Peptyd: MHC Wzbogacanie limfocytów T specyficznych dla epitopów na bazie tetramerów

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest identyfikacja rzadkich limfocytów T specyficznych dla epitopów z endogennego repertuaru limfocytów T myszy. Osiąga się to poprzez pierwsze barwienie zebranych komórek limfoidalnych odczynnikami tetrameru peptydowego MHC, które będą fluorescencyjnie znakować odpowiednie limfocyty T specyficzne dla epitopów. Te komórki znakowane tetramerem są następnie barwione mikrokulkami magnetycznymi sprzężonymi z przeciwciałami specyficznymi dla znacznika fluorescencyjnego na tetramerze.

Następnie magnetycznie znakowane komórki są przepuszczane przez namagnesowaną kolumnę w celu wzbogacenia próbki o limfocyty T specyficzne dla epitopów związanych z tetramerem. Na koniec komórki są barwione pod kątem pożądanych eksperymentalnych markerów komórkowych i przeprowadzana jest wieloparametrowa cytometria przepływowa w celu wykrycia i ilościowego określenia rzadkich populacji limfocytów T wzbogaconych w epitopy wzbogacone tetramerem. Główną zaletą stosowania tej techniki w porównaniu z innymi istniejącymi metodami, takimi jak transgeniczny system transferu adopcyjnego komórek T TCR, jest to, że badania są przeprowadzane na rzeczywistych populacjach poliklonalnych limfocytów T specyficznych dla epitopów, które rozwijają się naturalnie w układzie odpornościowym.

Co więcej, wysoka czułość detekcji zapewniana przez tę technikę umożliwia badanie tych populacji, gdy są one obecne na ekstremalnie niskich częstotliwościach. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na wiele kluczowych pytań z dziedziny immunologii, takich jak to, ile naiwnych limfocytów T może rozpoznać dany antygen z drobnoustroju chorobotwórczego oraz jak zmienia się skład klonalny populacji limfocytów T specyficznych dla epitopu w trakcie odpowiedzi immunologicznej. Przed rozpoczęciem sekcji dodaj jeden mililitr kompletnej pożywki EHAA do 60-milimetrowej pożywki hodowlanej zawierającej mały kwadrat nylonowej siatki o grubości 100 mikronów i umieść naczynie na lodzie.

Następnie usuń śledzionę z myszy poddanej eutanazji i jak najwięcej łatwo dostępnych węzłów chłonnych. Umieść chusteczki na nylonowej siatce w naczyniu hodowlanym. Użyj płaskiej górnej części zamkniętej 1,5-milimetrowej rurki z mikrofugą, aby delikatnie zetrzeć tkanki limfatyczne na nylonowej siatce.

Aby uwolnić limfocyty, dodaj kolejny mililitr pożywki do naczynia, a następnie pipetuj roztwór w górę iw dół, aby przekształcić komórki w zawiesinę. Teraz umieść nową nylonową siatkę na świeżej 15-mililitrowej probówce wirówkowej z polipropylenu, a następnie przenieś komórki przez nową siatkę. Opłucz naczynie i zetknij się z kolejnym mililitrem zimnego podłoża i przeciągnij objętości przez nowy kawałek siatki do 15-mililitrowej tubki.

Powtórz płukanie jeszcze raz. Po dodaniu buforu do sortowania na zimno do końcowej objętości 15 mililitrów, odwirować probówkę przez pięć minut w temperaturze 300 razy G i czterech stopniach Celsjusza. Następnie ostrożnie zassaj snat resus.

Zawiesić osad komórkowy w bloku FC do końcowej objętości równej w przybliżeniu dwukrotności objętości samego pastylki. Jeśli wystąpił duży stopień zlepiania się komórek. Ostrożnie usuń grudkę komórek za pomocą końcówki pipety, aby wybarwić limfocyty T specyficzne dla antygenu.

Dodaj znakowany fluorescencyjnie peptyd tetramer MHC do zawieszonego osadu komórkowego w zoptymalizowanym stężeniu. Następnie wymieszać zawiesinę komórkową i inkubować w optymalnym czasie i temperaturze w celu wiązania tetrameru. Następnie dodaj bufor do sortowania na zimno, aby zwiększyć objętość do 15 mililitrów i odwiruj, utrzymując komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Od teraz ostrożnie odsysaj supernatant. Następnie ponownie zawieś granulat komórkowy w buforze sortera do końcowej objętości 200 mikrolitrów. Teraz dodaj 50 mikrolitrów mikrogranulek sprzężonych z przeciwciałami mil tenny, które specyficznie zwiążą się ze znacznikiem fluorescencyjnym mieszanki tetramerów, a następnie inkubuj komórki i kulki związane z tetramerem w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po 20 minutach umyj komórki w buforze sortującym, podczas gdy komórki znajdują się w wirówce. Umieść kolumnę magnetyczną milani LS na magnesie quadro max i umieść nową 15-mililitrową polipropylenową probówkę wirówkową. Bezpośrednio pod kolumną dodaj trzy mililitry bufora sortującego na górę kolumny, umożliwiając mu spłynięcie do rurki o pojemności 15 mililitrów.

Następnie umieść kwadrat z nylonowej siatki o grubości 100 mikronów na szczycie kolumny. Gdy komórki zakończą wirowanie, ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić granulat w trzech mililitrach bufora sortera, przenieść zawiesinę komórek przez nylonową siatkę na górę kolumny. Gdy zawiesina komórek całkowicie spłynie do kolumny, przepłucz oryginalną probówkę kolejnymi trzema mililitrami buforu sortera i przenieś przez siatkę na kolumnę.

Zbierając pranie w tubie zbiorczej, wyrzuć nylonową siatkę. Następnie, gdy bufor całkowicie spłynie do probówki, umyj kolumnę jeszcze dwa razy trzema mililitrami buforu sortującego za każdym razem. Następnie zdejmij kolumnę z magnesu i umieść kolumnę nad nową 15-mililitrową polipropylenową probówką wirówkową.

Teraz dodaj kolejne pięć mililitrów bufora sortującego do kolumny. Natychmiast włóż tłok do górnej części kolumny i jednym ciągłym ruchem popchnij tłok całkowicie w dół, wypychając bufor z kolumny do rurki. Po odwirowaniu zarówno probówki zawierającej frakcję związaną, której wymykała się, jak i probówki zawierającej przepływ przez frakcję niezwiązaną, ostrożnie odessać supernatant z frakcji związanej i ponownie zawiesić osad komórkowy w buforze sortera do końcowej objętości dokładnie 95 mikrolitrów, zassać i ponownie zawiesić frakcję niezwiązaną do końcowej objętości dwóch mililitrów przed dalszym barwieniem frakcji komórek, Dodaj 200 mikrolitrów koralików do liczenia do pięciomililitrowej rurki faksowej i przenieś pięć mikrolitrów komórek do tej probówki.

Odłóż te probówki na bok w temperaturze czterech stopni Celsjusza do analizy. Później połącz główną mieszankę przeciwciał, aby zabarwić markery powierzchniowe na komórkach zgodnie z tabelą. W przypadku frakcji związanej dodać dawkę koktajlu przeciwciał bezpośrednio do komórek dla frakcji niezwiązanej.

Przenieść 90 mikrolitrów komórek do pięciomililitrowej rurki faksowej i dodać dawkę koktajlu przeciwciał do przeniesionej próbki dla każdego fluorochromu, który ma być użyty. Wymieszać 50 mikrolitrów pozostałej niezwiązanej frakcji komórek w pięciomililitrowej probówce faksowej z jednym mikrolitrem przeciwciała anty CD four sprzężonego z odpowiednim fluorochromem. Odłóż na bok niebarwioną kontrolę, a następnie inkubuj wszystkie próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut.

Następnie, po umyciu każdej probówki w pięciu mililitrach buforu sortera, należy ostrożnie odessać supernatant z próbek frakcji związanej i ponownie zawiesić komórki w 200 mikrolitrach buforu sortera. Przenieś komórki do mikroprobówek o pojemności 1,2 mililitra, przefaksuj mikroprobówki, a następnie przepłucz ich poprzednie probówki kolejnymi 200 mikrolitrami bufora sortującego, łącząc płukanki z odpowiednimi mikroprobówkami. Jeśli widoczne są grudki, przepuść komórki przez filtr 50 mikronów dla frakcji niezwiązanej i kontroli kompensacji, zdekantuj supernatant i ponownie zawieś granulki w jednym mililitrze bufora sortującego.

Analizuj barwione próbki przy użyciu sekwencji kolejnych bramek inkluzyjnych w celu identyfikacji CD czterech dodatnich lub CD ośmiu dodatnich limfocytów T, jak pokazano tutaj dla próbek frakcji związanej. Zbierz jak najwięcej komórek, maksymalnie do 2 milionów całkowitych zdarzeń dla próbek frakcji niezwiązanej. Zbierz łącznie 1 milion wydarzeń.

Na koniec, korzystając z tych samych ustawień maszyny, zbierz 10 000 zdarzeń z próbek zliczających ściegi. Ten pierwszy rysunek PRZEDSTAWIA reprezentatywne wykresy cytometrii przepływowej peptydu MHC dwóch tetramerów wzbogaconych w śledziony i węzły chłonne próbek od naiwnych myszy dla związanych i niezwiązanych frakcji komórek. Ustawiono szereg bramek, aby wybrać rozproszenie limfoidalne, dodatnie rozproszenie boczne z ujemnym CD o niskim zrzucie, trzy pozytywne zdarzenia tych CD, cztery dodatnie lub CD osiem pozytywnych zdarzeń bramkowano w celu analizy limfocytów T specyficznych dla epitopów lub barwienia tła.

Podwielokrotności niebarwionych komórek z frakcji związanych i niezwiązanych zmieszano z fluorescencyjnymi kulkami do liczenia i analizowano oddzielnie. Te wykresy gęstości przedstawiają reprezentatywne dane dla myszy uprzednio immunizowanych odpowiednim peptydem i pełnym adiuwantem. Ta sama strategia bramkowania szeregowego, co w poprzednim eksperymencie, została użyta do usunięcia wszelkich autofluorescencji i innych niepożądanych zdarzeń.

Z analizy populacji limfocytów T CD z czterema dodatnimi, populacja limfocytów T z dodatnim wynikiem CD 8 służyła jako użyteczna wewnętrzna kontrola negatywna dla barwienia peptydów MHC dwoma tetramerami limfocytów T CD czterech. Bezwzględną liczbę limfocytów T specyficznych dla epitopów w próbce oblicza się przez pomnożenie całkowitej liczby wszystkich komórek we frakcji związanej wzbogaconej próbki, określonej na podstawie analizy liczby kulek, przez proporcję tych komórek, które są tetramerycznie dodatnie, określoną na podstawie analizy barwienia komórek dla reprezentatywnych danych dotyczących myszy naiwnych pokazanych w pierwszej serii wykresów gęstości, Całkowita liczba komórek wynosiła 4 411, a liczba koralików wynosiła 5 589. Stężenie bulwy wynosił dwa razy od 10 do jednej piątej na mililitr.

Objętość kulki wynosiła 0,2 mililitra, a objętość ogniwa 0,005 mililitra. W ten sposób dane te wykorzystano do wygenerowania stężenia komórek 6,31 razy od 10 do jednej szóstej na mililitr. Stężenie komórek zostało następnie pomnożone przez całkowitą objętość próbki, aby uzyskać całkowitą liczbę komórek.

Dane te z kolei pomnożono przez procent pozytywnych zdarzeń tetrameru z analizy komórek, aby ustalić, że liczba specyficznych dla epitopu CD czterech dodatnich limfocytów T od tej naiwnej myszy wynosiła 98. Dla reprezentatywnych danych z immunizowanych myszy w drugiej serii wykresów gęstości, całkowita liczba specyficznych dla epitopów CD czterech dodatnich limfocytów T wynosiła 1,53 razy 10 do czwartego. Skuteczność wzbogacania spada wraz ze wzrostem liczby limfocytów T specyficznych dla epitopów.

Tak więc komórki tetramerowo-dodatnie można zobaczyć w niezwiązanej frakcji próbek zawierających bardzo wysokie częstotliwości komórek T specyficznych dla epitopów. W takich przypadkach liczbę limfocytów T specyficznych dla epitopów obecnych we frakcji niezwiązanej można obliczyć osobno i dodać do liczby znajdującej się we frakcji związanej. Na przykład w reprezentatywnej immunizowanej frakcji niezwiązanych komórek myszy całkowita liczba specyficznych dla epitopu CD czterech dodatnich limfocytów T wynosiła 8,97 razy 10 do trzeciej.

Tak więc, dodając liczby w frakcjach związanych i niezwiązanych, w całej immunizowanej próbce myszy było 2,43 razy 10 do czwartej całkowitej liczby specyficznych dla epitopu CD czterech dodatnich limfocytów T. Rzeczywiście, jeśli ekspansja komórek specyficzna dla epitopu jest wystarczająco silna, proces wzbogacania można pominąć. Po procedurze wzbogacania można przeprowadzić etapy samoutrwalania i przenikania, aby umożliwić barwienie białek wewnątrzkomórkowych, takich jak cytokiny i czynniki transkrypcyjne.

Chociaż metoda ta została pierwotnie zaprojektowana do badań limfocytów T ze śledziony i węzłów chłonnych, może być również stosowana do innych tkanek, takich jak grasica i jelito. Technika ta może być również stosowana do badania limfocytów T specyficznych dla epitypu w próbkach ludzkiej krwi i tkanek.