Synergistyczny efekt światła widzialnego i gentamycyny w odniesieniu do mikroorganizmów Pseudomona aeruginosa

Ogólnym celem poniższej procedury jest eksperymentalna walidacja zwiększenia skuteczności gentamycyny pod wpływem światła widzialnego w odniesieniu do Pseudomonas aerogen w roztworze. Zostanie to osiągnięte poprzez najpierw wyhodowanie eksperymentalnej kultury bakteryjnej. W drugim kroku bakterie zostaną poddane naświetlaniu w obecności lub przy braku zastosowania antybiotyku.

Na koniec próbki są pobierane z hodowli w ciągu 24 godzin, a następnie określa się liczbę jednostek tworzących kolonie w hodowli komórkowej dla każdego punktu czasowego. W końcowym etapie można ocenić wpływ oświetlenia na podatność bakterii na eliminację poprzez leczenie antybiotykowe. Zastosowanie tej techniki ma znaczenie dla terapii infekcji in vivo, ponieważ oświetlenie zwiększa skuteczność leczenia antybiotykami.

Procedurę zaprezentuje Anna Resnick, studentka studiów magisterskich w moim laboratorium. Należy rozpocząć od wyhodowania odpowiedniej kultury bakteryjnej w odpowiedniej pożywce wzrostowej. W tym przypadku szczep gram-ujemny P. aerogen, PAO1, jest hodowany w bulionie Luria w temperaturze 37 °C przez 13 godzin.

Następnie odwiruj komórki przez pięć minut przy około 3 145 G w temperaturze pokojowej. Po tym usuń znad powierzchni i resuspenduj bakterie w 10% pożywce Lauria, a następnie inkubuj komórki przez kolejne dwie godziny w pożywce Lauria w temperaturze 37 °C, aby kultura ponownie weszła w fazę stacjonarną. Następnie podziel zawiesinę bakteryjną na dwie grupy, dodając gentamycynę do jednej z nich.

Następnie umieść każdą z kultur na mieszadłach magnetycznych i włącz je. Dalej, rozdziel wiązkę laserową z lasera nd:YAG w trybie ciągłym lub alternatywnie z impulsowego lasera nd:YAG z przełącznikiem Q na dwie ścieżki optyczne, aby naświetlać kultury po rozpoczęciu iluminacji. Zacznij pobierać próbki o objętości 20 µL z grupy kontrolnej i grupy traktowanej antybiotykiem mniej więcej co dwie godziny przez okres 24 godzin.

Następnego dnia wykonaj rozcieńczenia seryjne uzyskanych próbek. Na przykład w tym doświadczeniu bakterie rozcieńczono ośmiokrotnie w stosunku 1:10, stosując objętość inokulacji 200 µL. Następnie wysiej rozcieńczenie na płytki z agarem w pożywce Luria oraz inkubuj próbki przez noc w temperaturze 37 °C.

Wyznaczyć liczbę jednostek tworzących kolonie (CFU) na płytce dla każdej próby, a następnie obliczyć logarytmiczną redukcję CFU zgodnie z przedstawionym schematem. Należy przyjąć, że y oznacza wartości CFU dla każdego punktu czasowego dokładnie w momencie pomiaru. CFU oznacza jednostkę tworzącą kolonię, a C oznacza liczbę CFU stwierdzoną w próbie kontrolnej w czasie początkowym.

Ponadto jednostki CFU na mililitr są równe liczbie kolonii pomnożonej przez czynnik rozcieńczenia i podzielonej przez objętość inokulum. Tutaj przedstawiono schematyczne ujęcie układu opartego na laserze, w którym laser NDA w trybie ciągłym lub laser z przełącznikiem Q jest dzielony na dwie ścieżki za pomocą optycznego dzielnika wiązki 50:50. Obie próbki są umieszczone na mieszadle.

Na obrazie przedstawiono układ eksperymentalny, w którym wiązka lasera jest dzielona pomiędzy dwie probówki, aby poddać obie próbki identycznym warunkom. Jedna z kultur jest traktowana antybiotykami, natomiast druga, stanowiąca grupę kontrolną, nie jest poddawana tej procedurze. Następnie bakterie są naświetlane laserami przez 24 godziny.

Wykres ten przedstawia efektywność naświetlania wpływającego na wzrost p aerogen przy użyciu odpowiednio lasera w trybie ciągłym lub lasera z przełącznikiem Q, w obecności lub w przypadku braku leczenia antybiotykami w próbkach kontrolnych niepoddanych działaniu światła. Nie odnotowano spadku żywotności komórek, niezależnie od tego, czy hodowle otrzymały antybiotyki, co sugeruje, że bakterie są oporne na gentamycynę; samo leczenie laserem również nie wpłynęło na wzrost komórek. Jednakże w hodowlach traktowanych jednocześnie laserem i antybiotykiem żywotność bakterii została zredukowana o kilka rzędów wielkości.

Najbardziej wyraźny efekt odnotowano po 24 godzinach, kiedy zastosowanie lasera w trybie ciągłym lub impulsowym (Q-switch) zredukowało żywotność komórek bakteryjnych o osiem rzędów wielkości w porównaniu z grupami kontrolnymi poddanymi wyłącznie działaniu antybiotyku lub samego światła. Dane te sugerują rozwiązanie w zakresie leczenia bakterii opornych na antybiotyki. Zatem kropki na tej rycinie reprezentują punkty rozproszenia światła, ułatwiające podwójną aplikację rozproszonego naświetlania laserowego i leczenia antybiotykiem poprzez cewnik wprowadzony do tkanki zainfekowanej bakteriami.

Ta końcowa figura widma absorpcyjnego wokół 532 wyraźnie pokazuje, że zarówno szczep bakteryjny p aerogen, jak i antybiotyk gentamycyna są przezroczyste przy tej długości fali, co czyni tę długość fali odpowiednim wyborem dla terapii skojarzonej. Przedstawiona technika utorowała drogę badaczom z zakresu mikrobiologii i medycyny do zbadania skuteczności tej metody, również w odniesieniu do biofilmów i układów narządowych. Należy pamiętać, że praca z mikroorganizmami pseudomona orgen może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy stosować odpowiednią technikę sterylną oraz sterylizowane środowisko i sprzęt.