In ovo Elektroporacja plazmidów opartych na miRNA w rozwijającej się cewie nerwowej i ocena fenotypów przez wstrzyknięcie DiI w preparatach z otwartą książką
16 października 2012
Opisana jest metoda, dzięki której ekspresja genów w cewie nerwowej może być obniżona w sposób specyficzny dla typu komórki, identyfikowalny. Pokazujemy, w jaki sposób elektroporacja in ovo plazmidów opartych na mikroRNA, które wywołują czasoprzestrzennie kontrolowaną interferencję RNA, może być wykorzystana do zbadania spoidła prowadzącego aksony w rozwijającej się cewie nerwowej.
Celem tej procedury jest ocena defektów kierowania aksonami w cewie nerwowej kurczaka po obniżeniu ekspresji genów w sposób identyfikowalny dla danego typu komórki. Osiąga się to poprzez przygotowanie zapłodnionych jaj kurzych do innovo elektroporacji poprzez wycięcie okienka w skorupce jajka. Drugim krokiem jest wstrzyknięcie i elektrooperacja konstruktów DNA kodujących mikroRNA do cewy neuronowej.
Następnie rdzenie kręgowe są wycinane i mocowane w płaskich preparatach z otwartej książki. Ostatnim krokiem jest wstrzyknięcie barwnika fluorescencyjnego w celu wizualizacji projekcji aksonalnych. Ostatecznie mikroskopia fluorescencyjna jest wykorzystywana do pokazania zarówno komórek doświadczających wyciszania genów, jak i do oceny późniejszego wpływu na prowadzenie aksonów kompulsoryjnych.
Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami jest wyciszanie genów w zależności od typu komórki. Aby plazmidy były zgodne z instrukcjami, należy zapoznać się z pisemnym protokołem: Wysiaduj jaja w temperaturze 38,5 stopni Celsjusza i wilgotności około 45%, aż do osiągnięcia pożądanego etapu rozwoju. Aby zbadać przewodnictwo neuronów spoidełkowych za pomocą Axon, należy inkubować zarodki przez około trzy dni, aż osiągną stadium hamburgera i Hamiltona od 17 do 18.
Po osiągnięciu pożądanego etapu rozwoju i przed zgromadzeniem się białka będącego przedmiotem zainteresowania w zarodku, należy wyjąć jaja z inkubatora i umieścić je w stabilnej pozycji poziomej na 20 minut, aby ponownie ułożyć zarodek na żółtku w górnej części jaja. Po ponownym umieszczeniu zarodków na żółtku wyjmij jaja z inkubatora i przetrzyj je 70% etanolem. Następnie umieść pasek taśmy wzdłuż długiej osi jajka i za pomocą skalpela zrób mały otwór w końcu jajka i drugi w rogu obszaru, który ma być oknowy.
Następnie włóż strzykawkę wyposażoną w igłę o rozmiarze 18 do otworu na końcu jajka pod kątem 45 stopni i zasysaj około trzech mililitrów albuminy, uważając, aby nie uszkodzić żółtka. Użyj małych nożyczek trzymanych poziomo, aby wyciąć okienko w jaju bez uszkadzania zarodka. Następnie uszczelnij okno za pomocą taśmy.
Na koniec za pomocą pędzla nałóż stopiony wosk parafinowy, aby uszczelnić otwór na końcu jajka i w ten sam sposób uszczelnić wszelkie pęknięcia w jajku. Następnie włóż jajo z powrotem do inkubatora. Powtórz ten proces ze wszystkimi jajami, które mają być elektroporowane.
Usuń taśmę z jednego z jaj w okienkach i zarodek jest etapizowany zgodnie z hamburgerem i Hamiltonem. Następnie użyj kleszczy, aby podnieść dodatkowe błony zarodkowe z rdzeniowej połowy zarodka w obszarze, w którym znajdują się główne żyły linii prawego i lewego wiklinu. Wejdź do tułowia, delikatnie rozerwij lub przetnij błony nożyczkami sprężynowymi i wlej je w kierunku ogona.
Teraz użyj delikatnego ssania, aby załadować mieszaninę DNA, która ma być elektroporowana, do szklanej mikrokapilary z dołączoną rurką. Wprowadzić mikrokapilę do centralnego kanału cewy nerwowej tuż nad kończynami tylnymi i wstrzyknąć doustnie roztwór DNA kontrolujący objętość wstrzyknięcia. Niebieski barwnik powinien rozprzestrzeniać się od czubka ogona do komory rozwijającego się mózgu.
Dodaj kilka kropli sterylnego PBS na wierzch zarodka i umieść elektrody równolegle do przedniej tylnej osi zarodka, nie dotykając zarodka ani żadnych naczyń krwionośnych. Następnie trzymaj elektrody nieruchomo i oczyść elektro. Po elektroporacji wyjmij elektrody i szybko spłucz sterylną wodą, aby usunąć zdenaturowane białka z białka jaja.
Na koniec upuść nieco bardziej sterylny PBS na zarodek, a następnie ponownie zamknij jajo taśmą. Tak jak poprzednio, prawidłowe uszczelnienie ma kluczowe znaczenie, aby uniknąć odwodnienia zarodka. Następnie należy umieścić zarodek z powrotem w inkubatorze, aż do osiągnięcia pożądanego etapu rozwoju.
Gdy zarodek dotrze do Hamburger Hamilton, stadium od 25 do 26, użyj kleszczy, aby usunąć zarodek z jaja i umieść go na szalce Petriego pokrytej elastomerem sil guard. Użyj kleszczy, aby usunąć dodatkowe błony zarodkowe i połóż zarodek grzbietową stroną do dołu. Teraz użyj 0,2 milimetrowych szpilek do owadów, aby delikatnie rozciągnąć i przypiąć zarodek przez szyję i ogon.
Następnie przypnij kończyny zarodka, wkładając szpilki pod kątem, aby nie przeszkadzały w późniejszym rozwarstwieniu. Oświetl naczynie zawierające zarodek od dołu, aby można było dostrzec gęstość tkanki. Użyj nożyczek sprężynowych, aby otworzyć jamę brzuszną i delikatnie skrobać kleszczami, aby usunąć serce i narządy wewnętrzne.
Gdy wszystkie narządy zostaną całkowicie usunięte, segmentowane kręgi i rdzeń kręgowy będą widoczne. Następnie obróć zarodek o 180 stopni i za pomocą nożyczek sprężynowych wykonaj płytkie nacięcie przez kręgi leżące nad rdzeniem kręgowym na szyi. Następnie wykonaj dwa krótkie podłużne nacięcia przez kręgi po obu stronach rdzenia kręgowego od szyi do ogona.
Użyj kleszczy, aby podnieść kręgi klapy z dala od rdzenia kręgowego, a następnie oderwij kręgi jednym paskiem w kierunku ogona. Następnie delikatnie rozciągnij i ponownie przypnij zarodek przez ogon i kończyny. Teraz zidentyfikuj opony rdzeniowe rdzenia kręgowego, które powinny wyglądać jak ciemna, gęsta linia tkanki między cewą nerwową a zwojami korzenia grzbietowego, a następnie użyj igły lub cienkiego skalpela mikrochirurgicznego, aby przeciąć opony mózgowe wzdłuż każdej strony rdzenia od szyi do ogona.
Opony mózgowe powinny łatwo oddzielać się od rdzenia kręgowego z powodu rozciągania przypiętego zarodka. Na koniec przetnij rdzeń kręgowy na poziomie zawiązka skrzydła i rdzeń do zawiązka kończyny. Następnie użyj kleszczy, aby wyjąć rdzeń kręgowy ruchem rostralnym rdzenia kręgowego, upewniając się, że rdzeń pozostaje najpierw zanurzony w PBS.
Rozłóż wyizolowany rdzeń kręgowy na szpatułce i przenieś go do świeżego naczynia pokrytego syl guard zawierającego 4% para formaldehydu w PBS. Następnie ostrożnie przypnij rdzeń kręgowy przyśrodkowo i kwartalnie 0,1 milimetrowymi szpilkami do owadów, aby uzyskać preparat do montażu płaskiego, inkubując paraldehyd przez 30 minut do jednej godziny. Uważaj, aby nie przesadzić.
Ponieważ zwiększy to tło i zmniejszy wydajność dyfuzji diod. Następnie ostrożnie odlej paraldehyd i zastąp go PBS. Po przygotowaniu pięciu miligramów na mililitr szybko di w etanolu, odłamać końcówkę szklanej mikropipety o małej średnicy przymocowanej do plastikowej rurki i wciągnąć roztwór do pipety iet.
Włóż napełnioną igłę do naczynia z PBS i sprawdź, czy barwnik nie wycieka z igły. Jeśli tak, średnica jest zbyt szeroka i należy przygotować nową igłę. Upewnij się, że preparat otwartej książki jest oświetlony od dołu i znajduje się gęstszy podłużny pasek tkanki znajdujący się około jednej piątej szerokości książki Hemi Od bocznej krawędzi ciała komórkowe neuronów spoidła są po prostu grzbietowe do tej ciemnej linii.
Włóż końcówkę szklanej mikropipety do tkanki, a gdy igła zostanie wyjęta, zaciągnij się niewielką ilością oka D za pomocą szybko działającej pipety doustnej Powtarzaj procedurę co 0,5 milimetra wzdłuż otwartej książki. Po zakończeniu wstrzyknięć należy użyć pipety transferowej, aby odessać i wyrzucić. Wszelkie nadmiarowe niewykonanie tego spowoduje wysokie tło.
Powtórz tę procedurę dla wszystkich preparatów z otwartą książką. Następnie umieść naczynie zawierające wstrzyknięte preparaty w temperaturze czterech stopni Celsjusza na około trzy dni, aby barwnik mógł rozprzestrzenić się wzdłuż aksonów. Po tym czasie należy zamontować preparaty zgodnie z instrukcją zawartą w pisemnym protokole.
Przekroje poprzeczne i otwarte książki pochodziły z hamburgerów Hamilton Stage od 25 do 26 zarodków kurczaka, które zostały poddane ocenie elektrycznej w Hamburger Hamilton Stage 18. Jak widać tutaj w przekroju, promotor działający w wersji beta napędza wszechobecną ekspresję. Strzałka wskazuje grzbietowy kierunek brzuszny.
Obraz ten przedstawia przykład wzorców ekspresji białek fluorescencyjnych uzyskanych w wyniku elektroporacji wektorów plazmidowych. Tutaj wszechobecna ekspresja promotora beta aktyny jest widoczna w preparacie z otwartej książki. Strzałka wskazuje kierunek rostralnego rdzenia.
Ten obraz przedstawia przekrój poprzeczny po elektroporacji z konstruktem zawierającym wzmacniacz matematyczny. To napędza ekspresję w jednym neuronze. Tutaj wyrażenie z konstruktu wzmacniacza matematycznego jest widoczne w przygotowaniu otwartej książki.
Ten przekrój pokazuje ekspresję jastrzębia, jeden wzmacniacz po obustronnej elektroporacji konstruktu. Wzmacniacz hawk A one napędza ekspresję szczególnie w płycie podłogowej. To przygotowanie do otwartej książki pokazuje wzorzec ekspresji jastrzębi jeden konstrukt w płycie podłogowej.
Ten obraz przedstawia obraz jasnego pola aplikacji miejsc wstrzyknięcia Dai. Podczas przygotowywania otwartej książki, Dai został wstrzyknięty w punktowy wzór blisko bocznego brzegu otwartej książki. Po stronie elektro ocenianej, ten obraz pokazuje wizualizację ekspresji GFP w tym samym preparacie, a tutaj jest wizualizowane Dai.
Po trzech dniach dyfuzji, spoidło rozluźniające się na trajektoriach powinno być możliwe do uwidocznienia pod mikroskopem fluorescencyjnym. Normalne trajektorie aksonów będą rosły w kierunku płyty podłogowej, przecinają płytę podłogową, a następnie obracają się i rosną. Sprzymierzeniec, jak widać tutaj.
Nieprawidłowe fenotypy wynikające z knockdownu genu, takie jak ten pokazany tutaj, można porównać do trajektorii archetypicznej. W tym przykładzie jakiś akson zatrzymuje płytę podłogową lub podejmuje błędne decyzje o skręcie po stronie kontralateralnej. Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby zachować ostrożność i cierpliwość na wszystkich etapach precyzyjnego wstrzykiwania i sekcji.
Wymaga to pewnej praktyki. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wstrzykiwać i jeść plazmidy RNAI, aby zbadać funkcję genów podczas rozwoju cewy nerwowej w sposób specyficzny dla typu komórki.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł opisuje metodę do regulacji w dół ekspresji genów w rurze nerwowej w sposób specyficzny dla typu komórki i możliwy do prześledzenia. Technika wykorzystuje elektroporację in ovo plazmidów opartych na microRNA do badania przewodzenia aksonów łączących podczas rozwoju rurki nerwowej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia rozwojowa
- Ekspresja genów
Tło
- Rozumienie przewodzenia aksonów jest kluczowe dla wglądu w rozwój układu nerwowego.
- Regulacja ekspresji genów może zapewnić wgląd w określone procesy komórkowe.
- Podejścia oparte na microRNA pozwalają na ukierunkowane wyciszenie genów.
- Elektroporacja in ovo to technika stosowana do wprowadzania materiału genetycznego do zarodków.
Cel badania
- Ocenienie defektów przewodzenia aksonów w rurce nerwowej kurczaka.
- Regulacja w dół ekspresji genów w sposób specyficzny i możliwy do prześledzenia.
- Wizualizowanie efektów wyciszenia genów na projekcjach aksonalnych.
Stosowane metody
- Przygotowanie zapłodnionych jaj kurczaka poprzez wycięcie okna w skorupce jaja.
- Wstrzyknięcie i elektroporacja konstruktów DNA kodujących microRNA do rurki nerwowej.
- Zsekcjonowanie i fiksacja elektroporowanych rdzeni kręgowych w preparatach typu "otwarta książka".
- Wstrzyknięcie fluorescencyjnego barwnika do wizualizowania projekcji aksonalnych.
Główne wyniki
- Mikroskopia fluorescencyjna ujawnia komórki ulegające wyciszeniu genów.
- Technika pozwala na ocenę przewodzenia aksonów łączących.
- Regulacja w dół specyficznych genów wpływa na ścieżki przewodzenia aksonów.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia rozwoju rurki nerwowej.
Wnioski
- Metoda dostarcza cennego narzędzia do badania funkcji genów w rozwoju układu nerwowego.
- Elektroporacja in ovo microRNA jest skuteczna w ukierunkowanym wyciszeniu genów.
- Wyniki poprawiają nasze rozumienie mechanizmów przewodzenia aksonów.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables precise, cell type-specific gene knockdown in vivo to interrogate axon guidance mechanisms, supporting target validation in neurodevelopmental pathways. By linking molecular perturbation to phenotypic readouts in commissural neurons, it provides mechanistic de-risking for therapeutic target hypotheses. The approach enhances predictive confidence in early discovery by enabling traceable, reproducible assessment of gene function in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by knocking down specific genes in defined neuronal populations to assess axon guidance phenotypes.
- Operational Value: Uses traceable fluorescent markers to directly link gene silencing to cellular phenotypes, reducing ambiguity in target validation.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by testing gene function in a living embryo context, improving translational relevance of targets.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative axonal trajectory data via DiI injection and confocal imaging, enabling standardized phenotypic readouts for screening.
- Operational Value: Allows multiplexed knockdown of multiple genes in independent spinal cord regions, increasing assay throughput and efficiency.
- Scientific Value: Produces reproducible, traceable readouts that support assay standardization and cross-experiment comparability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses a disease-relevant system (chicken neural tube) to model conserved axon guidance mechanisms, supporting preclinical target assessment.
- Operational Value: Provides a platform for continuity from gene knockdown in discovery to phenotypic validation in preclinical models.
- Scientific Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by linking molecular intervention to functional axonal outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through phenotypic screening to preclinical validation, enabling iterative de-risking of neurodevelopmental targets.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling cell type-specific gene knockdown in commissural neurons.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized DiI tracing and confocal visualization of axonal projections for compound or genetic screening.
- Analytics: Generates quantitative measurements of axon guidance defects (e.g., stalling, misrouting) that enable comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by using a conserved model system to assess target relevance before mammalian validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for probing multiple genes or pathways in axon guidance, reducing redundant model development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in axon guidance pathways through traceable, phenotype-linked gene silencing.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility via fluorescent tracing and open-book preparation, enabling reliable cross-laboratory data.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early phenotypic evidence of target involvement in neural circuit formation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by validating targets in a functional, in vivo context before major investment.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryo handling, microsurgery, and fluorescent microscopy for successful electroporation and axon tracing.
- Dependent on specialized instrumentation including electroporators, microinjectors, and confocal microscopes for precise delivery and visualization.
- Necessitates cross-team standardization of embryo staging, injection volumes, and fixation times to ensure reproducibility across experiments.
- Involves adaptation considerations when extending to other model systems or neuronal subtypes beyond commissural dI1 neurons.
- Practical limitations include technical skill dependency and time-intensive dissection steps, which may affect scalability for large-scale screening campaigns.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:15
Preparing Eggs for Electroporation
2:59
Electroporation of miRNA
4:49
Dissection of Embryos for Spinal Cord Preparations
7:28
Fixation of Open-books
8:11
DiI Injection into Commissural Neurons
9:48
Results: Promoter-driven Cell-type Specific Expression in Neural Tube Cross-section and Open-book Preparations
12:12
Conclusion
