Mikrogaważ larw danio pręgowanego

Ogólnym celem niniejszej procedury jest podanie materiałów drogą doustną do światła jelita larw danio pręgowanego. Najpierw larwy zostają znieczulone i umieszczone na formie do iniekcji wyłożonej metylocelulozą. Następnie larwy są delikatnie zanurzane w formie i ustawiane zgodnie z kątem igły do zgłębnika oraz mikromanipulatora.

Następnie igłę wprowadza się do otworu gębowego larwy i manewruje w kierunku bańki jelitowej. Po dotarciu na miejsce materiał uwalnia się do światła jelita. Ostatnim krokiem jest wyjęcie larwy z metylocelulozy i umieszczenie jej w świeżej pożywce w celu wybudzenia z anestezji.

Ostatecznie metoda ta może być wykorzystana do dostarczania substancji bezpośrednio do światła jelita larw zebrafish, co pozwala na badanie transportu w obrębie jelita lub w tkankach pozajelitowych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak zanurzenie w wodzie zawierającej interesującą substancję, jest możliwość rygorystycznej kontroli ilości dostarczonego materiału, jak również czasu i dawkowania. Zmniejsza to zmienność eksperymentalną, a w niektórych przypadkach toksyczność związaną z określonymi substancjami.

Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy napotkaliśmy trudności z aplikacją niektórych sond fluorescencyjnych w stężeniach wystarczająco wysokich, aby były one wykrywalne w nabłonku jelitowym za pomocą mikroskopii. Wysokie stężenia niekiedy prowadzą do śmierci ryb, a mimo to nie zapewniają sygnału fluorescencyjnego wystarczająco silnego do obrazowania. Na początek należy wyciągnąć kilka igieł do zgłębnikowania za pomocą wyciągacza do mikropipet oraz pożyczyć kapilary z krzemionkowego szkła.

Przenieś próbkę pod mikroskop stereoskopowy w celu przycięcia igieł. Najpierw wyrównaj końcówkę igły z końcem przezroczystej linijki lub rastra. Po wyrównaniu użyj precyzyjnych pęset zegarmistrzowskich, aby odciąć igłę około jednego milimetra od końcówki.

Obejrzyj końcówkę igły przy 100-krotnym powiększeniu. Średnica igły powinna wynosić od 27 do 30 µm, a końcówka powinna być tępą. Aby uzyskać bardziej powtarzalne wyniki, należy unikać igieł ostrych lub poszarpanych.

Mikropiec może zostać wykorzystany do lepszej kontroli punktu przycięcia igły oraz do polerowania igły w ogniu. Wskazówki dotyczące usuwania ostrych krawędzi. Następnie należy przygotować roztwór do gavage.

W większości zastosowań dodaje się czerwień fenolową, aby ułatwić wizualizację mikroinjektora i umieszczenie roztworu do zgłębnikowania. Po napełnieniu olejem mineralnym zamocuj igłę do zgłębnikowania w jednostce do mikroiniekcji nano jet two. Owiń plastikową szalkę Petriego o średnicy 10 centymetrów folią biofilm, aby uzyskać płaską, wodoodporną powierzchnię, i nanieś około 2 µl roztworu do zgłębnikowania na parafilm.

Kolejnym krokiem jest ręczne napełnienie igły do gavage. Należy uważać, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza do oleju mineralnego. Aby skalibrować objętość wyrzutu, należy wstrzykiwać małe kropelki do małej szalki Petriego wypełnionej olejem mineralnym, aż będą one miały jednolity rozmiar, a następnie zmierzyć średnicę kropel za pomocą analizy graficznej i obliczyć ich objętość.

Zależność spójności między igłami przedstawiono tutaj. Przed użyciem igły do zgłębnikowania należy usunąć wszelkie pozostałości oleju mineralnego, płukąc ją w czystym medium dla zebrafish. Po ogrzaniu formy aros należy pokryć trzy rowki 3% metylocelulozą. Rowek powinien być pokryty w stopniu wystarczającym do utrzymania ryby, ale nie tak małą ilością, aby metyloceluloza szybko wyschła.

Następnie do otworów płytki sześciodołkowej należy nalać około 4 mL medium dla rybek danio, a następnie przenieść larwy rybek danio z każdej grupy eksperymentalnej do osobnych dołków. W celu znieczulenia ryb należy przygotować trzykrotny roztwór tricainu w odpowiednim medium dla rybek danio.

Zanurzyć ryby w znieczuleniu, mieszcząc taką samą objętość roztworu trica z medium i delikatnie zakręcając naczyniem. Gdy tylko ryby przestaną się poruszać, za pomocą szerokiej pipety Pasteura przenieść je pojedynczo na metylocelulozę, układając ich głowy pod kątem 45 stopni w rowku, a ogony w stronę kąta 90 stopni. Używając tępej sondy do sekcji, delikatnie docisnąć każdą larwę do metylocelulozy, aby ustabilizować ich pozycję.

Następnie ustaw urządzenie do mikroiniekcji nano jet two tak, aby igła była nachylona pod niewielkim kątem. Upewnij się, że zakres wysuwania będzie wystarczający, aby dotrzeć poza dno studzienki. Aby zminimalizować potrzebę późniejszych korekt, ustaw jednostkę mikroiniekcyjną na podawanie 4,6 nanolitrów przy użyciu ustawienia powolnej iniekcji (slow inject), trzymając jedną rękę w celu wprowadzania niewielkich poprawek w położeniu płytki z unieruchomionymi larwami, a drugą rękę do sterowania mikromanipulatorem jednostki mikroiniekcyjnej.

Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ danio prążkowane są bardzo małe i łatwo ulegają uszkodzeniu. Identyfikacja struktury przełyku pod stereomikroskopem oraz określenie odpowiedniej siły nacisku na igłę do zgłębnikowania w celu dotarcia do światła jelita wymagają praktyki. W pierwszej kolejności ostrożnie wprowadź igłę do zgłębnikowania do pyska znieczulonej ryby.

Przejdź przez przełyk i lekko naciśnij zwieracz przełyku, aby wprowadzić końcówkę tuż za przednią ścianę jelita. Po wprowadzeniu do przedniej opuchłości (anterior bulb) delikatnie podaj materiał przy tych ustawieniach. Podana objętość powinna jedynie wypełnić przednią opuchłości jelita i nie powinna wyciekać przez przełyk ani kloakę.

Szybko i płynnie wycofaj igłę. Uważaj, aby nie uwolnić znacznych ilości materiału do przełyku. Po wyjęciu igły do gavage'u przenieś rybę do naczynia zawierającego świeże medium.

Wyprowadź larwy z narkozy i usuń metylocelulozę, płucząc je kilkukrotnie w świeżej pożywce. Przenieś larwy do szalki Petriego lub płytki 6-dołkowej do czasu dalszego użycia. W późniejszych analizach można zastosować mikrozgłębnik do wprowadzania różnych materiałów do organizmów badawczych rybek zebropławów.

Na początek należy przygotować niezbędne roztwory do zgłębnika, aby zademonstrować tę metodę. Do analizy szczelności bariery nabłonka jelitowego wykorzystuje się dekstran 10 KD sprzężony z Texas. Red.

Postępując zgodnie z omówionymi wcześniej krokami, wykonaj zgłębnikowanie grup od 10 do 20 larw zebrafish dla każdego stanu doświadczalnego. Jeśli to możliwe, powtórz tę procedurę na grupach dubletowych lub tripletowych. Po zgłębnikowaniu doprowadź larwy do wybudzenia z anestezji i pozwól im na swobodne pływanie w świeżym medium.

Po około 20 minutach ponownie znieczul larwy w sposób opisany wcześniej. Po znieczuleniu umieść larwy w 3% metylocelulozie na bloku z 3% agarozy; obrazuj larwy za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego z filtrem Texas red, wybierając takie powiększenie, aby widoczne były larwy od pyska do obszaru bezpośrednio za końcem kloaki. Fluorescencja powinna być intensywna w świetle jelita.

Niemniej jednak, funkcję bariery ocenia się na podstawie poziomu dekstranu, który pojawia się w tkankach pozajelitowych; należy dostosować ekspozycję, aby umożliwić wizualizację fluorescencji tułowia. Nawet jeśli prowadzi to do prześwietlenia fluorescencji światła jelita podczas podania samego dekstranu, jest on zatrzymywany w świetle jelita. Jednak w przypadku larw poddanych działaniu EDTA, który rozluźnia połączenia ścisłe nabłonka, dekstran jest widoczny w krążeniu oraz w naczyniach i przestrzeniach międzytkankowych.

W tych przykładach program Image J został wykorzystany do ilościowego oznaczenia względnej średniej fluorescencji w obszarze zainteresowania (ROI) w tułowiu danio pręgowanego, a następnie znormalizowano ją względem ROI znajdującego się poza rybą jako kontroli wewnętrznej. Tutaj wyniki uzyskane przy użyciu zwykłej igły zestawiono z wynikami otrzymanymi za pomocą igły z mikrokuźni. Mniejsza liczba larw w grupie z samą dekstryną wykazywała fluorescencję poza układem pokarmowym, co sugeruje, że igły z mikrokuźni rzadziej powodują uszkodzenia larw.

Przy bliższym przyjrzeniu się jednemu z obszarów, dekstran ponownie znajduje się wyłącznie w świetle jelit, nie przenikając do naczyń krwionośnych ani przestrzeni pozajelitowych. W przypadku braku EDTA, podczas gdy przy zastosowaniu EDTA dekstran jest obserwowany w przestrzeniach pozajelitowych oraz w świetle aorty grzbietowej i tylnej żyły głównej, sygnał krwi w tym miejscu wynika z przepływu krwi. Podczas wykonywania tej procedury należy upewnić się, że igła nie ma poszarpanych krawędzi, że ryby są odpowiednio ustawione i stabilnie unieruchomione w metylocelulozie, a także zachować ostrożność i cierpliwość podczas nauki wprowadzania igły przez przełyk larwy.

Technikę tę można wykorzystać w szerokim zakresie zastosowań u danio pręgowanego, które wymagają kontrolowanego wprowadzania lub wizualizacji materiałów w obrębie jelita. Pozwala ona na ścisłą kontrolę czasu, drogi i dawki podawania substancji do organizmu zwierzęcia, co znacząco redukuje zmienność w obrębie jednego doświadczenia oraz pomiędzy różnymi eksperymentami.