Cytometria masowa: Protokół codziennego dostrajania i uruchamiania próbek komórek na cytometrze masowym CyTOF

Celem remontu tej procedury jest zademonstrowanie prawidłowego codziennego strojenia i analizy próbki na instrumencie CyTOF. Najpierw maszyna jest montowana i włączana. Następnie ustawienia instrumentu są optymalizowane pod kątem dostrojenia do maksymalnego sygnału.

Maszyna jest wtedy gotowa do uruchomienia próbek. W ostatnim kroku maszyna jest czyszczona i wyłączana. Ostatecznie, optymalne dane komórkowe mogą być pozyskiwane zgodnie z określonymi wymaganiami czasowymi.

Wizualna demonstracja tej techniki ma kluczowe znaczenie. Codzienne procedury konfiguracji, strojenia i czyszczenia są trudne do nauczenia się z instrukcji. Ponieważ w grę wchodzi wiele jednoczesnych kroków oprogramowania.

Musisz zdobyć doświadczenie, aby wyczuć odpowiednie poziomy tła i intensywność sygnału co najmniej 15 minut przed rozpoczęciem eksperymentu. Otwórz oprogramowanie CyTOF i wybierz konfigurację urządzenia. Następnie w zakładce klatki na karty kliknij przycisk włączania grzałki, aby płaszcz komory natryskowej osiągnął 200 stopni Celsjusza.

Wymienić strzykawkę w pompie strzykawkowej na świeżą strzykawkę wypełnioną wodą o mili sześciance. Następnie wyczyść nebulizator, dwukrotnie przepłukując go 5% Citronem przez port dosięgowy. Aby usunąć resztki cytryny, powtórz płukanie wsteczne wodą Milli Q.

Następnie otwórz zawór zbiornika gazu argonowego, co spowoduje włączenie się kontrolki Argonne z przodu maszyny. Następnie podłącz nebulizator do wlotu gazu do uzupełniania i podłącz nebulizator do rurki wprowadzającej płyn. Włóż koniec nebulizatora do białego otworu w płaszczu grzewczym na karcie sterownika RFG w oknie ustawień przyrządu.

Kliknij uruchom plazmę, a następnie kliknij OK. Po zakończeniu uruchamiania ponownie kliknij OK w wyskakującym okienku. Teraz włącz pompę strzykawkową.

Podczas napełniania strzykawki należy nacisnąć przycisk stop, a nie przycisk pauzy, aby zresetować licznik głośności Przed kalibracją cytometru masowego należy upewnić się, że nagrzewał się przez 20 minut. Po ustabilizowaniu się urządzenia kliknij przycisk ustawień akwizycji, aby otworzyć okno ustawień akwizycji danych. W zakładce anality.

Kliknij układ okresowy pierwiastków, aby otworzyć panel wyboru izotopów. Następnie wybierz izotopy w rozwiązaniu do strojenia DVS sciences wymienionym w instrukcji i kliknij Zapisz. Następnie kliknij przycisk izotopów na odczyt, aby otworzyć okno mas na odczyt.

Wybierz opcję zliczania impulsów i przeskaluj oś y, wprowadzając nową liczbę, a następnie naciskając Enter. Teraz napełnij zieloną strzykawkę do wstrzykiwań o pojemności jednego mililitra roztworem strojącym. Obróć selektor portów próbki, aby załadować.

Wstrzyknij 450 mikrolitrów roztworu strojeniowego, a następnie przekręć selektor, aby wstrzyknąć. Poczekaj, aż izotopy roztworu strojeniowego zaczną pojawiać się jako smugi na tym wyświetlaczu. Sygnały w czasie lotu, od 9 400 do 9 800, są spowodowane izotopami ksenonu w gazie argonowym.

Teraz wróć do okna mas na czytanie i kliknij zielony przycisk odtwarzania. Każda kolorowa linia reprezentuje wybrane izotopy z zakładki anality. Gdy poziomy izotopów są stabilne, dostosuj bieżący prąd wyboru z menu rozwijanego w zakładce parametrów w oknie ustawień akwizycji danych.

W oknie uruchamiania wprowadź zero w polu zakończenie, wprowadź wartość 10. W polu Wartość kroku wprowadź wartość 0,5, a w polu Czas ustalania wprowadź wartość 200. Następnie kliknij Zapisz.

Następnie kliknij z powrotem na okno mas na czytanie i kliknij odtwórz. Po zanotowaniu, gdzie sygnały izotopów osiągają szczyt, przejdź do zakładki ustawień kanału DAC w oknie ustawień instrumentu. Przewiń w dół do pozycji bieżącej i wprowadź wartość piku izotopu.

Kliknij opcję Ustaw bieżącą wartość rzeczywistą, a następnie zapisz. Następnie zmień menu rozwijane, aby uzupełnić gaz. Wprowadź 0,55 w oknie początkowym, 0,95 w oknie końcowym, 0,05 w oknie wartości kroku i 200 w oknie czasu ustalania.

Kliknij Zapisz. Po powrocie do okna mas na odczyt i ponownym kliknięciu przycisku odtwarzania, oś x będzie teraz wyświetlać natężenie przepływu gazu uzupełniającego. Zwróć uwagę na wartości, w których sygnały izotopów osiągają szczyt i obserwuj szybki wzrost sygnału GD 1 55 pod koniec.

Następnie wróć do zakładki ustawień kanału DAC. Przewiń w dół do pozycji uzupełniania, gazu i wprowadź nową wartość piku izotopu. Kliknij opcję Ustaw rzeczywistą bieżącą wartość.

Następnie ponownie kliknij przycisk Zapisz, aby zapisać stosunek pożądanego izotopu do tlenku. Najpierw wykonaj drugi zastrzyk 450 mikrolitrów roztworu strojenia. Następnie na karcie parametrów wybierz czas z menu rozwijanego i wprowadź zero w oknie początkowym, 10 w oknie końcowym, jeden w oknie wartości kroku i 200 w oknie rozliczeniowym.

Po kliknięciu przycisku odtwarzania w oknie mas na odczyt, użyj kursora, aby odczytać wyższą wartość dla TM 1 69 lub TB 1 59, a także wartość GD 1 55. Teraz wstrzyknij trzy mililitry wody Milli Q przez pętlę próbki, a następnie 500 mikrolitrów roztworu do płukania DVS. W zakładce kalibracji masy kliknij przycisk uruchom, aby monitorować postęp mycia do momentu, gdy intensywność smug zacznie się zmniejszać.

Następnie dodaj trzy mililitry wody w kształcie milikostki i monitoruj, aż smugi spadną do poziomu tła. Zacznij od wprowadzenia izotopów próbki, które właśnie zademonstrowano dla izotopów roztworu strojenia, a następnie kliknij przycisk Zapisz. Następnie otwórz okno akwizycji i zmień ustawienia akwizycji zgodnie z potrzebami dla objętości próbki.

Na przykład próbka o pojemności 450 mikrolitrów wypełni pętlę próbki i zajmie 600 sekund, aby uwzględnić opóźnienia w pozyskiwaniu danych z komórki. Ustaw opóźnienie akwizycji na co najmniej 30 sekund, a opóźnienie stabilności detektora na co najmniej 20 sekund przed uruchomieniem. Przemyć próbki komórek co najmniej dwukrotnie wodą o mili sześciennej, a następnie ponownie zawiesić próbkę w maksymalnej ilości 10 do sześciu komórek na mililitr i przefiltrować otrzymany roztwór komórek przez sitko o pojemności 35 mikrometrów.

Aby usunąć wszelkie agregaty. Teraz wprowadź nową nazwę pliku dla bieżącej próbki. Pamiętaj, że wszystkie pliki muszą być zapisane na dysku E.

Następnie przełącz zawór pętli próbki na załadowanie, wstrzyknij próbkę, przełącz zawór pętli próbki z powrotem na wtrysk, a następnie kliknij przycisk uruchom. W oknie akwizycji. Komórki będą reprezentowane w oknie migawki jako poziome zbiory znaczników w każdym pionowym kanale izotopowym i będą wykazywać najlepszą rozdzielczość około 300 do 500 komórek na sekundę, jak pokazano tutaj.

Po zakończeniu pobierania danych z próbki pojawi się wyskakujące okienko. Kliknij przycisk OK, aby potwierdzić zakończenie przebiegu próbki, a następnie wstrzyknij co najmniej 500 mikrolitrów wody MQ między każdą próbką, aby zminimalizować przenoszenie próbki w celu oczyszczenia maszyny Po użyciu wstrzyknąć 450 mikrolitrów roztworu płuczącego do pętli próbki. Monitoruj uwalnianie wolnego metalu, a następnie przepłucz pętlę próbki trzema mililitrami wody mili Q, monitorując mycie, aż do osiągnięcia poziomów smug tła.

Następnie, aby wyłączyć urządzenie, wybierz zakładkę Kontroler RFG w oknie konfiguracji przyrządu i kliknij przycisk zatrzymaj plazmę. Po zakończeniu procedury kliknij OK w wyskakującym okienku, zalecając usunięcie nebulizatora pod zakładką klatki karty. Wyłącz grzałkę, zamknij zawór na dopływie argonne, a następnie ostrożnie pociągnij nebulizator do tyłu, aby wyjąć go z komory natryskowej.

Następnie odkręć rurkę wprowadzającą próbkę i odłóż ją na bok. Odkręć przyłącze wprowadzania gazu do makijażu, aż lekko się poluzuje, a następnie zdejmij nebulizator. Na koniec, używając tej samej strzykawki i rurki, jak pokazano wcześniej, wyczyść oba porty nebulizatora za pomocą 5%Citron i przechowuj nebulizator pokryty 5%Citronem do następnego użycia.

Odpowiednie mycie cytometru masowego wodą UE i roztworem płuczącym DVS zmniejszy poziom absorpcji metalu przez rurkę i inne części maszyny, pomagając zredukować tło, jak widać na tych wykresach. Niewłaściwe strojenie reprezentowane przez linię magenta znacznie zwiększyło tworzenie się tlenków na m plus 16 w porównaniu z prawidłowo dostrojoną próbką, jak pokazano na ciemnoniebieskiej linii. Powoduje to nieznaczne zmniejszenie pożądanych sygnałów na poziomie m i znaczne zwiększenie niepożądanych zakłóceń tła na poziomie m plus 16.

Właściwe mycie i właściwe rozcieńczanie próbek w wodzie Milli Q zapewni minimalne tło i największą rozdzielczość komórek, jednocześnie równoważąc potrzebę prędkości. Podobnie jak dane z reprezentatywnego eksperymentu pokazanego w tym eksperymencie, kulki polistyrenowe zawierające naturalną obfitość lantanu 1 39 ODIUM one 40, TERB 1 59, DIUM 1 69 i LUTET 1 75 zostały uruchomione w trybie akwizycji komórek. Dane zostały przeanalizowane za pomocą FlowJo, a zanieczyszczenia z wszelkich złamanych koralików zostały zablokowane.

Prawidłowo dostrojona próbka została określona jako o natężeniu przepływu 0,74 litra na minutę, jak pokazano ciemnoniebieską linią. Przy tym natężeniu przepływu zaobserwowano wyższe natężenie sygnału niż przy niższych natężeniach przepływu, a ta prawidłowo dostrojona próbka wykazała się wyższym sygnałem przy masach metalu M i mniejszym sygnałem przy masach m plus 16 tlenków niż nieprawidłowo dostrojone sygnały. Zbliżenie sygnału o masie M LANTHANUM 1 39 i THULIUM 1 69 pokazane jest tutaj.

Należy zauważyć, że natężenie przepływu gazu uzupełniającego wpływa na intensywność sygnału LANTHANUM 1 39 bardziej niż na intensywność sygnału tulu 1 69. Wykresy te pokazują sygnał o masach tlenków 1 55 i 180 5 plus m plus 180 5 odpowiadających odpowiednio tlenkom lantanu 1 39 plus oh 16 i tulu 1 69 plus oh 16. Należy zauważyć, że natężenie przepływu gazu uzupełniającego zwiększa sygnał o masie 1 55 znacznie bardziej niż sygnał o masie 180 5, ponieważ lantan 1 39 łatwiej utlenia się niż tul 1 69.

Poniżej przedstawiono intensywność sygnału m i m plus 16 w funkcji natężenia przepływu gazu uzupełniającego. Wypełnione ikony reprezentują MASĘ M. Podczas gdy otwarte ikony reprezentują masę M plus 16, kolory linii odpowiadają odpowiedniej masie M. Należy zauważyć, że intensywność sygnału LANTHANUM 1 39 i cena ODIUM 1 41 są w dużym stopniu uzależnione od natężenia przepływu gazu uzupełniającego. Nawet osiągając punkt, w którym występuje więcej masy m plus 16 tlenku niż masa M. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak prawidłowo uruchomić CyTOF, dostroić go, następnie uruchomić próbki, a na koniec odpowiednio wyczyścić i wyłączyć maszynę pod koniec codziennych biegów.