Ilościowe badanie lokomocji swobodnie pływających mikroorganizmów z wykorzystaniem dyfrakcji laserowej
25 października 2012
Mikroskopijne organizmy, takie jak swobodnie pływający nicień C. elegans, żyją i zachowują się w złożonym trójwymiarowym środowisku. Przedstawiamy nowatorskie podejście, które zapewnia analizę C. elegans przy użyciu wzorów dyfrakcyjnych. Podejście to polega na śledzeniu czasowej okresowości wzorów dyfrakcyjnych generowanych przez kierowanie światła laserowego przez kuwetę.
Ogólnym celem tej procedury jest zmierzenie częstotliwości młócenia swobodnie pływających mikroskopijnych organizmów. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie próbki mikroskopijnych robaków. Następnie przygotowywana jest konfiguracja optyczna.
Następnie rejestrowany jest wzór dyfrakcyjny wprowadzony przez żywe organizmy. Na koniec zarejestrowane dane są analizowane w celu określenia częstotliwości pływania. Ostatecznie analiza dyfrakcyjna służy do pokazania zmian we wzorcach lokomocji nieskrępowanych robaków.
Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak tradycyjna mikroskopia, jest to, że wzorce pływania można obserwować, gdy gatunek porusza się swobodnie w przestrzeni trójwymiarowej. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w swobodnie pływającą morską elegancję, może być również stosowana do innych przezroczystych, małych i mikroskopijnych organizmów narażonych na różne warunki. Aby skonfigurować C elegance do analizy wideo, zacznij od użycia spłaszczonego platynowego drucianego kilofa, aby przenieść od 10 do 20 GR dorosłych nicieni do świeżego NGM.
Wypełnione agarem płytki Petriego zawierające małe okrągłe plamki E. coli. Pozwól nicieniom złożyć jaja przez trzy do pięciu godzin, a następnie usuń dorosłe osobniki. W ten sposób powstaje mała, zsynchronizowana rozwojowo kultura składająca się z 50 do 150 nicieni, aby wyhodować nicienie do wczesnej dorosłości, inkubować szalki Petriego w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez cztery do pięciu dni.
W dniu analizy wideo użyj jednego mililitra dejonizowanej wody destylowanej, aby spłukać płytkę z młodymi dorosłymi nicieniami, zbierając w ten sposób od 50 do 150 robaków z zsynchronizowanej hodowli. Użyj mikrowirówki, aby obrócić robaki na dno probówki lub pozwól im osiąść grawitacyjnie przez około 15 minut. Usuwa większość wody z rurki i zastępuje ją jednym mililitrem dejonizowanej wody destylowanej, aby zmyć wszelkie przylegające bakterie z nicieni.
Za pomocą mikropipety przenieś od pięciu do 10 nicieni w wodzie do kwarcu vete. Zmontuj konfigurację optyczną, jak pokazano tutaj, używając lasera helowego neonowego o długości 543 nanometrów do nadpróbkowania dwóch aluminiowych luster na przedniej powierzchni używanych do kierowania wiązką laserową przez vete, uchwytu vete, ekranu projekcyjnego i szybkiej kamery zdolnej do filmowania z prędkością około 240 klatek na sekundę. Następnie użyj kawałka paraformu, aby przykryć górną część vete i odwrócić go, aby wymieszać nicienie z kolumną wody.
Umieść vete w uchwycie vete tak, aby robaki znajdowały się początkowo w pobliżu górnej części vete. Za pomocą lusterek skieruj wiązkę lasera przez środek lustra. Ponieważ nicienie są gęstsze od wody, będą powoli opadać na dno vete podczas pływania w słupie wody na ekranie projekcyjnym, pokoloruj miejsce odpowiadające transmitowanej wiązce laserowej na czarno, aby zmniejszyć rozpraszanie, gdy transmitowana wiązka styka się z ekranem projekcyjnym.
Wyeliminowanie lub zmniejszenie rozpraszania od przesyłanej wiązki zapobiegnie nasyceniu matrycy CCD kamery z powodu transmitowanej wiązki. Aby uchwycić miarę wielkości wzoru dyfrakcyjnego, narysuj linię o długości około pięciu centymetrów na ekranie projekcyjnym obok plamki transmitowanej wiązki laserowej, nie zakłócając obrazu w świetle dyfrakcyjnym. Wyłącz światło w pomieszczeniu i nagrywaj obrazy dyfrakcyjne na ekranie, gdy robaki przechodzą przez wiązkę lasera.
Aby przygotować dane wideo, zainstaluj następujący program do analizy wideo i zaimportuj wideo do programu. Ustaw początek układu współrzędnych tak, aby pokrywał się z przesyłaną plamką lasera za pomocą oprogramowania. Śledź przemieszczenie kątowe obrazu dyfrakcyjnego utworzonego przez każdy nicień.
Skopiuj i wklej dane do arkusza kalkulacyjnego i dodaj 180 stopni lub PI dla wszystkich kątów ujemnych. Aby utworzyć wykres ciągły. Korzystając z konfiguracji do analizy wideo, umieść fotodiodę z małym obszarem poza środkiem wzoru dyfrakcyjnego bezpośrednio przed ekranem projekcyjnym przez port USB A.
Podłącz fotodiodę do oscyloskopu cyfrowego, który łączy się z komputerem. Obserwuj wzorce młócenia na ekranie komputera. Zapisywanie zestawów danych w formacie ASCI lub tekstowym w celu analizowania danych.
Użyj wideo lub zdjęcia, aby zaimportować dane do programu do analizy danych, który może dopasować przebiegi. Korzystając z minimalizacji chiqua, dopasuj krzywą sinusoidalną, aby określić częstotliwość młócenia. Uśrednij częstotliwości pływania z różnych próbek i określ wariancję.
W tym badaniu dane analizowano statystycznie przy użyciu jednego czynnika Inova, a następnie Bon Ferran. Test wielokrotnych porównań Wartość P mniejsza niż 0,05 jest uważana za statystycznie istotną dla modelowania wzorów dyfrakcyjnych. Zacznij od użycia mikroskopu do zrobienia zdjęć, aby uzyskać obraz.
Przeciągnij go do Mathematica. Użyj polecenia binary eyes, aby przekonwertować go na czarno-biały. Alternatywnie można użyć polecenia wykrywania krawędzi, aby utworzyć czarno-biały obraz, w którym dwie końcowe liczby kontrolują chropowatość wynikowych krawędzi.
Następnie, za pomocą polecenia danych obrazu, przekonwertuj obraz na macierz zer i jedynek. Użyj polecenia forer, aby przeforerować, przekształcić matrycę, a następnie podnieść do kwadratu wartość bezwzględną macierzy i wyświetlić wynikowy obraz, który jest wzorem dyfrakcyjnym odpowiadającym oryginalnemu obrazowi. Ponadto użyj funkcji log, aby przeskalować kontrast obrazu.
Na koniec porównaj modelowe wzory dyfrakcyjne ze wzorami dyfrakcyjnymi uzyskanymi od swobodnie pływających robaków. W tym przykładzie morska elegancja była badana w kwarcowym weterynarzu Q o szerokości jednego centymetra, grubości pięciu milimetrów i wysokości czterech centymetrów. Pobieranie próbek pojedynczego robaka za pomocą analizy wideo.
Średnia częstotliwość pływania uzyskana z analizy wideo u weterynarza o grubości pięciu milimetrów wynosiła około 2,5 Hz. Podobnie, próbkowanie pojedynczego robaka przy użyciu metody akwizycji danych w czasie rzeczywistym i oscyloskopu cyfrowego spowodowało częstotliwość pływania około 2,7 Hz. Tę procedurę można powtórzyć dla wielu robaków.
Szczegółowe badanie swobodnie pływających robaków wykazało średnią częstotliwość pływania wynoszącą 2,37 Hz w ciągu pięciu milimetrów. Zgodnie z oczekiwaniami częstotliwość pływania jest wyższa niż w przypadku pełzającego robaka. Korzystając z tej metody dyfrakcyjnej, stwierdzono, że średnie częstotliwości pływania morskiej elegancji, która jest ograniczona do szkiełka mikroskopowego, odpowiadają wcześniej opublikowanej wartości dwóch herców.
Podążając za filmem. Przygotowanie danych i modelowanie wzorów dyfrakcyjnych pokazanych w tym filmie pozwala na modelowanie wzorców dyfrakcyjnych pływania. Za pomocą obrazów robaków uzyskanych za pomocą konwencjonalnego mikroskopu, modelowane wzory dyfrakcyjne są wykorzystywane do symulacji cyklu pływania morskiej elegancji.
Udany model składa się z fizycznie wykonalnego sukcesu wzorców pływania, dopasowanych do częstotliwości pływania. Robak powinien mieć taki sam kształt pod koniec cyklu pływania, jak na początku cyklu pływania. Po opanowaniu tej techniki można wykonać w mniej niż minutę dla każdego robaka, korzystając z szybkiej diety fotograficznej, obserwując cykle pływania na ekranie komputera.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oceniać swobodnie pływające nicienie.
Overview
To badanie przedstawia nowatorskie podejście do analizy zachowania pływania nicienia C. elegans z wykorzystaniem wzorców dyfrakcji. Śledząc czasową periodyczność tych wzorców, naukowcy mogą uzyskać wgląd w ruch tych mikroskopijnych organizmów w trójwymiarowym środowisku.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biofizyka
- Analiza zachowań
Tło
- C. elegans jest organizmem modelowym do badania ruchu.
- Tradycyjne metody mikroskopowe ograniczają obserwację organizmów w przestrzeni trójwymiarowej.
- Wzorce dyfrakcji mogą zapewnić nową metodę analizy ruchu.
- Ta technika może być zastosowana do innych przezroczystych mikroskopijnych organizmów.
Cel badania
- Pomiar częstości ruchu szarpania wolno pływającego C. elegans.
- Analiza wzorców ruchu z wykorzystaniem analizy dyfrakcji.
- Ulepszenie istniejących metod obserwacji zachowania pływania.
Zastosowane metody
- Przygotowanie zsynchronizowanej kultury C. elegans.
- Ustawienie układu optycznego z wykorzystaniem lasera helowo-neonowego.
- Rejestrowanie wzorców dyfrakcji podczas pływania nicieni przez wiązkę laserową.
- Analiza danych za pomocą oprogramowania do analizy wideo i metod statystycznych.
Główne wyniki
- Średnia częstotliwość pływania C. elegans została zmierzyta na poziomie około 2,37 Hz.
- Zaobserwowano różnice w częstotliwości pływania w porównaniu z zachowaniem pełzania.
- Technika ta pozwala na rzeczywisto czasową obserwację ruchu w trzech wymiarach.
- Analiza statystyczna potwierdziła istotność wyników.
Wnioski
- Ta metoda dyfrakcji zapewnia cenne narzędzie do badania zachowania pływania u C. elegans.
- Podejście można dostosować do innych mikroskopijnych organizmów.
- Przyszłe badania mogą rozszerzyć się na konsekwencje wzorców ruchu w różnych warunkach.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative analysis of freely swimming micro-organisms using laser diffraction enables high-throughput, real-time measurement of locomotion in three dimensions, overcoming the constraints of traditional microscopy. This approach provides robust, quantitative outputs for behavioral phenotyping and functional validation in early discovery. The method supports predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking for neurobiology and movement disorder research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of neuromuscular function in live, unconstrained model organisms.
- Supports functional target validation by measuring real-time behavioral outputs under varying conditions.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing between normal and perturbed locomotion patterns.
- Provides reproducible, quantitative endpoints for portfolio triage and early-stage decision making.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, high-throughput measurement of locomotor activity for phenotypic screening.
- Generates reproducible, quantitative data suitable for assay development and compound evaluation.
- Enables rapid comparison of locomotion metrics across experimental conditions and genetic backgrounds.
- Supports platform scalability and reuse for diverse transparent micro-organisms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns behavioral phenotyping with disease-relevant endpoints in neurobiology and movement disorders.
- Provides translational continuity from discovery through preclinical validation of neuromuscular targets.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative, statistically validated outputs.
- Facilitates predictive de-risking for movement-related therapeutic hypotheses.
Pipeline & Workflow Integration
This laser diffraction method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, enabling quantitative behavioral analysis from early target validation through lead identification and preclinical research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying neuromuscular function in live organisms.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible locomotion metrics for compound and genetic screening.
- Analytics: Delivers quantitative frequency measurements and statistical outputs for robust condition comparison.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by aligning behavioral outputs with disease models.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, reusable platform for diverse transparent micro-organism studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neuromuscular target validation.
- Operational Value: Standardizes and accelerates behavioral phenotyping with high reproducibility and throughput.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust, quantitative endpoints.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of movement-related therapeutic programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical instrumentation and quantitative behavioral analysis.
- Needs access to laser diffraction setup, high-speed imaging, and data analysis infrastructure.
- Demands cross-team standardization of data acquisition and statistical analysis protocols.
- Adaptable to various transparent micro-organisms with appropriate calibration.
- Limited to organisms and conditions compatible with optical diffraction and real-time imaging.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:23
C. elegans Preparation for Video Analysis
2:52
Optical Setup for the Video Analysis
4:36
Video Data Preparation
5:23
Real Time Data Acquistion for Instant Observation of Swimming Frequencies and Data Analysis
6:36
Model Diffraction Patterns Using Mathematica as an Example
7:48
Representative Laser Diffraction Results
9:34
Conclusion
