Badania nad zmianami w funkcjonowaniu obwodów hipokampa po łagodnym urazowym uszkodzeniu mózgu

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest zbadanie zmian w funkcjonowaniu sieci obszarów mózgu dotkniętych eksperymentalnym modelem łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu. Eksperymenty rozpoczynają się od zastosowania bocznego urazu metodą fluid percussion injury u myszy, co naśladuje zarówno patologię, jak i symptomatologię łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu u ludzi. W drugim kroku, w celu oceny upośledzenia funkcji poznawczych wywołanego urazem mózgu, wykorzystuje się zależne od hipokampa zachowanie – warunkową reakcję lękową kontekstową. Następnie, za pomocą rejestracji pozakomórkowych i wewnątrzkomórkowych wraz z barwnikami wrażliwymi na napięcie, określa się regionalnie specyficzne zmiany w równowadze synaptycznej między pobudzającą a hamującą transmisją synaptyczną. W badanym obszarze, którym jest hipokamp, wyniki wykazują specyficzne dla podregionów zmiany w całkowitej skuteczności synaptycznej w hipokampie, opierając się na różnicach między myszami kontrolnymi a myszami z urazem mózgu w trzech opisanych technikach rejestracji.

Główną zaletą tego podejścia jest możliwość rozróżnienia wpływu zarówno stanu patologicznego, jak i potencjalnych środków terapeutycznych na wielu skalach fizjologicznych, co pozwala na uzyskanie spójniejszego obrazu deficytów w obrębie tego obwodu. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące urazowego uszkodzenia mózgu, takie jak określenie, które konkretnie neurony są najbardziej podatne na uszkodzenia, a co za tym idzie, w największym stopniu przyczyniają się do dysfunkcji hipokampa po urazie. Implikacje naszego podejścia wykraczają w stronę leczenia urazowego uszkodzenia mózgu, ponieważ pozwala ono najpierw nakreślić mechanizmy podstawowe, a następnie opracować potencjalne terapie w celu przywrócenia prawidłowej fizjologii w obszarach uszkodzonych w wyniku urazu mózgu.

W tej procedurze znieczul mysz, podając dootrzewnowo mieszankę ketaminy i ksylazyny. Następnie wykonaj kraniotomię w kształcie litery C nad prawym obszarem ciemieniowym, używając trepanu o średnicy zewnętrznej 3 mm. Następnie przymocuj adapter igły Luer-Lock nad otworem kraniotomii, używając cyjanoakrylanu i akrylu stomatologicznego.

Po 24 godzinach poddaj mysz znieczuleniu przy użyciu izofluranu drogą wziewną. Gdy oddech wróci do normy, lecz zanim mysz stanie się wrażliwa na bodźce, podaj 20 milisekundowy impuls soli fizjologicznej na czaszkę za pomocą urządzenia do urazów płynnych (fluid percussion injury device). Natychmiast po urazie zdejmij adapter. Następnie ponownie znieczul mysz izofluranem i zaszyj skórę głowy.

Przez dwa kolejne dni przed treningiem warunkowej reakcji lękowej należy oswajać mysz poprzez manipulację. W dniu treningu umieść mysz w komorze warunkującej na trzy minuty, a następnie podaj wstrząs podłogowy o natężeniu 1,5 amp przez dwie sekundy. Po tym pozostaw mysz w komorze na dodatkowe 30 sekund przed jej wyjęciem.

Po 24-godzinnym okresie oczekiwania należy ponownie umieścić mysz w komorze warunkującej na pięć minut, a następnie ocenić stopień zamrożenia w pięciosekundowych odstępach czasu siedem dni po urazie. Należy przygotować jeden litr sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego oraz 250 mililitrów roztworu cukrowego do cięcia. Należy upewnić się, że wszystkie instrumenty i roztwory wykorzystywane podczas przygotowywania skrawków mózgu są schłodzone w lodzie.

Szybko i delikatnie znieczul mysz przy użyciu izofluranu. Wyjmij mózg z organizmu myszy i umieść go w sacharozie. Następnie przytnij mózg.

Umieść świeżo odciętą powierzchnię brzuszną mózgu na kropli superglue na stole Vibram przed blokiem agaru. Wykonaj przekroje koronalne o grubości 350 micron. Powinno być możliwe uzyskanie czterech lub pięciu plastrów z nienaruszonym obwodem hipokampa.

Następnie inkubować skrawki przez co najmniej jedną godzinę w temperaturze 37 °C. Teraz przygotować elektrody borokrzemianowe o oporności od dwóch do pięciu megaomów. Za pomocą wyciągacza pionowego przenieść skrawek do komory, a następnie umieścić elektrodę w uchwycie elektrod do rejestracji pozakomórkowych potencjałów polowych.

Umieść elektrodę stymulującą nad traktem aksonalnym w skrawku, np. nad drogą perienteryczną lub kolateralami Shafera. Następnie kontynuuj wprowadzanie elektrody rejestrującej w głąb skrawka. W kolejnym kroku podaj pojedynczy impuls elektryczny, aby wywołać polowy zewnątrzkomórkowy potencjał postsynaptyczny.

Kontynuuj stymulację, zmieniając głębokość elektrody rejestrującej pomiędzy bodźcami, aż do uzyskania maksymalnej odpowiedzi. Jest to wskazanie, że elektrody znajdują się na tym samym poziomie. Analiza zazwyczaj składa się z pomiarów obejmujących porównanie amplitudy wolty włókien u myszy z uszkodzeniem mózgu oraz w grupie operowanej pozornie w celu oceny aktywacji presynaptycznej, a także porównanie nachylenia fEPSP w celu oceny aktywacji postsynaptycznej. W przypadku rejestracji metodą patch clamp ponownie przenieś skrawek do komory i obniż elektrodę rejestrującą.

Zbliż elektrodę do komórki, przykładając ciśnienie dodatnie, aby zapobiec zapchaniu się elektrody rejestrującej podczas przesuwania jej przez tkankę. Gdy elektroda delikatnie dotknie komórki, przyłóż ciśnienie ujemne, aby utworzyć giga-uszczelnienie (giga seal) między elektrodą a błoną plazmatyczną. Następnie zastosuj krótkie impulsy ciśnienia ujemnego, aby przerwać ciągłość błony plazmatycznej i uzyskać konfigurację whole-cell.

Wyeliminuj przejściowe zjawiska pojemnościowe za pomocą wzmacniacza i skompensuj rezystancję szeregową, aby zapewnić dokładność pomiarów. Następnie określ i porównaj częstotliwość oraz amplitudę spontanicznych prądów synaptycznych u myszy z urazami mózgu oraz w grupie kontrolnej poddanej operacji pozorowanej. Na tym etapie przygotuj roztwór zapasowy barwnika, mieszając 1 mg barwnika three onap DHQ w 50 µL etanolu.

Rozdziel dwa mikrolitry w alikwotach do probówek owiniętych folią i przechowuj w temperaturze -20 °C. Roboczy roztwór barwnika przygotowuj codziennie w rozcieńczeniu 1:200 w A CSF. Następnie inkubuj skrawek na zwilżonym A CSF papierze filtracyjnym i barw 90 mikrolitrami barwnika przez 16 minut.

Następnie wypłucz go i umieść w komorze rejestrującej interfejs. Umieść elektrody stymulujące i rejestrujące zgodnie z opisem w sekcji rejestracji potencjału pola zewnątrzkomórkowego.

Dostosuj natężenie stymulacji światłem tak, aby odpowiedź znajdowała się w centrum pola widzenia kamery. Obrazy zakresu są zazwyczaj pozyskiwane z częstotliwością od 500 do 1000 klatek na sekundę. Uruchom migawkę dla stymulacji światłem na 200 milisekund przed stymulacją elektryczną, aby umożliwić stabilizację początkowego szybkiego fotowybielania.

Przerwa między próbami trwa 10 sekund. Należy przeplatać próby akwizycji ze stymulacją elektryczną i bez stymulacji elektrycznej, aby umożliwić późniejsze odjęcie tła z prób bez stymulacji. Następnie należy zarejestrować natężenie światła spoczynkowego przed otwarciem migawki.

Każdy pomiar VSD można analizować jako film z odczytami fluorescencji. Oznacza to, że każdy pomiar stanowi trójwymiarową macierz danych z wartościami w przestrzennych wymiarach X i Y w czasie. Należy zarejestrować od 10 do 12 pomiarów VSD dla każdego warunku testowego i obliczyć wewnątrzpikselową znormalizowaną zmianę fluorescencji przed naświetleniem zgodnie z załączonym manuskryptem.

Na tym rysunku przedstawiono przykład rejestracji fEPSP w obszarze CA1. Pierwsze wychylenie w dół to artefakt stymulacji, po którym następuje wolta włókien presynaptycznych, a następnie fEPSP. Poniżej znajdują się krzywe wejście-wyjście obrazujące spadek całkowitej skuteczności synaptycznej w CA1 po urazie spowodowanym uderzeniem cieczy (fluid percussion injury).

A tutaj znajdują się krzywe wejścia i wyjścia przedstawiające wzrost netto skuteczności synaptycznej w zakręcie zębatym po FPI. Przedstawiono tutaj przykład spontanicznego pobudzającego prądu postsynaptycznego z komórki piramidalnej obszaru CA1. Tutaj widoczny jest przykład serii potencjałów czynnościowych z komórki piramidalnej obszaru CA1 oraz szybko strzelającego neuronu interneurona obszaru CA1.

Jest to wypełniony barwnikiem Lucifer yellow neuron hamujący typu CA1 bez kolców dendrytycznych, a tutaj znajduje się wypełniony barwnikiem Lucifer yellow neuron piramidowy CA1 z kolcami dendrytycznymi. Rysunki przedstawiają koronalny przekrój hipokampa myszy. Piksele od żółtych do czerwonych reprezentują aktywność pobudzającą w obszarze CA1 14 ms po stymulacji aferentnych włókien kolaterali Schaffera.

Kolor czerwony oznacza silniejszą depolaryzację, natomiast żółty wskazuje na mniejszą, lecz wciąż znaczącą depolaryzację. Niebieskie piksele reprezentują miejsca aktywności hamującej w obszarze ca 1 56 milisekund po tej samej stymulacji aferentnych kolaterali Schaffera, przy czym ciemniejszy niebieski oznacza silniejszą hiperpolaryzację. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak łączyć wiele technik rejestracji ex vivo w celu zbadania istotnego klinicznie stanu patologicznego związanego z dysfunkcją obwodów.