Sekcja, hodowla i analiza embrionalnej tkanki siatkówki Xenopus laevis

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie pierwotnej hodowli komórek siatkówki zwierzęcia z rodzaju Xenopus. Cel ten osiąga się poprzez najpierw usunięcie tkanek otaczających w celu odsłonięcia siatkówki. Drugim krokiem jest wycięcie tkanki siatkówki.

Następnie tkanka siatkówki zostaje poddana dysocjacji do pojedynczych komórek. Ostatnim krokiem jest wysianie komórek siatkówki na płytkę UnCloned i dodanie flu oh 4:00 AM w celu obrazowania wapnia. Ostatecznie wykorzystuje się mikroskopię konfokalną do wykrycia aktywności wapniowej w hodowli komórek siatkówki.

Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinach biologii rozwoju, neurobiologii i biologii komórki, takie jak rola wapnia i aktywności elektrycznej w rozwoju siatkówki, a także ekspresja genów na poziomie pojedynczych komórek. Zazwyczaj osoby po raz pierwszy wykonujące tę procedurę będą miały z nią trudności, ponieważ do szybkiego i dokładnego przeprowadzenia sekcji niezbędna jest precyzyjna motoryka mała. Demonstracja wizualna tej metody jest krytyczna, gdyż kroki sekcji są trudne i wymagają złożonej koordynacji wzrokowo-ruchowej.

Aby rozpocząć tę procedurę wewnątrz komory z laminarnym przepływem powietrza, należy przygotować i opisać następujące elementy: jedną plastikową płytkę Petriego o średnicy 60 milimetrów zawierającą 10 mililitrów pożywki do hodowli komórek, która będzie służyć jako płytka do sekcji. Opcjonalnie, do płytki do sekcji można dodać 10 miligramów kolagenazy B, aby uzyskać stężenie końcowe 1,0 miligrama na mililitr, co ułatwia rozdzielanie warstw tkanki podczas sekcji embrionów w stadium 25 lub wcześniejszych.

Należy również przygotować jedną płytkę do hodowli o średnicy 35 mm zawierającą 2 ml pożywki do hodowli komórkowej. Przygotować także jedną pustą probówkę do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml, która posłuży jako probówka do dysocjacji eksplantu, oraz jedną stożkową probówkę Falcon o pojemności 15 ml zawierającą 15 ml.

Pożywka do hodowli komórkowej. Następnie przygotować dwie plastikowe szalki Petriego o średnicy 35 mm zawierające po 2 ml CMF do sekcji: jedną do wykorzystania jako płytkę do dysocjacji eksplantu, a drugą jako płytkę do płukania eksplantu poza komorą z laminarnym przepływem powietrza. Przygotować dwie plastikowe szalki Petriego o średnicy 60 mm zawierające 10 ml.

0,1 XMMR, jedna do wykorzystania jako płytka podtrzymująca, druga jako płytka towarzysząca, oraz jedna dodatkowa plastikowa szalka Petriego o średnicy 60 milimetrów zawierająca 10 mililitrów 0,1 XMMR oraz 0,5 mg/ml MS 2 22. Następnie do płytki z dysocjacją eksplantów dodać 40 µl 5% trypsyny w CMF.

Wymieszać przez delikatne obracanie naczynka, a następnie odstawić. Następnie przeprowadzić sekcję pod stereomikroskopem, używając dwóch par precyzyjnych pęset. Wykonać cięcie pośrodkowe w płaszczyźnie strzałkowej na stronie brzusznej embrionu, zaczynając od końca tylnego i kontynuując przez gruczoł cementowy w części przedniej embrionu.

Ostrożnie otwórz zarodek, rozszerzając obie strony nacięcia. W ten sposób grzbietowa strona zarodka będzie skierowana w stronę płytki sekcyjnej. Następnie otwórz brzuszny ektoderm, aby odsłonić endoderm i mezoderm.

Następnie usuń endodermę i mezodermę – pierwszą i największą warstwę tej tkanki. Endoderma ma bardzo puszysty wygląd, składa się z dużych komórek i nie wykazuje wyraźnej organizacji. Po usunięciu tej warstwy widoczne staną się somity oraz Noor.

W celu uzyskania lepszego kontrastu przenieś embrion do oddzielnej plastikowej szalki Petriego o średnicy 60 milimetrów zawierającej 10 mililitrów pożywki hodowlanej oraz 100 mikrolitrów 1% roztworu siarczanu błękitu Nilu i inkubuj przez dwie do trzech minut. Następnie przenieś go z powrotem na płytkę sekcyjną. Zabieg ten zabarwi ektodermę, somity oraz Noor, co ułatwi ich identyfikację i orientację.

Koncentrując się na przedniej części embrionu, ostrożnie usuń ną i pozostałą mezodermę, aby odsłonić mózg oraz pęcherzyki optyczne. Po całkowitym odsłonięciu mózgu i pęcherzyków optycznych, użyj pęsety, aby przeciąć rurkę neuralną i leżącą pod nią ektodermę bezpośrednio za mózgiem. Obróć tę część tak, aby ektodermą było skierowane do góry.

Należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić znajdujących się pod spodem pęcherzyków optycznych, i ostrożnie usunąć ektodermę. Na koniec, w przypadku embrionu starszego niż stadium 25, oddziel pęcherzyki optyczne od mózgu za pomocą pęsety. W pierwszej kolejności usuń brzuszną część embrionu pęsetą na płytce do znieczulania.

Aby uzyskać lepszy kontrast, przenieś zarodek do plastikowej szalki Petriego o średnicy 60 mm zawierającej 10 ml 0,1 XMMR oraz 100 µl 1% Nile blue sulfate na dwie do trzech minut w celu zabarwienia ektodermy. Następnie przenieś go na płytkę sekcyjną. Następnie, trzymając zarodek w miejscu, ostrożnie usuń siatkówkę lub pęcherzyk optyczny znajdujący się bezpośrednio pod nakładającą się ektodermą.

Po wycięciu pęcherzyka optycznego lub siatkówki, należy go ostrożnie przenieść do płyty do płukania eksplantów X za pomocą mikropipety P 100 z końcówką odporną na aerozole. Należy uważać, aby eksplant nie zetknął się z żadną granicą faz powietrze-ciecz. Następnie należy pozostawić eksplant na 30 sekund.

Następnie przenieś 80 µL 0,1% trypsyny w CMF z płytki do dysocjacji preparatu do probówki do dysocjacji preparatu. Po tym przenieś siatkówkę lub pęcherzyk optyczny z płytki do płukania preparatu do probówki do dysocjacji preparatu, unikając przeniesienia roztworu do płukania preparatu.

Następnie pozostaw tkankę w probówce do dysocjacji eksplantatów na jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Jeśli w trakcie eksperymentu planowane jest wykonanie wielu obrazów komórek, przymocuj siatkę do spodu płytki hodowlanej za pomocą małych kropel superkleju. Pozwoli to na wykonanie obrazów tych samych komórek w tych samych orientacjach na różnych etapach procedury wysiewania komórek.

Najpierw powoli pobierz 40 µL roztworu z probówki do dysocjacji eksplantu i odrzuć go. Następnie, używając pipety P 100 z końcówką z filtrem przeciwaerozolowym, powoli przenieś komórki na płytkę hodowlaną. Podczas przenoszenia komórek na płytkę pipetuj powoli, umieszczając komórki na niewielkiej powierzchni w centrum płytki.

Na tej ilustracji przedstawiono przykład aktywności wapniowej pojedynczej komórki w ciągu godziny obrazowania. Ryciny te prezentują reprezentatywne wyniki eksperymentów obrazowania wapniowego w komórkach embrionalnej siatkówki, analizowane na różnych etapach rozwoju. W skrócie, wyniki wskazują, że poziom wapnia jest regulowany rozwojowo, z obecnością szczytów aktywności (spiking peaks) w stadium 35, co koreluje aktywność wapniową z komórkami wykazującymi pozytywny wynik dla specyficznej sondy.

W eksperymentach na rybach, mimo braku statystycznie istotnych różnic, zaobserwowano tendencję, według której komórki wykazujące pozytywny wynik dla markera GABAergicznego przejawiały wyższy poziom aktywności szpilek wapniowych niż komórki pozytywne dla markera glutamatergicznego lub dla kodującego gen PT F1 A.A, będącego czynnikiem transkrypcyjnym skorelowanym z promowaniem fenotypu GABAergicznego. Po opanowaniu techniki, jej wykonanie dla jednej płytki zajmuje około trzech godzin i 30 minut, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia procedury. Po zastosowaniu tej metody można wykorzystać inne techniki, takie jak hodowla komórkowa, hybrydyzacja C two lub rejestracje elektrofizjologiczne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, np. które komórki wykazują ekspresję specyficznych markerów fenotypowych, lub w celu analizy zapisów elektrofizjologicznych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić sekcję tkanki siatkówki, dysocjować tkankę siatkówki oraz wysiać komórki siatkówki na płytki.