Podwójne rejestracje elektrofizjologiczne odpowiedzi astroglialnych i neuronalnych wywołanych synaptycznie w ostrych skrawkach hipokampa

Klasycznie komunikacja między elementami presynaptycznymi i postsynaptycznymi obejmuje potencjał czynnościowy docierający do zakończenia presynaptycznego, który poprzez wzrost poziomu wapnia wyzwala uwalnianie glutaminianu aktywującego receptory postsynaptyczne. Jednakże obserwacje, że astrocyty ściśle kontaktują się z synapsami i wykazują ekspresję receptorów neurotransmiterów, zmieniły to spojrzenie na koncepcję synapsy trójdzielnej. W związku z tym trwająca transmisja glutaminergiczna będzie również aktywować astrocyt i wyzwalać wzrost poziomu wapnia wewnątrzkomórkowego.

Uwalnianie gliotransmiterów, które mogą wiązać się z receptorami synaptycznymi lub pozasynaptycznymi, moduluje aktywność presynaptyczną i postsynaptyczną. Co więcej, astrocy wykazują ekspresję głównego systemu wychwytu glutaminianu uwalnianego w synapsach. Dodatkowo, za pośrednictwem swoich kanałów potasowych, usuwają oni potas z zakończeń presynaptycznych i postsynaptycznych, który jest uwalniany podczas generowania potencjałów czynnościowych i następującej po nich aktywacji postsynaptycznej.

Potas ten jest następnie transportowany wewnątrzkomórkowo do miejsc o niższym pozakomórkowym stężeniu potasu, gdzie zostaje uwolniony lub dyfunduje poprzez złącza szczelinowe do sąsiednich astrocytów. Zatem, poprzez kontrolowanie pozakomórkowego stężenia substancji neuroaktywnych, a także poprzez uwalnianie gliotransmiterów, astrocyty odgrywają istotną rolę w określaniu siły aktywności synaptycznej. Moje laboratorium bada rolę oddziaływań neuroglejalnych w patofizjologii mózgu.

W związku z tym szeroko wykorzystaliśmy i udoskonaliliśmy tę technikę, aby zgłębić rolę astrocytów w synaptycznej transmisji zachodzącej w czasie rzeczywistym. Technika ta jest niezwykle skuteczna, ponieważ pozwala na jednoczesny i ciągły monitoring dynamicznych odpowiedzi elektrofizjologicznych neuronów. Dziś, w ramach kliniki Osteocytes Evap, Ash oraz Jeremy Siebel, członkowie laboratorium, zaprezentują sposób wykonania tej metody oraz wyjaśnią, w jaki sposób pomaga ona w badaniu ścisłego dialogu między neuronami a astrocytami.

Zbadano wpływ sieci astroglii na neurony, przekaźnictwo synaptyczne oraz plastyczność poprzez jednoczesne rejestrowanie aktywności neuronów oraz transportu potasu i glutaminianu w astroglii, co wykazało, że sieciowanie astrocytarne ułatwia usuwanie pozakomórkowego potasu i glutaminianu podczas aktywności neuronalnej. Przeanalizowano właściwości i plastyczność astroglii w kontekście neurofizjologii. Podczas rejestracji aktywności wywołanej w astroglii i neuronach zidentyfikowano, że odpowiedź astrocytów na aktywację neuronalną odbywa się głównie poprzez prądy potasowe.

Prąd ten wykazuje własną plastyczność elektrofizjologiczną, która nie reguluje pobudliwości i plastyczności neuronów. Innymi słowy, odliczanie astrocytów, tych najbardziej pobudzonych. Neuronów. Przedstawimy tutaj istotną metodę jednoczesnego badania aktywności neuronów i astroglei w ostrych skrawkach hipokampa poprzez przeprowadzanie podwójnych rejestracji prądów błonowych astrocytów oraz potencjałów postsynaptycznych neuronów wywołanych stymulacją włókien presynaptycznych.

Ponadto przeprowadzimy parowe rejestracje pojedynczych neuronów i sąsiadujących z nimi astrocytów, aby zbadać odpowiedzi glikowe ASTO podczas aktywności neuronalnej. Wybraliśmy hipokamp, ponieważ obszar ten wykazuje silną kompartymentalizację anatomiczną i funkcjonalną oraz jest dobrze scharakteryzowany pod kątem obwodów neuronalnych, a także aktywności synaptycznej i plastyczności. Rozpocznij eksperymenty od przygotowania skrawków mózgu z hipokampa; w celu ich przygotowania najpierw przygotuj schłodzony, natleniony roztwór.

Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy; głęboko znieczul myszy, szybko odetnij głowy i przenieś je do A CSF. Otwórz czaszkę, wykonując trzy cięcia, aby oddzielić obie półkule. Na koniec przenieś je do natlenionego A CSF.

Pozostaw do inkubacji przez około pięć minut. Następnie zacznij od jednej półkuli. Disekcję hipokampa rozpoczyna się od usunięcia śródmózgowia.

Szczegółowa dyssekcja hipokampa została przedstawiona na tej rycinie. Najpierw umieść oddzieloną półkulę w taki sposób, aby odsłonić miejsce przyczepu kory do śródmózgowia. Za pomocą dwóch łyżeczek usuń śródmózgowie.

Teraz hipokamp będzie widoczny, zgodnie z oznaczeniem przerywanymi liniami. Wypreparuj hipokamp za pomocą łyżeczki, zaczynając od fia, która jest widoczna jako szeroka struktura. Wsuń łyżeczkę pod hipokamp i przy pomocy drugiej łyżeczki odetnij korę przylegającą do hipokampa.

Przenieś hipokamp do małej płytki hodowlanej z natlenionym A CSF i postąp analogicznie z drugą półkulą. Umieść oba hipokampy na małym bloku AGA stroną otworu skierowaną do góry. Następnie odessij A CSF. Przyklej hipokamp do urządzenia do nacinania.

Przenieś hipokamp do komory do krojenia i przygotuj skrawki o grubości 300 lub 400 µm. Zbierz skrawki do natlenionej komory przechowawczej i pozostaw je w temperaturze pokojowej na co najmniej jedną godzinę przed rozpoczęciem pomiarów, aby przeprowadzić pełne rejestracje pojedynczych astrocytów. Przenieś skrawek hipokampu na szkiełko nakrywkę powleczoną polilizyną.

Osusz nadmiar A CSF, aby umożliwić przytwierdzenie skrawka hipokampa do szkiełka podstawowego pokrytego polilizyną, a następnie ponownie dodaj A CSF na skrawka. Przenieś skrawek do komory rejestracyjnej, w której stale przepływa natleniony A CSF z prędkością perfuzji od 1 do 2 ml/min. W celu identyfikacji astrocytów do rejestracji metodą patch-clamp można wykorzystać myszy wykazujące ekspresję EGFP pod specyficznym dla astrogleju promotorem GFAP.

Wypełnij szklaną pipetę o oporności od czterech do sześciu mega omów filtrowanym, zimnym roztworem wewnątrzkomórkowym; stosując roztwór wewnątrzkomórkowy zawierający rodaninę, możesz zwizualizować w kolorze czerwonym przypatchowany astrocyt w kolorze zielonym. Widoczne są sąsiednie astrocyty wykazujące ekspresję EGFP. Pod promotorem GFAP astrocyty można zidentyfikować po niewielkim rozmiarze somy, wynoszącym około 10 mikrometrów, oraz rozgałęzieniu głównego wypustu, który zazwyczaj obejmuje od trzech do czterech odgałęzień.

Strzykawka połączona za pomocą wężyka z pipetą umożliwia zastosowanie dodatniego ciśnienia podczas wprowadzania jej do tkanki. W oknie poleceń wyzwól impuls testowy o wartości 10 millivolt i wyzeruj prąd podtrzymujący. Następnie, za pomocą mikromanipulatora, przesuń pipetę w głąb tkanki, aby zbliżyć się do komórki. Po dotarciu do powierzchni komórki przesuwaj ją dalej, aż pojawi się wgłębienie widoczne jako odchylenie światła, co wskazuje na niewielką deformację powierzchni komórki.

Dzięki przyłożeniu dodatniego ciśnienia błona komórkowa astrocytu zostanie szczelnie przyległa do otworu szklanej pipety, co będzie można zaobserwować poprzez wzrost oporności w momencie uzyskania tzw. giga-uszczelnienia (giga seal). Wykonaj kompensację pojemności, przechodząc do konfiguracji całego układu poprzez delikatne przyłożenie ujemnego ciśnienia, obserwując jednocześnie parametry testowe w oknie poleceń. Przebicie błony komórkowej będzie widoczne jako przepływ prądu przez błonę.

Zastosowanie serii kroków napięcia hiperpolaryzujących i depolaryzujących pozwala na charakterystykę właściwości błony komórkowej; astrocyty zazwyczaj wykazują jedynie pasywne odpowiedzi prądowe. Wstrzykiwanie prądu w trybie clamp prądowy (current clamp) nie prowadzi do powstania potencjału czynnościowego. Brak wyładowań jest dodatkowym potwierdzeniem, że w rzeczywistości wykonano patch astrocyta. Dodanie znacznika, takiego jak sulfur czy domine B, do pipety patchowej umożliwia wizualizację patchowanego astrocyta.

Ponadto pasywna dyfuzja znacznika przez 20 minut w trybie clampy prądowej (current clamp) umożliwia wizualizację sąsiednich astrocytów połączonych poprzez połączenia szczelinowe w celu przeprowadzenia podwójnych rejestracji neuronalnej transmisji pobudzającej oraz wywołanych następstw prądów astrocytarnych. W pierwszej kolejności blokujemy transmisję hamującą za pomocą precor toinu, aby zapobiec nadpobudliwości, która występuje w przypadku braku transmisji GABAergicznej. Przecinamy połączenia pośredzone przez kolaterale shaer między CS3 a C1 za pomocą małego noża irydowego.

Następnie umieszczamy elektrodę stymulującą pole CSF A, elektrodę rejestrującą pole oraz elektrodę do patch clampu astrocytów. W skrawku hipokampa wybieramy astrocyt i umieszczamy elektrodę pola w odległości 200 µm od niego, aby upewnić się, że astrocyt rzeczywiście integruje aktywność rejestrowaną elektrodą pola; stymulacja kolaterali Schaffera wywoła pobudzający potencjał polowy. Potencjał polowy ten składa się z odpowiedzi włókien, odzwierciedlającej liczbę stymulowanych aksonów, oraz następującej po niej depolaryzacji postsynaptycznej, co pozwala na jednoczesną rejestrację potencjałów polowych neuronów oraz odpowiedzi prądowych całego komórki astrogleju.

Najpierw ustaw elektrodę do rejestracji polowej w odległości około 50 µm od wybranego astrocytu. Następnie przesuń elektrodę do patch-clamp do somy astrocytu i wykonaj uszczelnienie membrany (patch-clamp); potwierdź, że wybrana komórka jest rzeczywiście astrocytem, analizując jej pasywne właściwości błonowe. Teraz, stymulując Shaer Cs, możemy jednocześnie rejestrować aktywność neuronalną i następujący po niej prąd astrocytarny, który objawia się długotrwałą odpowiedzią do 50 pA ze względu na łączność sieciową oraz fakt, że jeden astrocyt kontaktuje się z synapsami nawet 100 neuronów.

Komórki te integrują aktywność dużej liczby jednocześnie aktywowanych synaps w celu przeprowadzenia podwójnych rejestracji z całych komórek poszczególnych neuronów i sąsiadujących astrocytów; opuszczamy dwie elektrody patch do obszaru stratum skrawka hipokampa. W regionie CA1 zidentyfikuj pożądany neuron, a na tej samej głębokości, w odległości około 20 do 60 mikrometrów, astrocyt, następnie ustaw obie pipety około 10 mikrometrów nad każdą z komórek, przykładając nadciśnienie. Pipeta do rejestracji z astrocytu powinna zostać umieszczona jak najbliżej docelowego astrocytu, aby uniknąć dalszych ruchów mechanicznych.

W pierwszej kolejności należy uzyskać uszczelnienie gga na neuronie. Następnie przechodzi się do patchowania astrocytu, który zazwyczaj uszczelnia się wolniej niż neurony. Podsumowując ważne kroki niezbędne do wykonania podwójnych rejestracji typu wholesale, należy najpierw opuścić dwie pipety rejestrujące do preparatu tkankowego.

Zbliż się do somy astrocytu, następnie wykonaj uszczelnienie gga na neuronie i zakończ procedurę, wykonując uszczelnienie gga na astrocytcie; neurony zazwyczaj wykazują znacznie wyższą rezystancję błony niż astrocyty, która w przypadku neuronów piramidowych wynosi około 200 do 500 mega przy obu komórkach. Obecnie w trybie clamp napięciowy i hiperpolaryzacji błona aktywuje przejściowe prądy sodowe w neuronie i pasywne odpowiedzi potasowe w astrocytcie. Wykazujemy tutaj, że indukcja szybkich pobudzających potencjałów polowych postsynaptycznych poprzez stymulację kollateral shaa wywołuje następującą po niej długotrwałą odpowiedź prądową.

W sąsiadującym astrocycie hamowanie jonotropowych receptorów glutaminianu za pomocą kwasu remikowego wykazuje, że większość prądu astrocytarnego wynika z pobudzającej aktywacji postsynaptycznej. Pozostała odpowiedź BAIC składa się z szybkiego, przejściowego transportu glutaminianu wrażliwego na TBOA oraz niewielkiego prądu długotrwałego, najprawdopodobniej wynikającego z presynaptycznego uwalniania potasu podczas potencjałów czynnościowych. Prąd astrocytarny monitoruje bardzo wiarygodnie aktywność postsynaptyczną, ponieważ oba parametry rosły liniowo wraz ze wzrostem aktywności presynaptycznej.

Ponadto prądy astrocytarne wykazują, podobnie jak odpowiedzi neuronalne, facylitację podwójną. Umiarkowana pojedyncza stymulacja kolaterali włókien szyjących indukuje stosunkowo duży synaptycznie wywołany prąd astroglialny w porównaniu z niewielką wywołaną depolaryzacją rejestrowaną w tej samej komórce w trybie zaciskowym prądowy. Wynika to z niskiej rezystancji błony astrocytów.

Rejestracja dynamiki potencjału błonowego TTO gly wywołanego synaptycznie jest bezpośrednią miarą lokalnego stężenia potasu w przestrzeni pozakomórkowej. Wykonując rejestrację parzystą neuronu i sąsiadującego astrocytu, nie zaobserwowano odpowiedzi prądowej astrocytu podczas generowania potencjałów czynnościnościowych przez neuron, co wskazuje na brak sprzężenia elektrycznego. Potencjał postsynaptyczny pobudzający wywołany w regionie CS 3 wywołuje również odpowiedzi prądowe astrocytów. Ponadto stymulacja one, her silnie potencjowała odpowiedź neuronalną w regionie CS 3, podczas gdy prąd astrocytarny zwiększył się jedynie umiarkowanie.

Po obejrzeniu tego filmu powinniśmy lepiej zrozumieć, jak przygotować i przeprowadzić pomyślne podwójne pomiary elektrofizjologiczne neuronów i astrocytów. Wykorzystując tę technikę, można badać dynamiczne przesyłanie sygnałów w czasie rzeczywistym między neuronami a astrocytami dla interesującej nas odpowiedzi elektrofizjologicznej. W szczególności można zbadać, czy nowe oddziaływania GL obejmujące funkcje i modulacje kanałów jonowych przyczyniają się do definiowania sytuacji fizjologicznych lub patologicznych.

Dziękujemy za obejrzenie i życzymy powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentu.