Name: In ovo Elektroporacja plazmidów opartych na miRNA w rozwijającej się cewie nerwowej i ocena fenotypów przez wstrzyknięcie DiI w preparatach z otwartą książką (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 41 s
Description: Poznaj metodę in ovo elektroporacji plazmidów miRNA w cewie nerwowej kurczaka, umożliwiającą specyficzne wyciszanie genów i ocenę defektów prowadzenia aksonów komisuralnych. Technika ta pozwala na precyzyjne badanie rozwoju układu nerwowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca w laboratorium E.S. jest wspierana przez Szwajcarską Narodową Fundację Naukową. Chcielibyśmy podziękować dr. Beat Kunza za pomoc w filmowaniu.

<ol><li>Chédotal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+tales+of+the+midline%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Further tales of the midline.</a> Current Opinion in Neurobiology. 21, 68-75 (2011).</li>
<li>Avraham, O., Hadas, Y., Vald, L., Zisman, S., Schejter, A., Visel, A., Klar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+axonal+guidance+and+sorting+in+dorsal+interneurons+by+the+Lim-HD+proteins+Lhx9+and+Lhx1%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1.</a> Neural Development. 4, 21(2009).</li>
<li>Wilson, N. H., Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type+specific%2C+traceable+gene+silencing+for+functional+gene+analysis+during+vertebrate+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Cell type specific, traceable gene silencing for functional gene analysis during vertebrate neural development.</a> Nucleic Acids Research. 39, e133(2011).</li>
<li>Das, R. M., van Hateren, N. J., Howell, G. R., Farrell, E. R., Bangs, F. K., Porteous, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+system+for+RNA+interference+in+the+chicken+using+a+modified+microRNA+operon%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon.</a> Developmental Biology. 294, 554-563 (2006).</li>
<li>Perrin, F. E., Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+lipophilic+dyes+in+studies+of+axonal+pathfinding+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Use of lipophilic dyes in studies of axonal pathfinding in vivo.</a> Microscopy Research and Technique. 48, 25-31 (2000).</li>
<li>Timmer, J., Johnson, J., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+in+ovo+electroporation+for+the+rapid+analysis+of+neural-specific+murine+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">The use of in ovo electroporation for the rapid analysis of neural-specific murine enhancers.</a> Genesis. 29, 123-132 (2001).</li>
<li>Kieleczawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+modifications+of+the+standard+DNA+sequencing+protocol+allow+for+sequencing+through+siRNA+hairpins+and+other+repeats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Techniques%22%5BJournal%5D)">Simple modifications of the standard DNA sequencing protocol allow for sequencing through siRNA hairpins and other repeats.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 16, 220-223 (2005).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).</li>
<li>Boulland, J., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenotransplantation+of+Human+Stem+Cells+into+the+Chicken+Embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo.</a> J. Vis. Exp. (41), e2071(2010).</li>
<li>Kim, B. G., Dai, H. -N., McAtee, M., Vicini, S., Bregman, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+of+dendritic+spines+with+the+carbocyanine+dye+DiI+for+confocal+microscopic+imaging+in+lightly+fixed+cortical+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Labeling of dendritic spines with the carbocyanine dye DiI for confocal microscopic imaging in lightly fixed cortical slices.</a> Journal of Neuroscience Methods. 162, 237-243 (2007).</li>
<li>Murphy, M. C., Fox, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterograde+tracing+method+using+DiI+to+label+vagal+innervation+of+the+embryonic+and+early+postnatal+mouse+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Anterograde tracing method using DiI to label vagal innervation of the embryonic and early postnatal mouse gastrointestinal tract.</a> Journal of Neuroscience Methods. 163, 213-225 (2007).</li>
<li>Helms, A. W., Abney, A. L., Ben-Arie, N., Zoghbi, H. Y., Johnson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoregulation+and+multiple+enhancers+control+Math1+expression+in+the+developing+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system.</a> Development. 127, 1185-1196 (2000).</li>
<li>Li, X., Lufkin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre+recombinase+expression+in+the+floorplate%2C+notochord+and+gut+epithelium+in+transgenic+embryos+driven+by+the+Hoxa-1+enhancer+III%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Cre recombinase expression in the floorplate, notochord and gut epithelium in transgenic embryos driven by the Hoxa-1 enhancer III.</a> Genesis. 26, 121-122 (2000).</li>
<li>Mauti, O., Baeriswyl, T., Stoeckli, E. T. G. ene <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+by+Injection+and+Electroporation+of+dsRNA+in+Avian+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Silencing by Injection and Electroporation of dsRNA in Avian Embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2008).</li>
<li>Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+on+using+in+ovo+electroporation+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function.</a> Developmental Dynamics. 229, 433-439 (2004).</li>
<li>Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+and+confirming+the+specificity+of+RNAi+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enhancing and confirming the specificity of RNAi experiments.</a> Nature Methods. 3, 677-681 (2006).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Ta prosta, oparta na wektorach strategia ekspresji sztucznego miRNA może być wykorzystana do wyciszenia endogennej ekspresji genów w cewie nerwowej kurczaka. Te funkcjonalne narzędzia umożliwiają jednoczesne wyciszanie wielu genów, kontrolę czasową oraz specyficzność komórkową, co ułatwia wyjaśnianie złożonych ścieżek rozwojowych. W szczególności wykazaliśmy użyteczność tych plazmidów w badaniu prowadzenia aksonów komisuralnych, ponieważ plazmidy te mogą być wykorzystane do wyciszenia różnych genów w neuronach komisuraln...

<table><tbody><tr><td>Kapilary szklane 0.5 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B120F-4</td><td></td></tr><tr><td>Wytwornica elektrod szklanych</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporator</td><td>BTX</td><td>ECM 830</td><td></td></tr><tr><td>Elastomer silikonowy Sylgard</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td></td></tr><tr><td>Drut wolframowy, 0.075 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>TGW0325</td><td></td></tr><tr><td>Szpilki entomologiczne, 0.20 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>Szpilki entomologiczne, 0.10 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta Dumont #55</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Fast DiI</td><td>Molecular Probes</td><td>D-7756</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopy fluorescencyjne</td><td>Olympus</td><td>SZX12, BX51</td><td></td></tr></tbody></table>

in ovo elektroporacja plazmidów opartych na mirna w rozwijającej się rurze neuronalnej i ocena fenotypów poprzez wstrzykiwanie dii w preparatach typu open-book

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

Neurony komisuralne dI1 zostały szeroko zbadane w celu wyjaśnienia mechanizmów leżących u podstaw prowadzenia aksonów podczas rozwoju1,2. Neurony te znajdują się w grzbietowej części rdzenia kręgowego i wysyłają swoje aksony wzdłuż stereotypowych trajektorii. Aksony komisuralne początkowo kierują się brzusznie w stronę płyty dna, a następnie przecinają ją. Po przekroczeniu linii środkowej aksony te wykonują gwałtowny zwrot w kierunku rostralnym i biegną podłużnie w stronę mózgu. Każdy z tych etapów jest regulowany przez skoordynowane działanie atraktantów i repulsantów prowadzących. Prawidłowa interpretacja tych sygnałów jest kluczowa dla prowadzenia aksonów wzdłuż ich wyznaczonej ścieżki. Zatem fizjologiczny wkład konkretnej cząsteczki w prowadzenie aksonów komisuralnych najlepiej badać w kontekście żywego embrionu. W związku z tym wyciszanie genów in vivo musi być precyzyjnie kontrolowane, aby można było starannie odróżnić aktywność genów w prowadzeniu aksonów od ich potencjalnych wielu innych ról podczas rozwoju.
W niniejszej pracy opisujemy metodę wyciszania ekspresji genów w rurce nerwowej kurczaka w sposób specyficzny dla typu komórek i umożliwiający ich śledzenie. Wykorzystujemy nowatorskie wektory plazmidowe3 zawierające specyficzne dla typu komórek promotory/enhancery, które sterują ekspresją fluorescencyjnego białka markerowego, bezpośrednio po którym następuje transkrypt miR30-RNAi4 (zlokalizowany w obrębie 3'-UTR cDNA kodującego białko fluorescencyjne) (Rycina 1). Po elektroporacji do rozwijającej się rurki nerwowej wektory te wywołują wydajną regulację w dół ekspresji genów oraz ekspresję jasnych fluorescencyjnych białek markerowych, co umożliwia bezpośrednie śledzenie komórek poddanych wyciszeniu3. Mieszanie różnych wektorów RNAi przed elektroporacją pozwala na jednoczesne wyciszenie dwóch lub więcej genów w niezależnych regionach rdzenia kręgowego. Umożliwia to badanie złożonych oddziaływań komórkowych i molekularnych podczas rozwoju w sposób szybki, prosty, precyzyjny i niedrogi. W połączeniu ze śledzeniem trajektorii aksonów komisuralnych za pomocą DiI w preparatach typu open-book5, metoda ta stanowi użyteczne narzędzie do badań in vivo komórkowych i molekularnych mechanizmów wzrostu i prowadzenia aksonów komisuralnych. W zasadzie można zastosować dowolny promotor/enhancer, co potencjalnie zwiększa możliwości zastosowania tej techniki w badaniach in vivo funkcji genów podczas rozwoju6.
W niniejszym filmie zaprezentowano najpierw sposób obchodzenia się z jajami i ich okienkowania, wstrzykiwanie plazmidów DNA do rurki neuralnej oraz procedurę elektroporacji. W celu zbadania prowadzenia aksonów komisuralnych rdzeń kręgowy zostaje usunięty z zarodka w formie preparatu typu „otwarta książka” (open-book preparation), utrwalony, a następnie wstrzyknięty DiI, co pozwala na śledzenie przebiegu aksonów. Rdzeń kręgowy zostaje zamontowany między szkiełkami cover-slip i poddany wizualizacji przy użyciu mikroskopii konfokalnej.

Opisano metodę, która pozwala na specyficzne dla typu komórek i możliwe do śledzenia obniżenie ekspresji genów w rurce nerwowej. Wykazujemy, w jaki sposób elektroporacja in ovo plazmidów opartych na mikroRNA, które wywołują kontrolowaną przestrzennie i czasowo interferencję RNA, może być wykorzystana do badania prowadzenia aksonów komisuralnych w rozwijającej się rurce nerwowej.

In ovo elektroporacja plazmidów opartych na miRNA w rozwijającej się rurze neuronalnej i ocena fenotypów poprzez wstrzykiwanie DiI w preparatach typu open-book

Komisuralne neurony dI1 były przedmiotem szeroko zakrojonych badań mających na celu wyjaśnienie mechanizmów leżących u podstaw prowadzenia aksonów podczas rozwoju1,2. Neurony te są ...

Celem niniejszej procedury jest ocena wad prowadzenia aksonów w cewie nerwowej kurczaka po wyciszeniu ekspresji genów w sposób umożliwiający śledzenie konkretnego typu komórek. Cel ten osiąga się poprzez przygotowanie zapłodnionych jaj kurzych do elektroporacji in ovo poprzez wycięcie okna w skorupce jaja. Drugim krokiem jest wstrzyknięcie i elektroporacja konstruktów DNA kodujących mikroRNA do cewy nerwowej.Następnie rdzenie kręgowe z elektroporowanych zwierząt są wycinane i utrwalane w preparatach typu „rozłożona książka” (flat mount open book). Ostatnim krokiem jest wstrzyknięcie fluorescencyjnego barwnika w celu wizualizacji projekcji aksonalnych. Ostatecznie wykorzystuje się mikroskopię fluorescencyjną, aby wskazać komórki poddane wyciszeniu genów oraz ocenić późniejsze efekty w zakresie prowadzenia aksonów komisuralnych.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest specyficzne dla typu komórek wyciszanie genów. W celu przygotowania plazmidów należy zapoznać się z instrukcjami zawartymi w protokole pisemnym. Inkubować jaja w temperaturze 38,5 °C i wilgotności około 45% aż do osiągnięcia pożądanego stadium rozwoju. Aby badać prowadzenie aksonów neuronów komisuralnych, inkubować embriony przez około trzy dni, aż osiągną stadium 17–18 według skali Hamburgera i Hamiltona.Po osiągnięciu pożądanego etapu rozwoju i przed akumulacją białka docelowego w zarodku, należy wyjąć jaja z inkubatora i umieścić je w stabilnej pozycji poziomej na 20 minut, aby zarodek przemieścił się na górną część żółtka w górnej części jaja. Po tym, jak zarodki znajdą się na górze żółtka, należy wyjąć jaja z inkubatora i przetrzeć je 70% ethanol. Następnie należy nakleić pasek taśmy wzdłuż długiej osi jaja i za pomocą skalpela wykonać mały otwór na tępym końcu jaja oraz kolejny w narożniku obszaru, który ma zostać wycięty (windowed).Następnie w miejsce otworu na tępym końcu jaja pod kątem 45 stopni wprowadź strzykawkę z igłą o rozmiarze 18 G i odessać około trzech mililitrów albuminy, uważając, aby nie uszkodzić żółtka. Używając małych nożyczek trzymanych poziomo, wytnij w jajku okno, nie uszkadzając zarodka. Następnie zabezpiecz okno za pomocą taśmy.Na koniec za pomocą pędzla nanieś roztopiony wosk parafinowy, aby uszczelnić otwór na tępym końcu jaja, a w ten sam sposób uszczelnij wszelkie pęknięcia w skorupce. Następnie umieść jajo z powrotem w inkubatorze. Powtórz ten proces dla wszystkich jaj przeznaczonych do elektroporacji.Zdejmij taśmę z jednego z jaj z okienkiem i określ stadium rozwoju zarodka zgodnie z klasyfikacją Hamburgera i Hamiltona. Następnie za pomocą pęsety unieś błony pozazarodkowe z grzbietowej połowy zarodka w obszarze, w którym przebiegają główne prawe i lewe żyły witelinowe. Ostrożnie wprowadź się w głąb tułowia, delikatnie rozdzierając lub rozcinając błony nożyczkami sprężynowymi, i odsuń je w kierunku ogona.Następnie, za pomocą delikatnego ssania, należy wprowadzić mieszaninę DNA do elektroporacji do szklanej mikrokapilary z przymocowaną rurką. Wprowadź mikrokapilarę do kanału centralnego cewy nerwowej, tuż powyżej kończyn tylnych, i wstrzyknij roztwór DNA, kontrolując objętość wstrzykiwania ustami. Niebieski barwnik powinien rozprzestrzenić się od końcówki ogona aż do komory rozwijającego się mózgu.Nanieś kilka kropli sterylnego PBS na zarodek, a następnie umieść elektrody równolegle do osi przednio-tylnej zarodka, uważając, aby nie dotknąć zarodka ani żadnych naczyń krwionośnych. Następnie unieruchom elektrody i przeprowadź elektroporację. Po elektroporacji usuń elektrody i szybko przepłucz zarodek sterylną wodą, aby usunąć zdenaturowane białka z białka jaja.Na koniec nanieś nieco więcej sterylnego PBS na embrion, a następnie ponownie zamknij jajo za pomocą taśmy. Podobnie jak wcześniej, prawidłowe uszczelnienie jest kluczowe, aby uniknąć odwodnienia embrionu. Następnie umieść embrion z powrotem w inkubatorze, aż do osiągnięcia pożądanego stadium rozwoju.Gdy embrion osiągnie stadium 25–26 według skali Hamburgera-Hamiltona, za pomocą pęsety wyjmij go z jaja i umieść w szalce Petriego pokrytej elastomerem sil guard. Użyj pęsety, aby usunąć pozazarodkowe błony i ułóż embrion stroną grzbietową do dołu. Następnie za pomocą szpilek entomologicznych o średnicy 0,2 mm delikatnie rozciągnij embrion i przyszpilj go za pomocą wkłuć w okolicy szyi i ogona.Następnie przypnij kończyny zarodka, wbijając szpilki pod kątem, aby nie utrudniały one późniejszej sekcji. Oświetl szalkę z zarodkiem od dołu, aby umożliwić ocenę gęstości tkanek. Użyj nożyczek sprężynowych do otwarcia jamy brzusznej, a następnie delikatnie usuń serce i narządy wewnętrzne, zdrapując je za pomocą pęsety.Po całkowitym usunięciu wszystkich narządów widoczne będą segmentowane kręgi oraz rdzeń kręgowy. Następnie należy obrócić embrion o 180 stopni i za pomocą nożyczek sprężynowych wykonać płytkie cięcie przez kręgi nad rdzeniem kręgowym w okolicy szyi. Następnie należy wykonać dwa krótkie cięcia podłużne przez kręgi po obu stronach rdzenia kręgowego, od szyi do ogona.Używając pęsety, unieś kręgi odstające od rdzenia kręgowego, a następnie odważ kręgi w jednym pasie w kierunku ogona. Następnie delikatnie rozciągnij i ponownie przypnij embrion za pomocą szpilek w obrębie ogona i kończyn. Teraz zidentyfikuj opony rdzenia kręgowego, które powinny wyglądać jak ciemna, gęsta linia tkanki pomiędzy rurką neuralną a zwojami korzeni grzbietowych, a następnie użyj igły Ster lub precyzyjnego skalpela mikrochirurgicznego, aby przeciąć opony wzdłużnie po każdej stronie rdzenia, od szyi do ogona.Opony powinny łatwo oddzielić się od rdzenia kręgowego dzięki rozciągnięciu przypiętego embrionu. Na koniec przetnij rdzeń kręgowy na poziomie pąka skrzydła oraz w kierunku kaudalnym względem pąka kończyny. Następnie za pomocą pęsety wyjmij rdzeń kręgowy ruchem w kierunku rostralno-kaudalnym, upewniając się, że rdzeń pozostaje zanurzony w PBS First.Rozciągnij wyizolowany rdzeń kręgowy na szpatułce i przenieś go do nowej płytki powlekanej sylgardem, zawierającej 4% paraformaldehyd w PBS. Następnie ostrożnie przytwierdź rdzeń kręgowy za pomocą szpilek entomologicznych 0,1 mm w kierunku przyśrodkowym i ćwiartkowym, aby przygotować preparat płaski, inkubując w paraformaldehydzie od 30 minut do jednej godziny. Należy uważać, aby nie doprowadzić do nadmiernej fiksacji.Ponieważ zwiększy to tło i zmniejszy efektywność dyfuzji diod. Następnie ostrożnie odlej paraldehyd i zastąp go PBS. Po przygotowaniu roztworu fast di w etanolu o stężeniu pięciu miligramów na mililitr, odłam końcówkę szklanej mikropipety o małej średnicy przymocowanej do plastikowej rurki i naciągnij roztwór do wnętrza pipety.Wprowadź napełnioną igłę do naczynia z PBS i sprawdź, czy barwnik nie wycieka z igły. Jeśli tak się dzieje, średnica jest zbyt duża i należy przygotować nową igłę. Upewnij się, że preparat w układzie „otwartej księgi” (open book) jest oświetlony od dołu, a gęstszy podłużny pas tkanki znajduje się mniej więcej w jednej piątej szerokości półksięgi od krawędzi bocznej; ciała komórek neuronów komisuralnych znajdują się tuż powyżej tej ciemnej linii.Wprowadź końcówkę szklanej mikropipety do tkanki, a podczas wycofywania igły wprowadź niewielką ilość D eye za pomocą pipety ustnej. Szybko powtórz tę procedurę co 0,5 mm wzdłuż długości rozwarcia książki. Po zakończeniu iniekcji użyj pipety transferowej, aby odessać i usunąć nadmiar di; w przeciwnym razie wystąpi wysokie tło.Powtórz procedurę dla wszystkich preparatów typu open book. Następnie umieść szalkę z wstrzykniętymi preparatami w temperaturze czterech stopni Celsjusza na około trzy dni, aby barwnik mógł rozprzestrzenić się wzdłuż aksonów. Po upływie tego czasu zamontuj preparaty zgodnie z instrukcjami zawartymi w protokole pisemnym.Przekroje poprzeczne i preparaty typu „open book” wykonano z zarodków kurzych w stadiach 25–26 według skali Hamburgera-Hamiltona, które poddano elektroporacji w stadium 18 według skali Hamburgera-Hamiltona. Jak widać tutaj na przekroju poprzecznym, promotor beta-aktyny napędza ekspresję ubikwitarnej. Strzałka wskazuje kierunek grzbietowo-brzuszny.Na tym obrazie przedstawiono przykład wzorców ekspresji białek fluorescencyjnych uzyskanych po elektroporacji wektorów plazmidowych. Tutaj widoczna jest wszechobecna ekspresja z promotora beta-aktyny w preparacie typu „otwarta książka” (open book). Strzałka wskazuje kierunek rostralny rdzenia.Na tym obrazie przedstawiono przekrój poprzeczny po elektroporacji konstruktem zawierającym enhancer math1. Napędza on ekspresję w neuronach di1. Tutaj ekspresja z konstruktu z enhancerem math1 jest widoczna w preparacie typu „otwarta książka” (open book preparation).Ten przekrój poprzeczny przedstawia ekspresję enhancera hawk A1 po obustronnej elektroporacji konstruktu. Enhancer hawk A1 napędza ekspresję specyficznie w płytce dna. Ta preparacja w układzie „otwartej książki” pokazuje wzór ekspresji konstruktu hawk A1 w płytce dna.Na tym obrazie przedstawiono obraz w polu jasnym z naniesionymi miejscami iniekcji Dai. W preparacie typu „otwartej księgi” (open book), Dai wstrzyknięto w układzie punktowym w pobliżu bocznej krawędzi preparatu. Po prawej stronie obraz przedstawia wizualizację ekspresji GFP w tym samym preparacie, gdzie widoczny jest sygnał Dai.Po trzech dniach dyfuzji, rozluźnienie komisury na trajektoriach powinno być możliwe do zwizualizowania pod mikroskopem fluorescencyjnym. Normalne trajektorie aksonów będą rosły w kierunku płyty podłoża, przekroczą płytę podłoża, a następnie skręcą i będą dalej rosnąć. Wszystko tak, jak widać tutaj.Nieprawidłowe fenotypy wynikające z wyciszenia genów, takie jak pokazany tutaj, można porównać do trajektorii archetypowej. W tym przykładzie niektóre aksony zatrzymują się na płycie dna lub podejmują błędne decyzje dotyczące skrętu po stronie przeciwległej. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest zachowanie ostrożności i cierpliwości na każdym etapie precyzyjnej iniekcji oraz sekcji.Wymagają one pewnej wprawy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak wstrzykiwać i wprowadzać plazmidy RNAI w celu badania funkcji genów podczas rozwoju rurki neuralnej w sposób specyficzny dla danego typu komórek.

in-ovo-electroporation-mirna-based-plasmids-developing-neural-tube

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

In ovo Elektroporacja plazmidów opartych na miRNA w rozwijającej się rurce nerwowej i ocena fenotypu przez wstrzyknięcie DiI w preparatach typu open-book

W niniejszym filmie zaprezentowano sposób wizualizacji szlaków aksonalnych genetycznie zdefiniowanych grup neuronów w embrionalnym rdzeniu kręgowym kurczaka, z wykorzystaniem elektroporacji in ovo genów reporterowych pod kontrolą specyficznych elementów enhancera.

Rozszyfrowanie dróg aksonalnych genetycznie zdefiniowanych grup neuronów w cewie nerwowej kurczaka z wykorzystaniem elektroporacji in ovo

In utero elektroporacja jest cenną metodą transfekcji neuronalnych komórek progenitorowych in vivo. W zależności od rozmieszczenia elektrod oraz momentu rozwojowego przeprowadzenia elektroporacji, można ukierunkować proces na określone podgrupy komórek kory mózgowej. Następnie komórki docelowe można analizować in vivo lub in vitro pod kątem efektów modyfikacji genetycznych.

Elektroporacja in utero z następującą po niej pierwotną hodowlą neuronów w celu badania funkcji genów w podzbiorze neuronów korowych

In utero elektroporacja umożliwia szybkie dostarczanie genów w sposób kontrolowany przestrzennie i czasowo do rozwijającego się ośrodkowego układu nerwowego (OUN). W niniejszej pracy opisujemy wysoce adaptowalny protokół elektroporacji in utero, który może być wykorzystany do dostarczania konstruktów ekspresyjnych do wielu embrionalnych domen OUN, w tym do telencefalonu, diencefalonu i siatkówki.

Efektywne dostarczanie genów do wielu obszarów OUN z wykorzystaniem elektroporacji in utero

Niniejsza praca opisuje opracowanie techniki elektroporacji in vitro, która umożliwia manipulację ekspresją genów w dolnej części wargi rombowej embrionów w połowie okresu gestacji.

In vitro elektroporacja dolnej wargi rombowej zarodków myszy w połowie okresu gestacji

W celu oceny funkcji i regulacji genów podczas rozwoju dopaminergicznych neuronów śródmózgowia opisujemy metodę obejmującą elektroporację in ovo konstruktów plazmidowego DNA do embrionalnych progenitorów dopaminergicznych neuronów brzusznej części śródmózgowia kurczaka. Technika ta może być wykorzystana do uzyskania wydajnej ekspresji genów zainteresowania w celu zbadania różnych aspektów rozwoju śródmózgowia i różnicowania neuronów dopaminergicznych.

In ovo elektroporacja śródmózgowia kurczaka w celu badania funkcji genów w rozwoju neuronów dopaminergicznych

Kontrola ekspansji somatycznych komórek macierzystych jest głównym czynnikiem utrudniającym ich badanie oraz zastosowanie w terapii. W niniejszym opracowaniu opisujemy system czasowej kontroli ekspansji neuronalnych komórek macierzystych podczas rozwoju oraz w wieku dorosłym, który może zostać wykorzystany do zwiększenia liczby neuronów generowanych w mózgu myszy.

Ekspansja embrionalnych i dorosłych komórek macierzystych układu nerwowego poprzez elektroporację in utero lub stereotaksycyjne wstrzyknięcie wirusowe

Ekspresja ektopowa to jedna z technik wyjaśniających rolę mikroRNA w rozwoju mózgu. Jednak celowanie w określone obszary za pomocą elektroporacji in ovo jest trudne. Tutaj pokazujemy skuteczny sposób selektywnego elektroportowania brzusznych i grzbietowych obszarów śródmózgowia.

In ovo Ekspresja mikroRNA w brzusznym śródmózgowiu piskląt

Prezentujemy przejściową transgenezę i knockdown genu u Ciona intestinalis, siostrzanej grupie strunowców kręgowców, przy użyciu technik mikroiniekcji i elektroporacji. Takie metody ułatwiają genomikę funkcjonalną u tego prostego bezkręgowca, który charakteryzuje się podstawowymi cechami kręgowców, w tym struną grzbietową i nabłonkiem czuciowym głowy, a także wieloma ortologiami genów związanych z chorobami ludzkimi.

Mikroiniekcja zarodka i elektroporacja w jelicie strunowca Ciona

Opracowaliśmy nowatorskie podejście do utraty funkcji, które polega na wprowadzeniu i genomowej integracji sztucznych sekwencji mikro-RNA w zarodkach piskląt za pomocą elektroporacji in ovo i systemu transpozonów Tol2. Technika ta zapewnia solidną i stabilną metodologię knockdownu genów do badań funkcji genów podczas rozwoju.

Podejście do utraty funkcji w embrionalnej siatkówce pisklęcia przy użyciu transgenicznej ekspresji sztucznych mikroRNA za pośrednictwem transpozonu Tol2

W tym protokole opisujemy, jak wstrzyknąć lentiwirusowi do mysiej jamy owodniowej w E7.5, prowadząc do jednolitej transdukcji całej płytki nerwowej, przy minimalnym szkodliwym wpływie na przeżycie lub rozwój embrionalny.

Celowanie w mysią płytkę nerwową za pomocą nanoiniekcji in utero (NEPTUNE) w 7. dniu embrionalnym

Poznaj metodę in ovo elektroporacji plazmidów miRNA w cewie nerwowej kurczaka, umożliwiającą specyficzne wyciszanie genów i ocenę defektów prowadzenia aksonów komisuralnych. Technika ta pozwala na precyzyjne badanie rozwoju układu nerwowego.

In ovo Elektroporacja plazmidów opartych na miRNA w rozwijającej się cewie nerwowej i ocena fenotypów przez wstrzyknięcie DiI w preparatach z otwartą książką (Wideo) | JoVE Journal

In ovo elektroporacja plazmidów opartych na miRNA w rozwijającej się rurze neuronalnej i ocena fenotypów poprzez wstrzykiwanie DiI w preparatach typu open-book

Przeglądaj więcej filmów