Name: Ilościowe badanie lokomocji swobodnie pływających mikroorganizmów z wykorzystaniem dyfrakcji laserowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Poznaj metodę ilościowej analizy lokomocji C. elegans z wykorzystaniem dyfrakcji laserowej. Technika ta umożliwia obserwację ruchu w przestrzeni trójwymiarowej bez ograniczeń tradycyjnej mikroskopii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Tzlil Rozenblat, Alexandrze Bello i Karlowi Spuhlerowi za pomoc techniczną. Praca ta była wspierana przez Vassar College Undergraduate Research Summer Institute (URSI), Lucy Maynard Salmon Research Fund oraz grant NASA nr NX09AU90A, grant National Science Foundation Center for Research Excellence in Science and Technology (NSF-CREST) nr 0630388 oraz grant NSF nr 1058385.

1. Przygotowanie C. elegans do analizy wideo
<ol>
 <li>Przenieś 10-20 dorosłych, zapłodnionych nicieni na świeże szalki Petri wypełnione agarem NGM, używając cienkiej, spłaszczonej igły platynowej. Szalki Petri z agarem NGM zawierają małą, okrągłą plamkę E. coli (najlepsze wyniki daje szczep o ograniczonym wzroście OP50), która służy nicieniom jako pożywienie. Pozostaw nicienie na 3-5 hr w celu zniesienia jaj, a następnie usuń osobniki dorosłe, tworząc w ten sposób małą, zsynchronizowaną rozwojowo kulturę 50-150 nicieni. Pozostaw nicienie do osiągnięcia wczesnego stadium dorosłości, inkubując szalki Petri w temperaturze 20 °C przez 4-5 dni. Metody hodowli te opierają się na ustalonych procedurach (Stiernagle 2006).5</li>
 <li>W dniu analizy wideo wypłucz szalkę z młodymi dorosłymi nicieniami 1 ml dejonizowanej wody destylowanej, zbierając w ten sposób 50-150 osobników z zsynchronizowanej kultury. Można również zastosować roztwór buforowy, taki jak M9 lub PBS. Użyj mikrocentryfugi, aby odwirować nicienie na dno probówki, lub pozostaw je do osiedlenia się pod wpływem grawitacji przez około 15 min. Usuń większość wody z probówki i zastąp ją 1 ml dejonizowanej wody destylowanej, aby wypłukać przylegające bakterie z ciał nicieni.</li>
 <li>Przenieś nicienie w wodzie lub buforze do kuwety kwarcowej za pomocą mikropipety. Ważne jest, aby pracować z małą liczbą osobników, łącznie około 5-10 nicieni naraz lub nawet mniej, aby prawdopodobieństwo oświetlenia przez laser tylko jednego nicienia w danym momencie było wysokie. Jeśli liczba nicieni na szalkach hodowlanych jest zbyt duża, rozcieńcz je w wodzie lub buforze, aż do osiągnięcia pożądanej gęstości. Można również przenosić pojedyncze nicienie do kropli wody lub buforu na świeżej płytce agarowej w celu ich wypłukania, a następnie przenosić poszczególne osobniki do kuwety. W naszym badaniu użyliśmy kuwet o rozmiarach 1 mm, 2 mm i 5 mm, aby zbadać wpływ ograniczeń fizycznych na zachowanie pływackie.</li>
</ol>
2. Układ optyczny do analizy wideo
<ol>
 <li>Wykonaj konfigurację zgodnie z przedstawionym schematem w Rysunek 1 wykorzystując laser helowo-neonowy (HeNe) o długości fali 543 nm (zielony), dwa lustra aluminiowe z powłoką na powierzchni przedniej, uchwyt na kuwetę, ekran projekcyjny oraz kamerę wysokich prędkości (Casio High Speed Exilim) zdolną do filmowania z częstotliwością ok. 240 kl./s. Dwa lustra służą do kierowania wiązki lasera przez kuwetę. W zależności od charakteru badania można zastosować kuwety o różnych rozmiarach. Przykładowo, w celu wykazania wpływu ograniczeń przestrzennych na częstotliwości pływania, zastosowano kuwety o grubości 5 mm. Wiązka lasera musi spełniać wymagania dotyczące nadpróbkowania; t.j.., organizm nie powinien zasłaniać więcej niż jednej trzeciej wiązki lasera. Dla C. eleganswiązka lasera powinna mieć średnicę około 2 mm w punkcie oddziaływania z nicieniem. Średnica wiązki lasera nie powinna przekraczać 5 mm, ponieważ utrudni to zlokalizowanie wzoru dyfrakcyjnego. Odległość od organizmu dyfrakcyjnego do ekranu powinna być znacznie większa niż rozmiar samego organizmu.</li>
 <li>Przykryć górną część kuwety parafilmem i odwrócić ją, aby wymieszać nicienie w kolumnie wody. Umieścić kuwetę w uchwycie tak, aby nicienie znajdowały się początkowo w górnej części naczynia. Za pomocą luster skierować wiązkę lasera przez środek kuwety. Ponieważ nicienie mają większą gęstość niż woda, będą powoli opadać na dno kuwety, jednocześnie pływając w kolumnie wody.</li>
 <li>Na ekranie projekcyjnym zamaluj na czarno miejsce odpowiadające przechodzącej wiązce laserowej, aby zredukować rozproszenie w punkcie styku wiązki z ekranem (Rycina 2)Alternatywnie w ekranie projekcyjnym można wykonać otwór, aby umożliwić przejście wiązki transmitowanej przez ekran. Wyeliminowanie lub ograniczenie rozproszenia wiązki transmitowanej zapobiegnie nasyceniu matrycy CCD kamery przez tę wiązkę.</li>
 <li>Aby wyznaczyć miarę rozmiaru wzoru dyfrakcyjnego, narysuj linię o długości około 5 cm na ekranie projekcyjnym obok plamki przechodzącego wiązki lasera, tak aby nie zakłócać obrazu światła ugiętego.</li>
 <li>Rozpocznij nagrywanie kamerą przy włączonym świetle w pomieszczeniu, aby linia o długości 5 cm znalazła się na tym samym materiale wideo co obrazy dyfrakcyjne. Wyłącz światło w pomieszczeniu. Nagrywaj kamerą obrazy dyfrakcyjne na ekranie w momencie, gdy dżdżownice przechodzą przez wiązkę lasera.</li>
</ol>
3. Przygotowanie danych wideo
<ol>
 <li>Zainstaluj program do analizy wideo (Logger Pro: <a href="http://www.vernier.com/products/software/lp/" target="_blank">http://www.vernier.com/products/software/lp/</a>) na komputerze. Zaimportuj wideo do programu do analizy wideo</li>
 <li>Ustaw punkt początkowy tak, aby pokrywał się z transmitowaną plamką lasera. Ustaw skalę, korzystając z linii 5 cm na ekranie projekcyjnym.</li>
 <li>Śledź przemieszczenie kątowe obrazu dyfrakcyjnego utworzonego przez każdego nicienia, korzystając z oprogramowania do analizy wideo (Rysunek 3)</li>
 <li>Aby wyznaczyć przemieszczenie kątowe poprzez obliczenie arctan (y/x), skopiuj i wklej dane do arkusza kalkulacyjnego (Excel) i dodaj 180 deg lub π do wszystkich ujemnych kątów, aby uzyskać ciągły wykres (Rysunek 4).</li>
</ol>
4. Akwizycja danych w czasie rzeczywistym do natychmiastowej obserwacji częstotliwości pływania
<ol>
 <li>Wykorzystując ten sam układ, co w przypadku analizy wideo, umieść fotodiodę (DET10A firmy ThorLabs) o niewielkiej powierzchni (~1 mm2) poza centrum wzoru dyfrakcyjnego, bezpośrednio przed ekranem projekcyjnym.</li>
 <li>Podłącz fotodiodę do cyfrowego oscyloskopu (PicoScope firmy Pico Technology), który jest połączony z komputerem za pomocą portu USB. Obserwuj wzory oscylacji na ekranie komputera.</li>
 <li>Zapisz pozyskane zestawy danych w formacie ASCII lub tekstowym.</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
 <li>Importuj dane pozyskane za pomocą wideo lub fotodiody do programu do analizy danych umożliwiającego dopasowanie przebiegów czasowych z wykorzystaniem minimalizacji chi-kwadrat. W niniejszej procedurze użyto programu Origin (<a href="http://www.originlab.com/" target="_blank">http://www.originlab.com/</a>). Dopasuj krzywą sinusoidalną w celu wyznaczenia częstotliwości miotania (Rysunki 4 i 5).</li>
 <li>Oblicz średnie częstotliwości pływania dla różnych próbek i wyznacz wariancję. W tej badaniu dane analizowano statystycznie za pomocą jednoczynnikowej analizy ANOVA, a następnie testu wielokrotnych porównań Bonferroniego. Wartość p &lt; 0,05 uznano za istotną statystycznie.</li>
</ol>
6. Modelowanie obrazów dyfrakcyjnych na przykładzie programu Mathematica
Uwaga: Wzory dyfrakcyjne można modelować przy użyciu wielu różnych narzędzi obliczeniowych. Procedura ta będzie się różnić w zależności od zastosowanego narzędzia, takiego jak MatLab, Excel, Origin itp.
<ol>
 <li>Wykonanie zdjęcia: Wykonać zdjęcia nicieni na szkiełku mikroskopowym przy użyciu tradycyjnego mikroskopu.</li>
 <li>Binaryzacja obrazu: Zaimportować obraz nicienia „Worm” do programu Mathematica, przeciągając go do okna programu. Przekształcić obraz w obraz czarno-biały (binaryzacja). Można to osiągnąć za pomocą polecenia „Binarize” w Mathematica: BlackandWhiteImage=Binarize[Worm]. Obraz można następnie wyświetlić jako obraz czarno-biały. 
 Alternatywnie można użyć polecenia „EdgeDetect”, aby utworzyć BlackandWhiteImage: EdgeDetect[Worm,6.0,0.035], gdzie dwie ostatnie liczby kontrolują grubość uzyskanych krawędzi.</li>
 <li>Konwersja obrazu na macierz zer i jedynek: Można to osiągnąć za pomocą polecenia „ImageData” w Mathematica: Matrix=ImageData[BlackandWhiteImage].</li>
 <li>Transformata Fouriera macierzy: Użyć polecenia „Fourier” w Mathematica, aby przeprowadzić transformację Fouriera macierzy, stosując wskazane FourierParameters: FTransform = Fourier[Matrix, FourierParameters -&gt; {0, -2}].</li>
 <li>Kwadrat modułu macierzy w celu uzyskania macierzy dyfrakcyjnej i poprawy kontrastu obrazu: Podnieść do kwadratu wartość bezwzględną macierzy i wyświetlić otrzymany obraz, który stanowi wzór dyfrakcyjny odpowiadający obrazowi oryginalnemu. Należy również użyć funkcji „Log”, aby przeskalować kontrast obrazu: ImageContrast = Image[Log[1 + (Abs[FTransform])^2]/0.5].</li>
 <li>Zmiana rozmiaru obrazu dla łatwiejszego oglądania: Wyciąć centralny wzór dyfrakcyjny i zmienić rozmiar według uznania: ImageResize[ImageContrast [y, 100], 500].</li>
 <li>Porównać modelowane wzory dyfrakcyjne z wzorami dyfrakcyjnymi uzyskanymi z swobodnie pływających nicieni. (Rycina 6)</li>
</ol>

<ol><li>Korta, J., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mahadevan, L., Samuel, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensation+and+mechanical+load+modulate+the+locomotory+gait+of+swimming+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanosensation and mechanical load modulate the locomotory gait of swimming C. elegans.</a> J. Exp. Biol. 210, (2007).</li>
<li>James, J. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJames%2C+JF+%22A+student%27s+guide+to+Fourier+transforms+with+applications+in+physics+and+engineering%22">A student's guide to Fourier transforms with applications in physics and engineering</a>. , Cambridge Univ. Press. (1995).</li>
<li>Pierce-Shimomura, J. T., Chen, B. L., Mun, J. J., Ho, R., Sarkis, R., McIntire, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+crawling+and+swimming+locomotory+patterns+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 20982-20987 (2008).</li>
<li>Li, W., Feng, Z., Sternbert, P. W., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C.+elegans+stretch+receptor+neuron+revealed+by+a+mechanosensitive+TRP+channel+homologue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A C. elegans stretch receptor neuron revealed by a mechanosensitive TRP channel homologue.</a> Nature. 440, 684-687 (2006).</li>
<li>Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStiernagle%2C+T+%22WormBook%22">WormBook</a>. ed, W. ormB. ook, , (2006).</li>
<li>Dynamic Diffraction Analysis and the Transformation of C. elegans. Eells, R., Lueckheide, M., Magnes, J., Susman, K., Rozenblat, T., Kakhurel, R. Symposium for Undergraduate Research, Division of Laser Science (APS) - LS XXVII, San Jose, CA, , (2011).</li>
<li>Magnes, J., Raley-Susman, K. M., Melikechi, N., Sampson, A., Eells, R., Bello, A., Lueckheide, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Freely+Swimming+C.+elegans+using+Laser+Diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22O.+J.+Biphys%22%5BJournal%5D)">Analysis of Freely Swimming C. elegans using Laser Diffraction.</a> O. J. Biphys. , (2012).</li>
<li>Magnes, J., Raley-Susman, K. M., Sampson, A., Eells, R. Locomotive Analysis of C. Elegans through Diffraction, Control number: 348 Session: JTuA - Joint FiO/LS Poster Session I Pres. number: JTuA39. FiOs/LS, October 26, Rochester, NY, , (2010).</li>
<li>Kim, N., Dempsey, C. M., Kuan, C. J., Zoval, J., O'Rourke, E., Ruvkun, G., Madou, M. J., Sze, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gravity+fource+transduced+by+the+MEC-4%2FMEC-10+DEG%2FEnaC+channel+modulates+DAF-16%2FFoxO+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Gravity fource transduced by the MEC-4/MEC-10 DEG/EnaC channel modulates DAF-16/FoxO activity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 177, 835-845 (2007).</li>
<li>Park, S., Hwang, H., Nam, S. -W., Martinez, F., Austin, R. H., Ryu, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Caenorhabditis+elegans+locomotion+in+a+structured+microfluidic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Enhanced Caenorhabditis elegans locomotion in a structured microfluidic environment.</a> PLOS One. 3, e2550(2008).</li>
<li>Keller, H. E. Objective Lenses for Confocal Microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKeller%2C+HE+%22Handbook+of+Biological+Confocal+Microscopy%22">Handbook of Biological Confocal Microscopy</a>. Pawley, J. B. , 3rd edition, Springer. 145-161 (2006).</li>
<li>Conrad, J. Depth of Field in Depth. , Large Format Page. Available from: 
 
 <a target="_blank" href="http://www.largeformatphotography.info/articles/DoFinDepth.pdf">http://www.largeformatphotography.info/articles/DoFinDepth.pdf</a> (2011).</li>
<li>Martin, L. C. TECHNICAL OPTICS. II, Pitman Publishing Corporation. (1950).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Opracowaliśmy nowatorskie podejście do pomiaru ruchu i prostych zachowań lokomocyjnych w czasie rzeczywistym u organizmów mikroskopijnych, takich jak nicienie, które nie wymaga użycia mikroskopów.8 To podejście metodologiczne mogłoby zostać wykorzystane również do badania licznych organizmów mikroskopijnych, takich jak protisty. Metoda ta jest ograniczona jedynie długością fali zastosowanego światła. Organizm nie może być mniejszy niż długość fali światła. Poza oszczędnością kosztów i przenośnością wymaganego sprzętu, kluczową zaletą tego podejścia jest możliwość pomiaru zachowania w czasie rzeczywistym i w trzech wymiarach, bez wąskich ograniczeń płaszczyzn obrazowania pod mikroskopem. Dzięki tej technice możliwe jest również badanie wpływu sił grawitacyjnych lub wielu innych czynników na zachowanie, których nie można badać za pomocą metod opartych na mikroskopach.9 W ten sposób możemy uzyskać lepsze zrozumienie naturalnych zachowań lokomocyjnych mikroorganizmów, uwolnionych od ograniczeń kropel na szkiełkach mikroskopowych lub specjalistycznych komór mikroprzepływowych (Park et al, 2008).10
Brak informacji o fazie w obrazie dyfrakcyjnym uniemożliwia bezpośrednie odtworzenie obrazu odpowiadającego obiektowi dyfrakcyjnemu, ponieważ obraz dyfrakcyjny w polu dalekim jest proporcjonalny do kwadratu wartości bezwzględnej transformaty Fouriera. W związku z tym obliczamy obrazy dyfrakcyjne na podstawie obrazów nicieni, aby można było je dopasować do obrazów dyfrakcyjnych swobodnie pływających nematod (Rysunek 6).
Ta metoda przyniosła rezultaty w przypadku naprawdę swobodnie pływających C. elegans i może być zastosowana do każdego gatunku mikroskopijnego, który porusza się w środowisku optycznie przezroczystym, takim jak woda lub wiele różnych roztworów jonowych. Konwencjonalne mikroskopy pozwalają na badania jedynie z głębokością ogniskowania rzędu mikrometrów.11 Wynika to z ograniczonej głębi ostrości podczas ogniskowania światła:
<img alt="Równanie stopni swobody, DoF ≈ 2Nc(m+1)/(m^2), dla analizy statystycznej." src="/files/ftp_upload/4412/4412eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 1"> 
gdzie liczba przysłony N jest odwrotnie proporcjonalna do kręgu rozmycia (c), tak że krótka ogniskowa wiąże się z dużym c.12,13 Choć ta metoda dyfrakcyjna z pewnością nie zastępuje konwencjonalnej mikroskopii, pozwala ona na szybkie uzyskanie wyników ilościowych, co umożliwia manipulowanie gatunkami w czasie rzeczywistym przy niskich kosztach. Wzory dyfrakcyjne można uzyskać za pomocą dowolnego wskaźnika laserowego. Wzory dyfrakcyjne mogą być rejestrowane przy obniżonej rozdzielczości czasowej za pomocą zwykłego aparatu cyfrowego. Nawet jeśli użytkownik nie ma pod ręką mikroskopu ani fotodiody, kluczowe elementy tego eksperymentu, takie jak pomiar częstotliwości miotania się i ocena wzorów dyfrakcyjnych, mogą być wykonane przy minimalnych nakładach finansowych.

<table><tbody><tr><td>Laser HeNe 543 nm</td><td>Melles Griot</td><td>LGX1</td><td>Można użyć dowolnego lasera w zakresie widzialnym o mocy mniejszej niż 5 mW.</td></tr><tr><td>2 lustra aluminiowe z powierzchnią przednią</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-F01</td><td></td></tr><tr><td>Szybka kamera Exilim</td><td>Casio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kuweta kwarcowa</td><td>Starna Cells</td><td>21/G/5</td><td></td></tr><tr><td>LoggerPro (oprogramowanie)</td><td>Vernier</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.vernier.com/products/software/lp/&quot; target=&quot;_blank">http://www.vernier.com/products/software/lp/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Mathematica 8</td><td>Wolfram</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.wolfram.com/&quot; target=&quot;_blank">http://www.wolfram.com/&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

ilościowe badanie lokomocji swobodnie pływających mikroorganizmów z wykorzystaniem dyfrakcji laserowej

Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction

Mikroorganizmy glebowe i wodne żyją i zachowują się w złożonym środowisku trójwymiarowym. Większość badań nad zachowaniem mikroorganizmów prowadzono natomiast z wykorzystaniem metod opartych na mikroskopach, co ogranicza ruch i zachowanie do wąskiego, niemal dwuwymiarowego pola ogniskowania.1 Przedstawiamy nowatorskie podejście analityczne, które umożliwia analizę w czasie rzeczywistym swobodnie pływających C. elegans w kuwecie, bez zależności od sprzętu mikroskopowego. Metoda ta polega na śledzeniu okresowości czasowej wzorów dyfrakcyjnych generowanych poprzez kierowanie światła laserowego przez kuwetę. Pomiarom poddajemy częstotliwości oscylacji swobodnie pływających nicieni.
Analiza dyfrakcyjnych wzorów pola dalekiego dostarcza informacji o kształcie fal organizmów z rodzaju nematodes. Dyfrakcja jest procesem uginania się światła na krawędziach obiektu. W tym przypadku światło ulega dyfrakcji na organizmach. Fale świetlne interferują, co może prowadzić do powstania wzoru dyfrakcyjnego. Dyfrakcyjny wzór pola dalekiego, nazywany również wzorem Fraunhofera, powstaje, gdy odległość od obiektu do ekranu jest znacznie większa niż rozmiar dyfrakcyjnego obiektu. W takim przypadku wzór dyfrakcyjny można obliczyć (wymodelować) przy użyciu transformaty Fouriera.2
C. elegans to wolnożyjące nicienie glebowe, które poruszają się w trzech wymiarach. Przemieszczają się zarówno po macierzy stałej, takiej jak gleba lub agar, w sinusoidalnym wzorcu lokomocyjnym zwanym pełzaniem, jak i w cieczy w innym wzorcu zwanym pływaniem.3 Rola informacji sensorycznych dostarczanych przez komórki mechanosensoryczne, chemosensoryczne i termosensoryczne, które kontrolują plastyczne zmiany we wzorcach lokomocyjnych oraz przełączanie między nimi, zaczyna być dopiero wyjaśniana.4 Opisujemy podejście optyczne do pomiaru lokomocji nicieni w trzech wymiarach, które nie wymaga użycia mikroskopu i pozwoli nam rozpocząć badanie złożoności lokomocji nicieni w różnych warunkach.

W ramach przykładu badaliśmy C. elegans w kuwecie kwarcowej o szerokości 1 cm, grubości 5 mm i wysokości 4 cm. Pobierając dane dla pojedynczego nicienia za pomocą analizy wideo, średnia częstotliwość pływania uzyskana z analizy wideo w kuwecie o grubości 5 mm wynosi około 2,5 Hz (Rysunek 4). Podobnie, pobierając dane dla pojedynczego nicienia za pomocą metody akwizycji danych w czasie rzeczywistym przy użyciu cyfrowego oscyloskopu (PicoScope), otrzymujemy częstotliwość pływania wynoszącą około 2,7 Hz (Rysunek 5). Procedurę tę można powtórzyć dla wielu nicieni. Szczegółowe badanie swobodnie pływających nicieni wykazało średnią częstotliwość pływania 2,37 Hz w kuwecie 5 mm.6 Zgodnie z oczekiwaniami, częstotliwość pływania jest wyższa niż w przypadku nicienia pełzającego (~0,8 Hz).3 Stosując tę metodę dyfrakcyjną, stwierdzono, że średnie częstotliwości pływania C. elegans ograniczonego do szkiełka mikroskopowego są zgodne z wcześniej opublikowaną wartością 2 Hz.1,7
Postępowanie zgodnie z procedurami 3.) a następnie 6.) umożliwia modelowanie wzorców dyfrakcji pływania przy użyciu obrazów nicieni uzyskanych za pomocą konwencjonalnego mikroskopu. Modelowane wzorce dyfrakcji są wykorzystywane do symulacji cyklu pływania C. elegans (Rysunek 6). Pomyślny model składa się z fizycznie wykonalnych, następujących po sobie wzorców pływania, które odpowiadają częstotliwościom pływania. Nicień powinien znajdować się w tej samej formie na koniec cyklu pływania, w jakiej był na jego początku.
<img alt="Schemat dyfrakcji laserowej z kuwetą optyczną dla C. elegans; przedstawia drogę wiązki i dyfrakcję światła." src="/files/ftp_upload/4412/4412fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Do stworzenia dynamicznego wzoru dyfrakcyjnego z wykorzystaniem żywych C. elegans użyto zielonego lasera HeNe. Wzór dyfrakcyjny ten został zarejestrowany przy prędkości 240 fps.
<img alt="Wzór dyfrakcyjny, interferencja laserowa w laboratoryjnym układzie optycznym, ilustrująca superpozycję fal." src="/files/ftp_upload/4412/4412fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Namalowanie czarnej kropki zwiększa absorpcję wiązki przechodzącej. Saturacja kamery spowodowana światłem rozproszonym ulega zmniejszeniu, a wzór dyfrakcyjny staje się widoczny.
<img alt="Eksperyment dyfrakcji laserowej; wykres analizy danych; układ optyczny; obraz interferencyjny." src="/files/ftp_upload/4412/4412fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Zrzut ekranu z oprogramowania do analizy wideo (Logger Pro) przedstawiający śledzony wzór dyfrakcyjny dżdżownicy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4412/4412fig3large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę</a>.
<img alt="Wykres cyklu pływania C. elegans w kuwecie; dane wideo i dopasowanie częstotliwości przy 2.47 Hz; kąt względem czasu." src="/files/ftp_upload/4412/4412fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Dane wideo odpowiadające cyklowi pływania nicienia w kuwecie 5 mm. Dopasowanie krzywej wykazuje częstotliwość pływania wynoszącą ~ 2.5 Hz.
<img alt="Analiza cyklu pływania, C. elegans, wykres dopasowania częstotliwości, kuweta 5 mm, intensywność w czasie." src="/files/ftp_upload/4412/4412fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Dane w czasie rzeczywistym odpowiadające cyklowi pływania nicienia w kuwecie 5 mm. Dopasowanie krzywej wykazuje częstotliwość pływania wynoszącą ~ 2.7 Hz.
<img alt="Mikroskopia Caenorhabditis elegans, wzory dyfrakcyjne; analiza optyczna, schemat badań biofizycznych." src="/files/ftp_upload/4412/4412fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6. Górny rząd przedstawia rzeczywiste wzory dyfrakcyjne, które odpowiadają modelowym wzorom dyfrakcyjnym w dolnym rzędzie. Modelowe wzory dyfrakcyjne zostały wytworzone przy użyciu nicieni na szkiełku przedmiotowym (środkowy rząd).

Mikroskopijne organizmy, takie jak wolno pływający nicień C. elegans, żyją i zachowują się w złożonym trójwymiarowym środowisku. Przedstawiamy nowatorskie podejście umożliwiające analizę C. elegans z wykorzystaniem wzorów dyfrakcyjnych. Metoda ta polega na śledzeniu periodyczności czasowej wzorów dyfrakcyjnych generowanych poprzez kierowanie wiązki lasera przez kuwetę.

Ilościowe badanie lokomocji swobodnie pływających mikroorganizmów z wykorzystaniem dyfrakcji laserowej

Mikroorganizmy glebowe i wodne żyją i zachowują się w złożonym środowisku trójwymiarowym. Większość badań nad zachowaniem mikroorganizmów, w...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar częstotliwości ruchów wiciowych (thrashing) swobodnie pływających organizmów mikroskopowych. W tym celu najpierw przygotowuje się próbkę mikroskopijnych nicieni, a następnie konfiguruje układ optyczny.Następnie rejestrowany jest wzór dyfrakcyjny wprowadzony przez żywe organizmy. Na koniec zarejestrowane dane są analizowane w celu określenia częstotliwości pływania. Ostatecznie analiza dyfrakcyjna służy do wykazania zmian w wzorcach lokomocji nieograniczonych pierścienic.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak tradycyjna mikroskopia, jest możliwość obserwacji wzorców pływania gatunku poruszającego się swobodnie w przestrzeni trójwymiarowej. Chociaż metoda ta pozwala na uzyskanie informacji o swobodnie pływających osobnikach C. elegans, można ją zastosować również do innych przezroczystych, małych i mikroskopijnych organizmów poddanych różnym warunkom. Aby przygotować C. elegans do analizy wideo, należy najpierw za pomocą spłaszczonego platynowego drutu przenieść od 10 do 20 dorosłych nicieni na świeże podłoże NGM.Płytki Petri z agarem zawierające małe, okrągłe plamki E. coli. Pozostawić nicienie na okres od trzech do pięciu godzin w celu złożenia jaj, a następnie usunąć osobniki dorosłe. W ten sposób utworzy się mała, rozwojowo zsynchronizowana hodowla od 50 do 150 nicieni; aby doprowadzić nicienie do wczesnej dorosłości, inkubować płytki Petri w temperaturze 20 °C przez cztery do pięciu dni.W dniu analizy wideo należy użyć jednego mililitra dejonizowanej wody destylowanej do wypłukania płytki z młodymi dorosłymi nicieniami, zbierając w ten sposób od 50 do 150 osobników z zsynchronizowanej hodowli. Należy wykorzystać mikrowirówkę, aby ściągnąć nicienie na dno probówki, lub pozwolić im opaść grawitacyjnie przez około 15 minut. Następnie należy usunąć większość wody z probówki i zastąpić ją jednym mililitrem dejonizowanej wody destylowanej, aby wypłukać przylegające do nicieni bakterie.Za pomocą mikropipety przenieś od pięciu do 10 nicieni w wodzie do kuwety kwarcowej. Złóż układ optyczny zgodnie z przedstawionym schematem, wykorzystując laser helowo-neonowy o długości fali 543 nanometrów, dwa lustra aluminiowe z odbiciem od powierzchni przedniej do kierowania wiązki lasera przez kuwetę, uchwyt do kuwety, ekran projekcyjny oraz szybką kamerę zdolną do filmowania z prędkością około 240 klatek na sekundę. Następnie użyj kawałka parafiny, aby zakryć górną część kuwety, i odwróć ją, aby wymieszać nicienie w słupie wody.Umieść vete w uchwycie do vete w taki sposób, aby nicienie znajdowały się początkowo w górnej części vete. Za pomocą luster skieruj wiązkę lasera przez środek vete. Ponieważ nicienie są gęstsze od wody, będą powoli opadać na dno vete, przepływając przez kolumnę wody; na ekranie projekcyjnym zaznacz punkt odpowiadający przechodzącej wiązce lasera kolorem czarnym, aby zmniejszyć rozproszenie w miejscu, w którym wiązka pada na ekran.Eliminacja lub redukcja rozproszenia wiązki przechodzącej zapobiegnie nasyceniu matrycy CCD kamery przez tę wiązkę. Aby określić rozmiar wzoru dyfrakcyjnego, narysuj linię o długości około pięciu centymetrów na ekranie projekcyjnym obok plamki przechodzącej wiązki laserowej, tak aby nie zasłaniać obrazu światła dyfrakcyjnego. Wyłącz światło w pomieszczeniu i rejestruj obrazy dyfrakcyjne na ekranie w momencie, gdy nicienie przechodzą przez wiązkę lasera.Aby przygotować dane wideo, zainstaluj następujący program do analizy wideo i zaimportuj do niego nagranie. Używając oprogramowania, ustaw punkt początkowy tak, aby pokrywał się z transmitowaną plamką laserową. Śledź przemieszczenie kątowe obrazu dyfrakcyjnego tworzonego przez każdego nicienia.Skopiuj i wklej dane do arkusza kalkulacyjnego, a następnie do wszystkich ujemnych kątów dodaj 180 stopni lub PI, aby uzyskać ciągły wykres. Korzystając z zestawu do analizy wideo, umieść fotodiodę o małej powierzchni poza centrum wzoru dyfrakcyjnego, bezpośrednio przed ekranem projekcyjnym, podłączając ją przez port USB.Podłącz fotodiodę do oscyloskopu cyfrowego połączonego z komputerem. Obserwuj wzorce drgań na ekranie komputera. Zapisz zestawy danych w formacie ASCII lub tekstowym w celu ich analizy.Wykorzystaj wideo lub zdjęcie, aby zaimportować dane do programu do analizy danych umożliwiającego dopasowywanie przebiegów falowych. Używając minimalizacji chi-kwadrat, dopasuj krzywą sinusoidalną w celu wyznaczenia częstotliwości miotania. Oblicz średnią częstotliwość pływania dla różnych próbek i wyznacz wariancję.W niniejszym badaniu dane analizowano statystycznie przy użyciu jednoczynnikowej analizy wariancji ANOVA, a następnie testu wielokrotnych porównań Bonferroniego. Wartość P mniejsza od 0,05 uznano za statystycznie istotną dla wzorców dyfrakcyjnych. Rozpocznij od użycia mikroskopu do wykonania obrazów w celu analizy obrazu.Przeciągnij plik do programu Mathematica. Użyj polecenia binary eyes, aby przekonwertować go na obraz czarno-biały. Alternatywnie zastosuj polecenie edge detect, aby stworzyć obraz czarno-biały, w którym dwie ostatnie liczby kontrolują stopień rozdzielczości wynikłych krawędzi.Następnie, korzystając z polecenia image data, przekształć obraz w macierz zer i jedynek. Użyj polecenia forer, aby wykonać transformację macierzy, następnie oblicz kwadrat wartości bezwzględnej macierzy i wyświetl otrzymany obraz, który stanowi wzór dyfrakcyjny odpowiadający obrazowi oryginalnemu. Dodatkowo zastosuj funkcję log, aby przeskalować kontrast obrazu.Na koniec porównaj modelowe wzory dyfrakcyjne z wzorami dyfrakcyjnymi otrzymanymi od swobodnie pływających nicieni. W niniejszym przykładzie badano *C. elegans* w kwarcowej kasecie Q-vet o szerokości jednego centymetra, grubości pięciu milimetrów i wysokości czterech centymetrów. Pobieranie próbek od pojedynczego nicienia za pomocą analizy wideo.Średnia częstotliwość pływania uzyskana z analizy wideo w naczyniu o grubości pięciu milimetrów wynosiła około 2,5 hertz. Podobnie, pobranie próbek z jednego nicienia przy użyciu metody akwizycji danych w czasie rzeczywistym i oscyloskopu cyfrowego pozwoliło uzyskać częstotliwość pływania wynoszącą około 2,7 hertz. Procedurę tę można powtórzyć dla wielu nicieni.Szczegółowe badanie swobodnie pływających nicieni wykazało średnią częstotliwość pływania wynoszącą 2,37 hertz w pięciomilimetrowej probówce. Zgodnie z oczekiwaniami, częstotliwość pływania jest wyższa niż w przypadku pełzającego nicienia. Z zastosowaniem tej metody dyfrakcyjnej ustalono, że średnie częstotliwości pływania C. elegans, ograniczonego do szkiełka mikroskopowego, odpowiadają wcześniej opublikowanej wartości dwóch herców.Zgodnie z treścią filmu. Przygotowanie danych i modelowanie wzorów dyfrakcyjnych zaprezentowane w tym materiale umożliwiają modelowanie wzorów dyfrakcyjnych podczas pływania. Przy wykorzystaniu obrazów nicieni uzyskanych za pomocą konwencjonalnego mikroskopu, wymodelowane wzory dyfrakcyjne służą do symulacji cyklu pływania *Caenorhabditis elegans*.Skuteczny model składa się z fizycznie możliwych do zrealizowania wzorców pływania, odpowiadających częstotliwościom pływania. Robak powinien znajdować się w tej samej pozycji na końcu cyklu pływania, w której był na jego początku. Po opanowaniu tej techniki, w przypadku każdego robaka można ją przeprowadzić w mniej niż minutę, korzystając z szybkiej metody fotograficznej i obserwując cykle pływania na ekranie komputera.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat oceny swobodnie pływających nicieni.

quantitative-locomotion-study-freely-swimming-micro-organisms-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Badanie ilościowego ruchu mikroorganizmów pływających swobodnie za pomocą dyfrakcji laserowej

Opisano proces wytwarzania kanałów mikroprzepływowych oraz ich zastosowanie w eksperymentach służących do badania zachowań chemotaktycznych morskich drobnoustrojów w niejednorodnym środowisku nutrientowym (patchy nutrient seascape) oraz zachowań pływackich bakterii w przepływie ścinającym.

Odpowiedź chemotaktyczna mikroorganizmów morskich na mikroskalowe warstwy składników odżywczych

Źródło: Scheidweiler, D. i in. Łączenie urządzeń płynowych z mikroskopią i cytometrią przepływową do badania transportu mikroorganizmów w ośrodkach porowatych na skalach przestrzennych. J. Vis. Exp. (2020).Ten film demonstruje użycie urządzenia mikrofluidycznego do ilościowego określania ruchliwości bakterii poprzez porowatą matrycę złożoną z losowo ułożonych filarów. Do urządzenia wprowadzane są fluorescencyjnie znakowane bakterie, obrazowane mikroskopią podczas przemieszczania się przez...

Ocena ruchliwości bakteryjnej za pomocą urządzenia mikrofluidycznego

Opisano półautomatyczną metodę mikro-elektro-fluidyczną do wywoływania lokomocji na żądanie u Caenorhabditis elegans. Metoda ta opiera się na neurofizjologicznym zjawisku robaków reagujących na łagodne pola elektryczne ("elektrotaksję") wewnątrz kanałów mikroprzepływowych. Elektrotaksja mikroprzepływowa służy jako szybka, czuła, tania i skalowalna technika badań przesiewowych pod kątem czynników wpływających na zdrowie neuronów.

Elektrotaksja oparta na mikroprzepływach do analizy ilościowej na żądanie lokomocji Caenorhabditis elegans

Przedstawiona tutaj technika mierzy ścieżkę swobodnie pływających mikroskopijnych gatunków za pomocą ekspozycji na pojedynczej długości fali.  C. elegans są używane do demonstracji obrazowania cieni jako niedrogiej alternatywy dla kosztownych mikroskopów.  Technikę tę można dostosować do różnych orientacji, środowisk i gatunków w celu pomiaru kierunku, prędkości, przyspieszenia i sił.

Obrazowanie cieni o pojedynczej długości fali lokomocji Caenorhabditis elegans, w tym oszacowania siły

Przedstawiono metodę przygotowania katalitycznie aktywnych koloidów Janusa, które mogą "pływać" w płynach i określać ich trajektorie 3D.

Przygotowanie i śledzenie 3D katalitycznych urządzeń pływających

Ten manuskrypt opisuje, jak rozróżniać różne nicienie za pomocą sygnatur dyfrakcyjnych dalekiego pola. Porównujemy lokomocję 139 dzikich i 108 "rolkowych" C. elegans, uśredniając częstotliwości związane z czasową sygnaturą dyfrakcyjną Fraunhofera w jednym miejscu za pomocą lasera o fali ciągłej.

Analiza dyfrakcyjna oparta na Fourierze żywych Caenorhabditis elegans

Mikroskopia lokalizacji pojedynczych cząsteczek 3D jest wykorzystywana do badania pozycji przestrzennych i trajektorii ruchu fluorescencyjnie znakowanych białek w żywych komórkach bakteryjnych. Opisany w niniejszym dokumencie protokół eksperymentalny i analizy danych określa dominujące zachowania dyfuzyjne białek cytozolowych w oparciu o zbiorcze trajektorie pojedynczych cząsteczek.

Mikroskopia śledzenia pojedynczych cząsteczek - narzędzie do określania stanów dyfuzyjnych cząsteczek cytozolowych

Przedstawiono protokół do generowania dynamicznych krajobrazów chemicznych przez fotolizę w układach mikroprzepływowych i milifluidowych. Metodologia ta jest odpowiednia do badania różnych procesów biologicznych, w tym zachowania ruchliwego, pobierania składników odżywczych lub adaptacji mikroorganizmów do substancji chemicznych, zarówno na poziomie pojedynczej komórki, jak i populacji.

Generowanie kontrolowanych, dynamicznych krajobrazów chemicznych w celu badania zachowania mikroorganizmów

Tutaj opisujemy użycie płytek gradientu induktora do oceny ruchliwości roju bakterii, jednocześnie uzyskując wiele odpowiedzi stężenia.

Kwantyfikacja ruchliwości roju powierzchni bakterii na płytkach gradientu induktora

Ta procedura opisuje, jak wizualizować, śledzić i określać ilościowo Acanthamoeba spp. Ruchliwość.

Oznaczanie ilościowe Acanthamoeba spp. Ruchliwość

Badanie to analizuje wpływ wieku na lokomocję u C. elegans poprzez pomiar największego wykładnika Lyapunova (LLE). Wraz z wiekiem C. elegans wykazują wzrost i późniejszy spadek kontroli motorycznej. Wyniki pokazują szczyt LLE po pięciu dniach, a następnie spadek wraz z wiekiem robaków.

Wiekowa dynamika lokomocji u Caenorhabditis elegans: analiza wykładnika Lyapunova

Poznaj metodę ilościowej analizy lokomocji C. elegans z wykorzystaniem dyfrakcji laserowej. Technika ta umożliwia obserwację ruchu w przestrzeni trójwymiarowej bez ograniczeń tradycyjnej mikroskopii.

Ilościowe badanie lokomocji swobodnie pływających mikroorganizmów z wykorzystaniem dyfrakcji laserowej

Przeglądaj więcej filmów