Name: Cytometria masowa: Protokół codziennego dostrajania i uruchamiania próbek komórek na cytometrze masowym CyTOF (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Naucz się codziennego dostrajania cytometru masowego CyTOF dla analizy komórkowej. Ten protokół pokazuje optymalizację ustawień, przygotowanie próbek i procedury czyszczenia, aby uzyskać wysokiej jakości dane.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować dr Evanowi Newellowi i dr Seanowi Bendallowi za uwagi. Chcielibyśmy również podziękować firmie DVS Sciences oraz dr Seanowi Bendallowi za dostarczenie próbki polistyrenowych kulek zawierających wiele lantanowców. Jesteśmy wdzięczni za finansowanie z grantu NIH 2 U19 AI057229.

Wszystkie próbki komórek do analizy CyTOF muszą zostać utrwalone i permeabilizowane. Umożliwia to lepszą penetrację interkalatora DNA zawierającego iryd oraz zapobiega lizie komórek podczas etapów płukania wodą MilliQ i resuspensji bezpośrednio przed wstrzyknięciem do cytometru masowego.
1. Uruchamianie cytometru masowego
<ol>
 <li>Uruchom program oprogramowania CyTOF. Wybierz Instrument Setup. W karcie Card Cage przejdź do prawego dolnego rogu i kliknij przycisk Heater „ON”. Włącz grzałkę co najmniej 15 min przed planowanym rozpoczęciem pracy, aby zapewnić odpowiedni czas na osiągnięcie przez płaszcz komory rozpylnej temperatury 200 °C.</li>
 <li>Zastąp białą strzykawkę Norm-Ject 3 ml w pompie strzykawkowej nową strzykawką wypełnioną wodą MilliQ.</li>
 <li>Czyszczenie nebulizatora. Przepłucz nebulizator w kierunku odwrotnym, używając strzykawki i prowadnicy do przeciągnięcia 5% citranox 2-3 razy zarówno przez mniejszy port doprowadzania cieczy, jak i większy port doprowadzania gazu. Powtórz płukanie wsteczne wodą MilliQ, aby usunąć pozostałości citranox.</li>
 <li>Sprawdź, czy kontrolki na przednim panelu CyTOF świecą się zgodnie z Rysunkiem 1.</li>
 </ol>
 <img alt="Panel sterowania cytometru masowego, konfiguracja CyTOF do analizy komórkowej, wskaźnik wyłączonego osprzętu plazmowego." src="/files/ftp_upload/4398/4398fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
 Rysunek 1. Podświetlenie panelu CyTOF przed uruchomieniem.
 <ol start="5">
 <li>Otwórz zawór butli z argonem. Powinno to spowodować zapalenie się kontrolki „ARGON” na przednim panelu.</li>
 <li>Podłącz nebulizator do wlotu gazu pomocniczego. Odkręć złącze rurki gazu pomocniczego, a następnie wyjmij czarną gumową uszczelkę o-ring oraz biały stożkowy element plastikowy. Zwróć uwagę na szerszy „wyrostek” na trzpieniu portu doprowadzania gazu w nebulizatorze. Umieść złącze na porcie doprowadzania gazu. Nałóż czarną uszczelkę o-ring na koniec portu gazowego i nasuń ją za szerszą część trzpienia portu. Na górze umieść biały stożkowy element plastikowy wąskim końcem na zewnątrz i przykręć go do rurki gazu pomocniczego.</li>
 <li>Podłącz nebulizator do rurki doprowadzającej ciecz. Ostrożnie włóż cienką rurkę do otworu na końcu nebulizatora. Odczuwalne będą dwa opory, podobne do tych w mikropipecie. Po pierwsze, dociskaj do momentu poczucia lekkiego oporu; koniec cienkiej rurki powinien znajdować się na końcu prostej sekcji szklanej. Po drugie, dociśnij mocniej, aby wprowadzić koniec prostej sekcji szklanej głębiej do złącza, a następnie dokręć śrubę mocującą, aby zapewnić szczelność. Włóż koniec nebulizatora do białego otworu w płaszczu grzejnym.</li>
 <li>W zakładce RFG Controller okna Instrument Setup naciśnij „Start Plasma”. Ponieważ nebulizator jest już włożony, naciśnij „OK”. Oprogramowanie uruchomi chłodziarkę, rozpocznie przepływ gazu i wzbudzi plazmę. Napięcie detektora zacznie rosnąć. Po zakończeniu procesu pojawi się okno z komunikatem „Plasma start-up sequence has finished successfully”; naciśnij „OK”. Na panelu przednim powinny zapalić się nowe kontrolki (Rycina 2).</li>
</ol>
<img alt="Panel sterowania cytometru masowego CyTOF z wskaźnikami stanu plazmy, chłodzenia i gazu argonowego." src="/files/ftp_upload/4398/4398fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
 Rycina 2. Kontrolki panelu CyTOF po zapłonie plazmy i pomyślnym zakończeniu uruchamiania.
 <ol start="9">
 <li>Uruchomienie pompy strzykawkowej. W prawym górnym rogu naciśnij zielony przycisk „play”, aby uruchomić pompę strzykawkową i rozpocząć przepływ cieczy przez rurki oraz rozpylanie z nebulizatora. Domyślne ustawienia strzykawki są przeznaczone dla 3 ml wody. Aby próbka mogła przepływać przez pętlę próbkową, pompę strzykawkową należy okresowo uzupełniać po wyczerpaniu zapasu wody. Na górze ekranu znajduje się licznik wskazujący ilość cieczy, która wypłynęła z pompy strzykawkowej. Pompa strzykawkowa zatrzyma się, gdy licznik ten osiągnie wartość „3.000” lub gdy tłok dotrze do końca strzykawki. Podczas ponownego napełniania strzykawki należy nacisnąć „stop”, a nie niebieski przycisk „pause”, aby zresetować licznik.</li>
</ol>
2. Codzienna kalibracja cytometru masowego
<ol>
 <li>Cytometr masowy będzie potrzebował około 20 min na osiągnięcie gorącej, stabilnej plazmy przed kalibracją. Celem kroków strojenia jest maksymalizacja pożądanego sygnału Tm169 lub Tb159 przy jednoczesnym utrzymaniu sygnału „Gd155” (tlenek; La139+O16) poniżej 3% wyższej wartości. Kliknij przycisk Acquisition Settings, aby otworzyć okno Data Acquisition Settings. W karcie Analytes kliknij tablicę pierwiastków, aby otworzyć panel wyboru izotopów. Wybierz izotopy obecne w roztworze strojącym DVS Sciences wymienione w instrukcji, a następnie kliknij „save”.</li>
 <li>Kliknij przycisk Isotopes Per Reading, aby otworzyć okno Mass(es) Per Reading. Wybierz „Pulses Count”, a następnie zmień skalę osi y, wpisując nową liczbę i naciskając „enter”.</li>
 <li>Napełnij zieloną strzykawkę Norm-Ject o pojemności 1 ml roztworem strojącym. Przekręć przełącznik portu próbkowania na „LOAD”, wstrzyknij 450 μl roztworu strojącego, a następnie przekręć przełącznik na „INJECT”. W karcie Mass Calibration okna Data Acquisition Settings naciśnij „Run”, aby monitorować przepływające masy. Lewa strona okna odpowiada niższym masom, natomiast prawa strona wyższym masom. Uwaga: w obszarze TOF 9400-9800 będą już widoczne sygnały ze względu na izotopy ksenonu w gazie argonowym (Rysunek 3). Czekaj, aż izotopy roztworu strojącego zaczną pojawiać się w tym widoku w formie smug (Rysunek 4).</li>
 </ol>
 <img alt="Schemat spektrometrii mas TOF; konfiguracja akwizycji danych; kalibracja masy; analiza czasu przelotu." src="/files/ftp_upload/4398/4398fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
 Rycina 3. Okno karty kalibracji masy, przedstawiające poziomy tła dla różnych izotopów po płukaniu roztworem myjącym i wodą. Obszar wokół TOF 9400-9800 odpowiada izotopom ksenonu w gazie argonowym i powinien być zawsze obecny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig3large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą figurę</a>.
<img alt="Wykres spektrometrii mas czasu przelotu; analiza danych spektralnych pokazująca separację jonów." src="/files/ftp_upload/4398/4398fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
 Rycina 4. Okno karty kalibracji masy, pokazujące pionowe pasy dla różnych izotopów w roztworze strojącym DVS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig4large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę</a>.
 <ol start="4">
 <li>Powróć do okna Mass(es) Per Reading i naciśnij zielony przycisk „Play” w lewym górnym rogu. Każdy izotop wybrany w kroku 2.1 jest reprezentowany przez linię o innym kolorze. Domyślną osią x jest „Time” (czas) w sec. Monitoruj poziomy poszczególnych izotopów do momentu ich ustabilizowania się.</li>
 <li>Strojenie prądu. W karcie Parameter okna Data Acquisition Settings wybierz „Current” z menu rozwijanego. Ustaw start=0, finish=10, step value=0.5, settling time=200 i naciśnij „save”. Kliknij ponownie w oknie Mass(es) Per Reading i naciśnij play. Osią x jest teraz „Current” (prąd). Odnotuj i zapisz wartości, przy których sygnały izotopów osiągają szczyt (Rycina 5). W karcie DAC Channels Setup okna Instrument Setup przewiń w dół do pozycji „Current” i wprowadź tę nową wartość. Naciśnij „Set actual current value”, a następnie „save”.</li>
 </ol>
 <img alt="Wykres spektrometrii masowej, intensywność względem masy, pokazujący izotopy (Xe, Cs, La) w analizie zliczeń impulsów." src="/files/ftp_upload/4398/4398fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
 Rysunek 5. Aktualny profil strojenia.
 <ol start="6">
 <li>Dostrojenie gazu doprowadzającego. Zmień menu rozwijane na „Make-up gas”. Ustaw start=0,55, end=0,95, step value=0,05, settling time=200. Naciśnij save. Powróć do okna Mass(es) Per Reading i naciśnij play. Oś x reprezentuje teraz natężenie przepływu gazu doprowadzającego („Make-up gas”). Zapisz wartości, przy których sygnały izotopów osiągają maksimum. Zwróć uwagę na gwałtowny wzrost sygnału „Gd155” pod koniec pomiaru (Rysunek 6). Powróć do karty DAC Channels Setup, przesuń widok w dół do sekcji „Make-up gas” i wprowadź tę nową wartość. Naciśnij „Set actual current value”, a następnie „save”.</li>
</ol>
<img alt="Wykres liczby impulsów spektrometrii mas dla pierwiastków od Xe do Ir, pokazujący zmienność intensywności widma." src="/files/ftp_upload/4398/4398fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 6"> 
 Rycina 6. Profil strojenia gazu uzupełniającego.
 <ol start="7">
 <li>Rejestracja stosunku pożądanego izotopu do tlenku. Wykonaj drugi wtrysk 450 μl roztworu strojącego. W karcie Parameter wybierz z menu rozwijanego opcję „Time”, ustaw start=0, end=10, step value=1, settling time=200. Naciśnij „save”. Kliknij „play” w oknie Mass(es) Per Reading. Po ustabilizowaniu się linii (Rycina 7) użyj kursora, aby odczytać wartości w górnych lewych polach dla Tm169 lub Tb159 (wyższa wartość) oraz wartość dla „Gd155” (&lt;3% wyższej wartości). Wartości te można również zapisać w pliku strojącym do późniejszego wykorzystania.</li>
 </ol>
 <img alt="Wykres spektrometrii masowej przedstawia liczbę impulsów izotopowych w czasie dla pierwiastków takich jak Xe i Gd." src="/files/ftp_upload/4398/4398fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 7"> 
 Rysunek 7. Pomiar intensywności sygnałów roztworu strojącego po optymalizacji prądu oraz gazu wyrównawczego.
 <ol start="8">
 <li>Czyszczenie pętli próbkowej. Wstrzyknij 3 ml wody MilliQ przez pętlę próbkową, a następnie 500 μl roztworu myjącego DVS Wash Solution. Monitoruj przebieg czyszczenia, naciskając „run” w zakładce Mass Calibration. Myj do momentu, aż intensywność smug (Rysunek 4) zacznie spadać, a następnie podaj 3 ml wody MilliQ i monitoruj proces aż do osiągnięcia poziomów tła (Rysunek 3).</li>
</ol>
3. Analiza próbek
<ol>
 <li>Otwórz okno Acquisition. Ustawienia domyślne: Do Analysis = On-The-Fly, Signal to Analyze = Dual, Dual Count Calibration = Data. Wybrana jest opcja Noise Reduction. Każde z tych ustawień można zmienić w razie potrzeby. Wprowadź nazwę pliku. Wszystkie pliki MUSZĄ zostać zapisane na dysku E://.</li>
 <li>Ustawianie opóźnień akwizycji. Ze względu na długość rurek między pętlą próbkową a nebulizatorem wystąpi niewielkie opóźnienie w rejestrowaniu zdarzeń komórkowych, wynoszące około 30 s. W związku z tym suma „Acquisition delay” i „Detector stability delay” powinna wynosić co najmniej 30 s. Opóźnienie stabilizacji detektora (Detector stability delay) powinno wynosić co najmniej 20 s.</li>
 <li>Ustawianie czasu zbierania danych. „Acquisition time” to liczba sekund, przez które próbka ma być analizowana. Wypełnienie całej pętli próbkowej o pojemności 450 μl wymagałoby 600 s do zakończenia procesu. Sugeruje się dodanie od 50 do 100 s do czasu zakończenia pomiaru, aby zminimalizować przeniesienie próbki (carry-over).</li>
 <li>Resuspensja próbki. Aby zminimalizować odkładanie się soli w urządzeniu, sugeruje się wykonanie co najmniej dwóch płukań wodą MilliQ po zakończeniu barwienia komórek, a następnie końcową resuspensję w wodzie MilliQ. Objętość wody MilliQ użytej do resuspensji osadu komórkowego będzie zależeć od liczby komórek wyjściowych oraz odzysków komórkowych po całej procedurze barwienia. Dobrym punktem wyjścia jest 106 (wyjściowych) komórek/ml. Po resuspensji przefiltruj próbkę przez sitko do komórek, aby usunąć agregaty.</li>
 <li>Rozpoczęcie pomiaru próbki. Wprowadź nową nazwę pliku dla bieżącej próbki. Przełącz zawór pętli próbkowej na pozycję „LOAD”, wstrzyknij próbkę, przełącz z powrotem na „INJECT”, a następnie kliknij „Run” w oknie Acquisition.</li>
 <li>Rejestrowanie zdarzeń komórkowych. Komórki będą reprezentowane w oknie podglądu (snapshot window) jako poziome skupiska oznaczeń w każdym pionowym kanale izotopu/markera (Rysunek 8). Choć cytometr masowy może rejestrować 1 000 komórek/s, lepsza rozdzielczość między zdarzeniami komórkowymi jest zazwyczaj uzyskiwana przy 300-500 komórkach/s. Odpowiada to średnio ~1 komórce na odświeżenie ekranu. Przed rozpoczęciem wzrostu licznika zdarzeń komórkowych może minąć do 30 s. Wynika to z przetwarzania danych w trybie „On-the-fly”; żadne informacje o zdarzeniach komórkowych nie zostają utracone.</li>
 </ol>
<img alt="Analiza danych z cytometrii przepływowej, wykres intensywności fluorescencji, system kwantyfikacji populacji komórek." src="/files/ftp_upload/4398/4398fig8.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 8"> 
 Rycina 8. Okno akwizycji podczas analizy próbki, przedstawiające poziome rzędy punktów odpowiadających elementom powiązanym z trzema oddzielnymi zdarzeniami komórkowymi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig8large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę</a>.
 <ol start="7">
 <li>Jakość zdarzeń komórkowych. Należy zwrócić uwagę na wszelkie smugi tła w każdym kanale izotopowym, a także na częstotliwość zdarzeń komórkowych. Cytometr masowy rozpoznaje „zdarzenie komórkowe” jako określony wzrost sygnału powyżej poziomu tła, zatem sygnał tła pochodzący z wolnych metali lub niezwiązanych przeciwciał może zmienić liczbę „zdarzeń komórkowych”. Dodatkowo, analiza komórek przy zbyt wysokim stężeniu może spowodować zwiększoną liczbę zdarzeń typu dublet. Tło można zmniejszyć poprzez dodatkowe przemycia lub większe rozcieńczenie komórek. Liczbę dubletów można zminimalizować poprzez większe rozcieńczenie komórek, kosztem wydłużonego czasu analizy.</li>
 <li>Zakończenie akwizycji danych z próbki. Po osiągnięciu czasu akwizycji zbieranie danych zostanie zakończone. Przed pojawieniem się okna wyskakującego z przyciskiem „OK” wystąpi niewielkie opóźnienie; wynika ono ponownie z przetwarzania danych w czasie rzeczywistym („On-the-Fly”). Akwizycję próbki można również przerwać przedwcześnie, naciskając przycisk „Stop”. W takim przypadku wszystkie zarejestrowane już zdarzenia komórkowe zostaną policzone i zapisane w plikach wyjściowych.</li>
 <li>Wtryskiwanie co najmniej 500 μl wody MilliQ pomiędzy każdą próbką pomaga również zminimalizować przenoszenie resztek próbki (carryover).</li>
</ol>
4. Czyszczenie urządzenia po użyciu
<ol>
 <li>Roztwór płuczący. Po analizie ostatniej próbki i przemyciu pętli próbkowania wodą, wstrzyknij 450 μl roztworu płuczącego do pętli próbkowania. Monitoruj uwalnianie wolnego metalu w karcie Kalibracji Masy (Mass Calibration) okna Ustawień Akwizycji Danych (Data Acquisition Settings) tak jak w kroku 2.8 (Rysunek 9). Gdy sygnał wolnego metalu zacznie spadać, przemyj układ 3 ml wody MilliQ i monitoruj proces, aż do osiągnięcia poziomu tła.</li>
</ol>
<img alt="Ekran akwizycji danych spektrometrii mas, wykres TOF, wyniki kalibracji masy, detekcja jonów." src="/files/ftp_upload/4398/4398fig9.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 9"> 
 Rycina 9. Okno karty kalibracji masy podczas czyszczenia po pomiarze przy użyciu roztworu DVS Wash. Pionowe prążki w obszarze TOF 9800-11000 to izotopy znaczników przeciwciał usuwane z urządzenia. Pionowe prążki wokół TOF 11500 odpowiadają dwóm izotopom interkalatora Ir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig9large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę</a>.
5. Wyłączanie urządzenia
<ol>
 <li>W zakładce RFG Controller okna Instrument Setup wybierz opcję „Stop Plasma”. Po zakończeniu procedury pojawi się okno pop-up z prośbą o usunięcie nebulizera. Naciśnij „OK”. W zakładce Card Cage wyłącz grzejnik. Zamknij zawór dopływu argonu.</li>
 <li>Usuwanie nebulizera. Usuń nebulizer z komory rozpylnej, ostrożnie wyciągając go do tyłu. Odkręć przewód doprowadzający próbkę z kroku 1.6 i odłóż na bok. Lekko poluzuj połączenie doprowadzające gaz pomocniczy, a następnie wyciągnij nebulizer. Pozostawienie złączki skręconej zmniejszy ryzyko zagubienia czarnego gumowego o-ringu i białego stożkowego elementu plastikowego.</li>
 <li>Czyszczenie nebulizera. Przepłucz wstecznie oba porty nebulizera 5% roztworem citranoxu, używając strzykawki i przewodu zgodnie z krokiem 1.3. Przechowuj pod przykryciem w 5% roztworze citranoxu do następnego użycia.</li>
</ol>

<ol><li>Bandura, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+cytometry%3A+Technique+for+real+time+single+cell+multitarget+immunoassay+based+on+inductively+coupled+plasma+Time-of-Flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass cytometry: Technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma Time-of-Flight mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 81, 6813-6822 (2009).</li>
<li>Lou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer-based+elemental+tags+for+sensitive+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.%2C+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Polymer-based elemental tags for sensitive bioassays.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 46, 6111-6114 (2007).</li>
<li>Majonis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curious+results+with+palladium-+and+platinum-carrying+polymers+in+mass+cytometry+bioassays+and+an+unexpected+application+as+a+dead+cell+stain%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Curious results with palladium- and platinum-carrying polymers in mass cytometry bioassays and an unexpected application as a dead cell stain.</a> Biomacromolecules. 12, 3997-4010 (2011).</li>
<li>Leipold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+mass+cytometry+methods+for+bacterial+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Development of mass cytometry methods for bacterial discrimination.</a> Anal. Biochem. 419, 1-8 (2011).</li>
<li>Bendall, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li>
<li>Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytometry+by+Time-of-Flight+shows+combinatorial+cytokine+expression+and+virus-specific+cell+niches+within+a+continuum+of+CD8%2B+T+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cytometry by Time-of-Flight shows combinatorial cytokine expression and virus-specific cell niches within a continuum of CD8+ T cell phenotypes.</a> Immunity. 36, 142-152 (2012).</li>
</ol>

Obaj autorzy pracują w Human Immune Monitoring Center, centrum usługowym na Uniwersytecie Stanforda, które pobiera opłaty od użytkowników wyłącznie w celu pokrycia kosztów analiz, w tym cytometrii masowej.

W ciągu ostatnich kilku dekad fluorescencyjna cytometria przepływowa stanowiła podstawową metodę analizy pojedynczych komórek, zarówno pod kątem ekspresji powierzchniowej, jak i w testach funkcjonalnych. Jednak problem nakładania się widm barwników fluorescencyjnych ograniczył liczbę markerów stosowanych jednocześnie. Choć opisano eksperymenty z wykorzystaniem ponad 12 jednoczesnych markerów, konieczny zakres kompensacji sprawia, że jest to trudne technicznie.
Zamiast fluoroforów, cytometria m...

<table><tbody><tr><td>Cytometr masowy CyTOF</td><td>DVS Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór płuczący</td><td>DVS Sciences</td><td>201071</td><td>0.05% kwasu fluorowodorowego w wodzie</td></tr><tr><td>Roztwór strojący</td><td>DVS Sciences</td><td>201072</td><td>0.5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, śladowa ilość kwasu azotowego</td></tr><tr><td>Kuleczki polistyrenowe zawierające Eu</td><td>DVS Sciences</td><td>201073</td><td>Zawierają izotopy Eu o naturalnej obfitości; kuleczki dostarczane w stężeniu około 1 milion/ml</td></tr><tr><td>Kuleczki polistyrenowe zawierające wiele lantanowców (La/Pr/Tb/Tm/Lu)</td><td>DVS Sciences</td><td>Obecnie niedostępne w sprzedaży</td><td>Zawierają izotopy wymienionych lantanowców o naturalnej obfitości</td></tr><tr><td>Kwas azotowy (stężony)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A467-500</td><td>Klasa ICP-MS Optima trace-metal pure</td></tr><tr><td>Polistyrenowa probówka z okrągłym dnem i nakrętką z filtrem do komórek-5 ml</td><td>BD</td><td>352235</td><td>używana do filtrowania próbek komórek przed wstrzyknięciem</td></tr><tr><td>Strzykawka tuberkulinowa Norm-Ject-1 ml</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4010-200V0</td><td>bez silikonu, bez lateksu</td></tr><tr><td>Strzykawka Norm-Ject-3 ml</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4010.000V0</td><td>bez silikonu, bez lateksu</td></tr><tr><td>Woda MilliQ</td><td></td><td></td><td>Woda czysta 18 M&amp;#937;; nie może być przechowywana w szklanych lub plastikowych butelkach mytych komercyjnym detergentem (ze względu na wysoką zawartość baru).</td></tr><tr><td>Citranox</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273236</td><td>detergent kwasowy</td></tr><tr><td>Gaz argonowy</td><td>Praxair</td><td>AR 5.0UH-T</td><td>99.999% ultra-wysoka czystość</td></tr></tbody></table>

cytometria masowa: protokół codziennego strojenia i analizy próbek komórek na cytometrze masowym cytof

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

W ostatnich latach szybka analiza pojedynczych komórek była powszechnie przeprowadzana z wykorzystaniem cytometrii przepływowej i przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie. Jednak problem nakładania się widm emisji fluoroforów ograniczył liczbę sond możliwych do jednoczesnego użycia. W przeciwieństwie do tego, nowy cytometr masowy CyTOF firmy DVS Sciences łączy system wprowadzania pojedynczych komórek w fazie ciekłej z ICP-MS.1 Zamiast fluoroforów, do przeciwciał lub innych specyficznych sond dołączane są polimery chelatujące zawierające silnie wzbogacone izotopy metali.2-5 Dzięki czystości metali i rozdzielczości masowej cytometru masowego nie występuje „nakładanie się widm” sąsiednich izotopów, a co za tym idzie, nie ma potrzeby stosowania macierzy kompensacyjnych. Ponadto, dzięki zastosowaniu lantanowców, nie występuje tło biologiczne, a zatem nie istnieje odpowiednik autofluorescencji. Przy oknie masowym obejmującym masę atomową 103-203 teoretycznie można by jednocześnie rozróżnić do 100 znaczników. Obecnie, dzięki odczynnikom chelatującym dostępnym w ofercie DVS Sciences, dostępnych jest ponad 35 kanałów, co pozwala na bezprecedensową analizę profilu immunologicznego próbek.6-7
Wady cytometrii masowej obejmują rygorystyczny wymóg stosowania oddzielnego izotopu metalu dla każdej sondy (brak odpowiedników rozproszenia przedniego lub bocznego) oraz fakt, że jest to technika destrukcyjna (brak możliwości odzyskania posortowanych komórek). Obecna konfiguracja cytometru masowego charakteryzuje się również współczynnikiem transmisji komórek na poziomie zaledwie ~25%, co wymaga zastosowania większej liczby komórek wejściowych.
Optymalne codzienne działanie cytometru masowego wymaga wykonania kilku kroków. Podstawowym celem optymalizacji jest maksymalizacja mierzonej intensywności sygnału pożądanych izotopów metali (M) przy jednoczesnym zminimalizowaniu tworzenia się tlenków (M+16), które obniżają intensywność sygnału M i zakłócają każdy pożądany sygnał przy M+16. Pierwszym krokiem jest rozgrzanie urządzenia, aby utworzyła się gorąca, stabilna plazma ICP. Po drugie, ustawienia prądu oraz szybkości przepływu gazu pomocniczego muszą być optymalizowane codziennie. Podczas zbierania próbek maksymalna częstotliwość zdarzeń komórkowych jest ograniczona przez wydajność detektora i szybkość przetwarzania do 1000 cells/sec. Jednakże, w zależności od jakości próbki, zazwyczaj pożądana jest niższa częstotliwość zdarzeń komórkowych (300-500 cells/sec), aby zapewnić lepszą rozdzielczość między zdarzeniami komórkowymi, a tym samym zmaksymalizować liczbę nienaruszonych singletów w stosunku do dubletów i debris. Na koniec, odpowiednie czyszczenie urządzenia na koniec dnia pomaga zminimalizować sygnał tła wynikający z obecności wolnych metali.

Postępowanie zgodnie z powyższym protokołem powinno przynieść cztery rezultaty. Po pierwsze, zapewnienie odpowiedniego czasu rozgrzewania cytometru masowego pozwoli na uzyskanie gorącej, stabilnej plazmy, niezbędnej do otrzymania optymalnego sygnału i minimalizacji tworzenia się tlenków. Po drugie, dokładne przemycie cytometru masowego wodą MilliQ i roztworem DVS Wash (Rysunek 9) pomoże zmniejszyć poziom adsorpcji metali na przewodach i innych częściach urządzenia, co przyczyni się do redukcji tła podcza...

Opisano kroki niezbędne do codziennego strojenia i optymalizacji wydajności cytometru masowego CyTOF. Omówiono uwagi dotyczące optymalnego przygotowania próbek oraz szybkości przepływu

Cytometria masowa: Protokół codziennego strojenia i analizy próbek komórek na cytometrze masowym CyTOF

W ostatnich latach szybka analiza pojedynczych komórek była powszechnie przeprowadzana z wykorzystaniem cytometrii przepływowej oraz przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie. Jednakże...

Głównym celem niniejszej procedury jest zaprezentowanie prawidłowego codziennego strojenia oraz analizy próbek na instrumencie CyTOF. W pierwszej kolejności urządzenie zostaje złożone i włączone. Następnie ustawienia instrumentu są optymalizowane w celu dostrojenia go do maksymalnego sygnału.Urządzenie jest następnie gotowe do analizy próbek. W ostatnim kroku urządzenie zostaje oczyszczone i wyłączone. W efekcie można uzyskać optymalne dane komórkowe zgodnie ze specyficznymi wymaganiami czasowymi.Wizualna demonstracja tej techniki jest kluczowa. Codzienne procedury konfiguracji, strojenia i czyszczenia są trudne do opanowania na podstawie instrukcji, ponieważ obejmują one wiele równoległych kroków w oprogramowaniu.Należy zdobyć doświadczenie, aby wyrobić sobie wyczucie odpowiednich poziomów tła i intensywności sygnału. Przynajmniej 15 minut przed rozpoczęciem eksperymentu należy uruchomić program oprogramowania CyTOF i wybrać konfigurację instrumentu. Następnie w zakładce koszyka kart należy kliknąć przycisk grzejnika, aby płaszcz komory rozpylającej osiągnął 200 °C.Wymień strzykawkę w pompie strzykawkowej na nową strzykawkę wypełnioną wodą milli cube. Następnie oczyść nebulizator,

mass-cytometry-protocol-for-daily-tuning-running-cell-samples-on

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Cytometria masowa: Protokół codziennego dostrajania i uruchomienia próbek komórkowych na masowym cytometrze CyTOF

Ten film przedstawia metodę proteomiczną pojedynczej komórki, która wykorzystuje przeciwciała sprzężone z metalami ciężkimi do odrębnego kodowania kreskowego komórek. Następnie stosuje się barwienie immunologiczne i cytometrię masową w celu oceny zmian immunologicznych fenotypowych i funkcjonalnych w ludzkich komórkach odpornościowych pochodzących z krwi pełnej.

Test kodów kreskowych do charakterystyki fenotypowej i funkcjonalnej komórek odpornościowych

Ten film ilustruje test oparty na cytometrii przepływowej do ilościowego oznaczania komórek raka starczego wywołanego terapią za pomocą podwójnych markerów starzenia. Wykrywanie i kwantyfikacja komórek starczych wymaga użycia substratu β-galaktozydazy. Substrat jest rozszczepiany przez aktywną lizosomalną β-galaktozydazę w komórkach starczych, wytwarzając produkt fluorescencyjny, który w połączeniu z granulkami autofluorescencyjnej lipofuscyny oznacza starcze komórki rakowe.

Kwantyfikacja starzejących się komórek nowotworowych wywołanych terapią za pomocą cytometrii przepływowej

Ten artykuł opisuje pobieranie i przetwarzanie próbek do analizy metodą cytometrii masowej.

Przygotowanie próbki do analizy cytometrii masowej

Tutaj opisujemy proteomiczne podejście pojedynczej komórki do oceny immunologicznych zmian fenotypowych i funkcjonalnych (indukcja cytokin wewnątrzkomórkowych) w próbkach krwi pełnej z obwodu, analizowanych za pomocą cytometrii masowej.

Jednokomórkowa analiza immunofenotypu i produkcji cytokin w obwodowej krwi pełnej za pomocą cytometrii masowej

Analiza cytometryczna przepływu okazała się przydatna do badania czystych kultur i monitorowania dynamiki społeczności mikroorganizmów. Przedstawiamy trzy kompleksowe przepływy pracy, od próbkowania po analizę danych, dla czystych kultur i złożonych społeczności, odpowiednio w przezroczystym podłożu, jak i w trudnych matrycach.

Charakterystyka dynamiki mikrobiomu – przepływy pracy oparte na cytometrii przepływowej od czystych kultur do naturalnych społeczności

Ten artykuł ilustruje potężną metodę ilościowego oznaczania mitochondriów lub lizosomów w żywych komórkach. Połączenie barwników specyficznych dla lizosomów lub mitochondriów z fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami przeciwko markerom powierzchniowym umożliwia ilościowe określenie tych organelli w mieszanych populacjach komórek, takich jak komórki pierwotne pobrane z próbek tkanek, przy użyciu wielobarwnej cytometrii przepływowej.

Kwantyfikacja mitochondriów i lizosomów w limfocytach T oparta na wielobarwnej cytometrii przepływowej

Ten protokół opisuje, jak izolować keratynocyty skóry od modeli mysich, barwić przeciwciałami znakowanymi metalem oraz analizować barwione komórki za pomocą cytometrii masowej w celu profilowania wzorca ekspresji interesujących białek w różnych fazach cyklu komórkowego.

Izolacja i barwienie keratynocytów skóry myszy do specyficznej dla cyklu komórkowego analizy ekspresji białek komórkowych za pomocą cytometrii masowej

Ten protokół dostosowuje pomiary cyklu komórkowego do wykorzystania na platformie cytometrii masowej. Dzięki wieloparametrowym możliwościom cytometrii masowej, bezpośredni pomiar inkorporacji jodu umożliwia identyfikację komórek w fazie S, podczas gdy markery cyklu wewnątrzkomórkowego umożliwiają scharakteryzowanie każdego stanu cyklu komórkowego w szeregu warunków eksperymentalnych.

Zastosowanie analogu pirymidyny, 5-jodo-2′-deoksyurydyny (IdU) z markerami cyklu komórkowego do ustalenia faz cyklu komórkowego na platformie cytometrii masowej

Tutaj prezentujemy protokół stopniowej rekonstytucji syntetycznych komórek prezentujących antygen za pomocą dwuwarstw lipidowych wspieranych przez koraliki i ich użycie do badania wyjścia synaptycznego z aktywowanych limfocytów T.

Przygotowanie dwuwarstw lipidowych wspieranych przez kulki w celu zbadania emisji cząstek stałych przez synapsy odpornościowe limfocytów T

Ten protokół pokaże ekstrakcję i analizę wolnych i estryfikowanych bioaktywnych kwasów tłuszczowych z komórek. Kwasy tłuszczowe są dokładnie oznaczane ilościowo za pomocą rozcieńczania stabilnych izotopów, chiralnej chromatografii cieczowej, wychwytywania elektronów, atmosferycznej jonizacji chemicznej, wielokrotnego monitorowania spektrometrii mas (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Ekstrakcja lipidów komórkowych do ukierunkowanego rozcieńczania stabilnych izotopów Chromatografia cieczowa - analiza spektrometrii mas

Naucz się codziennego dostrajania cytometru masowego CyTOF dla analizy komórkowej. Ten protokół pokazuje optymalizację ustawień, przygotowanie próbek i procedury czyszczenia, aby uzyskać wysokiej jakości dane.

Cytometria masowa: Protokół codziennego strojenia i analizy próbek komórek na cytometrze masowym CyTOF

Przeglądaj więcej filmów