Wysokoefektywna, specyficzna lokalnie transfekcja komórek adherentnych siRNA przy użyciu macierzy mikroelektrod (MEA)

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest przeprowadzenie transfekcji specyficznej dla konkretnego miejsca w komórkach adherentnych. Osiąga się to poprzez hodowlę monowarstwy komórek na matrycy mikroelektrod. W drugim kroku przyłożenie impulsu elektrycznego do wybranych elektrod prowadzi do elektroporacji komórek docelowych przylegających do powierzchni elektrod.

Prowadzi to do powstania w błonie komórkowej porów, które umożliwiają wniknięcie egzogennych cząsteczek do wnętrza komórki. Następnie można przeprowadzić przesiew komórek docelowych w celu wykrycia wynikowego fenotypu przy użyciu odpowiedniego testu. Opisana tutaj technika transfekcji w mikroskali oferuje kilka kluczowych zalet w porównaniu do konwencjonalnych metod transfekcji, takich jak elektroporacja masowa czy transfekcja chemiczna.

Po pierwsze, pozwala to na uzyskanie precyzyjnej kontroli przestrzennej nad samym procesem transfekcji i umożliwia wysokowydajną transfekcję pojedynczych komórek lub skupisk komórek, nawet w liniach komórkowych trudnych do transfekcji. Po drugie, jest to podejście łatwo skalowalne, co pozwala na realizację wysokoprzepustowych analiz molekularnych. Jedną z kluczowych zalet wykorzystania matrycy mikroelektrod do transfekcji miejscowej jest możliwość jednoczesnej oceny funkcjonalnej komórek docelowych, takiej jak ilościowa elektrofizjologia oraz zmiany morfologiczne.

Aby rozpocząć procedurę, wysterylizować MEA w autoklawie, następnie przenieść wysterylizowaną MEA do komory z laminarnym przepływem powietrza i umieścić ją w standardowej sterylnej polistyrenowej płytce Petriego przed wysianiem komórek na MEA; wysterylizować komorę z laminarnym przepływem powietrza, włączając lampę UV na 20 minut. Jeśli MEA jest wrażliwa na światło UV, przykryć płytkę Petriego z MEA sterylną folią aluminiową podczas naświetlania komory promieniami UV. Następnie, w przypadku komórek helo, potraktować powierzchnię MEA fibonektyną w stężeniu 10 µg/mL przez jedną do dwóch godzin.

Przepłucz MEA wodą dejonizowaną (DI water) i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Następnie pobierz komórki z hodowli linii komórek ssaków przylegających, używając trypsyny ETTA, i doprowadź je do stężenia od 100 do 200 komórek na µL w 1 mL pożywki komórkowej przeznaczonej do wysiewania. Następnie nanieś na MEA kropelkę 20 do 30 µL pożywki z komórkami.

Upewnij się, że jest wystarczająco duża, aby pokryć wszystkie elektrody na MEA. Następnie przenieś szalkę Petriego z MEA do inkubatora z nawilżaniem w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide. Czas inkubacji: od dwóch do czterech godzin.

Po wysianiu komórek przenieś płytkę Petri z MEA z inkubatora do komory z laminarnym przepływem powietrza. Następnie ostrożnie dodaj od 400 do 500 µL podgrzanej do 37 °C pożywki do studni MEA, a następnie sprawdź pod mikroskopem, czy komórki nadal przylegają i są równomiernie rozmieszczone na powierzchni MEA. Przenieś MEA z powrotem do inkubatora. Od ośmiu do 12 godzin po wysianiu komórek wykonaj jeden lub dwa przemycia roztworem PBS w celu usunięcia martwych komórek.

W typowym eksperymencie komórki są zazwyczaj gotowe do transfekcji od 24 do 48 godzin po wysianiu. Aby zachować spójność wydajności elektroporacji, zaleca się odczekać do momentu, gdy kultura osiągnie niemal pełną konfluencję przed przystąpieniem do elektroporacji. W celu uzyskania wysokiej wydajności transfekcji siRNA konieczne jest uprzednie określenie optymalnych parametrów impulsu napięcia elektroporacji dla danej MEA.

W niniejszej pracy opisujemy sekwencję kroków eksperymentalnych z wykorzystaniem jodku propidyny w celu wyznaczenia optymalnych parametrów elektroporacji przed jej przeprowadzeniem. Należy przygotować od 300 do 500 µL roztworu PI o stężeniu 30 µg/mL w lodowatym buforze do elektroporacji oraz 400 µL roztworu calcium AM o stężeniu 4 µM w PBS. Następnie MEA należy przenieść z inkubatora do komory z laminarnym przepływem powietrza.

Usuń pożywkę komórkową z MEA i przeprowadź płukanie PBS. Następnie dodaj od 300 do 500 µL schłodzonego w lodzie buforu do elektroporacji z pi. Następnie umieść w MEA dystanser o wysokości jednego milimetra.

Niezwykle ważne jest upewnienie się, że nie dotyka ono komórek znajdujących się w centrum MEA. Następnie należy połączyć MEA z interfejsem elektrycznym i wybrać elektrody przeznaczone do elektroporacji. W kolejnym kroku, w fazie elektroporacji, należy przyłożyć impulsy elektryczne o odpowiedniej amplitudzie i czasie trwania do wybranych elektrod.

Obniż stalową katodę owiniętą folią aluminiową w studzience MEA, aż zetknie się ona z jednofilowym dystansem. Następnie niezwłocznie przyłóż impulsy elektryczne do wybranych elektrod. W dalszej kolejności powtórz ten krok z innym zestawem elektrod, zgodnie z planem doświadczenia.

W naszych eksperymentach z komórkami helo zaobserwowaliśmy, że pojedynczy impuls napięcia o amplitudzie od 3 V do 9 V i czasie trwania od 1 ms do 10 ms, przy zastosowaniu elektrody o rozmiarze 100 µm, prowadził do skutecznej elektroporacji przy minimalnej śmiertelności komórek. Bezpośrednio po przyłożeniu impulsów napięcia przenieście MEA do inkubatora na pięć minut.

Po okresie inkubacji trwającym od 5 do 10 minut ostrożnie usuń dystanser z MEA. Następnie usuń 75% buforu do elektroporacji z otworu MEA i zastąp go ogrzaną pożywką komórkową. Następnie przenieś MEA z powrotem do inkubatora.

Po okresie inkubacji od dwóch do czterech godzin należy zastąpić pożywkę komórkową w studzience MEA od 300 do 500 µL roztworu calcium AM o stężeniu 4 µM w PBS. Po inkubacji komórek z calcium AM przenieś MEA z powrotem do inkubatora na kolejne 30 minut. Po etapie płukania zastąp calcium AM w studzience PBS, a następnie wykonaj obrazy fluorescencyjne komórek przy użyciu mikroskopu optycznego z filtrami dla pi.

Wchłanianie PI w wyniku elektroporacji powoduje czerwoną fluorescencję komórek, natomiast calcium am sprawia, że komórki żywe fluorescują na zielono. Żywotność komórek dla każdej elektrody można oszacować za pomocą tego równania, a wydajność elektroporacji dla każdej elektrody można oszacować za pomocą tego równania. Po wyznaczeniu optymalnych parametrów elektroporacji można je wykorzystać do specyficznego dla miejsca dostarczania cząsteczek a, a procedura elektroporacji dla cząsteczek siRNA jest taka sama jak procedura elektroporacji dla pi.

Przedstawiono tutaj swoiste dostarczanie jodku propidium do komórek HeLa za pomocą elektrody o średnicy 200 µm. Analizę żywotności opartą na wapniu przeprowadzono dwie godziny po elektroporacji. Żywe komórki są wskazane tutaj przez zieloną fluorescencję, a czerwona fluorescencja tutaj wykazuje pobranie pi przez komórki na elektrodzie.

Oto nałożone na siebie obrazy. Te komórki zostały poddane elektroporacji i są żywe, natomiast te komórki są martwe. Ta figura przedstawia transfekcję irna z markerem rumine przy użyciu elektrody o średnicy 200 µm, a ta figura przedstawia transfekcję komórek HeLa irna z markerem Alexa 4 88 przy użyciu elektrody o średnicy 100 µm.

Białe strzałki wskazują komórki przetransfekowane irna, natomiast czarne strzałki wskazują martwe komórki. Przedstawiona tutaj technika może zostać rozszerzona na różne linie komórkowe, w tym trudne do transfekcji linie pierwotne, oraz służyć do transfekcji większymi cząsteczkami, takimi jak plazmidy i białka.