Name: Wysoka wydajność, specyficzna dla miejsca transfekcja przylegających komórek za pomocą siRNA przy użyciu macierzy mikroelektrod (MEA) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Poznaj metodę wysokowydajnej transfekcji specyficznej dla miejsca w komórkach przylegających przy użyciu macierzy mikroelektrod. Technika ta umożliwia precyzyjne dostarczanie siRNA z kontrolą przestrzenną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Przygotowanie MEA
<ol>
	<li>Matryce MEA do zastosowań w eksperymentach z elektroporacji mogą być albo wykonane za pomocą standardowej techniki fotolitografii, zgodnie z wcześniejszym opisem18, albo zakupione bezpośrednio u producentów MEA, takich jak Multi Channel Systems <a href="http://www.multichannelsystems.com" target="_blank">(http:/www.multichannelsystems.com/)</a> oraz Alpha MED Scientific, Inc. <a href="http://www.med64.com/" target="_blank">(http://www.MED64.com)</a>. MEA wykorzystane w naszych eksperymentach zostały wykonane wewnętrznie w czystym pomieszczeniu na Arizona State University, zarządzanym przez Center for Solid State Electronics Research (CSSER). Wykorzystane MEA posiadały 32 elektrody z tlenku indu i cyny w układzie 8 na 4, o średnicach od 50-200 μm, umieszczone w szklanej studni o średnicy wewnętrznej 1 cm. Studnia szklana została przyklejona do MEA za pomocą polidimetylosiloksanu (PDMS).</li>
	<li>Przed wysiewaniem komórek wysterylizuj MEA w autoklawie. Można również stosować inne metody sterylizacji, takie jak moczenie w 70% etanolu, naświetlanie UV oraz obróbka gorącą wodą, zgodnie z opisami w innych źródłach, pod warunkiem, że nie naruszą one integralności MEA.</li>
	<li>Przenieś autoklawowaną MEA do dygestorium z laminarnym przepływem powietrza i umieść ją w standardowej sterylnej polistyrenowej szalce Petriego. Przed wysianiem komórek na MEA wysterylizuj dygestorium, włączając lampę UV na 20 min. Jeśli MEA jest wrażliwa na światło UV, przykryj szalkę Petriego zawierającą MEA sterylną folią aluminiową podczas naświetlania dygestorium promieniowaniem UV.</li>
</ol>
2. Wysiewanie komórek na MEA
<ol>
	<li>Zezbierz komórki z hodowli linii komórek ssaków przylegających, używając Trypsyny/EDTA, i doprowadź je do stężenia 100-200 komórek/μl w 1 ml pożywki komórkowej do wysiewu. W naszych eksperymentach pomyślnie hodowaliśmy na MEA linię fibroblastów NIH 3T3, linię komórek HeLa oraz pierwotne neurony korowe i hipokampalne.</li>
	<li>Nanieś kroplę 20-30 μl pożywki z komórkami na MEA. Przenieś szalkę Petriego z MEA do inkubatora. Ważne jest, aby upewnić się, że objętość kropli z komórkami jest wystarczająca, by pokryć wszystkie elektrody na MEA.</li>
	<li>2 hr po wysiewaniu komórek przenieś szalkę Petriego z MEA z inkubatora do komory z laminarnym przepływem powietrza i ostrożnie dodaj 400-500 μl uprzednio ogrzanej pożywki (37 °C) do studni MEA. Sprawdź pod mikroskopem, czy komórki nadal przylegają i są równomiernie rozłożone na powierzchni MEA. Przenieś MEA z powrotem do inkubatora. 2 hr okresu oczekiwania przed dodaniem pożywki zapewnia wystarczający czas na adhezję komórek do powierzchni MEA. Dodanie pożywki komórkowej zbyt wcześnie po wysiewaniu może doprowadzić do wypłukania komórek. Jeśli komórki nie przylegają dobrze do MEA, powierzchnię można potraktować czynnikami wspomagającymi adhezję, takimi jak polilizyna, fibronektyna i laminina, aby poprawić przyleganie komórek. W naszych eksperymentach z komórkami HeLa zazwyczaj traktujemy powierzchnię MEA fibronektyną (10 μg/ml) przez 1-2 hr.</li>
	<li>8-12 hr po wysiewaniu komórek wykonaj 1-2 płukania PBS, aby usunąć martwe komórki. Pożywkę komórkową można wymieniać co 24-48 hr w zależności od potrzeb. W typowym eksperymencie komórki są zazwyczaj gotowe do transfekcji 24-48 hr po wysiewaniu. Aby zachować spójność wydajności elektroporacji, zaleca się odczekać, aż kultura osiągnie co najmniej 80% konfluencji przed przeprowadzeniem elektroporacji.</li>
</ol>
3. Miejscowo swoista transfekcja siRNA
<ol>
	<li>Przygotować roztwór kwasów nukleinowych. W przypadku transfekcji siRNA należy przygotować roztwór do elektroporacji siRNA o stężeniu 1-2 μM w lodowatym buforze do elektroporacji, aby uzyskać objętość końcową 200-400 μl. W niniejszym artykule wideo demonstrujemy transfekcję komórek HeLa za pomocą siRNA o sekwencji scrambled sprzężonej z Alexa 488.</li>
	<li>Przenieść MEA z komórkami z inkubatora do sterylnej komory z laminarnym przepływem powietrza. Usunąć pożywkę komórkową z MEA i przeprowadzić przemywanie PBS. Następnie do dołka dodać 200-400 μl lodowatego roztworu do elektroporacji siRNA o stężeniu 1 μM.</li>
	<li>Przyłożyć anodowe prostokątne impulsy elektryczne do wybranych elektrod (optymalne parametry impulsu elektrycznego określić w kroku 4). W naszych eksperymentach do generowania impulsów elektrycznych wykorzystaliśmy generator przebiegów Pragmatic Instruments 2414A oraz 16-pinowy klips DIP (dual-inline-package) do nawiązania kontaktu z podkładkami przyłączeniowymi MEA. Generator przebiegów można połączyć z klipsem DIP za pomocą płytki drukowanej z demultiplekserem, aby zapewnić selektywność poszczególnych elektrod. Jako elektrodę odniesienia należy umieścić stalową katodę w pożywce komórkowej. Podczas opuszczania stalowej elektrody odniesienia do pożywki niezwykle ważne jest upewnienie się, że nie nawiąże ona kontaktu z powierzchnią MEA. Kontakt ten może spowodować uszkodzenie komórek i MEA. Zaleca się opuszczenie elektrody odniesienia na wysokość 1 mm nad komórkami. Aby ułatwić rozmieszczenie elektrody odniesienia, w dołku można umieścić dystans o wysokości 1 mm. Alternatywnym podejściem do stosowania zewnętrznej elektrody odniesienia jest wykorzystanie sąsiednich elektrod jako par katoda-anoda.</li>
	<li>Niezwłocznie po przyłożeniu impulsów elektrycznych do wybranych elektrod na MEA, przenieść MEA z powrotem do inkubatora. Po 5 min inkubacji ostrożnie zastąpić 75% buforu do elektroporacji podgrzaną wcześniej (37 °C) pożywką komórkową. Następnie można przeprowadzić obrazowanie fluorescencyjne, aby potwierdzić dostarczenie znakowanego fluorescencyjnie siRNA do komórek.</li>
</ol>
4. Optymalizacja parametrów elektroporacji
<ol>
	<li>Aby określić optymalne parametry impulsu elektrycznego dla elektroporacji, należy zaprojektować eksperymenty z zakresu wartości amplitudy impulsu, czasu trwania impulsu i liczby impulsów. W naszym doświadczeniu z komórkami HeLa zaobserwowaliśmy, że pojedynczy impuls napięcia o amplitudzie od 3 V do 9 V i czasie trwania od 1 msec do 10 msec dla elektrody o rozmiarze 100 μm prowadził do skutecznej elektroporacji przy minimalnej śmierci komórek. Zalecamy, aby w jednym czasie zmieniać tylko jeden parametr, utrzymując pozostałe na stałym poziomie. W celu ilościowego określenia wydajności elektroporacji dla każdego z parametrów impulsu stosujemy jodek propidyny (PI), barwnik nieprzenikający do wnętrza komórki, który barwi materiał nukleinowy, oraz metodologię opartą na teście żywotności, opisaną w krokach 4.2-4.5.</li>
	<li>Należy hodować komórki na MEA zgodnie z instrukcjami opisanymi w krokach 1 i 2.</li>
	<li>Przed elektroporacją należy przygotować 300-500 μl roztworu PI o stężeniu 30 μg/ml w lodowatym buforze do elektroporacji oraz 400 μl roztworu calcein AM o stężeniu 4 μM w PBS.</li>
	<li>Należy przenieść MEA z inkubatora do komory z laminarnym przepływem powietrza. Należy usunąć medium hodowlane z MEA i przeprowadzić przemycie PBS. Następnie należy dodać 300-500 μl lodowatego buforu do elektroporacji z PI.</li>
	<li>Należy przyłożyć impulsy elektryczne o pożądanej amplitudzie i czasie trwania do wybranych elektrod (sprzęt użyty w naszych eksperymentach do generowania i przykładania impulsu elektrycznego do MEA został opisany w kroku 3.3). Jako elektrodę odniesienia należy opuścić stalową elektrodę do buforu do elektroporacji w studzience MEA lub wykorzystać sąsiednią elektrodę jako odniesienie. Poprzez selektywne przykładanie impulsów o różnych amplitudach lub czasach trwania do różnych elektrod można przeprowadzić wiele eksperymentów na tym samym urządzeniu. Na przykład, na MEA z 32 elektrodami można przeprowadzić 8 eksperymentów, dzieląc 32 elektrody na 8 grup, z których każda składa się z 4 elektrod. Każda z 8 grup może być następnie stymulowana pojedynczym prostokątnym impulsem napięcia o czasie trwania 5 msec z amplitudami zmieniającymi się w zakresie 3 V-6 V w przyrostach 0,5 V, a jedną grupę można wykorzystać jako kontrolę.</li>
	<li>Natychmiast po przyłożeniu impulsów napięcia należy przenieść MEA do inkubatora na 5 min. Następnie należy ostrożnie usunąć 75% buforu do elektroporacji ze studzienki MEA i zastąpić go ciepłym medium hodowlanym. MEA należy przenieść z powrotem do inkubatora.</li>
	<li>Po okresie inkubacji od 2-4 hr należy zastąpić medium hodowlane w studzience MEA 300-500 μl roztworu Calcein AM o stężeniu 4 μM w PBS. MEA należy przenieść z powrotem do inkubatora na kolejne 30 min.</li>
	<li>Po inkubacji komórek z Calcein AM należy zastąpić roztwór Calcein AM w studzience MEA buforem PBS po dwukrotnym przemyciu PBS. Należy wykonać obrazy fluorescencyjne komórek za pomocą mikroskopu optycznego z filtrami dla PI (Wzbudzenie/Emisja - 535 nm/617 nm) i Calcein AM (Wzbudzenie/Emisja - 490 nm/520 nm). Pobranie PI w wyniku elektroporacji powoduje czerwoną fluorescencję komórek, a Calcein AM powoduje zieloną fluorescencję komórek żywych. Można zaobserwować trzy możliwe scenariusze: 1) komórka poddana elektroporacji i żywa (będzie fluorescować na czerwono i zielono), 2) komórki żywe, ale niepoddane elektroporacji (będą fluorescować tylko na zielono) oraz 3) komórki martwe w wyniku elektroporacji (będą fluorescować tylko na czerwono). Żywotność komórek obliczono jako procent całkowitej liczby komórek żywych na elektrodzie, a wydajność elektroporacji obliczono jako procent całkowitej liczby komórek załadowanych PI/siRNA.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Rysunek 1 przedstawia specyficzne dla miejsca ładowanie komórek HeLa barwnikiem PI. Można zaobserwować, że jedynie komórki znajdujące się na elektrodzie wykazują pobór PI (Rysunek 1B). W celu oceny żywotności komórek po elektroporacji przeprowadzono test żywotności (Rysunek 1A). Wydajność elektroporacji oraz żywotność komórek dla przykładu pokazanego na Rysunku 1 wyniosły odpowiednio 81.8 % i 96.1 %. Wysoką żywotność komórek i wydajność elektroporacji można osiągnąć poprzez optymalizację parametrów impulsu elektroporacyjnego. Specyficzna dla miejsca transfekcja komórek HeLa siRNA znakowanym fluorescencyjnie dla zoptymalizowanego impulsu elektroporacyjnego (8 V, 1 msec) pokazana jest na Rysunku 2. Ustalono, że wydajność elektroporacji dla siRNA przy 8 V, 1 msec wyniosła 74.4 ± 16.0 %, a żywotność komórek 87.9 ± 8.4 % (wszystkie dane przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe, N=5).
<img alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiające barwienie komórek; zielone i czerwone testy komórkowe do analizy." src="/files/ftp_upload/4415/4415fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Dostarczanie PI w konkretne miejsce w komórkach HeLa na elektrodzie 200 μm (6 V, 5 msec). A) Test żywotności oparty na Calcien wykonany 2 h po elektroporacji. Żywe komórki są wskazane przez zieloną fluorescencję. B) Czerwona fluorescencja wykazuje pobranie PI przez komórki na elektrodzie. C) Obraz nałożony z A i B. Białe strzałki wskazują komórki poddane elektroporacji, które są żywe. Czarne strzałki wskazują komórki martwe. Białe koło na A, B i C wskazuje obrys elektrody.
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna: lokalizacja białka w kolorze zielonym (A) i niebieskim (B); analiza komórkowa." src="/files/ftp_upload/4415/4415fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Transfekcja komórek HeLa z siRNA o sekwencji scramble znakowanej fluorescencyjnie. A) Obraz komórek HeLa na elektrodzie 100 μm transfekowanych siRNA znakowanym Alexa 488 (8 V, 1 msec). B) Obraz jąder komórkowych barwionych DAPI. Białe koło oznacza krawędź elektrody.

<ol><li>Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li>
<li>Caplen, N. J., Parrish, S., Imani, F., Fire, A., Morgan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+inhibition+of+gene+expression+by+small+double-stranded+RNAs+in+invertebrate+and+vertebrate+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Specific inhibition of gene expression by small double-stranded RNAs in invertebrate and vertebrate systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 9742(2001).</li>
<li>Elbashir, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplexes+of+21-nucleotide+RNAs+mediate+RNA+interference+in+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.</a> Nature. 411, 494-498 (2001).</li>
<li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+for+stable+expression+of+short+interfering+RNAs+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.</a> Science. 296, 550(2002).</li>
<li>Lee, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+small+interfering+RNAs+targeted+against+HIV-1+rev+transcripts+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 500-505 (2002).</li>
<li>Miyagishi, M., Taira, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((U6+promoter-driven+siRNAs+with+four+uridine+3%27+overhangs+efficiently+suppress+targeted+gene+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 497-500 (2002).</li>
<li>Paul, C. P., Good, P. D., Winer, I., Engelke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+expression+of+small+interfering+RNA+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Effective expression of small interfering RNA in human cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 505-508 (2002).</li>
<li>Xia, H., Mao, Q., Paulson, H. L., Davidson, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA-mediated+gene+silencing+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">siRNA-mediated gene silencing in vitro and in vivo.</a> Nat. Biotechnol. 20, 1006-1010 (2002).</li>
<li>Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+for+the+efficient+transfection+of+mammalian+cells+with+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA.</a> Nucleic Acids Res. 15, 1311(1987).</li>
<li>Felgner, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipofection%3A+a+highly+efficient%2C+lipid-mediated+DNA-transfection+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 84, 7413(1987).</li>
<li>Raptis, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((applications+of+electroporation+of+adherent+cells+in+situ%2C+on+a+partly+conductive+slide%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">applications of electroporation of adherent cells in situ, on a partly conductive slide.</a> Mol. Biotechnol. 4, 129-138 (1995).</li>
<li>Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfecting+mammalian+cells%3A+optimization+of+critical+parameters+affecting+calcium-phosphate+precipitate+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Transfecting mammalian cells: optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation.</a> Nucleic Acids Res. 24, 596-601 (1996).</li>
<li>Gao, Y., Liu, X. L., Li, X. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+progress+on+siRNA+delivery+with+nonviral+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Research progress on siRNA delivery with nonviral carriers.</a> International Journal of Nanomedicine. 6, 1017(2011).</li>
<li>Ziauddin, J., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarrays+of+cells+expressing+defined+cDNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microarrays of cells expressing defined cDNAs.</a> Nature. 411, 107-110 (2001).</li>
<li>Yamauchi, F., Kato, K., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+and+temporally+controlled+gene+transfer+by+electroporation+into+adherent+cells+on+plasmid+DNA-loaded+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Spatially and temporally controlled gene transfer by electroporation into adherent cells on plasmid DNA-loaded electrodes.</a> Nucleic Acids Res. 32, e187(2004).</li>
<li>Yamauchi, F., Kato, K., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer-by-Layer+Assembly+of+Poly+%28ethyleneimine%29+and+Plasmid+DNA+onto+Transparent+Indium%3F+Tin+Oxide+Electrodes+for+Temporally+and+Spatially+Specific+Gene+Transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Layer-by-Layer Assembly of Poly (ethyleneimine) and Plasmid DNA onto Transparent Indium? Tin Oxide Electrodes for Temporally and Spatially Specific Gene Transfer.</a> Langmuir. 21, 8360-8367 (2005).</li>
<li>Jain, T., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsystem+for+transfection+of+exogenous+molecules+with+spatio-temporal+control+into+adherent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Microsystem for transfection of exogenous molecules with spatio-temporal control into adherent cells.</a> Biosensors and Bioelectronics. 22, 863-870 (2007).</li>
<li>Jain, T., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-chip+for+spatially+controlled+transfection+of+nucleic+acid+payloads+into+cells+in+a+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Bio-chip for spatially controlled transfection of nucleic acid payloads into cells in a culture.</a> Lab on a Chip. 7, 1004-1011 (2007).</li>
<li>Jain, T., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrode+array+%28MEA%29+platform+for+targeted+neuronal+transfection+and+recording%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Engineering%2C+IEEE+Transactions+on%22%5BJournal%5D)">Microelectrode array (MEA) platform for targeted neuronal transfection and recording.</a> Biomedical Engineering, IEEE Transactions on. 55, 827-832 (2008).</li>
<li>Jain, T., McBride, R., Head, S., Saez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+parallel+introduction+of+nucleic+acids+into+mammalian+cells+grown+in+microwell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Highly parallel introduction of nucleic acids into mammalian cells grown in microwell arrays.</a> Lab on a Chip. 9, 3557-3566 (2009).</li>
<li>Huang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+and+high-throughput+electroporation+microchip+applicable+for+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">An efficient and high-throughput electroporation microchip applicable for siRNA delivery.</a> Lab Chip. 11, 163-172 (2010).</li>
<li>Efficient and high-throughput electroporation chips. Li, Z., Wei, Z., Li, X., Du, Q., Liang, Z. Solid-State Sensors, Actuators and Microsystems Conference (TRANSDUCERS), 2011 16th International, , IEEE. (2011).</li>
<li>Jain, T., Papas, A., Jadhav, A., McBride, R., Saez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+electroporation+of+surface-bound+siRNAs+in+microwell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">In situ electroporation of surface-bound siRNAs in microwell arrays.</a> Lab Chip. 12, 939-947 (2012).</li>
<li>Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Electroporationfor+Gene+Transfer+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Electroporationfor Gene Transfer In Vivo.</a> Neuron. 29, 583-591 (2001).</li>
<li>Akaneya, Y., Jiang, B., Tsumoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi-induced+gene+silencing+by+local+electroporation+in+targeting+brain+region%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">RNAi-induced gene silencing by local electroporation in targeting brain region.</a> J. Neurophysiol. 93, 594(2005).</li>
<li>Lee, W. G., Demirci, U., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+electroporation%3A+challenges+and+perspectives+for+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Microscale electroporation: challenges and perspectives for clinical applications.</a> Integr. Biol. 1, 242-251 (2009).</li>
<li>Boukany, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanochannel+electroporation+delivers+precise+amounts+of+biomolecules+into+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells.</a> Nature Nanotechnology. 6, 747-754 (2011).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

W niniejszym artykule wideo demonstrujemy zastosowanie MEA do specyficznej dla miejsca transfekcji komórek HeLa siRNA o sekwencji scrambled. Jedną z zalet tej technologii jest jej możliwość zastosowania w różnych liniach komórkowych, w tym w liniach pierwotnych. Nasze laboratorium wykazało wcześniej zastosowanie tej technologii do specyficznej dla miejsca transfekcji pierwotnych kultur neuronów hipokampa szczura w 18. dniu embrionalnym (E18) oraz komórek NIH-3T3 sekwencjami scrambled siRNA i plazmidem GFP18, 19</sup...

<table><tbody><tr><td>Pożywka komórkowa:&lt;br/&gt;Advanced MEM&lt;br/&gt;L-Glutamina 200 mM&lt;br/&gt;Penicylina/Streptomycyna&lt;br/&gt;Płodowa surowica bydlęca</td><td>Gibco/Invitrogen&lt;br/&gt;Himedia Laboratories/VWR&lt;br/&gt;Lonza group Ltd.&lt;br/&gt;Gibco/Invitrogen</td><td>12492-013&lt;br/&gt;95057-448&lt;br/&gt;09-757F&lt;br/&gt;16000-044</td><td>Skład pożywki komórkowej:&lt;br/&gt; 2% FBS, 2% L-glutaminy i 2% Pennstrep w Advanced MEM</td></tr><tr><td>Trypsyna EDTA</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>25-053-CL</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>siRNA o sekwencji scrambled znakowane Alexa 488 i rodamyną</td><td>Qiagen, Inc.</td><td>1027292</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do elektroporacji</td><td>Biorad Laboratories</td><td>165-2677</td><td></td></tr><tr><td>Generator przebiegów</td><td>Pragmatic</td><td>2414A</td><td>Można użyć dowolnego generatora przebiegów/impulsów zdolnego do dostarczenia wymaganych impulsów.</td></tr></tbody></table>

wysokoefektywna, specyficzna lokalnie transfekcja komórek adherentnych sirna przy użyciu macierzy mikroelektrod (mea)

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA)

Odkrycie szlaku RNAi u eukariotów oraz późniejszy rozwój czynników RNAi, takich jak siRNA i shRNA, pozwoliły na opracowanie skutecznej metody wyciszania konkretnych genów1-8 na potrzeby genomiki funkcjonalnej i terapeutyki. Głównym wyzwaniem w badaniach opartych na RNAi jest dostarczenie czynników RNAi do docelowych komórek. Tradycyjne niewirusowe techniki dostarczania, takie jak masowa elektroporacja i chemiczne metody transfekcji, często nie zapewniają niezbędnej kontroli przestrzennej nad dostarczaniem i cechują się niską wydajnością transfekcji9-12. Niedawne postępy w metodach transfekcji chemicznej, takich jak zastosowanie lipidów kationowych, polimerów kationowych i nanocząsteczek, doprowadziły do znacznego zwiększenia wydajności transfekcji13. Niemniej jednak techniki te wciąż nie oferują precyzyjnej kontroli przestrzennej nad dostarczaniem, co mogłoby przynieść ogromne korzyści w zminiaturyzowanych technologiach wysokoprzepustowych, badaniach pojedynczych komórek oraz analizie oddziaływań międzykomórkowych.
Ostatnie postępy technologiczne w dostarczaniu genów umożliwiły wysokoprzepustową transfekcję komórek adherentnych14-23, z czego większość metod opiera się na elektroporacji w mikroskali. Elektroporacja w mikroskali oferuje precyzyjną czasowo-przestrzenną kontrolę nad dostarczaniem (aż do poziomu pojedynczych komórek) i wykazano, że pozwala osiągnąć wysoką wydajność19, 24-26. Ponadto podejścia oparte na elektroporacji nie wymagają długotrwałego okresu inkubacji (zazwyczaj 4 godziny) z kompleksami siRNA i DNA, co jest konieczne w chemicznych metodach transfekcji, i prowadzą do bezpośredniego wprowadzenia nagich cząsteczek siRNA i DNA do cytoplazmy komórki. W konsekwencji ekspresja genów może zostać osiągnięta już sześć godzin po transfekcji27. Nasz zespół badawczy wcześniej zaprezentował wykorzystanie matryc mikroelektrodowych (MEA) do transfekcji specyficznej dla danej lokalizacji w adherentnych kulturach komórek ssaków17-19. W podejściu opartym na MEA dostarczenie materiału genetycznego odbywa się poprzez lokalną elektroporację komórek w mikroskali. Przyłożenie impulsu elektrycznego do wybranych elektrod generuje lokalne pole elektryczne, które prowadzi do elektroporacji komórek znajdujących się w obszarze stymulowanych elektrod. Niezależne sterowanie mikroelektrodami zapewnia przestrzenną i czasową kontrolę nad transfekcją, a także umożliwia przeprowadzenie wielu eksperymentów opartych na transfekcji na tej samej kulturze, co zwiększa przepustowość eksperymentalną i zmniejsza zmienność między kulturami. 
W niniejszym materiale opisujemy układ eksperymentalny oraz protokół celowanej transfekcji adherentnych komórek HeLa za pomocą siRNA o sekwencji scrambled znakowanej fluorescencyjnie z wykorzystaniem elektroporacji. Ten sam protokół można zastosować również do transfekcji wektorów plazmidowych. Ponadto opisany tutaj protokół można z łatwością rozszerzyć na różne linie komórek ssaków po wprowadzeniu niewielkich modyfikacji. Komercyjna dostępność MEA z predefiniowanymi oraz niestandardowymi układami elektrod sprawia, że technika ta jest dostępna dla większości laboratoriów badawczych dysponujących podstawowym wyposażeniem do hodowli komórkowych.

Artykuł szczegółowo opisuje protokół swoistej miejscowo transfekcji komórek ssaków w hodowli adherentnej za pomocą matrycy mikroelektrod (MEA) z wykorzystaniem siRNA o sekwencji scrambled.

Wysokoefektywna, specyficzna lokalnie transfekcja komórek adherentnych siRNA przy użyciu macierzy mikroelektrod (MEA)

Odkrycie szlaku RNAi u eukariotów i późniejsza opracowanie czynników RNAi, takich jak siRNA i shRNA, pozwoliły na stworzenie skutecznej metody do...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest przeprowadzenie transfekcji specyficznej dla konkretnego miejsca w komórkach adherentnych. Osiąga się to poprzez hodowlę monowarstwy komórek na matrycy mikroelektrod. W drugim kroku przyłożenie impulsu elektrycznego do wybranych elektrod prowadzi do elektroporacji komórek docelowych przylegających do powierzchni elektrod.Prowadzi to do powstania w błonie komórkowej porów, które umożliwiają wniknięcie egzogennych cząsteczek do wnętrza komórki. Następnie można przeprowadzić przesiew komórek docelowych w celu wykrycia wynikowego fenotypu przy użyciu odpowiedniego testu. Opisana tutaj technika transfekcji w mikroskali oferuje kilka kluczowych zalet w porównaniu do konwencjonalnych metod transfekcji, takich jak elektroporacja masowa czy transfekcja chemiczna.Po pierwsze, pozwala to na uzyskanie precyzyjnej kontroli przestrzennej nad samym procesem transfekcji i umożliwia wysokowydajną transfekcję pojedynczych komórek lub skupisk komórek, nawet w liniach komórkowych trudnych do transfekcji. Po drugie, jest to podejście łatwo skalowalne, co pozwala na realizację wysokoprzepustowych analiz molekularnych. Jedną z kluczowych zalet wykorzystania matrycy mikroelektrod do transfekcji miejscowej jest możliwość jednoczesnej oceny funkcjonalnej komórek docelowych, takiej jak ilościowa elektrofizjologia oraz zmiany morfologiczne.Aby rozpocząć procedurę, wysterylizować MEA w autoklawie, następnie przenieść wysterylizowaną MEA do komory z laminarnym przepływem powietrza i umieścić ją w standardowej sterylnej polistyrenowej płytce Petriego przed wysianiem komórek na MEA; wysterylizować komorę z laminarnym przepływem powietrza, włączając lampę UV na 20 minut. Jeśli MEA jest wrażliwa na światło UV, przykryć płytkę Petriego z MEA sterylną folią aluminiową podczas naświetlania komory promieniami UV. Następnie, w przypadku komórek helo, potraktować powierzchnię MEA fibonektyną w stężeniu 10 µg/mL przez jedną do dwóch godzin.Przepłucz MEA wodą dejonizowaną (DI water) i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Następnie pobierz komórki z hodowli linii komórek ssaków przylegających, używając trypsyny ETTA, i doprowadź je do stężenia od 100 do 200 komórek na µL w 1 mL pożywki komórkowej przeznaczonej do wysiewania. Następnie nanieś na MEA kropelkę 20 do 30 µL pożywki z komórkami.Upewnij się, że jest wystarczająco duża, aby pokryć wszystkie elektrody na MEA. Następnie przenieś szalkę Petriego z MEA do inkubatora z nawilżaniem w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide. Czas inkubacji: od dwóch do czterech godzin.Po wysianiu komórek przenieś płytkę Petri z MEA z inkubatora do komory z laminarnym przepływem powietrza. Następnie ostrożnie dodaj od 400 do 500 µL podgrzanej do 37 °C pożywki do studni MEA, a następnie sprawdź pod mikroskopem, czy komórki nadal przylegają i są równomiernie rozmieszczone na powierzchni MEA. Przenieś MEA z powrotem do inkubatora. Od ośmiu do 12 godzin po wysianiu komórek wykonaj jeden lub dwa przemycia roztworem PBS w celu usunięcia martwych komórek.W typowym eksperymencie komórki są zazwyczaj gotowe do transfekcji od 24 do 48 godzin po wysianiu. Aby zachować spójność wydajności elektroporacji, zaleca się odczekać do momentu, gdy kultura osiągnie niemal pełną konfluencję przed przystąpieniem do elektroporacji. W celu uzyskania wysokiej wydajności transfekcji siRNA konieczne jest uprzednie określenie optymalnych parametrów impulsu napięcia elektroporacji dla danej MEA.W niniejszej pracy opisujemy sekwencję kroków eksperymentalnych z wykorzystaniem jodku propidyny w celu wyznaczenia optymalnych parametrów elektroporacji przed jej przeprowadzeniem. Należy przygotować od 300 do 500 µL roztworu PI o stężeniu 30 µg/mL w lodowatym buforze do elektroporacji oraz 400 µL roztworu calcium AM o stężeniu 4 µM w PBS. Następnie MEA należy przenieść z inkubatora do komory z laminarnym przepływem powietrza.Usuń pożywkę komórkową z MEA i przeprowadź płukanie PBS. Następnie dodaj od 300 do 500 µL schłodzonego w lodzie buforu do elektroporacji z pi. Następnie umieść w MEA dystanser o wysokości jednego milimetra.Niezwykle ważne jest upewnienie się, że nie dotyka ono komórek znajdujących się w centrum MEA. Następnie należy połączyć MEA z interfejsem elektrycznym i wybrać elektrody przeznaczone do elektroporacji. W kolejnym kroku, w fazie elektroporacji, należy przyłożyć impulsy elektryczne o odpowiedniej amplitudzie i czasie trwania do wybranych elektrod.Obniż stalową katodę owiniętą folią aluminiową w studzience MEA, aż zetknie się ona z jednofilowym dystansem. Następnie niezwłocznie przyłóż impulsy elektryczne do wybranych elektrod. W dalszej kolejności powtórz ten krok z innym zestawem elektrod, zgodnie z planem doświadczenia.W naszych eksperymentach z komórkami helo zaobserwowaliśmy, że pojedynczy impuls napięcia o amplitudzie od 3 V do 9 V i czasie trwania od 1 ms do 10 ms, przy zastosowaniu elektrody o rozmiarze 100 µm, prowadził do skutecznej elektroporacji przy minimalnej śmiertelności komórek. Bezpośrednio po przyłożeniu impulsów napięcia przenieście MEA do inkubatora na pięć minut.Po okresie inkubacji trwającym od 5 do 10 minut ostrożnie usuń dystanser z MEA. Następnie usuń 75% buforu do elektroporacji z otworu MEA i zastąp go ogrzaną pożywką komórkową. Następnie przenieś MEA z powrotem do inkubatora.Po okresie inkubacji od dwóch do czterech godzin należy zastąpić pożywkę komórkową w studzience MEA od 300 do 500 µL roztworu calcium AM o stężeniu 4 µM w PBS. Po inkubacji komórek z calcium AM przenieś MEA z powrotem do inkubatora na kolejne 30 minut. Po etapie płukania zastąp calcium AM w studzience PBS, a następnie wykonaj obrazy fluorescencyjne komórek przy użyciu mikroskopu optycznego z filtrami dla pi.Wchłanianie PI w wyniku elektroporacji powoduje czerwoną fluorescencję komórek, natomiast calcium am sprawia, że komórki żywe fluorescują na zielono. Żywotność komórek dla każdej elektrody można oszacować za pomocą tego równania, a wydajność elektroporacji dla każdej elektrody można oszacować za pomocą tego równania. Po wyznaczeniu optymalnych parametrów elektroporacji można je wykorzystać do specyficznego dla miejsca dostarczania cząsteczek a, a procedura elektroporacji dla cząsteczek siRNA jest taka sama jak procedura elektroporacji dla pi.Przedstawiono tutaj swoiste dostarczanie jodku propidium do komórek HeLa za pomocą elektrody o średnicy 200 µm. Analizę żywotności opartą na wapniu przeprowadzono dwie godziny po elektroporacji. Żywe komórki są wskazane tutaj przez zieloną fluorescencję, a czerwona fluorescencja tutaj wykazuje pobranie pi przez komórki na elektrodzie.Oto nałożone na siebie obrazy. Te komórki zostały poddane elektroporacji i są żywe, natomiast te komórki są martwe. Ta figura przedstawia transfekcję irna z markerem rumine przy użyciu elektrody o średnicy 200 µm, a ta figura przedstawia transfekcję komórek HeLa irna z markerem Alexa 4 88 przy użyciu elektrody o średnicy 100 µm.Białe strzałki wskazują komórki przetransfekowane irna, natomiast czarne strzałki wskazują martwe komórki. Przedstawiona tutaj technika może zostać rozszerzona na różne linie komórkowe, w tym trudne do transfekcji linie pierwotne, oraz służyć do transfekcji większymi cząsteczkami, takimi jak plazmidy i białka.

high-efficiency-site-specific-transfection-adherent-cells-with-sirna

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Wysoka wydajność, specyficzna dla danego miejsca transfekcja przywierających komórek za pomocą siRNA z wykorzystaniem mikroelektrodowych tablic (MEA)

W niniejszej pracy wykorzystujemy ludzką bibliotekę esiRNA w badaniu wysokoprzepustowym w celu identyfikacji genów zaangażowanych w podział komórki. Przedstawiamy sposób przygotowania i przeprowadzenia przesiewu esiRNA, a także metodę analizy i walidacji uzyskanych wyników.

MISSION esiRNA do przesiewania RNAi w komórkach ssaków

Ten protokół dostarcza niezbędnych informacji do zakładania, pielęgnacji, rejestrowania i elektrycznego stymulowania kultur na MEA. Sieci in vitro dostarczają środków do zadawania fizjologicznie istotnych pytań na poziomie sieci i komórki, co prowadzi do lepszego zrozumienia funkcji i dysfunkcji mózgu.

Jak hodować, rejestrować i stymulować sieci neuronowe na matrycach mikroelektrod (MEA)

Niezawodna metoda wysokowydajnej ekspresji in vitro i następującego po niej zapisu elektrofizjologicznego rekombinowanych napięciowo zależnych kanałów jonowych w hodowlach ludzkich komórek embrionalnej nerki (HEK-293T).

Zoptymalizowana strategia transfekcji dla ekspresji i rejestracji elektrofizjologicznej rekombinowanych napięciowo zależnych kanałów jonowych w komórkach HEK-293T

Siatkowka śródplazmatyczna odgrywa kluczową rolę w biogenezie białek oraz w homeostazie wapnia. Opracowaliśmy system eksperymentalny, który pozwala nam zbadać rolę kanałów przecieku Ca2+ oraz scharakteryzować ich domniemane mechanizmy regulacyjne. System ten obejmuje wyciszanie genów za pomocą siRNA oraz obrazowanie Ca2+ w żywych komórkach.

Obrazowanie poziomu wapnia w żywych komórkach połączone z wyciszaniem genów za pomocą siRNA identyfikuje kanały przecieku Ca2+ w błonie ER i ich mechanizmy regulacyjne

Wideo pokazuje, jak używać zestawu mikroelektrod (MEA) do rejestrowania aktywności elektrofizjologicznej neuronów pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC). Aktywność elektrofizjologiczna z wielodołkowego MEA zawierającego kokulturę neuronów i astrocytów jest rejestrowana w celu wykrycia potencjałów czynnościowych z wielu neuronów w sieci, potwierdzając pomyślne różnicowanie hiPSC w neurony.

Pomiar aktywności elektrofizjologicznej sieci neuronalnych za pomocą układów mikroelektrod

Opisujemy metodę eksperymentów ratujących zubożenie, która zachowuje integralność komórkową i homeostazę białek. Adenofection umożliwia analizę funkcjonalną białek w procesach biologicznych, które opierają się na precyzyjnie dostrojonej dynamice opartej na aktynie, takiej jak mitotyczny podział komórek i miogeneza, na poziomie pojedynczej komórki.

Adenofekcja: metoda badania roli molekularnych białek opiekuńczych w morfodynamice komórkowej za pomocą eksperymentów depletion-rescue

Ten protokół ma na celu pokazanie, jak połączyć układy mikroelektrod in vitro z urządzeniami mikroprzepływowymi do badania transmisji potencjału czynnościowego w kulturach neuronalnych. Analiza danych, a mianowicie wykrywanie i charakteryzacja rozchodzących się potencjałów czynnościowych, odbywa się za pomocą nowego, zaawansowanego, a jednocześnie przyjaznego dla użytkownika i ogólnodostępnego narzędzia obliczeniowego.

Łączenie mikrofluidyki z układami mikroelektrod do badania komunikacji neuronalnej i propagacji sygnałów aksonalnych

Ten protokół opisuje wysokoprzepustową transfekcję plazmidową komórek ssaków na płytce 384-dołkowej przy użyciu technologii akustycznego wyrzucania kropel. Czasochłonne, podatne na błędy dozowanie i multipleksowanie DNA, ale także dozowanie odczynników do transfekcji, są sterowane programowo i wykonywane przez urządzenie nanodozujące. Komórki są następnie wysiewane w tych wstępnie wypełnionych studzienkach.

Wysokoprzepustowe multipleksowanie i transfekcja plazmidu DNA przy użyciu technologii akustycznego nanodozowania

Ten protokół ma na celu opisanie nowej metodologii pomiaru wewnętrznej szybkości wypalania serca za pomocą rejestracji matrycy mikroelektrod całej tkanki węzła zatokowo-przedsionkowego w celu identyfikacji wad rozrusznika serca u myszy. W tej metodzie można również wprowadzić środki farmakologiczne, aby zbadać ich wpływ na wewnętrzne rozruszniki serca.

Rejestracja szybkości wypalania węzłów zatokowo-przedsionkowych za pomocą matrycy mikroelektrod w celu identyfikacji wewnętrznych wad rozrusznika serca u myszy

Kombinacja poracji laserowej i matryc mikroelektrod (MEA) pozwala na rejestrację kardiomiocytów z hodowanych pierwotnych i pochodzących z komórek macierzystych zapisów podobny do potencjału czynnościowego. Kształt fali zapewnia lepszy wgląd w sposób działania badanych związków niż standardowe nagrania. Łączy on patch-clamp i odczyt MEA, aby jeszcze bardziej zoptymalizować badania nad bezpieczeństwem kardiologicznym w przyszłości.

Indukowane laserowo pomiary potencjału czynnościowego kardiomiocytów na układach mikroelektrod w celu zwiększenia predykcyjności bezpieczeństwa farmakologii

Poznaj metodę wysokowydajnej transfekcji specyficznej dla miejsca w komórkach przylegających przy użyciu macierzy mikroelektrod. Technika ta umożliwia precyzyjne dostarczanie siRNA z kontrolą przestrzenną.

Wysoka wydajność, specyficzna dla miejsca transfekcja przylegających komórek za pomocą siRNA przy użyciu macierzy mikroelektrod (MEA) (Wideo) | JoVE Journal

Wysokoefektywna, specyficzna lokalnie transfekcja komórek adherentnych siRNA przy użyciu macierzy mikroelektrod (MEA)

Przeglądaj więcej filmów