Funkcjonalny obrazowanie rezonansem magnetycznym (fMRI) ze stymulacją słuchową u ptaków śpiewających

Ogólnym celem tej procedury jest przedstawienie zoptymalizowanego protokołu dla skutecznej wizualizacji percepcji i przetwarzania dźwięków w obszarach słuchowych oraz regionach kontroli śpiewu w mózgu ptaka śpiewającego. Wykorzystując funkcjonalny rezonans magnetyczny (fMRI), osiąga się to poprzez przygotowanie wysokiej jakości bodźców słuchowych, które mogą zostać włączone do paradygmatu blokowego on-off w celu ich prezentacji ptakowi podczas skanowania fMRI. Drugim krokiem jest przygotowanie ptaka do skanowania poprzez podanie znieczulenia, a następnie umieszczenie go na przystosowanym legowisku dla zwierząt, które następnie wprowadza się do otworu skanera MRI. Następnie można przeprowadzić akwizycję obrazów fMRI podczas stymulacji słuchowej.

Ostatnim krokiem jest wstępne przetwarzanie uzyskanych danych MRI, w tym normalizacja obrazów do atlasu zebry (zebra finch). W końcowym etapie stosowana jest statystyczna analiza oparta na wokselach, która umożliwia wizualizację uzyskanych wyników oraz lokalizację aktywacji mózgu wywołanych bodźcami słuchowymi. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi częściej stosowanymi w badaniach nad słonecznikami metodami, takimi jak elektrofizjologia, histologia i techniki mapowania molekularnego, jest to, że fMRI jest nieinwazyjną metodą in vivo, która pozwala na badanie tego samego osobnika w czasie oraz analizę całego mózgu jednocześnie, bez wcześniejszych hipotez dotyczących lokalizacji substratów neuronalnych zaangażowanych w badany proces.

Osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ wdrażanie funkcjonalnego MRI u ptaków różni się znacząco i jest znacznie bardziej wymagające niż stosowanie tej samej metody u ludzi lub gryzoni. Wynika to nie tylko z niewielkiego rozmiaru mózgów tych obiektów, ale także z faktu, że ich czaszka składa się z licznych jam powietrznych, co powoduje artefakty podatności; stosując sekwencję spin-echo, która jest mniej podatna na te artefakty niż sekwencja gradientowa, możemy przeprowadzić funkcjonalne obrazowanie całego mózgu ptaka śpiewającego z bardzo dobrą specyficznością przestrzenną. Apertura skanera jest ograniczoną przestrzenią, która może zniekształcać bodźce słuchowe.

W związku z tym, aby rozpocząć przygotowania do niniejszego protokołu, należy nagrać bodźce dźwiękowe podczas ich odtwarzania wewnątrz otworu systemu MR 7 T przy użyciu mikrofonu światłowodowego i zweryfikować zniekształcenia dla używanego systemu MRI. Tutaj można zobaczyć częstotliwości wzmocnione i stłumione, co pokazują nagrania białego szumu wykonane poza skanerem oraz w miejscu położenia głowy ptaka wewnątrz otworu magnesu. Aby zrekompensować to sztuczne wzmocnienie, należy zastosować funkcję korektora do każdego bodźca, korzystając z oprogramowania Wave Lab dla przedstawionej konfiguracji.

W niniejszym protokole funkcja opiera się na jądrze Gaussa z parametrami wyświetlanymi na ekranie. Tutaj bodźce dźwiękowe powinny składać się z kilku poszczególnych motywów śpiewu konkretnego ptaka przeplatanych okresami ciszy; należy dostosować czas trwania tych okresów ciszy tak, aby całkowita ilość dźwięku i ciszy była identyczna dla wszystkich bodźców. Całkowita długość każdego bodźca wynosi 16 sekund, co odpowiada czasowi akwizycji dwóch obrazów fMRI.

Używając oprogramowania do przygotowania danych, znormalizuj intensywność każdego utworu pod kątem dopasowanej wartości średniej kwadratowej (RMS) oraz zastosuj filtr górnoprzepustowy o częstotliwości 400 hertz przed włączeniem ich do pełnego bodźca. Eksperyment można zaprojektować za pomocą oprogramowania do prezentacji, stosując blokowy schemat włącz/wyłącz (on-off), naprzemiennie stosując okresy stymulacji słuchowej i okresy odpoczynku. Każdy blok powinien trwać 16 sekund, co odpowiada czasowi akwizycji dwóch obrazów; każdy typ bodźca należy zaprezentować 25 razy, co pozwoli na uzyskanie 50 obrazów na bodziec i na badanego.

Kolejność prezentacji warunków powinna zostać zrandomizowana w obrębie i pomiędzy badanymi. Należy również skonfigurować paradygmat eksperymentalny w taki sposób, aby odbierał on triggery ze skanera. Zapewnia to, że podczas każdego powtórzenia w sekwencji fMRI oprogramowanie skanera wyśle trigger do oprogramowania odpowiedzialnego za prezentację bodźców słuchowych, które z kolei zarejestruje numer skanu i wykona odpowiednią komendę.

W niniejszym opracowaniu przedstawiamy protokół specjalnie dostosowany do pracy z dorosłymi zebrami domowymi. Zebry domowe powinny być utrzymywane w wolierach przy 12-godzinnym cyklu światła i 12-godzinnym cyklu ciemności, z nielimitowanym dostępem do pożywienia i wody w trakcie całego badania. Minimalna liczba osobników w jednym eksperymencie wynosi 15.

Liczba ta uwzględnia czułość fMRI w trybie echa spinowego oraz naturalną zmienność międzyosobniczą zjawisk biologicznych pomierzonych w eksperymencie. Aby przygotować się do eksperymentu, najpierw podłącz maskę na dziób do urządzenia sterującego przepływem gazów za pomocą plastikowych rurek i zamontuj ją na stole MRI w systemie MR o indukcji 7 T. Otwórz butle z tlenem i azotem, a następnie włącz urządzenie sterujące przepływem gazów.

Włącz również system z kontrolą sprzężenia zwrotnego oraz urządzenie do ogrzewania strumienia powietrza. Następnie znieczul zebrolika, stosując 3% isofluran w mieszaninie tlenu i azotu; wprowadź dziób ptaka do maski i przytrzymaj głowę, aż ptak zostanie w pełni znieczulony. Można to zweryfikować, delikatnie pociągając za stopę.

Gdy ptak zostanie w pełni uspokojony, stopa nie będzie cofana. Ponadto oczy ptaka będą zamknięte. Wprowadź sondę temperatury do kloaki, aby kontrolować temperaturę ciała przez cały czas trwania eksperymentu, oraz umieść czujnik pneumatyczny pod brzuchem w celu monitorowania częstotliwości oddechów.

Następnie załóż kamizelkę unieruchamiającą ciało ptaka na cały czas trwania eksperymentu. Utrzymuj częstotliwość oddychania w zakresie od 40 do 100 oddechów na minutę i zachowaj stałą temperaturę ciała na poziomie 40 stopni. Jeśli częstotliwość oddychania jest zbyt niska lub zbyt wysoka, odpowiednio dostosuj poziom znieczulenia.

Jeśli problem będzie występował nadal, należy przerwać eksperyment i wyjąć zwierzę z aparatury. W celu regeneracji, należy umieścić niemagnetyczne głośniki dynamiczne po obu stronach głowy kanarka zebra i podłączyć je do wzmacniacza. Należy upewnić się, że przewody głośników są poprowadzone z dala od sondy temperatury, ponieważ mogą one wpływać na odczyt temperatury.

W przypadku zbyt bliskiej odległości, należy umieścić powierzchniową cewkę RF na głowie zebra fincza. Następnie należy ustawić zebra fincza w centrum magnesu. Na koniec, przed rozpoczęciem skanowania, należy obniżyć poziom znieczulenia do 1,5% ISO fluoru.

Aby rozpocząć skanowanie, najpierw należy określić położenie mózgu w magnesie. Należy wykonać jeden zestaw obrazów lokalizacyjnych (scout) w płaszczyznach strzałkowej, poziomej i czołowej przy użyciu pojedynczego przekroju gradientowego i echa, a także wieloprzekrojowe obrazy lokalizacyjne, które zostaną wykorzystane później do pozycjonowania skanów funkcjonalnych. Następnie należy zmniejszyć szum gradientów, zwiększając ich czasy narastania do 1000 microseconds.

Następnie przygotuj sekwencję szybkiego obrazowania z wzmocnionym relaksowaniem, znaną również jako rARE T2-zależne fMRI. Następnie zaplanuj 15 przekrojów strzałkowych obejmujących niemal cały mózg. Teraz wybierz protokół słuchowy w oprogramowaniu do prezentacji, aby upewnić się, że oprogramowanie to nie pominie żadnego sygnału wyzwalającego ze skanera.

W pierwszej kolejności uruchom protokół słuchowy. Po pełnym załadowaniu protokołu rozpocznij sekwencję fMRI. Każdemu eksperymentowi fMRI powinno poprzedzać wykonanie 10 obrazów pustych (dummy images), aby sygnał osiągnął stan stacjonarny przed rozpoczęciem stymulacji słuchowej.

Po zakończeniu akwizycji należy uzupełnić dane do rozmiaru 64 na 64. Aby ocenić jakość danych, należy wstępnie przeanalizować wyniki, korzystając z narzędzia funkcjonalnego.

W oprogramowaniu ParaVision oblicz różnicową odpowiedź BOLD pomiędzy wszystkimi blokami stymulacji a linią bazową. Jeśli w głównych obszarach słuchowych nie zaobserwowano aktywacji, prawdopodobnie ptak nie słyszał lub nie przetworzył bodźców słuchowych z powodu problemów technicznych lub poziomu anestezji. W takim przypadku należy zweryfikować konfigurację i powtórzyć pomiar.

Po akwizycji funkcjonalnej wykonaj anatomiczną sekwencję 3D T2-zależną w tej samej orientacji co poprzednie skany fMRI. Następnie uzupełnij te dane zerami (zero-fill) do wymiarów 256 x 256 x 256.

Na koniec należy zdjąć zebrę z łoża MRI i pozwolić jej dojść do siebie po anestezji w klatce pod lampą grzewczą. Zazwyczaj powrót zebry do świadomości po anestezji izofluranem trwa mniej niż pięć minut. Już po kilku minutach ptak spróbuje wstać, a po pełnym wybudzeniu usiądzie na żerdzi zamiast na dnie klatki, co będzie sygnałem do rozpoczęcia przetwarzania danych.

W pierwszej kolejności należy przekonwertować dane MR na format analyze lub nifty. Następnie, przed rozpoczęciem przetwarzania danych w programie SPM, konieczne jest dostosowanie danych fMRI z ptaków śpiewających poprzez pomnożenie rozmiaru woksela przez 10. Ponieważ oprogramowanie do analizy fMRI zostało opracowane z myślą o przetwarzaniu danych fMRI pozyskiwanych od ludzi, najprostszym sposobem postępowania jest sztuczne zwiększenie rozmiaru woksela w danych fMRI ptaków przy użyciu oprogramowania MRI Crow.

Należy zauważyć, że ta korekta nie wpływa na same dane. Nie stosuje się ponownego próbkowania ani żadnych innych modyfikacji danych. Następnie pozyskane dane są poddawane wstępnemu przetwarzaniu.

Używając programu SPM8, najpierw należy przeprowadzić ponowną synchronizację danych fMRI oraz korejestrację anatomicznego zbioru danych 3D z szeregiem czasowym fMRI. Następnie należy znormalizować dane 3D oraz skorejestrowany szereg czasowy fMRI do atlasu mózgu zebry fincz (zebra finch brain MRI Atlas).

Zastosuj macierz transformacji do zbioru danych fMRI i wygładź dane za pomocą jądra Gaussa o rozmiarze 0,5 millimeter. Następnie przeprowadź statystyczną analizę opartą na wokselach w programie SPM eight, najpierw na poziomie poszczególnych ptaków, a następnie w analizie na poziomie grupy. Na koniec, aby zwizualizować wyniki i zlokalizować aktywacje funkcjonalne, nałóż statystyczną mapę parametryczną na atlas zebra finch, wysokorozdzielczy trójwymiarowy atlas mózgu zebra finch; współrzędne stereotaktyczne wykorzystane w opisanym procesie analizy wyników fMRI zebra finch zostały opracowane na potrzeby tego eksperymentu w Bioimaging lab w ramach zbioru danych MRI Atlas.

Kontury mózgu oraz kontury jąder są swobodnie dostępne za pośrednictwem widocznej tutaj strony internetowej. Przedstawiono tutaj widok boczny trójwymiarowej reprezentacji lewej półkuli z naniesionymi strukturami z atlasu, rzutowanymi na jej przekrój środkowy strzałkowy. Widoczny jest tutaj przykład odpowiedzi BOLD w fMRI w obrębie pola L pierwotnego obszaru słuchowego oraz sąsiednich wtórnych obszarów słuchowych, wywołanych przez różne bodźce słuchowe w porównaniu ze stanem spoczynkowym.

Wartości T są zakodowane kolorystycznie zgodnie ze skalą przedstawioną na rysunku; wyświetlone zostały tylko te voxele, w których test T okazał się istotny. Jest to kolejny przykład eksperymentu fMRI przeprowadzonego u kanarków zebra. Obrazy pokazują selektywne odpowiedzi na własną pieśń ptaka w obszarach mózgu XMLD i HVC.

Liczby pod obrazami wskazują współrzędne w milimetrach od linii środkowej. Znak dodatni oznacza, że przekroje i wyniki statystyczne pochodzą z prawej półkuli. Protokół opisany w tym filmie można łatwo dostosować do zastosowań u innych ptaków śpiewających, takich jak szpaki.

To jest przykład wyników takiego eksperymentu fMRI. Na rysunku przedstawiono aktywacje wywołane bodźcami słuchowymi w porównaniu z okresem spoczynku u tego samego osobnika szpaka w różnych sezonach. Wdrożenie i optymalizacja funkcjonalnego rezonansu magnetycznego u ptaków śpiewających otwiera nowe możliwości badawcze w dziedzinie analizy tych ptaków.

Wykazano już, że jest to cenna technika w eksperymentalnej analizie złożonych procesów sensoryczno-motorycznych i poznawczych leżących u podstaw komunikacji wokalnej u tych modeli zwierzęcych. Ponadto, dzięki swojej nieinwazyjności i podejściu obejmującemu cały mózg, fMRI może być stosowane jako metoda uzupełniająca dla częściej wykonywanych metod lokalnych i inwazyjnych. Rosnąca liczba eksperymentów fMRI u ptaków z rzędu kolibrów (SUNBIRDS) dowodzi możliwości zastosowania tej metody w badaniach nad procesami poznawczymi; przyszłe wysiłki powinny być skierowane na dalsze rozszerzenie eksperymentów MRI poza przetwarzanie słuchowe, które jest procesem pozostającym aktywnym w warunkach znieczulenia, poprzez wykorzystanie budzących się obiektów przyzwyczajonych do protokołu obrazowania.

Może to otworzyć nowe możliwości badawcze, w których ptaki będą mogły aktywnie uczestniczyć w eksperymentach EMI, a ich uwaga będzie mogła być kontrolowana eksperymentalnie.