Name: Peptyd: MHC Wzbogacanie limfocytów T specyficznych dla epitopów na bazie tetramerów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 58 s
Description: Poznaj metodę izolacji rzadkich limfocytów T specyficznych dla epitopów z użyciem tetramerów peptyd:MHC i mikrokulek magnetycznych. Technika ta umożliwia badanie endogennych populacji komórek T myszy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Andre Hanowi i Lawrence’owi Yenowi za pomoc techniczną oraz członkom laboratorium Jenkinsa za pomoc w opracowaniu niniejszego protokołu.

1. Izolacja komórek z tkanki limfatycznej
<ol>
 <li>Do szalki hodowlanej o średnicy 60 mm zawierającej mały kwadrat nylonowej siatki o oczkach 100 μm dodać 1 ml schłodzonego w lodzie cEHAA (EHAA + 10% FBS, pen/strep, gentamycyna, 2 mM L-glutaminy, 55 mM 2-merkaptoetanolu) lub innego równoważnego medium dla limfocytów T i umieścić na lodzie.</li>
 <li>Uśmiercić mysz.</li>
 <li>Usunąć śledzionę oraz jak największą liczbę łatwo dostępnych węzłów chłonnych. Powinny one obejmować co najmniej węzły chłonne pachwinowe, pachowe, ramienne, szyjne i krezkowe. Umieścić je na nylonowej siatce w szalce hodowlanej.</li>
 <li>Używając płaskiej góry zamkniętej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, delikatnie rozgnieść tkankę limfatyczną na nylonowej siatce, aby uwolnić limfocyty. Dodać kolejny 1 ml cEHAA i pipetować w górę i w dół, aby wprowadzić komórki w zawiesinę. Przenieść komórki przez kolejny fragment nylonowej siatki umieszczonej nad probówką wirówkową z polipropylenu o pojemności 15 ml. Przepłukać szalkę i siatkę kolejnym 1 ml schłodzonego w lodzie cEHAA, łącząc objętości w tej samej probówce. Powtórzyć czynność, aby uzyskać końcową objętość zawiesiny komórkowej wynoszącą 4 ml.</li>
 <li>Dodać zimny bufor do sortowania (PBS + 2% FBS, 0,05% azydku) do końcowej objętości 15 ml i wirować probówkę przez 5 min przy 300 x g w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Ostrożnie odessać supernatant, upewniając się, że na ściankach probówki nie pozostały krople cieczy. Resuspender pellet komórkowy w bloku Fc (bufor do sortowania + przeciwciało 2.4G2) do końcowej objętości wynoszącej w przybliżeniu dwukrotność objętości samego pelletu. Na przykład śledziona i węzły chłonne naiwnej myszy zazwyczaj dają pellet komórkowy o objętości około 100 μl. W takim przypadku dodać 100 μl bloku Fc, aby zwiększyć objętość do 200 μl. Jeśli doszło do znacznego skupiania się komórek, na tym etapie ostrożnie usunąć skupisko komórek końcówką pipety.</li>
</ol>
2. Barwienie tetramerami
<ol>
 <li>Dodać tetramer pMHC znakowany PE lub APC do stężenia końcowego 10 nM (lub stężenia zoptymalizowanego empirycznie).</li>
 <li>Wymieszać i inkubować przez 1 hr w temperaturze pokojowej (lub w czasie i temperaturze zoptymalizowanych empirycznie).</li>
 <li>Dodać zimny bufor do sortowania do objętości 15 ml i odwirować probówkę przez 5 min przy 300 x g w temperaturze 4 °C. Od tego momentu przechowywać próbki na lodzie lub w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Ostrożnie odessać supernatant, upewniając się, że na ściankach probówki nie pozostały krople cieczy. Resuspendować pellet komórkowy w buforze do sortowania do objętości końcowej 200 μl. W przypadku podwójnego wzbogacenia tetramerem resuspendować do objętości końcowej 150 μl.</li>
</ol>
3. Wzbogacanie magnetyczne
<ol>
 <li>Dodać 50 μl mikrokulek Miltenyi anti-PE lub anti-APC. W przypadku wzbogacenia podwójnym tetramerem dodać po 50 μl obu rodzajów.</li>
 <li>Wymieszać i inkubować przez 20 min w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Dodać zimny bufor do sortowania do objętości 15 ml i wirować probówkę przez 5 min przy 300 x g w 4 °C.</li>
 <li>W czasie oczekiwania przygotować kolumnę magnetyczną Miltenyi LS na magnesie MidiMACS lub QuadroMACS. Umieścić otwartą polipropylenową probówkę wirówkową o objętości 15 ml w statywie bezpośrednio pod kolumną.</li>
 <li>Dodać 3 ml buforu do sortowania na górze kolumny, pozwalając mu spłynąć do probówki 15 ml.</li>
 <li>Umieścić kwadrat z nylonowej siatki o oczkach 100 μm na górze kolumny.</li>
 <li>Po zakończeniu wirowania komórek ostrożnie odessać supernatant i resuspendować osad w 3 ml buforu do sortowania.</li>
 <li>Przenieść zawiesinę komórkową przez nylonową siatkę na górę kolumny.</li>
 <li>Gdy zawiesina komórkowa całkowicie spłynie do kolumny, przepłukać pierwotną probówkę kolejnymi 3 ml buforu do sortowania i przenieść bufor przez nylonową siatkę do kolumny, płucząc przy tym siatkę. Usunąć siatkę nylonową.</li>
 <li>Gdy bufor całkowicie spłynie do kolumny, dodać do niej kolejne 3 ml buforu do sortowania.</li>
 <li>Powtórzyć krok 10, aby uzyskać łącznie 3 płukania po 3 ml.</li>
 <li>Zdjąć kolumnę z magnesu i umieścić ją nad nową polipropylenową probówką wirówkową o objętości 15 ml.</li>
 <li>Dodać 5 ml buforu do sortowania do kolumny.</li>
 <li>Natychmiast włożyć tłok do górnej części kolumny i jednym ciągłym ruchem docisnąć go do końca, wypychając bufor z kolumny do probówki.</li>
 <li>Wirować probówki zawierające eluowaną frakcję związaną oraz przepuszczoną frakcję niezwiązaną przez 5 min przy 300 x g w 4 °C.</li>
 <li>Ostrożnie odessać supernatant z frakcji związanej, upewniając się, że na ściankach probówki nie pozostały krople cieczy. Resuspendować osad komórkowy w buforze do sortowania do końcowej objętości dokładnie 95 μl. Odessać i resuspendować frakcję niezwiązaną do końcowej objętości 2 ml.</li>
</ol>
4. Cytometria przepływowa
<ol>
 <li>Z każdej frakcji odbiór 5 μl i przenieść do 200 μl kulek zliczających (o stężeniu dostosowanym do 200,000/ml w buforze do sortowania) w probówce FACS o pojemności 5 ml. Przechowywać w temperaturze 4 °C do późniejszej analizy. Aby zaoszczędzić czas, kulki można rozdzielić do oznakowanych probówek przed rozpoczęciem eksperymentu.</li>
 <li>Przygotować master mix przeciwciał do barwienia markerów powierzchniowych na komórkach (Tabela 1). W celu oszczędności czasu można to zrobić przed rozpoczęciem eksperymentu.</li>
 <li>W przypadku frakcji związanej dodać dawkę koktajlu przeciwciał bezpośrednio do ~90 μl komórek w probówce. Jeśli planowana jest analiza frakcji niezwiązanej, przenieść 90 μl komórek do probówki FACS 5 ml i dodać dawkę koktajlu przeciwciał.</li>
 <li>Przygotować panel jednobarwnych kontroli kompensacji do cytometru przepływowego. Dla każdego użytego fluorochromu zmieszać 50 μl pozostałych komórek z frakcji niezwiązanej w probówce FACS 5 ml z 1 μl przeciwciała anty-CD4 skoniugowanego z odpowiednim fluorochromem. Należy pamiętać o przygotowaniu również kontroli niebarwionej.</li>
 <li>Wymieszać na wortexie i inkubować wszystkie próbki przez 30 min w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Do każdej probówki dodać 5 ml buforu do sortowania i wirować przez 5 min przy 300 x g w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>W przypadku frakcji związanej ostrożnie odessać nadsącz i resuspender komórki w 200 μl buforu do sortowania. Przenieść komórki do mikroprobówki FACS 1,2 ml. Przepłukać probówkę kolejnymi 200 μl buforu do sortowania i połączyć w tej samej mikroprobówce. Jeśli widoczne są agregaty komórkowe, przepuścić komórki przez filtr 50 μm.</li>
 <li>W przypadku frakcji niezwiązanej oraz kontroli kompensacji odlać lub odessać nadsącz i resuspender w 2 ml buforu do sortowania.</li>
 <li>Ustawić cytometr przepływowy, korzystając z jednobarwnych kontroli kompensacji. Jako dodatkowy rejestrowany parametr wybrać szerokość rozproszenia bocznego (SSC-W).</li>
 <li>Przeanalizować zabarwione próbki, stosując sekwencję następujących po sobie bramek inkluzyjnych w celu identyfikacji limfocytów T CD4+ lub CD8+, zgodnie z ilustracją na Rysunkach 1 i 2. Dla frakcji związanych zebrać jak najwięcej komórek, do maksymalnie 2,000,000 zdarzeń całkowitych. Dla frakcji niezwiązanych zebrać 1,000,000 zdarzeń całkowitych. Utrzymywać tempo akwizycji na poziomie 3,000 zdarzeń na sekundę lub niższym.</li>
 <li>Przy tych samych ustawieniach urządzenia przeanalizować próbki z kulkami zliczającymi. Zebrać 10,000 zdarzeń całkowitych.</li>
 <li>Zapisywać wszystkie dane jako pliki FCS.</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
 <li>Przeanalizuj pliki danych FCS dla próbek z koralikami liczącymi, korzystając z oprogramowania FlowJo. Przedstaw rozrzut przedni (forward scatter) w funkcji FITC i ustaw bramkę wokół koralików liczących (patrz Ryciny 1 i 2). Określ całkowitą liczbę koralików liczących wykrytych w każdej próbce. Odejmij tę wartość od całkowitej liczby zebranych zdarzeń, aby wyznaczyć liczbę zebranych zdarzeń komórkowych.</li>
 <li>Oblicz całkowitą liczbę wszystkich komórek w każdej próbce, stosując równania opisane w Ramce 1.</li>
 <li>Przeanalizuj pliki danych FCS dla próbek frakcji związanej i niezwiązanej po barwieniu. Ustaw sekwencję następujących po sobie bramek inkluzyjnych w celu zidentyfikowania limfocytów+, komórek o niskiej szerokości rozrzutu bocznego (side-scatter-widthlo), dump-, CD3+, CD4+ lub CD8+, tetramer+ T w każdej próbce, zgodnie z ilustracją na Ryciniach 1 i 2.</li>
 <li>Pomnóż całkowitą liczbę komórek w próbce przez częstotliwości każdej z bramek inkluzyjnych użytych do zdefiniowania komórek CD4+tetramer+ lub CD8+tetramer+, aby obliczyć całkowitą liczbę limfocytów T specyficznych dla epitopu (Ramka 1).</li>
</ol>

<ol><li>Knutson, K. L., dela Rosa, C., Disis, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+analysis+of+T-cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Laboratory analysis of T-cell immunity.</a> Front Biosci. 11, 1932-1944 (2006).</li>
<li>Kearney, E. R., Pape, K. A., Loh, D. Y., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+peptide-specific+T+cell+immunity+and+peripheral+tolerance+induction+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Visualization of peptide-specific T cell immunity and peripheral tolerance induction in vivo.</a> Immunity. 1, 327-339 (1994).</li>
<li>Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+epitope-specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Tracking epitope-specific T cells.</a> Nat Protoc. 4, 565-581 (2009).</li>
<li>Hataye, J., Moon, J. J., Khoruts, A., Reilly, C., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+and+memory+CD4%2B+T+cell+survival+controlled+by+clonal+abundance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Naive and memory CD4+ T cell survival controlled by clonal abundance.</a> Science. 312, 114-116 (2006).</li>
<li>Marzo, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+T+cell+frequency+dictates+memory+CD8%2B+T+cell+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Initial T cell frequency dictates memory CD8+ T cell lineage commitment.</a> Nat Immunol. 6, 793-799 (2005).</li>
<li>Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+the+repertoire%3A+broadening+the+scope+of+peptide-MHC+multimer+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis.</a> Nature reviews. Immunology. 11, 551-558 (2011).</li>
<li>Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+CD4%28%2B%29+T+cell+frequency+varies+for+different+epitopes+and+predicts+repertoire+diversity+and+response+magnitude%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude.</a> Immunity. 27, 203-213 (2007).</li>
<li>Seah, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+linear+range+for+accurately+quantifying+antigen-specific+T-cell+frequencies+by+tetramer+staining+during+natural+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The linear range for accurately quantifying antigen-specific T-cell frequencies by tetramer staining during natural immune responses.</a> European Journal of Immunology. 41, 1499-1500 (2011).</li>
<li>Obar, J. J., Khanna, K. M., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+naive+CD8%2B+T+cell+precursor+frequency+regulates+primary+and+memory+responses+to+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Endogenous naive CD8+ T cell precursor frequency regulates primary and memory responses to infection.</a> Immunity. 28, 859-869 (2008).</li>
<li>Daniels, M. A., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+for+CD8+in+T+cell+receptor+binding+and+activation+by+peptide%2Fmajor+histocompatibility+complex+multimers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers.</a> J Exp Med. 191, 335-346 (2000).</li>
<li>Pittet, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha+3+domain+mutants+of+peptide%2FMHC+class+I+multimers+allow+the+selective+isolation+of+high+avidity+tumor-reactive+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Alpha 3 domain mutants of peptide/MHC class I multimers allow the selective isolation of high avidity tumor-reactive CD8 T cells.</a> Journal of Immunology. 171, 1844-1849 (2003).</li>
<li>Choi, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+avidity+antigen-specific+CTL+identified+by+CD8-independent+tetramer+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">High avidity antigen-specific CTL identified by CD8-independent tetramer staining.</a> Journal of Immunology. 171, 5116-5123 (2003).</li>
<li>Chu, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+selection+optimizes+the+number+and+function+of+MHCII-restricted+CD4%2B+T+cell+clones+in+the+naive+polyclonal+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Positive selection optimizes the number and function of MHCII-restricted CD4+ T cell clones in the naive polyclonal repertoire.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11241-11245 (2009).</li>
<li>Chu, H. H., Moon, J. J., Kruse, A. C., Pepper, M., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+Selection+and+Peptide+Chemistry+Determine+the+Size+of+Naive+Foreign+Peptide-MHC+Class+II-Specific+CD4%2B+T+Cell+Populations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Negative Selection and Peptide Chemistry Determine the Size of Naive Foreign Peptide-MHC Class II-Specific CD4+ T Cell Populations.</a> J Immunol. 185, 4705-4713 (2010).</li>
<li>Legoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+TCR+reactivity+and+HLA+phenotype+on+naive+CD8+T+cell+frequency+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Impact of TCR reactivity and HLA phenotype on naive CD8 T cell frequency in humans.</a> J Immunol. 184, 6731-6738 (2010).</li>
<li>Alanio, C., Lemaitre, F., Law, H. K., Hasan, M., Albert, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+human+antigen-specific+naive+CD8%2B+T+cells+reveals+conserved+precursor+frequencies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Enumeration of human antigen-specific naive CD8+ T cells reveals conserved precursor frequencies.</a> Blood. 115, 3718-3725 (2010).</li>
<li>Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+of+Epitope-Specific+Naive+CD4%2B+T+Cells+Correlates+with+Immunodominance+in+the+Human+Memory+Repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Frequency of Epitope-Specific Naive CD4+ T Cells Correlates with Immunodominance in the Human Memory Repertoire.</a> Journal of Immunology. 188, 2537-2544 (2012).</li>
<li>Jenkins, M. K., Chu, H. H., McLachlan, J. B., Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+composition+of+the+preimmune+repertoire+of+T+cells+specific+for+Peptide-major+histocompatibility+complex+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">On the composition of the preimmune repertoire of T cells specific for Peptide-major histocompatibility complex ligands.</a> Annu Rev Immunol. 28, 275-294 (2010).</li>
<li>Matechak, E. O., Killeen, N., Hedrick, S. M., Fowlkes, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+II-specific+T+cells+can+develop+in+the+CD8+lineage+when+CD4+is+absent%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">MHC class II-specific T cells can develop in the CD8 lineage when CD4 is absent.</a> Immunity. 4, 337-347 (1996).</li>
<li>Burchill, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linked+T+cell+receptor+and+cytokine+signaling+govern+the+development+of+the+regulatory+T+cell+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Linked T cell receptor and cytokine signaling govern the development of the regulatory T cell repertoire.</a> Immunity. 28, 112-121 (2008).</li>
<li>Pepper, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+routes+of+bacterial+infection+induce+long-lived+TH1+memory+cells+and+short-lived+TH17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Different routes of bacterial infection induce long-lived TH1 memory cells and short-lived TH17 cells.</a> Nature Immunology. 11, 83-89 (2010).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Metoda wzbogacania komórek oparta na tetramerach pMHC, przedstawiona w niniejszym protokole, jest potężnym narzędziem do badania epitopowo-specyficznych limfocytów T z endogennych repertuarów limfocytów T. Zastosowanie tetramerów pMHC umożliwia wykrywanie epitopowo-specyficznych limfocytów T w oparciu bezpośrednio o zdolność ich receptorów TCR do wiązania kognatywnych ligandów pMHC. Wzbogacenie zapewnia poziom czułości pozwalający na wykrycie niezwykle rzadkich populacji antygenowo-specyficznych limfocytów T z endogennyc...

<table><tbody><tr><td>Tetramer (lub multimer) pMHC koniugowany z PE lub APC</td><td>Przygotowany przez badacza, pobrany z NIH tetramer core lub zakupiony z komercyjnych źródeł</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnetyczne mikrokule koniugowane z anty-PE</td><td>Miltenyi</td><td>130-048-801</td><td></td></tr><tr><td>Magnetyczne mikrokule koniugowane z anty-APC</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-855</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny magnetyczne LS</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Magnes MidiMACS lub QuadroMACS</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-302 lub 130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Kulek do liczenia komórek</td><td>Life Technologies</td><td>PCB-100</td><td></td></tr></tbody></table>

wzbogacanie limfocytów t swoistych dla epitopu z wykorzystaniem tetramerów peptyd-mhc

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

Podstawową potrzebą badaczy studiujących odporność adaptacyjną w modelach eksperymentalnych in vivo jest zdolność do identyfikacji limfocytów T na podstawie specyficzności ich receptora antygenowego (TCR). Dostępnych jest wiele metod pośrednich, w których populacja limfocytów T jest stymulowana in vitro specyficznym antygenem, a limfocyty T specyficzne dla epitopu są identyfikowane poprzez pomiar odpowiedzi funkcjonalnej, takiej jak proliferacja, produkcja cytokin lub ekspresja markerów aktywacji1. Metody te pozwalają jednak na zidentyfikowanie jedynie tych limfocytów T specyficznych dla epitopu, które wykazują jedną z wielu możliwych funkcji, i nie są one wystarczająco czułe, aby wykryć limfocyty T specyficzne dla epitopu o częstotliwościach charakterystycznych dla prekursorów naiwnych. Popularną alternatywą jest model adoptywnego transferu z użyciem myszy transgenicznych TCR, w którym monoklonalne limfocyty T pochodzące od myszy transgenicznej TCR są wprowadzane do histokompatybilnych biorców w celu stworzenia dużej populacji prekursorów limfocytów T specyficznych dla epitopu, które można łatwo śledzić przy użyciu przeciwciała przeciwko markerowi kongenicznemu2,3. Choć skuteczna, metoda ta obarczona jest artefaktami eksperymentalnymi związanymi z niefizjologiczną częstotliwością występowania limfocytów T o specyficzności względem pojedynczego epitopu4,5. Ponadto system ten nie może być wykorzystany do badania heterogeniczności funkcjonalnej klonów limfocytów T specyficznych dla epitopu w obrębie populacji poliklonalnej.
	Idealny sposób badania odporności adaptacyjnej powinien obejmować bezpośrednią detekcję limfocytów T specyficznych dla epitopu z endogennego repertuaru limfocytów T, przy użyciu metody, która rozróżnia specyficzność TCR wyłącznie na podstawie wiązania z kognatywnymi kompleksami peptyd:MHC (pMHC). Zastosowanie tetramerów pMHC oraz cytometrii przepływowej pozwala na osiągnięcie tego celu6, jednak metoda ta ogranicza się do detekcji populacji limfocytów T specyficznych dla epitopu o wysokiej częstotliwości, które występują jedynie po antygenowo indukowanej ekspansji klonalnej. W niniejszym protokole opisujemy metodę, która koordynuje wykorzystanie tetramerów pMHC oraz technologii magnetycznego wzbogacania komórek, aby umożliwić detekcję limfocytów T specyficznych dla epitopu o ekstremalnie niskiej częstotliwości z tkanek limfatycznych myszy3,7. Dzięki tej technice można kompleksowo śledzić całe populacje endogennych limfocytów T specyficznych dla epitopu u myszy na wszystkich etapach odpowiedzi immunologicznej.

Rysunek 1 przedstawia reprezentatywne wykresy cytometrii przepływowej próbek śledziony i węzłów chłonnych wzbogaconych o tetramery pMHCII pobranych od myszy naiwnych, natomiast Rysunek 2 przedstawia reprezentatywne dane dla myszy uprzednio immunizowanych odpowiednim peptydem+CFA. Sekwencyjne bramkowanie pozwala na usunięcie zdarzeń autofluorescencyjnych i innych niepożądanych zdarzeń z analizy populacji limfocytów T CD4+. Populacja limfocytów T CD8+ służy jako przydatna wewnętrzna kontro...

Niniejszy protokół opisuje zastosowanie tetramerów peptyd:MHC oraz magnetycznych mikrokulek do izolacji populacji limfocytów T specyficznych dla epitopu o niskiej częstotliwości oraz ich analizy za pomocą cytometrii przepływowej. Metoda ta umożliwia bezpośrednie badanie endogennych populacji limfocytów T w systemach eksperymentalnych in vivo.

Wzbogacanie limfocytów T swoistych dla epitopu z wykorzystaniem tetramerów peptyd-MHC

Podstawową potrzebą badaczy zajmujących się odpornością adaptacyjną z wykorzystaniem in vivo modeli eksperymentalnych jest możliwość identyfikacji limfocytów T na podstawie ich...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest identyfikacja rzadkich limfocytów T specyficznych dla konkretnego epitopu z endogennego repertuaru limfocytów T myszy. Osiąga się to poprzez wstępne barwienie pobranych komórek limfatycznych odczynnikami tetramerów MHC z peptydem, co pozwoli na fluorescencyjne oznakowanie odpowiednich limfocytów T specyficznych dla epitopu. Następnie komórki oznakowane tetramerami są barwione magnetycznymi mikrokuleczkami sprzężonymi z przeciwciałami specyficznymi dla znacznika fluorescencyjnego obecnego na tetramerze.Następnie komórki oznakowane magnetycznie są przepuszczane przez kolumnę magnetyczną w celu wzbogacenia próbki w limfocyty T swoiste dla epitopu związane z tetramerem. Na koniec komórki barwi się przy użyciu wybranych eksperymentalnych markerów komórkowych, a następnie przeprowadza wieloparametryczną cytometrię przepływową, aby wykryć i określić ilość rzadkich, wzbogaconych tetramerem populacji limfocytów T swoistych dla epitopu. Główną zaletą stosowania tej techniki w porównaniu z innymi istniejącymi metodami, takimi jak system adoptywnego transferu transgenicznych limfocytów T z TCR, jest to, że badania są prowadzone na rzeczywistych poliklonalnych populacjach limfocytów T swoistych dla epitopu, które rozwijają się naturalnie w układzie odpornościowym.Co więcej, wysoka czułość detekcji zapewniana przez tę technikę umożliwia badanie tych populacji, gdy występują one z niezwykle niską częstotliwością. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na wiele kluczowych pytań z zakresu immunologii, takich jak liczba naiwnych limfocytów T, które mogą rozpoznać dany antygen patogennego drobnoustroju, oraz sposób, w jaki skład klonalny populacji limfocytów T specyficznych dla epitopu zmienia się w przebiegu odpowiedzi immunologicznej. Przed rozpoczęciem sekcji do szalki hodowlanej o średnicy 60 mm zawierającej mały kwadrat nylonowej siatki o oczkach 100 µm należy dodać jeden mililitr kompletnego medium EHAA, a następnie umieścić szalkę na lodzie.Następnie należy wyizolować śledzionę z uśpionej myszy oraz jak największą liczbę łatwo dostępnych węzłów chłonnych. Tkanki należy umieścić na siatce nylonowej w naczyniu hodowlanym. Używając płaskiej góry zamkniętej probówki do wirowania o pojemności 1,5 ml, należy delikatnie rozetrzeć tkanki limfoidalne na siatce nylonowej.Aby uwolnić limfocyty, należy dodać do naczynia kolejny mililitr pożywki, a następnie kilkukrotnie pipetować roztwór, aby doprowadzić komórki do stanu zawiesiny. Następnie na nowej probówce wirówkowej z polipropylenu o pojemności 15 mililitrów należy umieścić nową siatkę nylonową, a potem przenieść komórki przez tę siatkę. Płucząc naczynie i siatkę kolejnym mililitrem schłodzonej pożywki, należy przepuścić uzyskane objętości przez nową siatkę do probówki o pojemności 15 mililitrów.Powtórz płukanie jeszcze raz. Po dodaniu zimnego buforu do sortera do uzyskania objętości końcowej 15 milliliters, wiruj probówkę przez pięć minut przy 300 ×g i czterech °C. Następnie ostrożnie odessaj znad osadu.Resuspender osad komórkowy w bloku FC do końcowej objętości wynoszącej około dwukrotność objętości samego osadu. W przypadku wystąpienia znacznej aglutynacji komórek, ostrożnie usunąć skupiska komórek za pomocą końcówki pipety w celu barwienia limfocytów T swoistych dla antygenu.Do ponownie zawieszonego osadu komórkowego dodać tetramer MHC z peptydem znakowanym fluorescencyjnie w optymalnym stężeniu. Następnie wymieszać zawiesinę komórkową i inkubować przez optymalny czas i w optymalnej temperaturze, aby umożliwić wiązanie tetrameru. Następnie dodać zimny bufor do sortowania, aby zwiększyć objętość do 15 mililitrów, i odwirować, utrzymując komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie należy ostrożnie odessać supernatant. Po tym resuspendować osad komórkowy w buforze do sortowania do uzyskania końcowej objętości 200 µL. Teraz dodać 50 µL mikrokulek sprzężonych z przeciwciałami Miltenyi, które swoiście zwiążą się z tagiem fluorescencyjnym mieszaniny tetramerów, a następnie inkubować komórki związane z tetramerami oraz kulki w temperaturze 4 °C.Po 20 minutach przemyć komórki buforem do sortowania, gdy znajdują się one w wirówce. Umieścić kolumnę magnetyczną Milani LS na magnesie Quadro Max i ustawić nową 15 mililitrową polipropylenową probówkę do wirówki. Bezpośrednio pod kolumną dodać trzy mililitry buforu do sortowania na górną część kolumny, pozwalając mu spłynąć do 15 mililitrowej probówki.Następnie należy umieścić na górze kolumny kwadrat z nylonowej siatki o oczkach 100 mikronów. Po zakończeniu wirowania komórek ostrożnie odessać nadsącz i resuspender osad w trzech mililitrach buforu do sortowania, a następnie przenieść zawiesinę komórkową przez nylonową siatkę na górną część kolumny. Gdy zawiesina komórkowa całkowicie spłynie do kolumny, przepłukać pierwotną probówkę kolejnymi trzema mililitrami buforu do sortowania i przenieść je przez siatkę na kolumnę.Po zebraniu płuczki w probówce zbiorczej należy usunąć nylonową siatkę. Następnie, gdy bufor całkowicie spłynie do probówki, należy przemyć kolumnę jeszcze dwa razy, używając za każdym razem trzech mililitrów buforu do sortowania. Następnie należy zdjąć kolumnę z magnesu i umieścić ją nad nową 15-mililitrową polipropylenową probówką wirówkową.Następnie dodaj do kolumny kolejne pięć mililitrów buforu do sortowania. Natychmiast włóż tłok do górnej części kolumny i jednym ciągłym ruchem dociśnij go do samego dołu, wypychając bufor z kolumny do probówki. Po odwirowaniu zarówno probówki zawierającej eluowaną frakcję związaną, jak i probówki zawierającej niezwiązaną frakcję przepływową, ostrożnie odessij nadsącz z frakcji związanej i resuspenduj osad komórkowy w buforze do sortowania do końcowej objętości dokładnie 95 µL; odessij i resuspenduj frakcję niezwiązaną do końcowej objętości dwóch mililitrów przed dalszym barwieniem frakcji komórkowych, dodaj 200 µL kulek liczących do pięciomililitrowej probówki do FACS i przenieś pięć mikrolitrów komórek do tej probówki.Odstaw te probówki do analizy w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przygotuj master mix przeciwciał do barwienia markerów powierzchniowych na komórkach zgodnie z tabelą. W przypadku frakcji związanej, dodaj dawkę koktajlu przeciwciał bezpośrednio do komórek w odniesieniu do frakcji niezwiązanej.Przenieś 90 µL komórek do probówki fax o pojemności 5 mL i dodaj do przeniesionej próbki dawkę koktajlu przeciwciał dla każdego z użytych fluorochromów. Wymieszaj 50 µL pozostałej niezwiązanej frakcji komórek w probówce fax o pojemności 5 mL z 1 µL przeciwciała anty-CD4 skoniugowanego z odpowiednim fluorochromem. Odstaw również niebarwioną kontrolę, a następnie wymieszaj wszystkie próbki na wortexie i inkubuj je w temperaturze 4 °C przez 30 minut.Następnie, po przemyciu każdej probówki pięcioma mililitrami buforu do sortowania, ostrożnie odessaj supernatant z próbek frakcji związanej i resuspenduj komórki w 200 µL buforu do sortowania. Przenieś komórki do probówek typu fax o pojemności 1,2 ml, a następnie wypłucz poprzednie probówki kolejnymi 200 µL buforu do sortowania, łącząc wypłukiny w odpowiednich probówkach mikrocentryfugowych. Jeśli widoczne są skupiska, przepuść komórki przez filtr 50 µm w przypadku frakcji niezwiązanej oraz kontroli kompensacji, zlej supernatant i resuspenduj osady w jednym mililitrze buforu do sortowania.Przeanalizuj barwione próbki, stosując sekwencję następujących po sobie bramkowań inkluzyjnych w celu identyfikacji limfocytów T CD4+ lub CD8+, zgodnie z ilustracją przedstawioną tutaj dla próbek frakcji związanej. Dla próbek frakcji niezwiązanej zbierz jak najwięcej komórek, maksymalnie do 2 milionów zdarzeń łącznie. Zbierz 1 milion zdarzeń łącznie.Na koniec, przy użyciu tych samych ustawień urządzenia, należy zebrać 10 000 zdarzeń z próbek zawierających koraliki zliczające. Pierwsza rycina PRZEDSTAWIA reprezentatywne wykresy z cytometrii przepływowej próbek śledziony i węzłów chłonnych myszy naiwnych, wzbogaconych o tetramery MHC II z peptydem, dla frakcji komórek związanych i niezwiązanych. Zastosowano sekwencję bramek w celu wyselekcjonowania zdarzeń o dodatnim rozproszeniu przednim i bocznym, niskim sygnale dump, ujemnym sygnale dump oraz dodatnim sygnale CD3; z tych zdarzeń wyselekcjonowano komórki CD4-dodatnie lub CD8-dodatnie do analizy limfocytów T specyficznych dla epitopu lub barwienia tła.Aliquoty niebarwionych komórek z frakcji związanej i niezwiązanej zmieszano z fluorescencyjnymi koralikami do liczenia i przeanalizowano osobno. Przedstawione wykresy gęstości obrazują reprezentatywne dane dla myszy uprzednio immunizowanych odpowiednim peptydem z dodatkiem pełnego adiuwantem. W celu usunięcia autofluorescencji oraz innych niepożądanych zdarzeń zastosowano tę samą sekwencyjną strategię bramowania, co w poprzednim eksperymencie.Z analizy populacji limfocytów T CD4+ wynika, że populacja limfocytów T CD8+ stanowiła przydatną wewnętrzną kontrolę negatywną dla barwienia tetramerami MHC II specyficznymi dla peptydów w limfocytach T CD4+. Bezwzględna liczba limfocytów T specyficznych dla epitopu w próbce jest obliczana poprzez pomnożenie całkowitej liczby wszystkich komórek w frakcji związanej wzbogaconej próbki, wyznaczonej na podstawie analizy liczby kulek, przez proporcję tych komórek wykazujących pozytywną reakcję z tetramerem, określoną w analizie barwienia komórek. Dla reprezentatywnych danych z naiwnej myszy przedstawionych w pierwszej serii wykresów gęstości całkowita liczba komórek wynosiła 4 411, a liczba kulek 5 589. Stężenie roztworu kulek wynosiło 2×10⁵ na mililitr.Objętość kulek wynosiła 0,2 milliliters, a objętość komórek 0,005 milliliters. Na podstawie tych danych wyznaczono stężenie komórek wynoszące 6,31 × 10⁶ per milliliter. Następnie stężenie komórek pomnożono przez całkowitą objętość próbki, aby obliczyć całkowitą liczbę komórek.Dane te z kolei pomnożono przez procent zdarzeń pozytywnych dla tetrameru z analizy komórek, aby ustalić, że liczba specyficznych dla epitopu komórek T CD4+ u tej myszy naiwnej wynosiła 98. Dla reprezentatywnych danych z myszy immunizowanej w drugiej serii wykresów gęstości całkowita liczba specyficznych dla epitopu komórek T CD4+ wynosiła 1,53 × 10⁴. Wydajność wzbogacania spada wraz ze wzrostem liczby specyficznych dla epitopu komórek T.Zatem komórki tetramer-dodatnie mogą być widoczne w frakcji nie związanej próbek zawierających bardzo wysoką częstotliwość T-komórek specyficznych dla epitopu. W takich przypadkach liczbę T-komórek specyficznych dla epitopu obecnych we frakcji nie związanej można obliczyć oddzielnie i dodać do liczby znalezionej we frakcji związanej. Na przykład, w reprezentatywnej frakcji komórek nie związanych od myszy immunizowanej, całkowita liczba CD4-dodatnich T-komórek specyficznych dla epitopu wynosiła 8,97 × 10³.Zatem po zsumowaniu liczby komórek w frakcjach związanych i niezwiązanych, w całej próbce z immunizowanej myszy stwierdzono 2,43 × 10⁴ wszystkich limfocytów T CD4+ specyficznych dla epitopu. Rzeczywiście, jeśli ekspansja komórek specyficznych dla epitopu jest wystarczająco silna, proces wzbogacania można pominąć. Po procedurze wzbogacania można przeprowadzić etapy utrwalania i permeabilizacji, aby umożliwić barwienie białek wewnątrzkomórkowych, takich jak cytokiny i czynniki transkrypcyjne.Choć metoda ta została pierwotnie opracowana do badań limfocytów T z śledziony i węzłów chłonnych, można ją zastosować również do innych tkanek, takich jak grasica i jelita. Technikę tę można również wykorzystać do badania limfocytów T specyficznych dla epitypu w próbkach krwi i tkanek ludzkich.

peptidemhc-tetramer-based-enrichment-of-epitope-specific-t-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Tetramery oparte na peptydach: wzbogacanie w komórki T specyficzne dla epitopów MHC

Niniejsza procedura demonstruje oczyszczanie i ekspansję in vitro antygenowo swoistych limfocytów T CD4+ z pełnej krwi obwodowej oraz ich wizualizację przy użyciu tetramerów MHC klasy II. Tetramery umożliwiają bezpośrednią wizualizację limfocytów T o pojedynczej swoistości antygenowej i określonym ograniczeniu MHC klasy II.<br...

Wizualizacja antygenowo swoistych limfocytów T CD4+ z wykorzystaniem tetramerów MHC klasy II

Ten film opisuje protokół izolacji limfocytów T CD8+ specyficznych dla rzadkiego antygenu za pomocą magnetycznych komórek prezentujących sztuczny antygen oparty na nanocząstkach (aAPC) funkcjonalizowanych antygenowymi peptydami MHC-Igs i przeciwciałami anty-CD28. Interakcja aAPC z limfocytami T CD8 + specyficznie eksprymującymi receptory limfocytów T ukierunkowanych na peptydy antygenowe, a następnie ich ekspansję in vitro, powoduje wzbogacenie i ekspansję tej populacji limfocytów T CD8 +.

Wzbogacanie i ekspansja limfocytów T CD8+ specyficznych dla antygenu

Ten film demonstruje metodę charakteryzowania limfocytów T pamięci CD8+ specyficznych dla małpiego wirusa niedoboru odporności (SIV) przy użyciu tetramerów peptydowo-głównego kompleksu zgodności tkankowej klasy I (pMHC-I). Tetramer pMHC-I to kompleks czterech cząsteczek MHC-I związanych z peptydami specyficznymi dla SIV i sprzężonych z fluoroforem. Te tetramery selektywnie wiążą się z receptorami limfocytów T (TCR) na limfocytach T CD8 + specyficznych dla SIV, ułatwiając charakterystykę tych...

Technika barwienia tetramerów peptydowych MHC-I do analizy komórek T pamięci CD8 + specyficznych dla SIV

Testy biochemiczne z rekombinowanymi ludzkimi cząsteczkami MHC II mogą dostarczyć szybkich, ilościowych wglądów w identyfikację, delecję lub projektowanie epitopów immunogennych. Tutaj opisany jest test wiązania peptyd-MHC II skalowany do płytek 384-dołkowych. Ten opłacalny format powinien okazać się przydatny w dziedzinie deimmunizacji białek oraz projektowania i opracowywania szczepionek.

Wysokoprzepustowy test wiązania MHC II do analizy ilościowej epitopów peptydowych

Ten manuskrypt opisuje, jak przeprowadzić (pojedyncze cząsteczki) testy oparte na transferze energii rezonansu Förstera (FRET) w celu zmierzenia dynamiki wiązania między receptorem antygenu limfocytów T (TCR) a cząsteczkami MHC naładowanymi peptydami antygenowymi, które występują w synapsie immunologicznej limfocytu T w kontakcie z funkcjonalizowaną dwuwarstwą lipidową podpartą planarnie.

Pomiar wiązania TCR-pMHC in situ za pomocą testu mikroskopowego opartego na FRET

Tutaj prezentujemy zoptymalizowany protokół do liczenia i charakteryzowania limfocytów T CD8+ makaków rezusów przeciwko wirusowi AIDS. Ten artykuł jest przydatny nie tylko w dziedzinie immunologii HIV, ale także w innych obszarach badań biomedycznych, w których wiadomo, że odpowiedzi limfocytów T CD8 + wpływają na wynik choroby.

Analiza limfocytów T CD8 + specyficznych dla małpiego wirusa niedoboru odporności u makaków rezusów za pomocą barwienia tetramerem peptydowo-MHC-I

Tutaj opisujemy metodę, która łączy barwienie in situ MHC-tetrameru z immunohistochemią w celu określenia lokalizacji, fenotypu i ilości limfocytów T specyficznych dla antygenu w tkankach. Protokół ten służy do określania charakterystyki przestrzennej i fenotypowej limfocytów T CD8 specyficznych dla antygenu w stosunku do innych typów komórek i struktur w tkankach.

In Situ Barwienie tetrameru MHC i analiza ilościowa w celu określenia lokalizacji, liczebności i fenotypu limfocytów T CD8 specyficznych dla antygenu w tkankach

Limfocyty T specyficzne dla antygenu są trudne do scharakteryzowania lub wykorzystania w terapiach ze względu na ich ekstremalnie niską częstotliwość. W tym miejscu przedstawiamy protokół rozwoju cząsteczki magnetycznej, która może wiązać się z limfocytami T specyficznymi dla antygenu, aby wzbogacić te komórki, a następnie rozszerzyć je kilkaset razy zarówno w celu charakteryzacji, jak i terapii.

Wzbogacanie i rozszerzanie rzadkich limfocytów T specyficznych dla antygenu za pomocą nanocząstek magnetycznych

Tutaj prezentujemy protokół jakościowego wykrywania ex vivo specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8+. Analiza jest możliwa w przypadku zawiesin pojedynczych komórek z narządów lub z niewielkich ilości krwi. Szeroki zakres badań wymaga analizy odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T (badania nad szczepieniami i immunoterapią nowotworów).

Jednoczesna kwantyfikacja limfocytów T CD8 + specyficznych dla antywektorów i anty-transgenów za pomocą barwienia tetramerem MHC I po szczepieniu wektorem wirusowym

Tutaj prezentujemy protokół oczyszczania kompleksów peptydowych MHC klasy I i klasy II z linii komórkowych myszy i ludzi, dostarczając wysokiej jakości danych immunopeptydomowych. Protokół koncentruje się na przygotowaniu próbki przy użyciu dostępnych na rynku przeciwciał.

Immunopeptydomika: izolacja mysich i ludzkich peptydów związanych z MHC klasy I i II do analizy spektrometrii mas

Dostarczamy szczegółowy protokół do izolowania i identyfikacji rzadkich populacji limfocytów T specyficznych dla antygenu w płucach myszy poprzez magnetyczne wzbogacanie limfocytów T na bazie kulek magnetycznych i tetramery peptydu:głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC).

Identyfikacja rzadkich limfocytów T specyficznych dla antygenu z płuc myszy za pomocą peptydów: głównych tetramerów kompleksu zgodności tkankowej

Poznaj metodę izolacji rzadkich limfocytów T specyficznych dla epitopów z użyciem tetramerów peptyd:MHC i mikrokulek magnetycznych. Technika ta umożliwia badanie endogennych populacji komórek T myszy.

Wzbogacanie limfocytów T swoistych dla epitopu z wykorzystaniem tetramerów peptyd-MHC

Przeglądaj więcej filmów