Name: Sekcja, hodowla i analiza embrionalnej tkanki siatkówki Xenopus laevis (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Naucz się przygotowywać pierwotne kultury komórek siatkówki Xenopus laevis z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej do obrazowania aktywności wapniowej. Ta technika umożliwia badanie fizjologii komórek siatkówki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Uprzejmie dziękujemy dr Johnowi Hayesowi za scenariusze; doktorom Ericowi Bradleyowi i Christopherowi Del Negro za pomoc w mikroskopii konfokalnej; Drew Hughes, Laura Odorizzi, Alex Garafalo, Rebecca Lowden i Liz MacMurray za ich pracę nad rozwojem projektu i dostarczenie wstępnych danych; Dr. Gregowi Smithowi za pomocne sugestie dotyczące analizy statystycznej. Praca ta była wspierana przez grant NIH (NINDS IR15N5067566-01) dla MSS oraz grant na edukację naukową Instytutu Medycznego Howarda Hughesa dla College of William and Mary.

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Dzięki dobrze scharakteryzowanym typom komórek, które są konserwatywne u wszystkich kręgowców, siatkówka stanowi użyteczny model do badania procesów molekularno-komórkowych rządzących specyfikacją i różnicowaniem typów komórek. Pierwotna hodowla komórkowa stanowi potężną metodę badania szerokiego zakresu procesów, w tym ekspresji genów, dynamiki białek oraz aktywności wapniowej i elektrycznej na poziomie rozdzielczości pojedynczej komórki. W tym miejscu przedstawiamy prostą technikę pierwotnej hodowli komórek z wypreparo...

<table><tbody><tr><td colspan="4">Do sekcji i hodowli</td></tr><tr><td>BD Falcon Easy Grip Naczynia do hodowli tkankowych, 35 mm</td><td>Fisher</td><td>08-772A</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe polistyrenowe szalki Petriego, 60 x 15 mm</td><td>Fisher</td><td>0875713A</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Nunclon Surface Petri (z Airventem)</td><td>Fisher</td><td>12-565-91</td><td></td></tr><tr><td>Cienkie kleszcze Dumont (Dumostar #55)</td><td>Fisher</td><td>NC9341917</td><td></td></tr><tr><td>Cellattice Szkiełko nakrywkowe z tworzywa sztucznego w mikrokratki, 25 mm</td><td>Fisher</td><td>50-313-17</td><td></td></tr><tr><td>Sól metanosulfonianu etylu m-aminobenzoesanu (MS-222)</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>103106</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan gentamycyny</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>380-003-G025</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna Gibco (1:250) Proszek</td><td>Life Technologies</td><td>27250-018</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza B z Clostridium histolyticum</td><td>Roche</td><td>11088831001</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Niebieski siarczan Nilu (opcjonalnie)</td><td>Pfaltz Bauer</td><td>N05550</td><td></td></tr><tr><td>500 ml System filtrów próżniowych/butelek do przechowywania, 0,22 &mu; m Pore 33,2 cm2 Membrana CN</td><td>Corning</td><td>430758</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><silny>do obrazowania wapnia</td></tr><tr><td>Fluo-4 AM 1 mM Roztwór w DMSO, Cell Permanent</td><td>Life Technologies</td><td>F-14217</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 10% roztwór w Water </td><td>Life Technologies</td><td>P-6866</td><td></td></tr><tr><td>LSM 510 System mikroskopu konfokalnego </td><td>Model Zeiss</td><td> Wycofany</td><td></td></tr><tr><td>odczynnik blokujący</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Do fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH)</td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenin-POD, Fab Fragments</td><td>Roche</td><td>11207733910</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-DNP-HRP </td><td>Perkin-Elmer</td><td>NEL747A</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 NHS ester</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td>PA13101</tr><tr><td>NHS-Fluorescein </td><td>Thermo Scientific</td><td>46409</td><td></td></tr><tr><td>Formamid, Dejonizowany</td><td>Amresco</td><td>0606-950ML</td><td></td></tr><tr><td>Torula RNA, Typ IX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3629</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna Sól sodowa, z błony śluzowej jelit świń</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393-250KU</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3023</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 2. Konkretne odczynniki i sprzęt.</td></tr><tr><td colspan="4"><table border="1"> <tbody> <tr> <td>Solution</td> <td>Reference</td> <td>Contents</td> </tr> <tr> <td>Podłoże do hodowli komórkowych</td> <td>Chang i Spitzer , 200954</td> <td>116 mM NaCl 0,67 mM KCl 2 mM CaCl2 1,31 mM MgSO4 4,6 mM Tris 1 % (v:v) Penicylina/Streptomycyna Doprowadzić pH do 7,8 za pomocą HCl. Filtr sterylizować, przechodząc przez 0,22 &mu; m Filtr CN. Przechowywać w temperaturze 4 &deg;C.</td> </tr> <tr> <td>Podłoże wolne od wapnia i magnezu (CMF)</td> <td>Gu et al., 199442; Gu i Spitzer, 199555</td> <td>116 mM NaCl 0,67 mM KCl 4,6 mM Tris 0,4 mM EDTA 1 % (v:v) Penicylina/Streptomycyna Dostosuj pH do 7,8 za pomocą HCl. Filtruj sterylizować, przechodząc przez 0,22 &mu; m CN filter. Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza. </td> </tr> <tr> <td>Bufor kwasu maleinowego (MAB)</td> <td>Sive et al., 200053 </td> <td>100 mM kwas maleinowy 150 mM NaCl (pH 7,5).</td> </tr> <tr> <td>Marc's Modified Ringers (MMR), 10X</td> <td>Sive et al., 200053 </td> <td>100 mM NaCl mM KCl 1 mM MgSO4 2 mM CaCl2 5 mM HEPES pH dostosowane do 7,4 z NaOH 0,1X MMR zawiera również 50 mg/ml siarczanu gentamycyny, a pH dostosowuje się do 7,4 za pomocą roztworu NaOH.</td> </tr> <tr> <td>MEMFA, 10X</td> <td>Sive et al., 200053</td> <td>0,1 M MOPS (Ph 7,4) 2 mM EGTA 1 mM MgSO4 3,7% formaldehydu Roztwór 10X, bez formaldehydu, można przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Formaldehyd dodaje się świeży (1/10 objętości standardowego 37% bulionu). </td> </tr> <tr> <td>In situ Bufor hybrydyzacyjny</td> <td>Sive et al., 200053</td> <td>50% Formamid 5X SSC 1 mg/ml Torula RNA 100 mg/ml Heparyna 1X Roztwór Denharta 0,1% Tween 20 0,1% CHAPS 10 mM EDTA.</td> </tr> </tbody> </table> Solutions. *Gentamycyna, antybiotyk, jest stosowana w naszych roztworach MMR, podczas gdy penicylina i streptomycyna są stosowane w naszych pożywkach hodowlanych.</td></tr></tbody></table>

sekcja, hodowla i analiza embrionalnej tkanki siatkówki xenopus laevis

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Proces, w którym przedni obszar płytki nerwowej powoduje powstanie siatkówki kręgowców, nadal jest głównym przedmiotem zarówno badań klinicznych, jak i podstawowych. Oprócz oczywistego znaczenia medycznego dla zrozumienia i leczenia chorób siatkówki, rozwój siatkówki kręgowców nadal służy jako ważny i elegancki system modelowy do zrozumienia określania i różnicowania typów komórek neuronalnych1-16. Siatkówka nerwowa składa się z sześciu odrębnych typów komórek (ganglion, amakryna, poziome, fotoreceptory, komórki dwubiegunowe i komórki glejowe Müllera) ułożonych w stereotypowe warstwy, wzorzec, który jest w dużej mierze konserwatywny wśród wszystkich kręgowców 12,14-18.
Podczas gdy badanie siatkówki w nienaruszonym rozwijającym się zarodku jest wyraźnie potrzebne do zrozumienia, jak ten złożony organ rozwija się z wystającego foreliation przodomózgowia w warstwową strukturę, istnieje wiele pytań, które korzystają z zastosowania metod wykorzystujących pierwotną hodowlę komórek przypuszczalnych komórek siatkówki 7,19-23. Na przykład analiza komórek z tkanek usuniętych i zdysocjowanych na różnych etapach pozwala dostrzec stan specyfikacji poszczególnych komórek na różnych etapach rozwoju, czyli los komórek przy braku interakcji z sąsiednimi tkankami 8,19-22,24-33. Pierwotna hodowla komórkowa pozwala również badaczowi na potraktowanie kultury określonymi odczynnikami i przeanalizowanie wyników na poziomie pojedynczej komórki 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, klasyczny system modelowy do badania wczesnego rozwoju neuronalnego 19,27,29,31-32,40-42, służy jako szczególnie odpowiedni system do hodowli pierwotnych komórek siatkówki 10,38,43-45.
Przypuszczalna tkanka siatkówki jest dostępna od najwcześniejszych etapów rozwoju, bezpośrednio po indukcji neuronalnej 25,38,43. Ponadto, biorąc pod uwagę, że każda komórka w zarodku zawiera zapas żółtka, komórki siatkówki mogą być hodowane w bardzo prostym, zdefiniowanym pożywce składającej się z buforowanego roztworu soli, usuwając w ten sposób zakłócające efekty inkubacji lub innych produktów na bazie surowic 10,24,44-45.
Jednak izolacja tkanki siatkówki od otaczających tkanek i późniejsze przetwarzanie jest wyzwaniem. W tym miejscu przedstawiamy metodę preparacji i dysocjacji komórek siatkówki u Xenopus laevis, która zostanie wykorzystana do przygotowania pierwotnych kultur komórkowych, które z kolei będą analizowane pod kątem aktywności wapnia i ekspresji genów w rozdzielczości pojedynczych komórek. Chociaż tematem przedstawionym w tej pracy jest analiza spontanicznych stanów przejściowych wapnia, technika ta ma szerokie zastosowanie w szerokim zakresie pytań i podejść badawczych (ryc. 1).

Przykłady pomyślnie wypreparowanych pęcherzyków optycznych (stadium 25) i siatkówek (stadium 35) przedstawiono na rysunkach 2E i 2J. Choć niniejszy protokół można stosować na różnych etapach rozwoju, kluczowe jest uzyskanie wyłącznie tkanki siatkówki, aby zapewnić dokładność dalszych eksperymentów. Na każdym etapie należy ostrożnie usunąć naskórek i dopilnować, aby pęseta nie przebiła tkanki siatkówki. W stadium 35 lub późniejszych soczewka jest widoczna jako przezroczysta warstwa na powierzchni siatkówk...

Xenopus laevis dostarcza idealnego systemu modelowego do badania specyfikacji losu komórki i funkcji fizjologicznych poszczególnych komórek siatkówki w pierwotnej hodowli komórkowej. Tutaj przedstawiamy technikę preparowania tkanek siatkówki i generowania pierwotnych kultur komórkowych, które są obrazowane pod kątem aktywności wapnia i analizowane przez hybrydyzację in situ.

Sekcja, hodowla i analiza embrionalnej tkanki siatkówki Xenopus laevis

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie pierwotnej hodowli komórek siatkówki zwierzęcia z rodzaju Xenopus. Cel ten osiąga się poprzez najpierw usunięcie tkanek otaczających w celu odsłonięcia siatkówki. Drugim krokiem jest wycięcie tkanki siatkówki.Następnie tkanka siatkówki zostaje poddana dysocjacji do pojedynczych komórek. Ostatnim krokiem jest wysianie komórek siatkówki na płytkę UnCloned i dodanie flu oh 4:00 AM w celu obrazowania wapnia. Ostatecznie wykorzystuje się mikroskopię konfokalną do wykrycia aktywności wapniowej w hodowli komórek siatkówki.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinach biologii rozwoju, neurobiologii i biologii komórki, takie jak rola wapnia i aktywności elektrycznej w rozwoju siatkówki, a także ekspresja genów na poziomie pojedynczych komórek. Zazwyczaj osoby po raz pierwszy wykonujące tę procedurę będą miały z nią trudności, ponieważ do szybkiego i dokładnego przeprowadzenia sekcji niezbędna jest precyzyjna motoryka mała. Demonstracja wizualna tej metody jest krytyczna, gdyż kroki sekcji są trudne i wymagają złożonej koordynacji wzrokowo-ruchowej.Aby rozpocząć tę procedurę wewnątrz komory z laminarnym przepływem p

dissection-culture-analysis-xenopus-laevis-embryonic-retinal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Sekcja, hodowla i analiza Xenopus laevis tkanki siatkówki zarodkowej

Xenopus embrionalne nabłonki stanowią idealny system modelowy do badania zachowań komórkowych, takich jak rozwój polaryzacji i zmiana kształtu podczas morfogenezy nabłonkowej. Tradycyjna histologia utrwalonych próbek jest coraz częściej uzupełniana przez konfokalne obrazowanie żywych komórek. W niniejszej pracy prezentujemy metody izolacji tkanek żaby oraz wizualizacji żywych komórek nabłonkowych i ich cytoszkieletu z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii żywych komórek.

Obrazowanie żywych komórek i analiza ilościowa embrionalnych komórek nabłonkowych u Xenopus laevis

Niniejszy artykuł opisuje metodę mikrodyssekcji siatkówek zebrafish (danio pręgowanego) z dołączonym lub usuniętym nabłonkiem barwnikowym siatkówki, z embrionów od jednego do trzech dni po zapłodnieniu.

Mikrodysekcja tkanek embrionalnego oka rybki zebrafish

Siatkówka Drosophila stanowi krystaliczną sieć złożoną z niewielkiej liczby typów komórek, które są generowane w sposób stereotypowy 1. Jej podatność na zaawansowane analizy genetyczne umożliwia badanie złożonych programów rozwojowych. Niniejszy protokół opisuje preparowanie oraz immunohistochemię siatkówek na trzech odrębnych etapach rozwoju, ze szczególnym uwzględnieniem różnicowania fotoreceptorów.

Disekcja i immunohistochemia siatkówek larwalnych, poczwarkowych i dorosłych Drosophila

Ten film opisuje, jak przeprowadzić sekcję i wyizolować kompleks oko-mózg od poczwarek Drosophila. Przedstawiony protokół pokazuje, że procedura pozwala uzyskać wysokiej jakości tkankę, kompatybilną na przykład z barwieniem immunologicznym, a także innymi eksperymentami z ekspresją genów.

Rozwarstwienie kompleksu oko-mózg z poczwarek much: metoda izolacji tkanki siatkówki

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzić preparację premigracyjnego grzebienia nerwowego czaszki (NC) od Xenopus laevis neurulas. Te eksplantaty można posiewać na fibronektynie i hodować in vitro lub przeszczepiać z powrotem do zarodków gospodarza. Technika ta pozwala na badanie mechanizmów przejścia, migracji i różnicowania nabłonka NC do mezenchymy.

Rozwarstwienie grzebienia nerwowego Xenopus laevis do hodowli eksplantatów in vitro lub przeszczepu in vivo

Ten protokół opisuje metodę preparowania, eksperymentalnego manipulowania i hodowli całych eksplantatów siatkówki z zarodków kurczaka. Kultury eksplantatów są przydatne, gdy potrzebny jest wysoki wskaźnik sukcesu, skuteczność i odtwarzalność w celu przetestowania wpływu plazmidów na elektroporację i/lub substancje odczynnikowe, tj. inhibitory enzymatyczne.

Całe eksplantaty siatkówki z zarodków kurczaka do elektroporacji i zabiegów odczynnikami chemicznymi

Ten artykuł przedstawia chirurgiczną metodę preparowania siatkówki poczwarki Drosophila wraz z protokołami przetwarzania tkanek do immunohistochemii, analizy zachodniej i ekstrakcji RNA.

Rozwarstwienie siatkówki poczwarki Drosophila w celu immunohistochemii, analizy zachodniej i izolacji RNA

To badanie ma na celu opracowanie nowego modelu ludzkiej organotypowej hodowli siatkówki (HORC), który zapobiega naruszeniu integralności siatkówki podczas obchodzenia się z eksplantatem. Osiąga się to poprzez hodowlę siatkówki z leżącym nad nią ciałem szklistym i leżącym pod nim barwnikiem siatkówki: nabłonkiem-naczyniówką (RPE-naczyniówką) i twardówką.

Charakterystyka nowatorskiej techniki organotypowej hodowli siatkówki u ludzi

Ten protokół, który pierwotnie został zgłoszony przez Fernandez-Godino et al. w 2016 roku1, opisuje metodę efektywnego izolowania i hodowli mysich komórek RPE, które tworzą funkcjonalną i spolaryzowaną monowarstwę RPE w ciągu jednego tygodnia na płytkach Transwell. Zabieg trwa około 3 godzin.

Skuteczna dyssekcja i hodowla pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki myszy

Ten protokół przedstawia i opisuje etapy izolacji, sekcji, hodowli i barwienia eksplantatów siatkówki uzyskanych od dorosłej myszy. Metoda ta jest korzystna jako model ex vivo do badania różnych chorób nerwowo-naczyniowych siatkówki, takich jak retinopatia cukrzycowa.

Eksplantat siatkówki dorosłej myszy jako model ex vivo do badania chorób nerwowo-naczyniowych siatkówki

Siatkówka wykazuje złożoną organizację przestrzenną w całej swojej strukturze laminarnej. Nowoczesna transkryptomika przestrzenna i techniki sekwencjonowania wymagają wycinków tkanek o grubości &lt; 20 μm, co ogranicza ich zastosowanie w badaniach siatkówki. Ta świeżo zamrożona metoda kriosekcji pozwala uzyskać cienkie przekroje siatkówki myszy, zachowując jednocześnie płaskie relacje przestrzenne, umożliwiając kompleksowe mapowanie molekularne blaszek.

En face Kriosekcja siatkówki myszy w celu przeprowadzenia wielowymiarowej przestrzennej analizy molekularnej

Naucz się przygotowywać pierwotne kultury komórek siatkówki Xenopus laevis z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej do obrazowania aktywności wapniowej. Ta technika umożliwia badanie fizjologii komórek siatkówki.

Sekcja, hodowla i analiza embrionalnej tkanki siatkówki Xenopus laevis

Przeglądaj więcej filmów