Name: Synergistyczne działanie światła widzialnego i gentamycyny na mikroorganizmy Pseudomona aeruginosa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: Odkryj synergiczne działanie światła widzialnego i gentamycyny przeciwko Pseudomonas aeruginosa. Ta metoda fototerapii znacząco zwiększa skuteczność antybiotyku, oferując nowe podejście do leczenia zakażeń opornych bakterii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Hodowla bakterii
<ol>
	<li>Gram-ujemny szczep P. aeruginosa PAO1 hodowano w bulionie Luria (LB) w temperaturze 37 °C przez 18 hr.</li>
	<li>Kulturę komórek odwirowano następnie przy 7,500 rpm (obrotów na minutę) przez 5 min, a supernatant usunięto.</li>
	<li>Bakterie zawieszono ponownie w 10% LB i inkubowano przez kolejne 2 hr, aby kultura ponownie weszła w fazę stacjonarną.</li>
	<li>Zawiesinę bakterii podzielono następnie na dwie grupy: do pierwszej grupy (2 probówki) nie dodawano antybiotyku, natomiast do drugiej grupy dodano antybiotyk gentamycynę (50 μg/ml).</li>
</ol>
2. Oznaczanie jednostek tworzących kolonie (CFU)
<ol>
	<li>W celu określenia żywotności komórek pobierano próbki o objętości 20 μl z eksperymentu mniej więcej co 2 hr w ciągu 24 hr. Próbki poddano rozcieńczeniom seryjnym, a następnie wysiano na płytki z agarem LB i inkubowano przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dla każdej grupy traktowania określono liczbę CFU na płytce i dokonano porównania między poszczególnymi przedziałami czasowymi i różnymi sposobami traktowania. Logarytmiczną redukcję CFU obliczono zgodnie z równaniem (1): 
	Log reduction= LogU-LogC[CFU/ml] 
	Gdzie U to wartość jednostek tworzących kolonie w każdym punkcie czasowym; CFU to jednostka tworząca kolonię, a jednostki CFU/ml są równe: 
	CFU/ml = ( liczba kolonii x współczynnik rozcieńczenia )/( objętość inokulatu ) 
	Natomiast C to liczba CFU stwierdzona w próbce kontrolnej w czasie początkowym. Należy zauważyć, że U oznacza współczynnik tworzenia kolonii w momencie pomiaru.</li>
	<li>Współczynnik rozcieńczenia to liczba rozcieńczeń, w których w każdym z nich stężenie bakterii zostało zredukowane dziesięciokrotnie. Objętość inokulatu wynosiła zawsze 200 µL i jest ona powiązana z rozmiarem użytej probówki.</li>
</ol>
Podsumowując kwestię stężeń, antybiotyk gentamycyna zastosowano w stężeniu 50 μg/ml. W odniesieniu do bakterii, do końca procesu wykonano łącznie 8 rozcieńczeń. Każde rozcieńczenie było dziesięciokrotne i przeprowadzano je w probówkach o objętości 200 μl. Punktem wyjścia było dodanie 20 μl próbek do probówki 200 μl (zatem stężenie początkowe wynosiło 20/200C0=0.1C0, gdzie C0 oznacza stężenie początkowe w 20 μl próbek), a stężenie końcowe zostało zredukowane o 8 rzędów wielkości w wyniku 8 rozcieńczeń.
3. Oświetlenie
<ol>
	<li>Laser CW Nd:YAG (długość fali 532 nm i średnia moc optyczna 200 mW) został rozdzielony na dwie ścieżki optyczne za pomocą optycznego dzielnika wiązki 50%/50%. Średnica wiązki wynosiła około 10 mm. Czas naświetlania wynosił 24 hr.</li>
	<li>Impulsowy laser Nd:YAG z przełącznikiem Q (długość fali 532 nm, średnia moc 300 mW i szczytowa moc optyczna 2,5 MW) został również rozdzielony na dwie ścieżki za pomocą optycznego dzielnika wiązki 50%/50%. Średnica plamki wynosiła 6 mm. Szerokość impulsu lasera z przełącznikiem Q wynosiła 6 nsec, a częstotliwość repetycji 15Hz. Średnia gęstość mocy wynosiła 106 mW/cm2, a szczytowa gęstość mocy 8,83 kW/mm2. Czas naświetlania wynosił 24 hr.</li>
</ol>
Należy zauważyć, że zawiesina bakteryjna była mieszana podczas napromieniowania i utrzymywana w odpowiednich warunkach hodowlanych zapewniających wzrost bakterii (we wszystkich probówkach znajdowało się podłoże Luria Broth, aby umożliwić wzrost bakterii).

<ol><li>Feuerstein, O., Persman, N., Weiss, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototoxic+Effect+of+Visible+Light+on+Porphyromonas+gingivalis+and+Fusobacterium+nucleatum%3A+An+In+Vitro+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">Phototoxic Effect of Visible Light on Porphyromonas gingivalis and Fusobacterium nucleatum: An In Vitro Study.</a> Photochemistry and Photobiology. 80, 412-415 (2004).</li>
<li>Enwemeka, C. S., Williams, D., Enwemeka, S. K., Hollosi, S., Yens, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+470-nm+light+kills+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+%28MRSA%29+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Photomed.+Laser+Surg%22%5BJournal%5D)">Blue 470-nm light kills methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in vitro.</a> Photomed. Laser Surg. 27, 221-226 (2009).</li>
<li>Guffey, J. S., Wilborn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+bactericidal+effects+of+405-nm+and+470-nm%5BTitle%5D)+AND+%22Photomed.+Laser+Surg%22%5BJournal%5D)">In vitro bactericidal effects of 405-nm and 470-nm.</a> Photomed. Laser Surg. 24, 684-688 (2006).</li>
<li>Lipovsky, A., Nitzan, Y., Friedman, H., Lubart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+of+Staphylococcus+aureus+strains+to+broadband+visible+light%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Sensitivity of Staphylococcus aureus strains to broadband visible light.</a> Photochem. Photobiol. 85, 255-260 (2008).</li>
<li>Lipovsky, A., Nitzan, Y., Lubart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+possible+Mechanism+for+visible+light+induced+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Surgery+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">A possible Mechanism for visible light induced wound healing.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 40, 509-514 (2008).</li>
<li>Lipovsky, A., Nitzan, Y., Gedanken, A., Lubart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visible+light-induced+killing+of+bacteria+as+a+function+of+wavelength%3A+Implication+for+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Surgery+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Visible light-induced killing of bacteria as a function of wavelength: Implication for wound healing.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 42, 467-472 (2010).</li>
<li>Feuerstein, O., Ginsburg, I., Dayan, E., Veler, D., Weiss, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Visible+Light+Phototoxicity+on+Porphyromonas+gingiwalis+and+Fusobacferium+nucleaturn%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Visible Light Phototoxicity on Porphyromonas gingiwalis and Fusobacferium nucleaturn.</a> Photochemistry and Photobiology. 81, 1186-1189 (2005).</li>
<li>Nussbaum, E. L., Lilge, L., Mazzulli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+630-%2C+660-%2C+810-%2C+and+905-nm+laser+irradiation+delivering+radiant+exposure+of+1-50+J%2Fcm2+on+three+species+of+bacteria+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Laser+Med.+Surg%22%5BJournal%5D)">Effects of 630-, 660-, 810-, and 905-nm laser irradiation delivering radiant exposure of 1-50 J/cm2 on three species of bacteria in vitro.</a> J. Clin. Laser Med. Surg. 20, 325-333 (2002).</li>
<li>Dadras, S., Mohajerani, E., Eftekhar, F., Hosseini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+Photoresponses+of+Staphylococcus+aureus+and+Pseudomonas+aeruginosa+to+514%2C+532%2C+and+633+nm+Low+Level+Lasers+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Different Photoresponses of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa to 514, 532, and 633 nm Low Level Lasers In Vitro.</a> Current Microbiology. 53, 282-286 (2006).</li>
<li>Stover, C. K., Pham, X. Q., Erwin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+genome+sequence+of+Pseudomonas+aeruginosa+PAO1%2C+an+opportunistic+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAO1, an opportunistic pathogen.</a> Nature. 406, 952-964 (2000).</li>
<li>Hamblin, M. R., Demidova, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+low+level+light+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+SPIE%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of low level light therapy.</a> Proc. SPIE. 6140, 1-12 (2006).</li>
<li>Krespi, Y. P., Stoodley, P., Hall-Stoodley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+disruption+of+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Laser disruption of biofilm.</a> Laryngoscope. 118, 1168-1173 (2008).</li>
<li>Reznick, Y., Banin, E., Lipovsky, A., Lubart, R., Zalevsky, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+laser+light+enhancement+of+susceptibility+of+bacteria+to+gentamycin+antibiotic%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Commun%22%5BJournal%5D)">Direct laser light enhancement of susceptibility of bacteria to gentamycin antibiotic.</a> Opt. Commun. 284, 5501-5507 (2011).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Fototerapia w ostatnich latach stała się obszarem zaawansowanych badań multidyscyplinarnych, wyłaniając się jako obiecujące podejście w leczeniu licznych chorób. W tym kontekście szeroko badano wykorzystanie światła w zakresie widzialnym. Przykładowo stwierdzono, że zakażone rany można leczyć skuteczniej, poddając je działaniu intensywnego światła widzialnego w celu sterylizacji. Udowodniono, że mechanizm działania tej metody polega na indukowaniu przez światło reaktywnych form tlenu (ROS), które zabijają bakterie11...

<table><tbody><tr><td>Pożywka Lauria</td><td>Difco</td><td>241420</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Sigma</td><td>G1914</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Difco</td><td>231710</td><td></td></tr></tbody></table>

synergistyczny efekt światła widzialnego i gentamycyny w odniesieniu do mikroorganizmów pseudomona aeruginosa

The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms

W ostatnim czasie ukazało się kilka publikacji na temat bakteriobójczego działania światła widzialnego, z których większość stwierdza, że za zabijanie różnych patogenów odpowiedzialna jest niebieska część widma (400 nm-500 nm)1-5. Zasugerowano, że fototoksyczny efekt niebieskiego światła jest wynikiem indukowanego światłem tworzenia się reaktywnych form tlenu (ROS) przez endogenne bakteryjne fotosensybilizatory, które absorbują światło głównie w obszarze niebieskim4,6,7. Istnieją również doniesienia o działaniu biobójczym światła czerwonego i bliskiej podczerwieni8, a także światła zielonego9.
W niniejszym badaniu opracowaliśmy metodę, która pozwoliła nam scharakteryzować wpływ wysokoenergetycznego zielonego światła (długość fali 532 nm) w trybie ciągłym (CW) oraz impulsowym z przełącznikiem Q (Q-S) na Pseudomonas aeruginosa. Wykorzystując tę metodę, zbadaliśmy również wpływ zielonego światła w połączeniu z leczeniem antybiotykiem (gentamycyną) na żywotność bakterii. P. aeruginosa jest powszechnym nosokomialnym patogenem oportunistycznym wywołującym różne choroby. Szczep ten jest dość odporny na wiele antybiotyków i zawiera wiele przewidywanych systemów effluxu wielolekowego RND typu AcrB/Mex10.
W zastosowanej metodzie wykorzystano wolno żyjące bakterie Gram-ujemne w fazie stacjonarnej (P. aeruginosa szczep PAO1), hodowane w pożywce Luria Broth (LB) i poddane działaniu laserów z przełącznikiem Q i/lub laserów CW, z dodatkiem lub bez dodatku antybiotyku gentamycyny. Żywotność komórek określano w różnych punktach czasowych. Uzyskane wyniki wykazały, że sama terapia laserowa nie obniżyła żywotności komórek w porównaniu z nieleczoną grupą kontrolną, a sama terapia gentamycyną spowodowała jedynie 0,5 log redukcji liczby żywych komórek P. aeruginosa. Jednakże połączone zastosowanie lasera i gentamycyny wywołało efekt synergistyczny, a żywotność P. aeruginosa została zredukowana o 8 log.
Zaproponowaną metodę można dodatkowo wdrożyć poprzez opracowanie urządzenia typu cewnik, zdolnego do wstrzykiwania roztworu antybiotyku do zainfekowanego narządu przy jednoczesnym naświetlaniu tego obszaru.

Układ oparty na laserze przedstawiono schematycznie na Rysunku 1. W pierwszym wariancie eksperymentalnym wykorzystano laser Nd:YAG w trybie ciągłym (CW) o długości fali 532 nm (druga harmoniczna Nd:YAG) i średniej mocy optycznej 200 mW. Wiązka ta została rozdzielona na dwie ścieżki optyczne za pomocą dzielnika wiązki 50%/50%, tak aby każda z rozdzielonych wiązek miała moc 100 mW. Średnica wiązki wynosiła około 10 mm, zatem gęstość mocy wynosiła około 100 mW/cm2. Czas ekspozycji wynosił 24 hr. ...

Wykazujemy, że opracowane urządzenie biomedyczne wykorzystujące ciągłe lub impulsowe leczenie laserem światła widzialnego w połączeniu z antybiotykoterapią (gentamycyną) wywołuje statystycznie istotny efekt synergistyczny, prowadzący do zmniejszenia żywotności P. aeruginosa PAO1 o 8 log w porównaniu z samą antybiotykoterapią.

Synergistyczny efekt światła widzialnego i gentamycyny w odniesieniu do mikroorganizmów Pseudomona aeruginosa

W ostatnim czasie ukazało się kilka publikacji na temat bakteriobójczego działania światła widzialnego, z których większość stwierdza, że niebieska część widma (400 nm–500...

Ogólnym celem poniższej procedury jest eksperymentalna walidacja zwiększenia skuteczności gentamycyny pod wpływem światła widzialnego w odniesieniu do Pseudomonas aerogen w roztworze. Zostanie to osiągnięte poprzez najpierw wyhodowanie eksperymentalnej kultury bakteryjnej. W drugim kroku bakterie zostaną poddane naświetlaniu w obecności lub przy braku zastosowania antybiotyku.Na koniec próbki są pobierane z hodowli w ciągu 24 godzin, a następnie określa się liczbę jednostek tworzących kolonie w hodowli komórkowej dla każdego punktu czasowego. W końcowym etapie można ocenić wpływ oświetlenia na podatność bakterii na eliminację poprzez leczenie antybiotykowe. Zastosowanie tej techniki ma znaczenie dla terapii infekcji in vivo, ponieważ oświetlenie zwiększa skuteczność leczenia antybiotykami.Procedurę zaprezentuje Anna Resnick, studentka studiów magisterskich w moim laboratorium. Należy rozpocząć od wyhodowania odpowiedniej kultury bakteryjnej w odpowiedniej pożywce wzrostowej. W tym przypadku szczep gram-ujemny P. aerogen, PAO1, jest hodowany w bulionie Luria w temperaturze 37 °C przez 13 godzin.Następnie odwiruj komórki przez pięć minut przy około 3 145 G w temperaturze pokojowej. P

the-synergistic-effect-visible-light-gentamycin-on-pseudomona

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Synergistyczny wpływ światła widocznego i gentamicyny na mikroorganizmy Pseudomona aeruginosa

Infekcje wywołane przez wielolekooporne (MDR) szczepy bakteryjne stały się poważnym zagrożeniem dla zdrowia publicznego, co spowodowało konieczność opracowania alternatywnych metod leczenia. Przedstawiamy protokół oceny skuteczności terapii przeciwdrobnoustrojowym światłem niebieskim (aBL) w zakażeniach MDR Acinetobacter baumannii w oparzeniach myszy za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego.

In vivo (in vivo) Badanie przeciwdrobnoustrojowej terapii światłem niebieskim w wielolekoopornych zakażeniach oparzeniami Acinetobacter baumannii przy użyciu obrazowania bioluminescencyjnego

Testy synergii przeciwdrobnoustrojowej są używane do oceny efektu dwóch lub więcej antybiotyków stosowanych w połączeniu i zazwyczaj są wykonywane za pomocą jednej z dwóch metod: szachownicy lub testu zabijania czasu. W tym miejscu przedstawiamy zautomatyzowaną, wspomaganą drukarką atramentową technikę synergii tablicy szachownicowej oraz klasyczne badanie synergii zabijania czasu.

Testowanie synergii przeciwdrobnoustrojowej za pomocą zautomatyzowanej tablicy szachownicy wspomaganej drukarką atramentową i ręcznej metody zabijania czasu

Ten protokół przedstawia szybki test wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe (AST) w ciągu 2,5 godziny poprzez stymulowane pojedynczymi komórkami obrazowanie metabolizmu D2O. Metoda ta ma zastosowanie do bakterii w moczu lub środowisku krwi pełnej, które są transformujące dla szybkiego jednokomórkowego fenotypowego AspAT w klinice.

Szybkie badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe za pomocą obrazowania stymulowanego rozpraszania Ramana indukcji deuteru w pojedynczej bakterii

Tutaj prezentujemy protokół inaktywacji bakterii chorobotwórczych za pomocą reaktywnych form tlenu wytwarzanych podczas fotolizy mononukleotydu flawinowego (FMN) pod wpływem światła niebieskiego i fioletowego o niskiej intensywności. Wykazano, że fotoliza FMN jest prostą i bezpieczną metodą w procesach sanitarnych.

Inaktywacja patogenów poprzez fotolizę ryboflawino-5′-fosforanu ryboflawiny w świetle widzialnym

Znaczenie małych kolonii w lekooporności Candida spp. nie zostało w pełni zbadane. Przeciwdrobnoustrojowa terapia fotodynamiczna (aPDT) stanowi obiecującą strategię walki z lekoopornymi infekcjami grzybiczymi. Badanie to pokazuje, że aPDT za pośrednictwem róży bengalskiej skutecznie dezaktywuje Candida glabrata i indukuje drobne kolonie, prezentując unikalną procedurę.

Indukcja drobnych kolonii w Candida glabrate za pomocą terapii fotodynamicznej za pośrednictwem Rose Bengal

Ta metodologia pozwala na stworzenie modelu wielomikrobiologicznego biofilmu w mukowiscydozie do testowania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe w laboratoriach badawczych i klinicznych. Model ten zapewnia dokładne i wiarygodne wyniki w szerokim zakresie danych wyjściowych.

Opracowanie wielomikrobiologicznego modelu biofilmu kolonijnego do badania środków przeciwdrobnoustrojowych w mukowiscydozie

Ten protokół opisuje prostą i ekonomiczną metodę oceny skuteczności potencjalnych fotosensybilizatorów w antybakteryjnej inaktywacji fotodynamicznej (aPDI), przy użyciu formatu 96-dołkowej płytki w połączeniu ze źródłem światła na panelu LED. Takie podejście umożliwia jednoczesne testowanie wielu warunków eksperymentalnych, w tym różnych stężeń, związków i szczepów bakterii.

Badania przesiewowe in vitro oparte na diodach LED do oceny fotoaktywowanych cząsteczek w inaktywacji fotodynamicznej bakterii

Urządzenie LED z niebieskim światłem o średnicy 405 nm wykazuje skuteczność antybakteryjną przeciwko szerokiemu zakresowi patogenów ran podczas oceny na syntetycznym modelu skóry opartym na kolagenie. To uproszczone podejście in vitro oferuje powtarzalną i etycznie wykonalną alternatywę dla wczesnej fazy oceny terapii przeciwdrobnoustrojowych opartych na świetle.

Badanie urządzenia LED z niebieskim światłem w celu tłumienia patogenów ran z wykorzystaniem syntetycznego modelu skóry na bazie kolagenu

Protokół ten zapewnia systematyczne ramy do oceny, w jaki sposób fitochemikalia mogą wzmacniać bakteriobójcze efekty tradycyjnych biocydów, wykorzystując modelowanie aktywności bakteriobójczej oraz testy interakcji kombinatorycznych, które mają na celu identyfikację synergicznych mieszanin poprawiających kontrolę mikroorganizmów i ograniczających ogólne zużycie biocydów.

In vitro Ocena wzmacniających efektów cząsteczek pochodzenia roślinnego na konwencjonalne biocydy

Niniejsza praca opisuje różne metody hodowli biofilmu Pseudomonas aeruginosa na hodowlach ludzkich komórkach nabłonkowych dróg oddechowych. Protokoły te można dostosować do badania różnych aspektów tworzenia biofilmu, w tym wizualizacji biofilmu, barwienia biofilmu, pomiaru jednostek tworzących kolonie (CFU) w biofilmie oraz badania cytotoksyczności biofilmu.

Modele kokultury biofilmów Pseudomonas aeruginosa hodowanych na żywych komórkach dróg oddechowych człowieka

Odkryj synergiczne działanie światła widzialnego i gentamycyny przeciwko Pseudomonas aeruginosa. Ta metoda fototerapii znacząco zwiększa skuteczność antybiotyku, oferując nowe podejście do leczenia zakażeń opornych bakterii.

Synergistyczny efekt światła widzialnego i gentamycyny w odniesieniu do mikroorganizmów Pseudomona aeruginosa

Przeglądaj więcej filmów