Optyczne pułapkowanie nanocząsteczek

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie układu do aperturowego chwytania optycznego w celu uwięzienia cząstek o rozmiarze około 20 nanometrów. W tym celu do istniejącego układu laserowego chwytania optycznego dodaje się detektor, aby umożliwić pomiar. Następnie mierzony roztwór nanocząstek jest dozowany do komory mikroprzepływowej z podwójną pułapką z nanootworami, a komora jest umieszczana w układzie do chwytania optycznego.

Gdy cząsteczka wnika do oświetlonego otworu, transmisja światła gwałtownie wzrasta z powodu obciążenia dielektrycznego. Jeśli cząsteczka próbuje opuścić otwór, zmniejszona transmisja powoduje zmianę pędu skierowaną na zewnątrz otworu, co zgodnie z trzecią zasadą dynamiki Newtona skutkuje siłą wciągającą cząsteczkę z powrotem do otworu, prowadząc do jej uwięzienia. Cząsteczka powoduje przesunięcie krzywej transmisji w stronę czerwieni, co można monitorować.

W związku z tym pułapka może pełnić funkcję czujnika. Ostatecznie można uzyskać wyniki wykazujące zdarzenia wychwytywania nanocząstek, w tym rozwijanie się uwięzionych białek, co objawia się zmianami natężenia lasera przechodzącego przez podwójny nanootwór. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak optyczne pułapkowanie siłą gradientową, jest możliwość wychwytywania mniejszych nanocząstek przy niższych natężeniach lasera.

Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biochemii, takie jak: w jaki sposób pojedyncze białka zwijają się i oddziałują ze sobą oraz jak cząsteczki wirusów infekują żywe komórki? Zazwyczaj osoby korzystające z tej metody napotykają trudności ze względu na skomplikowaną integrację podwójnej nanopory z istniejącym systemem pułapkowania laserowego. Układ pułapkowania optycznego oparto na zestawie pęset optycznych firmy Thor Labs, wyposażonym w moduł pomiaru siły.

Fotodioda lawinowa jest wykorzystywana do zastąpienia detektora kwadrantowego w module pomiaru siły. Podczas konfiguracji układu pułapki optycznej należy nosić ochronę oczu zawsze, gdy laser jest włączony. Należy upewnić się, że wiązka będzie ograniczona do bezpiecznego obszaru poprzez pracę w zamkniętym pomieszczeniu i maksymalne ograniczenie wiązki w obrębie układu pułapki; należy unikać noszenia odblaskowej biżuterii.

Należy założyć rękawiczki lateksowe. Aby zapewnić czystość układu optycznego, przygotuj zestaw do pęsety optycznej oraz moduł pomiaru siły. Zgodnie z instrukcjami producenta, zmontowany zestaw pęsety optycznej posiada konstrukcję odwróconego mikroskopu świetlnego i składa się z następujących elementów: lasera pułapkującego, obiektywu imersyjnego olejowego 100 x, trójosiowego stołu do pozycjonowania próbek oraz kamery CCD.

Należy pamiętać, że podczas pracy z diodami laserowymi zaleca się stosowanie ochrony przed wyładowaniami elektrostatycznymi. Moduł pomiaru siły umożliwia kalibrację pęsety optycznej przy użyciu detekcji pozycyjnej tylnej płaszczyzny ogniskowej kondensora. Zamiast modułów pomiaru siły stosuje się detektor fotodiodowy lawinowy na bazie krzemu lub fotodiodę PD.

Detektor pozycji kwadrantowej zawiera również filtr rezystorowo-kondensatorowy (filtr RC) składający się z rezystora 200 kΩ i kondensatora 100 pF. Jest on wykorzystywany do redukcji szumów wysokoczęstotliwościowych oraz ułatwienia obserwacji zdarzeń pułapkowania na oscyloskopie. Użyj kabla koncentrycznego, aby podłączyć filtr RC za detektorem APD. Następnie za pomocą kabli koncentrycznych i adaptera T podłącz oscyloskop oraz moduł akwizycji danych do filtra RC.

System jest teraz gotowy do wprowadzenia próbki. Podwójna nanoapertura składa się z dwóch nano-otworów wykonanych w złotej folii za pomocą skupionej wiązki jonów. Folia ma grubość 100 nanometrów i jest wsparta na szklanym podłożu.

Nanootwory nakładają się na siebie, tworząc dwa ostre wierzchołki. Nanocząstki zostaną uwięzione w szczelinie między tymi wierzchołkami przez światło lasera. Pada ono na podwójny nanootwór.

W warstwie metalicznej należy również wyfrezować duże elementy pasowania, aby ułatwić lokalizację podwójnego nanootworu w mikroskopie optycznym. Elementy te powinny znajdować się w odległości około 100 mikronów od podwójnego nanootworu. Do jednorazowego kubka wlej 10 g bazy polidimetylosiloksanu (PDMS) oraz 1 g utwardzacza. Mieszaj przez kilka minut.

Następnie odgazuj mieszaninę w komorze próżniowej, aż do całkowitego usunięcia pęcherzyków powietrza. Dalej wlej 1,5 g PDMS do czystej płytki Petri o średnicy dziewięciu centymetrów. Naniesiesz PDMS na dno płytki Petri metodą spin coatingu z prędkością 950 RPM przez 65 sekund.

Grubość nie jest krytyczna, o ile nie przekracza 80 mikronów. Delikatnie ułóż od trzech do pięciu szkiełek nakrywkowych nr 1,5 na PDMS w taki sposób, aby nie nachodziły na siebie, a następnie poddaj ewakuacji przez 30 minut.

Jeśli podczas ewakuacji szkiełkach przykrywkowych przesunęły się i nałożyły na siebie, ostrożnie je rozdziel. Należy upewnić się, że warstwa PDMS pod szkiełkami przykrywkowymi pozostaje cienka i jednorodna. Następnie ponownie poddajy szalkę Petriego próżni przez 30 minut.

Wyjmij szalkę Petriego z komory próżniowej i podgrzewaj ją na płycie grzejnej przez 20 minut w temperaturze 85 °C, aby utwardzić PDMS. Po zestaleniu się PDMS użyj żyletki, aby przeciąć materiał wzdłuż krawędzi jednego z szkiełek podstawowych. Następnie, używając pęsety z cienkimi końcówkami lub ostrza, delikatnie podważ szkiełko; cienka warstwa PDMS pozostanie przylegająca do szkiełka podstawowego.

Umieść szkiełko nakrywowe z PDMS w nowej płytce Petriego. Następnie, używając żyletki, wytnij w PDMS okno o wymiarach 3 mm na 3 mm. Okno to utworzy komorę, w której będzie przechowywany roztwór nanocząsteczek.

Użyj wycinarki laserowej do wykonania akrylowego uchwytu na szkiełka mikroskopowe z otworem o średnicy trzech czwartych cala w centrum. Oklej obwód otworu taśmą dwustronną. Użyj żyletki, aby usunąć nadmiar taśmy.

Umieść wykonane szkiełko przedmiotowe na jednej z przygotowanych szkiełek nakrywkowych powlekonych PDMS w taki sposób, aby PDMS znajdował się pomiędzy szkłem a akrylem. Za pomocą mikropipety dodaj kilka kropli 0,05% w/v roztworu nanokulek polistyrenowych do okna z PDMS.

Nanieś kroplę na warstwę złota w miejscu, w którym znajdują się nanootwory. Umieść próbkę złota na szkiełkach nakrywkowych tak, aby nanootwory znajdowały się wewnątrz okna z PDMS. Upewnij się, że w komorze nie ma pęcherzyków powietrza.

Następnie dociśnij złotą próbkę do szkiełka nakrywki. Usuń nadmiar roztworu za pomocą chusteczki, ponieważ użyty zostanie obiektyw imersyjny. Nałóż kroplę oleju po drugiej stronie szkiełka nakrywki, na obszarze okna PDMS.

Zwróć uwagę na położenie nano-otworów. Włóż preparat do uchwytu na preparaty stroną z olejkiem skierowaną w dół, a następnie opuść uchwyt, aż olejek immersyjny zetknie się z obiektywem mikroskopu.

Cel: w przybliżeniu ustawić stolik z preparatem tak, aby znaki rejestracyjne wyfrezowane w złotej folii znajdowały się pod obiektywem. Używając oprogramowania do akwizycji obrazu, takiego jak Thorsight, które wchodzi w skład zestawu do pułapkowania, zlokalizować znaki rejestracyjne na złotej folii i podążać wzdłuż linii wskaźnikowych do nanodziurek.

Ustaw preparat tak, aby znaczniki wskaźnikowe i inne obszary otwarte znajdowały się poza centrum ekranu. Nadmierna transmisja światła może uszkodzić A PD; włącz laser. Ponieważ lustro dichroiczne nie jest idealne, w pobliżu centrum ekranu powinna pojawić się plamka z wiązki laserowej.

Używając oprogramowania do sterowania stolikiem piezoelektrycznym, należy dalej precyzyjnie dostroić wyrównanie na wszystkich trzech osiach. Gdy wyrównanie będzie prawidłowe, zaobserwowane zostanie maksymalne napięcie PD, co będzie wskazywać na najwyższą transmisję przez nanoaperturę.

Po skonfigurowaniu systemu i załadowaniu próbki można przystąpić do pozyskiwania danych z pułapkowania optycznego. Pomocą się w znacznikach wskaźnikowych ustaw wiązkę w pobliżu znanej lokalizacji nanootworu. Podwójne nanootwory będą zbyt małe, aby można było je wyraźnie rozdzielić, i będą widoczne na ekranie jako małe kropki.

Transmisja światła przez próbkę jest wskazywana przez poziom sygnału na oscyloskopie. Należy dalej ustawiać próbkę tak, aby zmaksymalizować transmisję światła. Należy uważać na oznaczenia wskaźnikowe oraz widoczne i niewidoczne rysy, ponieważ w tych obszarach transmisja światła będzie wysoka; nanootwory będą objawiać się gwałtownymi skokami transmisji światła, w przeciwieństwie do rys.

Wprowadzaj bardziej stopniowe zmiany za pomocą płytki falowej. Dostrój polaryzację światła, aby uzyskać najwyższą transmitancję, ponieważ struktura podwójnych nanootworów jest spolaryzowana. W celu pozyskania danych próbkuj napięcie APD za pomocą modułu akwizycji danych przez żądany czas.

Czasy akwizycji wynoszą zazwyczaj od kilkudziesięciu do kilkuset sekund. W tym przypadku do akwizycji danych wykorzystano specjalistyczne oprogramowanie, a napięcie próbkowano z częstotliwością 2000 razy na sekundę. Za pomocą programu MATLAB przefiltrowano pozyskane dane przy użyciu filtru KY Gole i naniesiono je na wykres w funkcji czasu, aby wykazać pułapkowanie 20 nanometrowych nanocząstek polistyrenowych; transmisja przez podwójny nanootwór była mierzona w funkcji czasu.

Następnie wykreślono transmitancję optyczną za pomocą fotodiody (PD). W czasie zdarzenie uwięzienia ma charakter gwałtowny, z ostrym zboczem wskazującym na wyraźne przełączenie między dwoma poziomami mocy transmitowanej, co pokazano w tym przykładzie; często w stanie uwięzienia następuje wzrost szumu sygnału. Wzrost szumu ten wynika z ruchów brownowskich uwięzionej cząsteczki.

Należy zauważyć, że bez uwięzionej cząsteczki źródło szumu to nie występuje. W wynikach mogą pojawić się artefakty, które nie wskazują na zdarzenia uwięzienia. Wyniki wykazujące dryf, widoczny jako powolne zmiany transmisji w okresie kilku minut, tak jak pokazano tutaj, powinny zostać odrzucone. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak spektroskopia Ramanowska i fluorescencyjna, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące natury uwięzionej nanocząsteczki po jej rozwinięciu.

Technika ta utorowała drogę badaczom do analizy biologicznie istotnych nanocząsteczek na poziomie pojedynczych cząsteczek. Przykładowo, umożliwia wykrywanie wiązania białek oraz badanie infekcji wirusowych, w obu przypadkach na poziomie pojedynczej cząsteczki. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak zintegrować podwójną pułapkę optyczną nho z systemem laserowym mikroskopu odwróconego w celu chwytania pojedynczych nanocząsteczek.