalnym inkubatorze.</li>
</ol>
*Jeśli chcesz inkubować przez dłuższy czas, upewnij się, że używasz znacznie mniejszej objętości stymulatorów (10-20 μl) i umieść tkankę bezpośrednio w atmosferze 100% O2 pod ciśnieniem 1 Atm (patrz 3.5).
<ol start="4">
	<li>Usunąć medium ze stymulantami z powierzchni apikalnej tkanki i NIE ZASTĘPOWAĆ go świeżym medium, ponieważ tkanka nie otrzyma wystarczającej ilości O2, jeśli gruba warstwa medium na powierzchni apikalnej będzie uniemożliwiać wymianę gazową. Przykryć płytkę.</li>
	<li>Umieścić tkankę w atmosferze 100% O2 pod ciśnieniem 1 Atm.</li>
</ol>
4. Pozyskiwanie
<ol>
	<li>Po 24 h całkowitego czasu hodowli (± 2,5 h) ostrożnie usuń cylinder z tkanki za pomocą skalpela, delikatnie zeskrobując klej, a następnie przechowuj go w zależności od planowanej analizy (utrwal do badań immunohistochemicznych i/lub immunofluorescencji lub zamroź błyskawicznie w ciekłym N2 w celu oczyszczania RNA i profilowania ekspresji genów lub oczyszczania białek i analiz Western blot).</li>
	<li>Zabierz medium z komory bazolateralnej do profilowania sekrecji cytokin. Wirować z prędkością 8,000 rpm przez 7 min w celu osadzenia zanieczyszczeń, przenieś nadsącz do probówki Eppendorf (alternatywnie podziel na alykwoyty) i natychmiast przechowuj w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
*jeśli chcesz przechowywać nadnadłoża przez dłuższy czas, przechowuj je w temperaturze -80 °C.

<ol><li>Schuller, S., Lucas, M., Kaper, J. B., Giron, J. A., Phillips, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ex+vivo+response+of+human+intestinal+mucosa+to+enteropathogenic+Escherichia+coli+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The ex vivo response of human intestinal mucosa to enteropathogenic Escherichia coli infection.</a> Cell. Microbiol. 11, 521-530 (2009).</li>
<li>Tsilingiri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probiotic+and+postbiotic+activity+in+health+and+disease%3A+comparison+on+a+novel+polarised+ex-vivo+organ+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model.</a> Gut. , (2012).</li>
<li>Tsilingiri, K., Rescigno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Should+probiotics+be+tested+on+ex+vivo+organ+culture+models%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Should probiotics be tested on ex vivo organ culture models?</a> Gut Microbes. , Manuscript in preparation (2012).</li>
<li>Mileti, E., Matteoli, G., Iliev, I. D., Rescigno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+immunomodulatory+properties+of+three+probiotic+strains+of+Lactobacilli+using+complex+culture+systems%3A+prediction+for+in+vivo+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparison of the immunomodulatory properties of three probiotic strains of Lactobacilli using complex culture systems: prediction for in vivo efficacy.</a> PLoS One. 4, e7056(2009).</li>
<li>Cencic, A., Langerholc, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cell+models+of+the+gut+and+their+applications+in+food+microbiology--a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Functional cell models of the gut and their applications in food microbiology--a review.</a> Int. J. Food Microbiol. 141, Suppl 1. S4-S14 (2010).</li>
<li>te Velde, A. A., Verstege, M. A., Hommes, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+appraisal+of+the+current+practice+in+murine+TNBS-induced+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Bowel+Dis%22%5BJournal%5D)">Critical appraisal of the current practice in murine TNBS-induced colitis.</a> Inflamm. Bowel Dis. 12, 995-999 (2006).</li>
<li>Senior, P. V., Pritchett, C. J., Sunter, J. P., Appleton, D. R., Watson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crypt+regeneration+in+adult+human+colonic+mucosa+during+prolonged+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Crypt regeneration in adult human colonic mucosa during prolonged organ culture.</a> J. Anat. 134, 459-469 (1982).</li>
<li>Browning, T. H., Trier, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+culture+of+mucosal+biopsies+of+human+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Organ culture of mucosal biopsies of human small intestine.</a> J. Clin. Invest. 48, 1423-1432 (1969).</li>
<li>Besselink, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probiotic+prophylaxis+in+predicted+severe+acute+pancreatitis%3A+a+randomised%2C+double-blind%2C+placebo-controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Probiotic prophylaxis in predicted severe acute pancreatitis: a randomised, double-blind, placebo-controlled trial.</a> Lancet. 371, 651-659 (2008).</li>
<li>Lakhdari, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+NF-kappaB+modulation+capabilities+within+human+intestinal+commensal+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Identification of NF-kappaB modulation capabilities within human intestinal commensal bacteria.</a> J. Biomed. Biotechnol. 2011, 282356(2011).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Od dawna podkreśla się potrzebę opracowania fizjologicznie istotnych modeli, na których można byłoby rzetelnie testować metody leczenia błony śluzowej jelita u ludzi. Wielu badaczy zidentyfikowało potencjalne artefakty i wady w modelach komórkowych 5 oraz mysich 6, stosowanych dotychczas w tym celu. Rzeczywiście, mimo że często uzyskuje się obiecujące dane przedkliniczne, rzadko przekładają się one na istotne korzyści kliniczne.
Metoda opisana w niniejszej pracy stanowi s...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;silny&gt;Odczynniki&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>10X HBSS</td><td>Eurocalne</td><td>ECM4006XL</td><td></td></tr><tr><td>Peni/Strepto</td><td>Lonza</td><td>DE17602E</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Gibco</td><td>15750-037</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>BE12614</td><td></td></tr><tr><td>FBS-Na</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>100X ITS-X</td><td>Gibco</td><td>51500-056</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Tebu-bio</td><td>100-15</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Lonza</td><td>BE17605E</td><td></td></tr><tr><td>Aminokwasy nieessentialne 100X</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>NaPyr</td><td>Gibco</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;silny&gt;Materiały&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Cylindry do klonowania 6x8 mm</td><td>BellCo</td><td>2090-00608</td><td></td></tr><tr><td>Cylindry do klonowania 8x8 mm</td><td>BellCo</td><td>2090-0080</td><td></td></tr><tr><td>Cylindry do klonowania 10x10 mm</td><td>BellCo</td><td>2090-01010</td><td></td></tr><tr><td>Siatki metalowe</td><td>Własnej produkcji</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płytka do hodowli organów z centralną studnią</td><td>BD Falcon</td><td>353037</td><td></td></tr><tr><td>Klej chirurgiczny (Vetbond)</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Słoje tlenowe</td><td>Własnej roboty</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Butle z tlenem</td><td>Air Liquid Sanit&amp;#224;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

nowoczesna metoda hodowli i spolaryzowanej stymulacji eksplantów ludzkiej błony śluzowej jelita

A Novel Method for the Culture and Polarized Stimulation of Human Intestinal Mucosa Explants

Obecnie istnieje niewiele modeli pozwalających na realistyczne symulowanie złożonego mikrośrodowiska ludzkiego jelita, w którym zachodzi szereg interakcji. Prawidłowa homeostaza zależy bezpośrednio od tych oddziaływań, ponieważ kształtują one całą odpowiedź immunologiczną, indukując tolerancję na antygeny pokarmowe, przy jednoczesnym generowaniu skutecznych reakcji odpornościowych przeciwko drobnoustrojom patogennym, które zostały przypadkowo przyjęte wraz z pożywieniem.
Homeostaza jelitowa jest utrzymywana również poprzez różnorodne, złożone interakcje między mikrobiotą (w tym korzystnymi szczepami bakterii związanymi z pożywieniem) a organizmem gospodarza, które regulują przyleganie/degradację śluzu, produkcję peptydów przeciwdrobnoustrojowych przez barierę nabłonkową oraz „edukację” komórek nabłonka, kontrolującą fenotyp tolerogenny lub immunogenny specyficznych populacji komórek limfoidalnych rezydujących w jelitach. Interakcje te były dotychczas bardzo trudne do odtworzenia w testach in vitro z wykorzystaniem linii komórkowych lub mononuklearnych komórek krwi obwodowej. Ponadto modele mysie znacznie różnią się pod względem składników błony śluzowej jelit (organizacja warstwy śluzu, społeczność bakterii komensalnych) w stosunku do jelit ludzkich. W związku z tym trudne było prowadzenie badań nad różnymi terapiami, które mają zostać wprowadzone do praktyki klinicznej w przypadku istotnych schorzeń związanych ze stresem lub stanami patologicznymi, takich jak zespół jelita drażliwego, niespecyficzne zapalne schorzenia jelit czy rak jelita grubego.
Aby rozwiązać te problemy, opracowaliśmy nowatorski system umożliwiający polaryzowaną stymulację eksplantatów ludzkiej błony śluzowej jelit, które zachowują swoje uwarunkowanie in situ wynikające z oddziaływań mikrobioty gospodarza i odpowiedzi immunologicznej. Polaryzowana stymulacja apikalna ma kluczowe znaczenie dla wyniku wywołanej odpowiedzi odpornościowej. Wielokrotnie wykazano, że te same bodźce mogą wywołać całkowicie odmienne reakcje, gdy omijają powierzchnię apikalną nabłonka jelitowego, stymulując komórki nabłonkowe basolateralnie lub wchodząc w bezpośredni kontakt z komponentami blaszki właściwej, co zmienia fenotyp z tolerogennego na immunogenny i powoduje niepotrzebny oraz nadmierny stan zapalny w tym obszarze.
Osiągnęliśmy polaryzację stymulacji poprzez przyklejenie cylindra ograniczającego obszar stymulacji na powierzchni apikalnej śluzówki, zgodnie z opisem w protokole. Wykorzystaliśmy ten model do zbadania między innymi różnic w działaniu trzech różnych szczepów Lactobacilli. Wykazujemy, że system modelowy ten jest bardzo skutecznym narzędziem do oceny właściwości immunomodulujących probiotyków w warunkach zdrowia oraz choroby.

Udało nam się utrzymać w kulturze zdrową błonę śluzową jelita człowieka oraz błonę śluzową z chorobą IBD przez co najmniej 24 hr, zachowując żywotność tkanki. Zgodnie z wcześniejszymi obserwacjami 1, było to możliwe tylko wtedy, gdy większość czasu hodowli (co najmniej 85% całkowitego czasu) odbywała się w O2, ponieważ tkanka nie przetrwała 24 hr w konwencjonalnych inkubatorach (Rysunek 2). Wykazaliśmy również, że w tym modelu można obserwować różne reakcje eksplantów w zależności o...

Przedstawiamy nowatorską metodę utrzymywania ludzkiej błony śluzowej jelita w kulturze oraz monitorowania odpowiedzi na różne rodzaje bodźców przez co najmniej 24 hrs. Dzięki zastosowaniu naszej metody zachowana zostaje polarność tkanki, co umożliwia fizjologiczną stymulację drogą apikalną.

Nowoczesna metoda hodowli i spolaryzowanej stymulacji eksplantów ludzkiej błony śluzowej jelita

Obecnie istnieje niewiele modeli pozwalających na realistyczne symulowanie złożonego mikrośrodowiska ludzkiego jelita, w którym zachodzi szereg oddziaływań. Odpowiednie...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest odwzorowanie warunków in vivo dla stymulacji błony śluzowej jelit człowieka. Osiąga się to poprzez przyklejenie cylindra (tzw. cave cylinder) do strony apikalnej tkanki, aby zapobiec kontaktowi bodźca z powierzchnią bazolateralną. W drugim kroku stosuje się bodziec, co pozwoli na analizę wywołanej odpowiedzi immunologicznej.Następnie bodziec jest usuwany z powierzchni apikalnej tkanki, aby zachować jej żywotność przez okres od 24 do 36 godzin. Uzyskane wyniki mogą wykazać zróżnicowane efekty różnych szczepów probiotycznych na podstawie danych immunohistochemicznych, wydzielania cytokin, analizy profilu i tak dalej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak komora ASIC, jest możliwość jednoczesnej analizy do 20 warunków.Pozwala to na wydłużenie czasu hodowli do 36 godzin, a także zapewnia wystarczającą ilość materiału do różnych analiz odczytowych, takich jak analiza DNA/RNA, immunohistochemia, sekrecja cytokin itp. Chociaż model ten może dostarczyć cennych informacji w dziedzinie probiotyków, może być również wykorzystany w innych technologiach oraz do badania działania innych immunomodulatorów, takich jak leki biologiczne, leki przeciwzapalne i inne. Tkanka błony śluzowej jelita od osób zdrowych lub z chorobą zapalną jelit musi zostać pobrana podczas operacji.Po wycięciu preparatu należy go szybko przenieść do laboratorium, utrzymując go w niskiej temperaturze w buforze HBSS z dodatkiem penstrepu. Następnie należy rozpocząć od przemycia tkanki buforem i usunięcia wszelkich materiałów krezkowych. W kolejnym kroku, zachowując tkankę w buforze HBSS, należy oddzielić warstwę śluzówki od błony podśluzowej, używając sterylnych nożyczek i pincety.W szalce Petriego nie jest konieczne całkowite zanurzenie tkanki, jednak należy jak najrzadziej dotykać powierzchni śluzówkowej pęsetą. Następnie należy pociąć śluzówkę na paski o szerokości co najmniej jednego centymetra i jak największej długości, używając dwóch sterylnych skalpeli w sposób przypominający krojenie żywności. Po pocięciu należy delikatnie przemyć i oczyścić śluzówkę w HBSS wolnym od wapnia i magnezu.Na koniec rozłóż paski błony śluzowej na szalce Petriego stronami apikalnymi do góry. Zacznij od przygotowania świeżego TIS DMEM. Następnie nalej do 10 centymetrowej szalki Petriego około 30 mililitrów F-B-S-N-A i całkowicie zanurz w roztworze kratkę żelazną.Pozostaw płytkę otwartą i umieść na niej plastikowe cylindry. Przykrycie. Następnie nabierz trzy µL kleju chirurgicznego do pipety i ostrożnie nanieś klej na jedną z krawędzi plastikowego cylindra, trzymając go mocno pęsetą. Następnie delikatnie ustaw cylinder na stronie apikalnej błony śluzowej, jak najbliżej krawędzi jednego z pasków, aż klej wyschnie.Do centralnej studni płytki tkankowej wlej od 850 do 1000 µL pożywki, a następnie oprzyj żelazną kratkę o krawędzie centralnej studni płytki. Używając dwóch skalpeli, odetnij nadmiar tkanki z brzegów cylindra. Następnie ostrożnie podnieś cylinder z przytwierdzoną tkanką i umieść stronę bazolateralną tkanki na żelaznej kratce w centrum płytki.Następnie przystąp do stymulacji tkanki. Nanieś odpowiednie bodźce na środek plastikowego cylindra w pożądanym stężeniu. Nie dotykaj końcówką pipety cylindra ani powierzchni śluzówkowej i równomiernie pokryj powierzchnię wewnątrz cylindra.Następnie inkubuj tkankę przez maksymalnie trzy godziny. Inkubacja dłuższa niż trzy godziny jest również możliwa przy zastosowaniu mniejszej objętości roztworu stymulującego. Po inkubacji usuń stymulację z powierzchni apikalnej tkanki, ale nie zastępuj jej świeżą pożywką.Dodanie pożywki doprowadziłoby do uduszenia tkanki. Teraz napełnij słoik tlenowy tlenem 100% pod ciśnieniem jednej atmosfery na 24 godziny czasu hodowli. Zawsze zachowaj ostrożność podczas obsługi butli z tlenem i upewnij się, że została ona prawidłowo zamknięta po użyciu.Po 24-godzinnej hodowli stymulacyjnej, za pomocą skalpela ostrożnie wyjmij cylinder z tkanki, delikatnie zdrapując klej. Następnie, w przypadku analiz IHC lub immunofluorescencji, utrwal tkankę. W przypadku analizy ekspresji genów lub białek, zamroź tkankę gwałtownie w ciekłym azocie.Następnie pobierz pożywkę z podstawy i boków do profilowania wydzielania cytokin. Po tym kroku przenieś pożywkę do probówki do wirowania i oddziel zanieczyszczenia zgodnie z opisanym protokołem. Zdrowa błona śluzowa jelita ludzkiego oraz błona śluzowa z IBD były hodowane przez co najmniej 24 godziny w celu zachowania żywotności tkanek.Było to możliwe tylko wtedy, gdy co najmniej 85% czasu hodowli upłynęło w środowisku bogatym w tlen. Tradycyjnie hodowana śluzówka nie radzi sobie tak dobrze. Zdrową tkankę stymulowano następnie pro zapalną inwazyjną salmonellą.Dwie godziny po inokulacji widoczne było już zniszczenie górnej warstwy nabłonka w porównaniu z grupami kontrolnymi. Po 24 godzinach degeneracja stała się dość rozległa. Szczegółowe omówienie zastosowań eksperymentalnych wraz z opublikowanymi wynikami znajduje się w opracowanym manuskrypcie.Technika ta utorowała drogę badaczom pracującym w dziedzinie gastroenterologii do badania interakcji między gospodarzem a mikrobami w przewodzie pokarmowym. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak utrzymywać ludzką błonę śluzową jelita w hodowli oraz jak stymulować ją miejscowo. Należy pamiętać, że praca z próbkami pochodzenia ludzkiego może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać niezbędnych środków ostrożności.

a-novel-method-for-culture-polarized-stimulation-human-intestinal

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nowela metoda hodowli i polaryzowanej stymulacji ludzkiej śluzówki jelitowej w hodowli eksplantatów

Źródło: In, J. G. i in. Monowarstwy ludzkich koloniów do badania interakcji między patogenami, komensalami a nabłonkiem jelitowym gospodarza. J. Vis. Exp. (2019).Ten film pokazuje procedurę hodowania komórek nabłonkowych pochodzących z jelita grubego na systemie Transwell pokrytym kolagenem, aby uzyskać monowarstwę produkującą śluz, która modeluje barierę jelitową i umożliwia badania interakcji gospodarz–patogen.

Generowanie monowarstwy ludzkiej kolonoidu z funkcją bariery do badania interakcji gospodarz–patogen

W tym filmie opisujemy metodologię tworzenia systemu hodowli narządów jelitowych ex vivo w celu zbadania interakcji między fragmentami tkanki jelitowej myszy a specyficznymi bakteriami jelitowymi. Urządzenie składa się z dwóch par portów wejścia-wyjścia, z których pierwszy łączy światło tkanki jelitowej i dostarcza do niej specyficzną zawiesinę bakteryjną, a drugi w sposób ciągły dostarcza pożywkę do studzienek urządzenia w celu utrzymania żywotności tkanek ex vivo.

System hodowli narządów jelitowych ex vivo do badania interakcji między gospodarzem a mikrobiotą

Opisujemy metodę tworzenia ludzkich enteroidów z krypt jelita cienkiego i kolonoidów z krypt jelita grubego pobranych zarówno z tkanek chirurgicznych, jak i z biopsji. W tym artykule metodologicznym przedstawiamy metody hodowli, które są niezbędne do pomyślnego wzrostu i utrzymania ludzkich enteroidów i okronoidów.

Ustalenie ludzkich enteroidów nabłonkowych i kolonoidów z całej tkanki i biopsja

Tutaj opisany jest protokół zbierania, utrzymywania i leczenia organoidów jelita cienkiego myszy z wzorcami molekularnymi związanymi z patogenami (PAMP) i Listeria monocytogenes, a także nacisk na ekspresję genów i właściwe techniki normalizacji białka.

Hodowla ex vivo i stymulacja receptorów rozpoznawania wzorców organoidów jelitowych myszy

Opisujemy protokół in vitro do wspólnej hodowli mikrobiomu jelitowego i kosmków jelitowych przez dłuższy okres przy użyciu ludzkiego systemu mikrofizjologicznego typu gut-on-a-chip.

Współhodowla żywego mikrobiomu z mikroinżynieryjnymi kosmkami jelitowymi człowieka w urządzeniu mikroprzepływowym typu gut-on-a-chip

Ten protokół opisuje izolację i hodowlę mieszanych mysich komórek jelita cienkiego. Te pierwotne hodowle jelitowe umożliwiają badanie szlaków sygnałowych leżących u podstaw wydzielania peptydów jelitowych przy użyciu wielu technik.

Mieszane pierwotne hodowle mysiego jelita cienkiego przeznaczone do badania wydzielania hormonów jelitowych i obrazowania żywych komórek enteroendokrynnych

Tutaj prezentujemy protokół hodowli ludzkich monowarstw enteroidowych lub kolonoidowych, które mają nienaruszoną funkcję bariery, do badania interakcji nabłonkowo-mikrobiota gospodarza na poziomie komórkowym i biochemicznym.

Ludzkie monowarstwy okrężnicy do badania interakcji między patogenami, komensalami i nabłonkiem jelitowym gospodarza

Ten protokół opisuje, jak indukować różnicowanie komórek M w monowarstwach jelita krętego pochodzących z ludzkich komórek macierzystych oraz metody oceny ich rozwoju.

Indukowane różnicowanie komórek podobnych do komórek M w monowarstwach jelita krętego pochodzących z ludzkich komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy dwa protokoły, które pozwalają na modelowanie interakcji specyficznych dla wierzchołka jelita. Monowarstwy jelitowe pochodzące z organoidów i kultury interfejsu powietrze-ciecz (ALI) ułatwiają wytwarzanie dobrze zróżnicowanego nabłonka dostępnego zarówno od strony luminalnej, jak i podstawnej, podczas gdy organoidy jelitowe z odwróconą polaryzacją odsłaniają swoją wierzchołkową stronę i są podatne na testy o wysokiej przepustowości.

Metody hodowli do badania interakcji specyficznych dla wierzchołka przy użyciu modeli organoidów jelitowych

Badanie przedstawia metodę badania in vitro infekcji bakteryjnej z wykorzystaniem organoidów pochodzenia tkankowego z komórek macierzystych. Protokół opisuje, jak hodować i różnicować organoidy w dwóch wymiarach, zakażać je adherentno-inwazyjnymi Escherichia coli oraz oceniać kluczowe odczyty, w tym przełamanie bariery nabłonkowej, obrazowanie infekcji oraz odpowiedź RNA nabłonkowego.

Dwuwymiarowa hodowla organoidów na inwazynie lub wyciągu z błony podstawowej do badania interakcji gospodarz-bakteria

Poznaj nowatorską metodę hodowli eksplantatów błony śluzowej jelit człowieka z zachowaniem polaryzacji tkanek. Technika umożliwia analizę odpowiedzi immunologicznych na stymulację przez 24–36 godzin.

Nowoczesna metoda hodowli i spolaryzowanej stymulacji eksplantów ludzkiej błony śluzowej jelita

Przeglądaj więcej filmów