Przygotowanie i inaktywacja patogenów w koncentratach płytek krwi z podwójnej dawki warstwy leukocytowej z wykorzystaniem systemu INTERCEPT Blood System

W tym filmie przygotowany zostanie podwójny koncentrat platelets z puli siedmiu warstw leukocytarnych (Buffy coat), który następnie zostanie poddany działaniu preparatu Intercept. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać pełną wiedzę na temat tego, jak wytworzyć inaktywowany patogenowo podwójny koncentrat platelets. W pierwszej kolejności przedstawiamy schematyczny przegląd, po którym następuje demonstracja.

Pierwsze siedem jednostek donowanego krwi pełnej poddawanych jest wirowaniu i separacji w celu uzyskania siedmiu jednostek warstwy leukocytowej (buffy coat), które spełniają wymagania dotyczące objętości i hematokrytu. Warstwy leukocytowej są łączone, konsolidowane i wirowane. Następnie zawiesina płytkami jest oddzielana od pozostałych erytrocytów, aby uzyskać podwójną dawkę koncentratu platelets w celu inaktywacji patogenów i leukocytów.

Koncentrat płytek krwi w podwójnej dawce jest poddawany działaniu systemu Intercept, który sieciuje kwasy nukleinowe. Ostatecznie procedura ta pozwala uzyskać dwie terapeutyczne dawki płytek o akceptowalnej jakości in vitro przez siedem dni przechowywania, co określono na podstawie oceny pH, glukozy, mleczanów, PO2 i PCO2 oraz testu pH. Technik z mojego centrum krwiodawstwa zademonstruje procedurę, a my opiszemy wymagania dotyczące przetwarzania.

Najpierw należy upewnić się, że podwójna dawka koncentratu płytek krwi spełnia specyfikacje przetwarzania obejmujące objętość od 300 do 420 ml, dawkę płytek od 2,5 do 7 × 10¹¹ oraz zawartość erytrocytów poniżej 4 × 10⁶/ml. Procedurę tę należy rozpocząć od siedmiu jednostek krwi pełnej pobranych do zestawów do pobierania o pojemności 450 ml.

Umieść jednostki krwi w naczyniach wirówki i przeprowadź wirowanie z dużą siłą odśrodkową 4 880 RCF przez 11 minut w temperaturze pokojowej, ustawiając hamowanie na poziom B pięć zgodnie z instrukcjami producenta. Po wirowaniu krew zostanie rozdzielona na trzy warstwy: erytrocyty, warstwę leukocytową (buffy coat) oraz osocze. Przelej osocze do górnej torby satelitarnej, a erytrocyty do dolnej torby satelitarnej, pozostawiając warstwę leukocytową o objętości około 48 mililitrów i hematokrycie 37% w pojemniku do pobierania.

Umieść warstwy leukocytowe (buffy coats) na wytrząsarce do płytek w temperaturze pokojowej przez noc, łącząc sterylnie siedem warstw leukocytowych i 300 mililitrów SSP wraz z roztworem dodatkowym do płytek. W konfiguracji kaskadowej, z roztworem dodatkowym na górze, zaklemuj linię między roztworem dodatkowym a pierwszą warstwą leukocytową, jak pokazano tutaj. Otwórz zgrzewy między jednostkami warstw leukocytowych i pozwól im spłynąć do ostatniego pojemnika z warstwą leukocytową.

Następnie otwórz zacisk oraz połączenie pomiędzy roztworem dodatkowym a pierwszą warstwą leukocytarną (buffy coat) i pozwól, aby około jedna trzecia roztworu dodatkowego, czyli około 100 mililitrów, przepłukała sekwencyjnie każdy z pojemników z warstwą leukocytarną przed zamknięciem zacisku; powtórz płukanie jeszcze dwa razy, za każdym razem używając około 100 mililitrów roztworu dodatkowego. Odłącz zbiorczy pojemnik z warstwą leukocytarną od pustych pojemników. Objętość zgromadzonej warstwy leukocytarnej, wliczając roztwór dodatkowy, powinna wynosić około 600 mililitrów.

Umieść połączone warstwy buffy coat na mieszadle na jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie podłącz pojemnik do przechowywania płytek krwi z zintegrowanym filtrem do redukcji leukocytów do worka zawierającego pulę buffy coat. Umieść połączone warstwy buffy coat oraz pojemnik do przechowywania płytek krwi w wirówce i wiruj przy 462 RCF przez dziewięć minut i 20 sekund.

Po wirowaniu przelać zawiesinę platelets przez filtr redukcyjny Luca do pojemnika do przechowywania platelets. Wynikiem jest podwójna dawka koncentratu platelets zawierająca około 7 × 10¹¹ platelets w 420 mililitrach, która może zostać poddana inaktywacji patogenów za pomocą systemu Intercept. Podwójna dawka koncentratu platelets jest przetwarzana przy użyciu zestawu do przetwarzania Intercept, który składa się z pojemnika antoin, pojemnika do naświetlania oraz podwójnych pojemników do przechowywania.

Podłącz pojemnik z zawiesiną płytek do pojemnika z aminem w zestawie do przetwarzania przechyłowego. Następnie zawieś płytki. Odłam dolną kaniulę w pojemniku z aminem, aby umożliwić przepływ roztworu do pojemnika z oświetleniem.

Następnie przełam górną kaniulę w pojemniku z Amin, aby umożliwić przepływ płytkami krwi przez pojemnik z Amin do pojemnika do naświetlania. Delikatnie wymieszaj mieszaninę płytek krwi i amtosiny. Lekko ściśnij pojemnik do naświetlania, aby usunąć z niego powietrze.

Uszczelnij rurki pomiędzy pojemnikiem do iluminacji a pojemnikiem amato w taki sposób, aby z pojemnika do iluminacji wystawało nie więcej niż cztery centymetry rurki. Usuń i wyrzuć puste pojemniki. Umieść zestaw do przetwarzania w iluminatorze, wkładając pojemnik do iluminacji do dużego przedziału po lewej stronie, a organizer do mniejszego przedziału po prawej stronie.

Zeskanuj identyfikator darczyńcy. Kod produktu i przetwarzanie. Wprowadź numer serii do iluminatora.

Zamknij metalową pokrywę oraz szufladę. Naciśnij start, aby rozpocząć naświetlanie. Naświetlacz dostarcza kontrolowaną dawkę światła UVA do mieszaniny amin i płytek krwi w pojemniku do naświetlania.

Amina wiąże się pomiędzy parami zasad kwasów nukleinowych patogenów, które mogą znajdować się w jednostce platelets. Po naświetleniu powstają trwałe wiązania sieciowe, które blokują DNA lub RNA, uniemożliwiając patogenom dalszą replikację i wywoływanie choroby u biorcy produktu krwiopochodnego. Po naświetleniu należy usunąć zestaw do przetwarzania.

Następnie wyjmij pojemniki z organizera, zawieś płytki krwi oraz zestaw do przetwarzania. Odłam kaniulę przy wylocie pojemnika do naświetlania i pozwól, aby płytki krwi spłynęły do pojemnika CAD. Wewnątrz pojemnika CAD znajduje się płytka z unieruchomionymi makroporowatymi kuleczkami polistyrenowymi, które redukują poziom resztkowego aminy w produkcie krwi.

Należy uważać, aby nie wygiąć wafla CAD. Wypchnąć powietrze z pojemnika CAD do pojemnika z oświetleniem. Uszczelnić rurkę w pobliżu portu wlotowego pojemnika CAD.

Zdejmij i wyrzuć pusty pojemnik do iluminacji. Umieść pojemnik CAD wraz z dołączonymi pojemnikami do przechowywania na agitatorze do płytek na okres od sześciu do 16 godzin. Spowoduje to zmniejszenie pozostałej ilości amliny do stężenia mniejszego niż lub równego 2 µM.

Po zakończeniu procesu CAD wyjmij jednostki platelets z mieszadła, zawieś je, przełam kaniulę przy wylocie pojemnika CAD i pozwól, aby platelets spłynęły do dwóch pojemników do przechowywania. Następnie usuń powietrze z pojemników do przechowywania. Uszczelnij dren powyżej złączki Y i usuń pojemnik CAD.

Wynikiem są dwa koncentraty platelets z nieaktywnymi patogenami do oceny funkcji platelets in vitro. Określono dawkę platelets, pH, PO₂, produkcję mleczanu oraz zużycie glukozy w próbkach. Parametry koncentratów platelets określano do siódmego dnia przechowywania.

Rycina ta przedstawia średnią początkową dawkę płytek w koncentracie płytek o podwójnej dawce przed zabiegiem intercept oraz średnią dawkę płytek w każdym z przetworzonych produktów rozdzielonych do siódmego dnia przechowywania. Jak widać, strata płytek podczas przechowywania wyniosła około 9%. Redukcja ta nie różni się od spodziewanej straty płytek podczas przechowywania konwencjonalnych koncentratów płytek. Zgodnie z wymogami europejskimi, pH płytek musi pozostać powyżej 6,4 do końca okresu ważności.

Podczas przetwarzania pH koncentratów płytek krwi nieznacznie spada, w zależności od objętości koncentracji płytek oraz przepuszczalności gazowej pojemnika do przechowywania płytek. Rysunek ten przedstawia pH rozdzielonych produktów płytkowych w ciągu siedmiu dni przechowywania; podczas przechowywania pH pozostaje stabilne i utrzymuje się w granicach wymogów przetwórczych. W przechowywanych płytkach powinien nadal zachodzić metabolizm tlenowy, który jest wskaźnikiem zdolności płytek do funkcjonowania in vivo po przetoczeniu pacjentowi.

Zużycie O2 oraz produkcja CO2 przez płytki krwi wskazują na utrzymującą się respirację w próbkach z pojemnika PL 24 10 podczas siedmiu dni przechowywania. Podobnie metabolizm beztlenowy powinien być kontynuowany w przechowywanych płytkach. Zatem zużycie glukozy i produkcja mleczanu są również wskaźnikami zdolności płytek do funkcjonowania po transfuzji.

Te dwie ryciny przedstawiają poziomy mleczanu i glukozy w ciągu siedmiu dni przechowywania. Zużycie glukozy i produkcja mleczanu przez płytki krwi są ze sobą spójne. W ciągu siedmiu dni przechowywania w pięciu jednostkach poziom glukozy wynosił mniej niż 1,11 mmol/L, co stanowi dolną granicę oznaczalności testu na glukozę.

Przygotowanie i walidacja łączenia frakcji leukocytowej (buffy coat) pozwoliły na otrzymanie koncentratów płytek krwi spełniających kryteria wejściowe dla procesu inaktywacji patogenów, w szczególności w zakresie objętości, liczby płytek, stosunku plazmy oraz zanieczyszczenia erytrocytami. Końcowe jednostki spełniały kryteria walidacyjne przez siedem dni przechowywania, w tym w odniesieniu do dawki płytek i pH. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z konwencjonalną metodą przygotowania frakcji leukocytowej, która pozwala na uzyskanie pojedynczej dawki koncentratu płytek, jest maksymalizacja uzysku komponentów z pobranych jednostek krwi, redukcja kosztów operacyjnych dzięki zastosowaniu techniki podwójnej dawki oraz zwiększenie bezpieczeństwa pacjentów poprzez inaktywację patogenów przenoszonych przez transfuzje.