Name: Peptyd: MHC Wzbogacanie limfocytów T specyficznych dla epitopów na bazie tetramerów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 58 s
Description: Poznaj metodę izolacji rzadkich limfocytów T specyficznych dla epitopów z użyciem tetramerów peptyd:MHC i mikrokulek magnetycznych. Technika ta umożliwia badanie endogennych populacji komórek T myszy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować Andre Hanowi i Lawrence’owi Yenowi za pomoc techniczną oraz członkom laboratorium Jenkinsa za pomoc w opracowaniu niniejszego protokołu.

1. Izolacja komórek z tkanki limfatycznej
<ol>
 <li>Do szalki hodowlanej o średnicy 60 mm zawierającej mały kwadrat nylonowej siatki o oczkach 100 μm dodać 1 ml schłodzonego w lodzie cEHAA (EHAA + 10% FBS, pen/strep, gentamycyna, 2 mM L-glutaminy, 55 mM 2-merkaptoetanolu) lub innego równoważnego medium dla limfocytów T i umieścić na lodzie.</li>
 <li>Uśmiercić mysz.</li>
 <li>Usunąć śledzionę oraz jak największą liczbę łatwo dostępnych węzłów chłonnych. Powinny one obejmować co najmniej węzły chłonne pachwinowe, pachowe, ramienne, szyjne i krezkowe. Umieścić je na nylonowej siatce w szalce hodowlanej.</li>
 <li>Używając płaskiej góry zamkniętej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, delikatnie rozgnieść tkankę limfatyczną na nylonowej siatce, aby uwolnić limfocyty. Dodać kolejny 1 ml cEHAA i pipetować w górę i w dół, aby wprowadzić komórki w zawiesinę. Przenieść komórki przez kolejny fragment nylonowej siatki umieszczonej nad probówką wirówkową z polipropylenu o pojemności 15 ml. Przepłukać szalkę i siatkę kolejnym 1 ml schłodzonego w lodzie cEHAA, łącząc objętości w tej samej probówce. Powtórzyć czynność, aby uzyskać końcową objętość zawiesiny komórkowej wynoszącą 4 ml.</li>
 <li>Dodać zimny bufor do sortowania (PBS + 2% FBS, 0,05% azydku) do końcowej objętości 15 ml i wirować probówkę przez 5 min przy 300 x g w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Ostrożnie odessać supernatant, upewniając się, że na ściankach probówki nie pozostały krople cieczy. Resuspender pellet komórkowy w bloku Fc (bufor do sortowania + przeciwciało 2.4G2) do końcowej objętości wynoszącej w przybliżeniu dwukrotność objętości samego pelletu. Na przykład śledziona i węzły chłonne naiwnej myszy zazwyczaj dają pellet komórkowy o objętości około 100 μl. W takim przypadku dodać 100 μl bloku Fc, aby zwiększyć objętość do 200 μl. Jeśli doszło do znacznego skupiania się komórek, na tym etapie ostrożnie usunąć skupisko komórek końcówką pipety.</li>
</ol>
2. Barwienie tetramerami
<ol>
 <li>Dodać tetramer pMHC znakowany PE lub APC do stężenia końcowego 10 nM (lub stężenia zoptymalizowanego empirycznie).</li>
 <li>Wymieszać i inkubować przez 1 hr w temperaturze pokojowej (lub w czasie i temperaturze zoptymalizowanych empirycznie).</li>
 <li>Dodać zimny bufor do sortowania do objętości 15 ml i odwirować probówkę przez 5 min przy 300 x g w temperaturze 4 °C. Od tego momentu przechowywać próbki na lodzie lub w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Ostrożnie odessać supernatant, upewniając się, że na ściankach probówki nie pozostały krople cieczy. Resuspendować pellet komórkowy w buforze do sortowania do objętości końcowej 200 μl. W przypadku podwójnego wzbogacenia tetramerem resuspendować do objętości końcowej 150 μl.</li>
</ol>
3. Wzbogacanie magnetyczne
<ol>
 <li>Dodać 50 μl mikrokulek Miltenyi anti-PE lub anti-APC. W przypadku wzbogacenia podwójnym tetramerem dodać po 50 μl obu rodzajów.</li>
 <li>Wymieszać i inkubować przez 20 min w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Dodać zimny bufor do sortowania do objętości 15 ml i wirować probówkę przez 5 min przy 300 x g w 4 °C.</li>
 <li>W czasie oczekiwania przygotować kolumnę magnetyczną Miltenyi LS na magnesie MidiMACS lub QuadroMACS. Umieścić otwartą polipropylenową probówkę wirówkową o objętości 15 ml w statywie bezpośrednio pod kolumną.</li>
 <li>Dodać 3 ml buforu do sortowania na górze kolumny, pozwalając mu spłynąć do probówki 15 ml.</li>
 <li>Umieścić kwadrat z nylonowej siatki o oczkach 100 μm na górze kolumny.</li>
 <li>Po zakończeniu wirowania komórek ostrożnie odessać supernatant i resuspendować osad w 3 ml buforu do sortowania.</li>
 <li>Przenieść zawiesinę komórkową przez nylonową siatkę na górę kolumny.</li>
 <li>Gdy zawiesina komórkowa całkowicie spłynie do kolumny, przepłukać pierwotną probówkę kolejnymi 3 ml buforu do sortowania i przenieść bufor przez nylonową siatkę do kolumny, płucząc przy tym siatkę. Usunąć siatkę nylonową.</li>
 <li>Gdy bufor całkowicie spłynie do kolumny, dodać do niej kolejne 3 ml buforu do sortowania.</li>
 <li>Powtórzyć krok 10, aby uzyskać łącznie 3 płukania po 3 ml.</li>
 <li>Zdjąć kolumnę z magnesu i umieścić ją nad nową polipropylenową probówką wirówkową o objętości 15 ml.</li>
 <li>Dodać 5 ml buforu do sortowania do kolumny.</li>
 <li>Natychmiast włożyć tłok do górnej części kolumny i jednym ciągłym ruchem docisnąć go do końca, wypychając bufor z kolumny do probówki.</li>
 <li>Wirować probówki zawierające eluowaną frakcję związaną oraz przepuszczoną frakcję niezwiązaną przez 5 min przy 300 x g w 4 °C.</li>
 <li>Ostrożnie odessać supernatant z frakcji związanej, upewniając się, że na ściankach probówki nie pozostały krople cieczy. Resuspendować osad komórkowy w buforze do sortowania do końcowej objętości dokładnie 95 μl. Odessać i resuspendować frakcję niezwiązaną do końcowej objętości 2 ml.</li>
</ol>
4. Cytometria przepływowa
<ol>
 <li>Z każdej frakcji odbiór 5 μl i przenieść do 200 μl kulek zliczających (o stężeniu dostosowanym do 200,000/ml w buforze do sortowania) w probówce FACS o pojemności 5 ml. Przechowywać w temperaturze 4 °C do późniejszej analizy. Aby zaoszczędzić czas, kulki można rozdzielić do oznakowanych probówek przed rozpoczęciem eksperymentu.</li>
 <li>Przygotować master mix przeciwciał do barwienia markerów powierzchniowych na komórkach (Tabela 1). W celu oszczędności czasu można to zrobić przed rozpoczęciem eksperymentu.</li>
 <li>W przypadku frakcji związanej dodać dawkę koktajlu przeciwciał bezpośrednio do ~90 μl komórek w probówce. Jeśli planowana jest analiza frakcji niezwiązanej, przenieść 90 μl komórek do probówki FACS 5 ml i dodać dawkę koktajlu przeciwciał.</li>
 <li>Przygotować panel jednobarwnych kontroli kompensacji do cytometru przepływowego. Dla każdego użytego fluorochromu zmieszać 50 μl pozostałych komórek z frakcji niezwiązanej w probówce FACS 5 ml z 1 μl przeciwciała anty-CD4 skoniugowanego z odpowiednim fluorochromem. Należy pamiętać o przygotowaniu również kontroli niebarwionej.</li>
 <li>Wymieszać na wortexie i inkubować wszystkie próbki przez 30 min w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Do każdej probówki dodać 5 ml buforu do sortowania i wirować przez 5 min przy 300 x g w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>W przypadku frakcji związanej ostrożnie odessać nadsącz i resuspender komórki w 200 μl buforu do sortowania. Przenieść komórki do mikroprobówki FACS 1,2 ml. Przepłukać probówkę kolejnymi 200 μl buforu do sortowania i połączyć w tej samej mikroprobówce. Jeśli widoczne są agregaty komórkowe, przepuścić komórki przez filtr 50 μm.</li>
 <li>W przypadku frakcji niezwiązanej oraz kontroli kompensacji odlać lub odessać nadsącz i resuspender w 2 ml buforu do sortowania.</li>
 <li>Ustawić cytometr przepływowy, korzystając z jednobarwnych kontroli kompensacji. Jako dodatkowy rejestrowany parametr wybrać szerokość rozproszenia bocznego (SSC-W).</li>
 <li>Przeanalizować zabarwione próbki, stosując sekwencję następujących po sobie bramek inkluzyjnych w celu identyfikacji limfocytów T CD4+ lub CD8+, zgodnie z ilustracją na Rysunkach 1 i 2. Dla frakcji związanych zebrać jak najwięcej komórek, do maksymalnie 2,000,000 zdarzeń całkowitych. Dla frakcji niezwiązanych zebrać 1,000,000 zdarzeń całkowitych. Utrzymywać tempo akwizycji na poziomie 3,000 zdarzeń na sekundę lub niższym.</li>
 <li>Przy tych samych ustawieniach urządzenia przeanalizować próbki z kulkami zliczającymi. Zebrać 10,000 zdarzeń całkowitych.</li>
 <li>Zapisywać wszystkie dane jako pliki FCS.</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
 <li>Przeanalizuj pliki danych FCS dla próbek z koralikami liczącymi, korzystając z oprogramowania FlowJo. Przedstaw rozrzut przedni (forward scatter) w funkcji FITC i ustaw bramkę wokół koralików liczących (patrz Ryciny 1 i 2). Określ całkowitą liczbę koralików liczących wykrytych w każdej próbce. Odejmij tę wartość od całkowitej liczby zebranych zdarzeń, aby wyznaczyć liczbę zebranych zdarzeń komórkowych.</li>
 <li>Oblicz całkowitą liczbę wszystkich komórek w każdej próbce, stosując równania opisane w Ramce 1.</li>
 <li>Przeanalizuj pliki danych FCS dla próbek frakcji związanej i niezwiązanej po barwieniu. Ustaw sekwencję następujących po sobie bramek inkluzyjnych w celu zidentyfikowania limfocytów+, komórek o niskiej szerokości rozrzutu bocznego (side-scatter-widthlo), dump-, CD3+, CD4+ lub CD8+, tetramer+ T w każdej próbce, zgodnie z ilustracją na Ryciniach 1 i 2.</li>
 <li>Pomnóż całkowitą liczbę komórek w próbce przez częstotliwości każdej z bramek inkluzyjnych użytych do zdefiniowania komórek CD4+tetramer+ lub CD8+tetramer+, aby obliczyć całkowitą liczbę limfocytów T specyficznych dla epitopu (Ramka 1).</li>
</ol>

<ol><li>Knutson, K. L., dela Rosa, C., Disis, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+analysis+of+T-cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Laboratory analysis of T-cell immunity.</a> Front Biosci. 11, 1932-1944 (2006).</li>
<li>Kearney, E. R., Pape, K. A., Loh, D. Y., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+peptide-specific+T+cell+immunity+and+peripheral+tolerance+induction+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Visualization of peptide-specific T cell immunity and peripheral tolerance induction in vivo.</a> Immunity. 1, 327-339 (1994).</li>
<li>Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+epitope-specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Tracking epitope-specific T cells.</a> Nat Protoc. 4, 565-581 (2009).</li>
<li>Hataye, J., Moon, J. J., Khoruts, A., Reilly, C., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+and+memory+CD4%2B+T+cell+survival+controlled+by+clonal+abundance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Naive and memory CD4+ T cell survival controlled by clonal abundance.</a> Science. 312, 114-116 (2006).</li>
<li>Marzo, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+T+cell+frequency+dictates+memory+CD8%2B+T+cell+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Initial T cell frequency dictates memory CD8+ T cell lineage commitment.</a> Nat Immunol. 6, 793-799 (2005).</li>
<li>Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+the+repertoire%3A+broadening+the+scope+of+peptide-MHC+multimer+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis.</a> Nature reviews. Immunology. 11, 551-558 (2011).</li>
<li>Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+CD4%28%2B%29+T+cell+frequency+varies+for+different+epitopes+and+predicts+repertoire+diversity+and+response+magnitude%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude.</a> Immunity. 27, 203-213 (2007).</li>
<li>Seah, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+linear+range+for+accurately+quantifying+antigen-specific+T-cell+frequencies+by+tetramer+staining+during+natural+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The linear range for accurately quantifying antigen-specific T-cell frequencies by tetramer staining during natural immune responses.</a> European Journal of Immunology. 41, 1499-1500 (2011).</li>
<li>Obar, J. J., Khanna, K. M., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+naive+CD8%2B+T+cell+precursor+frequency+regulates+primary+and+memory+responses+to+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Endogenous naive CD8+ T cell precursor frequency regulates primary and memory responses to infection.</a> Immunity. 28, 859-869 (2008).</li>
<li>Daniels, M. A., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+for+CD8+in+T+cell+receptor+binding+and+activation+by+peptide%2Fmajor+histocompatibility+complex+multimers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers.</a> J Exp Med. 191, 335-346 (2000).</li>
<li>Pittet, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha+3+domain+mutants+of+peptide%2FMHC+class+I+multimers+allow+the+selective+isolation+of+high+avidity+tumor-reactive+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Alpha 3 domain mutants of peptide/MHC class I multimers allow the selective isolation of high avidity tumor-reactive CD8 T cells.</a> Journal of Immunology. 171, 1844-1849 (2003).</li>
<li>Choi, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+avidity+antigen-specific+CTL+identified+by+CD8-independent+tetramer+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">High avidity antigen-specific CTL identified by CD8-independent tetramer staining.</a> Journal of Immunology. 171, 5116-5123 (2003).</li>
<li>Chu, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+selection+optimizes+the+number+and+function+of+MHCII-restricted+CD4%2B+T+cell+clones+in+the+naive+polyclonal+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Positive selection optimizes the number and function of MHCII-restricted CD4+ T cell clones in the naive polyclonal repertoire.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11241-11245 (2009).</li>
<li>Chu, H. H., Moon, J. J., Kruse, A. C., Pepper, M., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+Selection+and+Peptide+Chemistry+Determine+the+Size+of+Naive+Foreign+Peptide-MHC+Class+II-Specific+CD4%2B+T+Cell+Populations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Negative Selection and Peptide Chemistry Determine the Size of Naive Foreign Peptide-MHC Class II-Specific CD4+ T Cell Populations.</a> J Immunol. 185, 4705-4713 (2010).</li>
<li>Legoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+TCR+reactivity+and+HLA+phenotype+on+naive+CD8+T+cell+frequency+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Impact of TCR reactivity and HLA phenotype on naive CD8 T cell frequency in humans.</a> J Immunol. 184, 6731-6738 (2010).</li>
<li>Alanio, C., Lemaitre, F., Law, H. K., Hasan, M., Albert, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+human+antigen-specific+naive+CD8%2B+T+cells+reveals+conserved+precursor+frequencies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Enumeration of human antigen-specific naive CD8+ T cells reveals conserved precursor frequencies.</a> Blood. 115, 3718-3725 (2010).</li>
<li>Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+of+Epitope-Specific+Naive+CD4%2B+T+Cells+Correlates+with+Immunodominance+in+the+Human+Memory+Repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Frequency of Epitope-Specific Naive CD4+ T Cells Correlates with Immunodominance in the Human Memory Repertoire.</a> Journal of Immunology. 188, 2537-2544 (2012).</li>
<li>Jenkins, M. K., Chu, H. H., McLachlan, J. B., Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+composition+of+the+preimmune+repertoire+of+T+cells+specific+for+Peptide-major+histocompatibility+complex+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">On the composition of the preimmune repertoire of T cells specific for Peptide-major histocompatibility complex ligands.</a> Annu Rev Immunol. 28, 275-294 (2010).</li>
<li>Matechak, E. O., Killeen, N., Hedrick, S. M., Fowlkes, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+II-specific+T+cells+can+develop+in+the+CD8+lineage+when+CD4+is+absent%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">MHC class II-specific T cells can develop in the CD8 lineage when CD4 is absent.</a> Immunity. 4, 337-347 (1996).</li>
<li>Burchill, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linked+T+cell+receptor+and+cytokine+signaling+govern+the+development+of+the+regulatory+T+cell+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Linked T cell receptor and cytokine signaling govern the development of the regulatory T cell repertoire.</a> Immunity. 28, 112-121 (2008).</li>
<li>Pepper, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+routes+of+bacterial+infection+induce+long-lived+TH1+memory+cells+and+short-lived+TH17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Different routes of bacterial infection induce long-lived TH1 memory cells and short-lived TH17 cells.</a> Nature Immunology. 11, 83-89 (2010).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Metoda wzbogacania komórek oparta na tetramerach pMHC, przedstawiona w niniejszym protokole, jest potężnym narzędziem do badania epitopowo-specyficznych limfocytów T z endogennych repertuarów limfocytów T. Zastosowanie tetramerów pMHC umożliwia wykrywanie epitopowo-specyficznych limfocytów T w oparciu bezpośrednio o zdolność ich receptorów TCR do wiązania kognatywnych ligandów pMHC. Wzbogacenie zapewnia poziom czułości pozwalający na wykrycie niezwykle rzadkich populacji antygenowo-specyficznych limfocytów T z endogennyc...

<table><tbody><tr><td>Tetramer (lub multimer) pMHC koniugowany z PE lub APC</td><td>Przygotowany przez badacza, pobrany z NIH tetramer core lub zakupiony z komercyjnych źródeł</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnetyczne mikrokule koniugowane z anty-PE</td><td>Miltenyi</td><td>130-048-801</td><td></td></tr><tr><td>Magnetyczne mikrokule koniugowane z anty-APC</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-855</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny magnetyczne LS</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Magnes MidiMACS lub QuadroMACS</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-302 lub 130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Kulek do liczenia komórek</td><td>Life Technologies</td><td>PCB-100</td><td></td></tr></tbody></table>

wzbogacanie limfocytów t swoistych dla epitopu z wykorzystaniem tetramerów peptyd-mhc

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

Podstawową potrzebą badaczy studiujących odporność adaptacyjną w modelach eksperymentalnych in vivo jest zdolność do identyfikacji limfocytów T na podstawie specyficzności ich receptora antygenowego (TCR). Dostępnych jest wiele metod pośrednich, w których populacja limfocytów T jest stymulowana in vitro specyficznym antygenem, a limfocyty T specyficzne dla epitopu są identyfikowane poprzez pomiar odpowiedzi funkcjonalnej, takiej jak proliferacja, produkcja cytokin lub ekspresja markerów aktywacji1. Metody te pozwalają jednak na zidentyfikowanie jedynie tych limfocytów T specyficznych dla epitopu, które wykazują jedną z wielu możliwych funkcji, i nie są one wystarczająco czułe, aby wykryć limfocyty T specyficzne dla epitopu o częstotliwościach charakterystycznych dla prekursorów naiwnych. Popularną alternatywą jest model adoptywnego transferu z użyciem myszy transgenicznych TCR, w którym monoklonalne limfocyty T pochodzące od myszy transgenicznej TCR są wprowadzane do histokompatybilnych biorców w celu stworzenia dużej populacji prekursorów limfocytów T specyficznych dla epitopu, które można łatwo śledzić przy użyciu przeciwciała przeciwko markerowi kongenicznemu2,3. Choć skuteczna, metoda ta obarczona jest artefaktami eksperymentalnymi związanymi z niefizjologiczną częstotliwością występowania limfocytów T o specyficzności względem pojedynczego epitopu4,5. Ponadto system ten nie może być wykorzystany do badania heterogeniczności funkcjonalnej klonów limfocytów T specyficznych dla epitopu w obrębie populacji poliklonalnej.
	Idealny sposób badania odporności adaptacyjnej powinien obejmować bezpośrednią detekcję limfocytów T specyficznych dla epitopu z endogennego repertuaru limfocytów T, przy użyciu metody, która rozróżnia specyficzność TCR wyłącznie na podstawie wiązania z kognatywnymi kompleksami peptyd:MHC (pMHC). Zastosowanie tetramerów pMHC oraz cytometrii przepływowej pozwala na osiągnięcie tego celu6, jednak metoda ta ogranicza się do detekcji populacji limfocytów T specyficznych dla epitopu o wysokiej częstotliwości, które występują jedynie po antygenowo indukowanej ekspansji klonalnej. W niniejszym protokole opisujemy metodę, która koordynuje wykorzystanie tetramerów pMHC oraz technologii magnetycznego wzbogacania komórek, aby umożliwić detekcję limfocytów T specyficznych dla epitopu o ekstremalnie niskiej częstotliwości z tkanek limfatycznych myszy3,7. Dzięki tej technice można kompleksowo śledzić całe populacje endogennych limfocytów T specyficznych dla epitopu u myszy na wszystkich etapach odpowiedzi immunologicznej.

Rysunek 1 przedstawia reprezentatywne wykresy cytometrii przepływowej próbek śledziony i węzłów chłonnych wzbogaconych o tetramery pMHCII pobranych od myszy naiwnych, natomiast Rysunek 2 przedstawia reprezentatywne dane dla myszy uprzednio immunizowanych odpowiednim peptydem+CFA. Sekwencyjne bramkowanie pozwala na usunięcie zdarzeń autofluorescencyjnych i innych niepożądanych zdarzeń z analizy populacji limfocytów T CD4+. Populacja limfocytów T CD8+ służy jako przydatna wewnętrzna kontro...

Niniejszy protokół opisuje zastosowanie tetramerów peptyd:MHC oraz magnetycznych mikrokulek do izolacji populacji limfocytów T specyficznych dla epitopu o niskiej częstotliwości oraz ich analizy za pomocą cytometrii przepływowej. Metoda ta umożliwia bezpośrednie badanie endogennych populacji limfocytów T w systemach eksperymentalnych in vivo.

Wzbogacanie limfocytów T swoistych dla epitopu z wykorzystaniem tetramerów peptyd-MHC

Podstawową potrzebą badaczy zajmujących się odpornością adaptacyjną z wykorzystaniem in vivo modeli eksperymentalnych jest możliwość identyfikacji limfocytów T na podstawie ich...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest identyfikacja rzadkich limfocytów T specyficznych dla konkretnego epitopu z endogennego repertuaru limfocytów T myszy. Osiąga się to poprzez wstępne barwienie pobranych komórek limfatycznych odczynnikami tetramerów MHC z peptydem, co pozwoli na fluorescencyjne oznakowanie odpowiednich limfocytów T specyficznych dla epitopu. Następnie komórki oznakowane tetramerami są barwione magnetycznymi mikrokuleczkami sprzężonymi z przeciwciałami specyficznymi dla znacznika fluorescencyjnego obecnego na tetramerze.Następnie komórki oznakowane magnetycznie są przepuszczane przez kolumnę magnetyczną w celu wzbogacenia próbki w limfocyty T swoiste dla epitopu związane z tetramerem. Na koniec komórki barwi się przy użyciu wybranych eksperymentalnych markerów komórkowych, a następnie przeprowadza wieloparametryczną cytometrię przepływową, aby wykryć i określić ilość rzadkich, wzbogaconych tetramerem populacji limfocytów T swoistych dla epitopu. Główną zaletą stosowania tej techniki w porównaniu z innymi istniejącymi metodami, takimi jak system adoptywnego transferu transgenicznych limfocytów T z TCR, jest to, że badania są prowadzone na rzeczywistych polikl

peptidemhc-tetramer-based-enrichment-of-epitope-specific-t-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Tetramery oparte na peptydach: wzbogacanie w komórki T specyficzne dla epitopów MHC

Niniejsza procedura demonstruje oczyszczanie i ekspansję in vitro antygenowo swoistych limfocytów T CD4+ z pełnej krwi obwodowej oraz ich wizualizację przy użyciu tetramerów MHC klasy II. Tetramery umożliwiają bezpośrednią wizualizację limfocytów T o pojedynczej swoistości antygenowej i określonym ograniczeniu MHC klasy II.<br...

Wizualizacja antygenowo swoistych limfocytów T CD4+ z wykorzystaniem tetramerów MHC klasy II

Ten film opisuje protokół izolacji limfocytów T CD8+ specyficznych dla rzadkiego antygenu za pomocą magnetycznych komórek prezentujących sztuczny antygen oparty na nanocząstkach (aAPC) funkcjonalizowanych antygenowymi peptydami MHC-Igs i przeciwciałami anty-CD28. Interakcja aAPC z limfocytami T CD8 + specyficznie eksprymującymi receptory limfocytów T ukierunkowanych na peptydy antygenowe, a następnie ich ekspansję in vitro, powoduje wzbogacenie i ekspansję tej populacji limfocytów T CD8 +.

Wzbogacanie i ekspansja limfocytów T CD8+ specyficznych dla antygenu

Ten film demonstruje metodę charakteryzowania limfocytów T pamięci CD8+ specyficznych dla małpiego wirusa niedoboru odporności (SIV) przy użyciu tetramerów peptydowo-głównego kompleksu zgodności tkankowej klasy I (pMHC-I). Tetramer pMHC-I to kompleks czterech cząsteczek MHC-I związanych z peptydami specyficznymi dla SIV i sprzężonych z fluoroforem. Te tetramery selektywnie wiążą się z receptorami limfocytów T (TCR) na limfocytach T CD8 + specyficznych dla SIV, ułatwiając charakterystykę tych...

Technika barwienia tetramerów peptydowych MHC-I do analizy komórek T pamięci CD8 + specyficznych dla SIV

Testy biochemiczne z rekombinowanymi ludzkimi cząsteczkami MHC II mogą dostarczyć szybkich, ilościowych wglądów w identyfikację, delecję lub projektowanie epitopów immunogennych. Tutaj opisany jest test wiązania peptyd-MHC II skalowany do płytek 384-dołkowych. Ten opłacalny format powinien okazać się przydatny w dziedzinie deimmunizacji białek oraz projektowania i opracowywania szczepionek.

Wysokoprzepustowy test wiązania MHC II do analizy ilościowej epitopów peptydowych

Ten manuskrypt opisuje, jak przeprowadzić (pojedyncze cząsteczki) testy oparte na transferze energii rezonansu Förstera (FRET) w celu zmierzenia dynamiki wiązania między receptorem antygenu limfocytów T (TCR) a cząsteczkami MHC naładowanymi peptydami antygenowymi, które występują w synapsie immunologicznej limfocytu T w kontakcie z funkcjonalizowaną dwuwarstwą lipidową podpartą planarnie.

Pomiar wiązania TCR-pMHC in situ za pomocą testu mikroskopowego opartego na FRET

Tutaj prezentujemy zoptymalizowany protokół do liczenia i charakteryzowania limfocytów T CD8+ makaków rezusów przeciwko wirusowi AIDS. Ten artykuł jest przydatny nie tylko w dziedzinie immunologii HIV, ale także w innych obszarach badań biomedycznych, w których wiadomo, że odpowiedzi limfocytów T CD8 + wpływają na wynik choroby.

Analiza limfocytów T CD8 + specyficznych dla małpiego wirusa niedoboru odporności u makaków rezusów za pomocą barwienia tetramerem peptydowo-MHC-I

Tutaj opisujemy metodę, która łączy barwienie in situ MHC-tetrameru z immunohistochemią w celu określenia lokalizacji, fenotypu i ilości limfocytów T specyficznych dla antygenu w tkankach. Protokół ten służy do określania charakterystyki przestrzennej i fenotypowej limfocytów T CD8 specyficznych dla antygenu w stosunku do innych typów komórek i struktur w tkankach.

In Situ Barwienie tetrameru MHC i analiza ilościowa w celu określenia lokalizacji, liczebności i fenotypu limfocytów T CD8 specyficznych dla antygenu w tkankach

Limfocyty T specyficzne dla antygenu są trudne do scharakteryzowania lub wykorzystania w terapiach ze względu na ich ekstremalnie niską częstotliwość. W tym miejscu przedstawiamy protokół rozwoju cząsteczki magnetycznej, która może wiązać się z limfocytami T specyficznymi dla antygenu, aby wzbogacić te komórki, a następnie rozszerzyć je kilkaset razy zarówno w celu charakteryzacji, jak i terapii.

Wzbogacanie i rozszerzanie rzadkich limfocytów T specyficznych dla antygenu za pomocą nanocząstek magnetycznych

Tutaj prezentujemy protokół jakościowego wykrywania ex vivo specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8+. Analiza jest możliwa w przypadku zawiesin pojedynczych komórek z narządów lub z niewielkich ilości krwi. Szeroki zakres badań wymaga analizy odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T (badania nad szczepieniami i immunoterapią nowotworów).

Jednoczesna kwantyfikacja limfocytów T CD8 + specyficznych dla antywektorów i anty-transgenów za pomocą barwienia tetramerem MHC I po szczepieniu wektorem wirusowym

Tutaj prezentujemy protokół oczyszczania kompleksów peptydowych MHC klasy I i klasy II z linii komórkowych myszy i ludzi, dostarczając wysokiej jakości danych immunopeptydomowych. Protokół koncentruje się na przygotowaniu próbki przy użyciu dostępnych na rynku przeciwciał.

Immunopeptydomika: izolacja mysich i ludzkich peptydów związanych z MHC klasy I i II do analizy spektrometrii mas

Dostarczamy szczegółowy protokół do izolowania i identyfikacji rzadkich populacji limfocytów T specyficznych dla antygenu w płucach myszy poprzez magnetyczne wzbogacanie limfocytów T na bazie kulek magnetycznych i tetramery peptydu:głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC).

Identyfikacja rzadkich limfocytów T specyficznych dla antygenu z płuc myszy za pomocą peptydów: głównych tetramerów kompleksu zgodności tkankowej

Poznaj metodę izolacji rzadkich limfocytów T specyficznych dla epitopów z użyciem tetramerów peptyd:MHC i mikrokulek magnetycznych. Technika ta umożliwia badanie endogennych populacji komórek T myszy.

Wzbogacanie limfocytów T swoistych dla epitopu z wykorzystaniem tetramerów peptyd-MHC

Przeglądaj więcej filmów