Name: Mikrozgłębnik larw danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Poznaj metodę mikrozgłębnika larw danio pręgowanego do precyzyjnego podawania substancji do światła jelita. Technika umożliwia kontrolowane badanie transportu w jelicie i tkankach pozajelitowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom laboratorium Rawlsa za pomocne sugestie dotyczące treści oraz dr. Alanowi Fanningowi za cenne dyskusje na temat przepuszczalności rozmiarowej połączeń ścisłych i metod ich naruszania. Dziękujemy również dr. Michaelowi Chui oraz dr. Nealowi Kramarcy z Michael Hooker Microscopy Facility za wsparcie w zakresie mikroskopii konfokalnej. Praca ta była finansowana z grantów National Institutes of Health T32 DK007737-15 (dla stażysty J.L.C.), F32 DK094592 (dla J.L.C.) oraz R01 DK081426 (dla J.F.R.).

<ol><li>Kuhlman, J., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screen+for+mutations+affecting+development+and+function+of+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Genetic screen for mutations affecting development and function of the enteric nervous system.</a> Dev. Dyn. 236, 118-127 (2007).</li>
<li>Pack, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+affecting+development+of+zebrafish+digestive+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mutations affecting development of zebrafish digestive organs.</a> Development. 123, 321-328 (1996).</li>
<li>Wallace, K. N., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+and+conserved+aspects+of+gut+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Unique and conserved aspects of gut development in zebrafish.</a> Dev. Biol. 255, 12-29 (2003).</li>
<li>Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+growth+and+differentiation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Intestinal growth and differentiation in zebrafish.</a> Mech. Dev. 122, 157-173 (2005).</li>
<li>Ng, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+digestive+system+in+zebrafish%3A+III.+Intestinal+epithelium+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Formation of the digestive system in zebrafish: III. Intestinal epithelium morphogenesis.</a> Dev. Biol. 286, 114-135 (2005).</li>
<li>Hama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+zebrafish+digestive+organ+function+using+multiple+quenched+fluorescent+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of zebrafish digestive organ function using multiple quenched fluorescent reporters.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 296, 445-453 (2009).</li>
<li>Carten, J. D., Bradford, M. K., Farber, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+digestive+organ+morphology+and+function+using+differential+fatty+acid+metabolism+in+live+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualizing digestive organ morphology and function using differential fatty acid metabolism in live zebrafish.</a> Dev. Biol. 360, 276-285 (2011).</li>
<li>Rich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+high-content+model+system+for+studies+of+gastrointestinal+transit%3A+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol+Motil%22%5BJournal%5D)">A new high-content model system for studies of gastrointestinal transit: the zebrafish.</a> Neurogastroenterol Motil. 21, 225-228 (2009).</li>
<li>Bagnat, M., Cheung, I. D., Mostov, K. E., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+single+lumen+formation+in+the+zebrafish+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic control of single lumen formation in the zebrafish gut.</a> Nat. Cell Biol. 9, 954-960 (2007).</li>
<li>Bagnat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cse1l+is+a+negative+regulator+of+CFTR-dependent+fluid+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cse1l is a negative regulator of CFTR-dependent fluid secretion.</a> Curr. Biol. 20, 1840-1845 (2010).</li>
<li>Shepherd, I., Eisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+zebrafish+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of the zebrafish enteric nervous system.</a> Methods Cell Biol. 101, 143-160 (2011).</li>
<li>Brugman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxazolone-induced+enterocolitis+in+zebrafish+depends+on+the+composition+of+the+intestinal+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Oxazolone-induced enterocolitis in zebrafish depends on the composition of the intestinal microbiota.</a> Gastroenterology. 137, 1757-1767 (2009).</li>
<li>Oehlers, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammatory+bowel+disease+%28IBD%29+susceptibility+genes+NOD1+and+NOD2+have+conserved+anti-bacterial+roles+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">The inflammatory bowel disease (IBD) susceptibility genes NOD1 and NOD2 have conserved anti-bacterial roles in zebrafish.</a> Dis. Model Mech. 4, 832-841 (2011).</li>
<li>Oehlers, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+enterocolitis+model+in+zebrafish+larvae+that+is+dependent+on+microbiota+and+responsive+to+pharmacological+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">A chemical enterocolitis model in zebrafish larvae that is dependent on microbiota and responsive to pharmacological agents.</a> Dev Dyn. 240, 288-298 (2011).</li>
<li>Faro, A., Boj, S. F., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fishing+for+intestinal+cancer+models%3A+unraveling+gastrointestinal+homeostasis+and+tumorigenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Fishing for intestinal cancer models: unraveling gastrointestinal homeostasis and tumorigenesis in zebrafish.</a> Zebrafish. 6, 361-376 (2009).</li>
<li>Fleming, A., Jankowski, J., Goldsmith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+gut+function+and+disease+changes+in+a+zebrafish+larvae+model+of+inflammatory+bowel+disease%3A+a+feasibility+study%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Bowel+Dis%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of gut function and disease changes in a zebrafish larvae model of inflammatory bowel disease: a feasibility study.</a> Inflamm. Bowel Dis. 16, 1162-1172 (2010).</li>
<li>Kanther, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+colonization+induces+dynamic+temporal+and+spatial+patterns+of+NF-kappaB+activation+in+the+zebrafish+digestive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Microbial colonization induces dynamic temporal and spatial patterns of NF-kappaB activation in the zebrafish digestive tract.</a> Gastroenterology. , (2011).</li>
<li>Rawls, J. F., Samuel, B. S., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gnotobiotic+zebrafish+reveal+evolutionarily+conserved+responses+to+the+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Gnotobiotic zebrafish reveal evolutionarily conserved responses to the gut microbiota.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4596-4601 (2004).</li>
<li>Rawls, J. F., Mahowald, M. A., Goodman, A. L., Trent, C. M., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+and+genetic+analysis+link+bacterial+motility+and+symbiosis+in+the+zebrafish+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging and genetic analysis link bacterial motility and symbiosis in the zebrafish gut.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7622-7627 (2007).</li>
<li>Kanther, M., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-microbe+interactions+in+the+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Host-microbe interactions in the developing zebrafish.</a> Curr. Opin. Immunol. 22, 10-19 (2010).</li>
<li>Bates, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+signals+from+the+microbiota+promote+different+aspects+of+zebrafish+gut+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinct signals from the microbiota promote different aspects of zebrafish gut differentiation.</a> Dev. Biol. 297, 374-386 (2006).</li>
<li>Cheesman, S. E., Guillemin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((We+know+you+are+in+there%3A+conversing+with+the+indigenous+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Microbiol%22%5BJournal%5D)">We know you are in there: conversing with the indigenous gut microbiota.</a> Res Microbiol. 158, 2-9 (2007).</li>
<li>Bates, J. M., Akerlund, J., Mittge, E., Guillemin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+alkaline+phosphatase+detoxifies+lipopolysaccharide+and+prevents+inflammation+in+zebrafish+in+response+to+the+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Intestinal alkaline phosphatase detoxifies lipopolysaccharide and prevents inflammation in zebrafish in response to the gut microbiota.</a> Cell Host Microbe. 2, 371-382 (2007).</li>
<li>Camp, J. G., Jazwa, A. L., Trent, C. M., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intronic+cis-regulatory+modules+mediate+tissue-specific+and+microbial+control+of+angptl4%2Ffiaf+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Intronic cis-regulatory modules mediate tissue-specific and microbial control of angptl4/fiaf transcription.</a> PLoS Genetics. , In Press (2012).</li>
<li>Cheesman, S. E., Neal, J. T., Mittge, E., Seredick, B. M., Guillemin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+proliferation+in+the+developing+zebrafish+intestine+is+regulated+by+the+Wnt+pathway+and+microbial+signaling+via+Myd88%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell proliferation in the developing zebrafish intestine is regulated by the Wnt pathway and microbial signaling via Myd88.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4570-4577 (2011).</li>
<li>Field, H. A., Kelley, K. A., Martell, L., Goldstein, A. M., Serluca, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gastrointestinal+physiology+using+a+novel+intestinal+transit+assay+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol.+Motil%22%5BJournal%5D)">Analysis of gastrointestinal physiology using a novel intestinal transit assay in zebrafish.</a> Neurogastroenterol. Motil. 21, 304-312 (2009).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%22">The Zebrafish Book</a>. , 4 edn, University of Oregon Press. (2000).</li>
<li>Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+generating+and+colonizing+gnotobiotic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish.</a> Nat. Protoc. 3, 1862-1875 (2008).</li>
<li>Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junction+pore+and+leak+pathways%3A+a+dynamic+duo%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tight junction pore and leak pathways: a dynamic duo.</a> Annu. Rev. Physiol. 73, 283-309 (2011).</li>
<li>Van Itallie, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+density+of+small+tight+junction+pores+varies+among+cell+types+and+is+increased+by+expression+of+claudin-2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">The density of small tight junction pores varies among cell types and is increased by expression of claudin-2.</a> J. Cell. Sci. 121, 298-305 (2008).</li>
<li>Van Itallie, C. M., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+size-dependent+permeability+of+the+tight+junction+using+PEG+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Measuring size-dependent permeability of the tight junction using PEG profiling.</a> Methods Mol. Biol. 762, 1-11 (2011).</li>
<li>Watson, C. J., Rowland, M., Warhurst, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+modeling+of+tight+junctions+in+intestinal+cell+monolayers+using+polyethylene+glycol+oligomers%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional modeling of tight junctions in intestinal cell monolayers using polyethylene glycol oligomers.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 281, 388-397 (2001).</li>
<li>Rodgers, L. S., Fanning, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+epithelial+permeability+by+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Regulation of epithelial permeability by the actin cytoskeleton.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 68, 653-660 (2011).</li>
<li>Gonzalez-Mariscal, L., Chavez de Ramirez, B., Cereijido, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junction+formation+in+cultured+epithelial+cells+%28MDCK%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Membr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tight junction formation in cultured epithelial cells (MDCK).</a> J. Membr. Biol. 86, 113-125 (1985).</li>
<li>Palant, C. E., Duffey, M. E., Mookerjee, B. K., Ho, S., Bentzel, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+regulation+of+tight-junction+permeability+and+structure+in+Necturus+gallbladder%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ca2+ regulation of tight-junction permeability and structure in Necturus gallbladder.</a> Am. J. Physiol. 245, C203-C212 (1983).</li>
<li>Holmberg, A., Schwerte, T., Pelster, B., Holmgren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+of+the+gut+motility+control+system+in+zebrafish+Danio+rerio+embryos+and+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ontogeny of the gut motility control system in zebrafish Danio rerio embryos and larvae.</a> J. Exp. Biol. 207, 4085-4094 (2004).</li>
<li>Rich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kit-like+immunoreactivity+in+the+zebrafish+gastrointestinal+tract+reveals+putative%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Kit-like immunoreactivity in the zebrafish gastrointestinal tract reveals putative.</a> 236, 903-911 (2007).</li>
<li>Holmberg, A., Olsson, C., Hennig, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TTX-sensitive+and+TTX-insensitive+control+of+spontaneous+gut+motility+in+the+developing+zebrafish+%28Danio+rerio%29+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">TTX-sensitive and TTX-insensitive control of spontaneous gut motility in the developing zebrafish (Danio rerio) larvae.</a> J. Exp. Biol. 210, 1084-1091 (2007).</li>
<li>Hennig, G. W., Costa, M., Chen, B. N., Brookes, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+peristalsis+in+the+guinea-pig+small+intestine+using+spatio-temporal+maps%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of peristalsis in the guinea-pig small intestine using spatio-temporal maps.</a> J. Physiol. 517 (Pt 2), 575-590 (1999).</li>
<li>Flynn, E. J. 3rd, Trent, C. M., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+and+nutritional+control+of+adipogenesis+in+zebrafish+%28Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Ontogeny and nutritional control of adipogenesis in zebrafish (Danio rerio.</a> J. Lipid Res. 50, 1641-1652 (2009).</li>
<li>Clifton, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+inhibitors+of+dietary+lipid+absorption+using+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of novel inhibitors of dietary lipid absorption using zebrafish.</a> PLoS One. 5, e12386(2010).</li>
<li>Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+analyses+of+vascular+tube+and+lumen+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish.</a> Development. 132, 5199-5209 (2005).</li>
<li>Berghmans, S., Hunt, J., Roach, A., Goldsmith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+offer+the+potential+for+a+primary+screen+to+identify+a+wide+variety+of+potential+anticonvulsants%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsy+Res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish offer the potential for a primary screen to identify a wide variety of potential anticonvulsants.</a> Epilepsy Res. 75, 18-28 (2007).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

W niniejszej pracy opisujemy nowy protokół bezpośredniego dostarczania materiałów do jelita larw zebrafish za pomocą mikrozondowania (mikrogavage). W trakcie całej procedury istnieje kilka krytycznych kroków, o których należy pamiętać. Po pierwsze, larwy zebrafish powinny być w dobrym stanie zdrowotnym przed eksperymentem, aby zapobiec zgonom niezwiązanym z zastosowaną terapią. Innym ważnym czynnikiem jest jakość igły do sondowania. Jednym z najtrudniejszych etapów protokołu jest odcięcie igły w odpowiednim miejscu bez t...

<table><tbody><tr><td>Finquel (metanosulfonian tricainy)</td><td>Argent Chemical Laboratories</td><td>MS-222</td><td>Znieczulenie larw</td></tr><tr><td>Roztwór czerwieni fenolowej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290-100 ml</td><td>0,5% w DPBS, testowany w hodowlach komórkowych</td></tr><tr><td>Olej mineralny, lekki, biały (wysokiej czystości)</td><td>Amresco</td><td>J217-500 ml</td><td>Do wypełniania igły i testowania objętości</td></tr><tr><td>TxRed-Dextran, 10,000 MW, utrwalany lizyną</td><td>Invitrogen/ Molecular Probes</td><td>D-1863</td><td>1% zawiesina w 1x PBS/czerwień fenolowa</td></tr><tr><td>FM4-64FX</td><td>Invitrogen/ Molecular Probes</td><td>F34653</td><td>Roztwór stokowy 5 mM w wodzie</td></tr><tr><td>Metyloceluloza</td><td>MP Biochemicals</td><td>0215549590</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary borokrzemowe</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-203-G/X</td><td>OD 1,14 mm, ID 0,53 mm, długość 3,5 cala</td></tr><tr><td>Plastikowa forma do wykonywania odlewów</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>TU-1</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie do mikroiniekcji Nanoject II</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>Wytwornica mikropipet Flaming Brown, filament z rynną o szerokości 3,0 mm</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97, FT330B</td><td>Wytwarzanie igieł</td></tr><tr><td>Pinceta studencka Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td>0,1 x 0,06 mm, przycinanie igieł</td></tr><tr><td>Siatka okularowa, 5 mm - 100 podziałek</td><td>Leica</td><td>10394771</td><td>Przycinanie igieł</td></tr><tr><td>Mikrokuźnia (Microforge)</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td>Przycinanie i wypalanie igieł</td></tr><tr><td>Igła do strzykawki tuberkulinowej SlipTip</td><td>Becton Dickinson</td><td>309626</td><td>1 ml, igła 25G 5/8</td></tr><tr><td>Mikrosfery Fluoresbrite YG (2,0 &amp;mu;m)</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18338</td><td>Analiza motoryki jelit</td></tr><tr><td>Mikroskop sekcyjny</td><td>Leica</td><td>S6E</td><td>Procedura gavage</td></tr><tr><td>Stereomikroskop fluorescencyjny</td><td>Leica</td><td>M205C</td><td>Test bariery dla dekstranu</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Zeiss</td><td>LSM510</td><td>Obrazowanie dekstranu w krwiobiegu</td></tr></tbody></table>

mikrogaważ larw danio pręgowanego

Microgavage of Zebrafish Larvae

Danio pręgowany stał się potężnym organizmem modelowym do badania rozwoju jelit1-5, fizjologii6-11, chorób12-16 oraz oddziaływań między gospodarzem a mikrobami17-25. Podejścia eksperymentalne w badaniu biologii jelit często wymagają wprowadzenia wybranych materiałów in vivo do światła jelita. W modelu larwalnym danio pręgowanego osiąga się to zazwyczaj poprzez zanurzenie ryb w roztworze wybranego materiału lub poprzez wstrzyknięcie go przez ścianę brzuszną. Przy zastosowaniu metody zanurzeniowej trudno jest dokładnie monitorować lub kontrolować drogę lub czas dostarczania materiału do jelit. Z tego powodu ekspozycja przez zanurzenie może powodować niezamierzoną toksyczność i inne efekty w tkankach pozajelitowych, co ogranicza potencjalny zakres ilości materiałów, które można dostarczyć do jelita. Ponadto ilość materiału przyjętego podczas ekspozycji przez zanurzenie może znacznie różnić się między poszczególnymi larwami26. Choć problemy te nie występują podczas bezpośredniego wstrzykiwania przez ścianę brzuszną, prawidłowe wstrzyknięcie jest trudne i powoduje uszkodzenia tkanek, które mogą wpłynąć na wyniki eksperymentalne. Przedstawiamy metodę mikrozondującej aplikacji doustnej (mikrogavage) u larw danio pręgowanego. Celem tej metody jest zapewnienie bezpiecznego, skutecznego i spójnego sposobu dostarczania materiałów bezpośrednio do światła przedniej części jelita u larwalnych danio pręgowanych przy kontrolowanym czasie podania. Mikrogavage wykorzystuje standardowy sprzęt do mikroiniekcji embrionów oraz stereomikroskopię, powszechnie dostępną w większości laboratoriów prowadzących badania nad danio pręgowanym. Po odpowiednim ustawieniu ryb w metylocelulozie, zabieg można przeprowadzić szybko, w tempie około 7-10 ryb/min, a przeżywalność po zabiegu wynosi blisko 100% w zależności od podanego materiału. Wykazujemy również, że mikrogavage umożliwia załadowanie światła jelita wysokimi stężeniami materiałów, które są śmiertelne dla ryb w przypadku ekspozycji przez zanurzenie. Aby zademonstrować użyteczność tej metody, prezentujemy test mikrogavage z wykorzystaniem fluorescencyjnego dekstranu, który może być użyty do ilościowego określenia przejścia z światła jelita do przestrzeni pozajelitowych. Test ten może służyć do weryfikacji prawidłowego wykonania procedury mikrogavage, a także stanowi nową metodę badawczą u danio pręgowanego do sprawdzania szczelności bariery nabłonka jelitowego w różnych warunkach eksperymentalnych (np. manipulacje genetyczne, leczenie farmakologiczne lub ekspozycja na czynniki środowiskowe). Ponadto pokazujemy, jak mikrogavage może być wykorzystane do oceny motoryki jelit poprzez podanie fluorescencyjnych mikrosfer i monitorowanie ich późniejszego przemieszczania się. Mikrogavage można zastosować do dostarczania różnorodnych materiałów, takich jak żywe mikroorganizmy, wydzielane czynniki/toksyny mikrobiologiczne, środki farmakologiczne i sondy fizjologiczne. Dzięki tym możliwościom metoda mikrogavage u larwalnych danio pręgowanych ma potencjał do usprawnienia szerokiego zakresu dziedzin badawczych wykorzystujących system modelowy danio pręgowanego.

Gdy gavage jest przeprowadzany prawidłowo, podany materiał powinien znajdować się w całości w przedniej części jelita, przy minimalnej lub całkowitej nieobecności pozostałości materiału w przełyku (Rysunek 3). Należy dobrać taką objętość podawanego materiału, która zostanie zmieszczona w przedniej opuszce i nie będzie wyciekać przez kloakę lub przełyk. Jeśli objętość materiału lub ciśnienie podania będą zbyt wysokie, siła fizyczna gavage może doprowadzić do uszkodzenia nabłonka lub wycieku przez niego. M...

Przedstawiamy nowatorską metodę mikrozgavage u larw danio pręgowanego, wykorzystującą standardowy sprzęt do mikroiniekcji embrionów oraz stereomikroskopię. Wykazujemy, że mikrozgavage jest bezpieczną i wydajną techniką, przydatną do dostarczania kontrolowanych ilości różnorodnych materiałów bezpośrednio do światła jelita larw danio pręgowanego.

Mikrogaważ larw danio pręgowanego

Danio pręgowany stał się potężnym organizmem modelowym do badania rozwoju jelit1-5, fizjologii6-11, chorób12-16 oraz interakcji gospodarz-mikrob...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest podanie materiałów drogą doustną do światła jelita larw danio pręgowanego. Najpierw larwy zostają znieczulone i umieszczone na formie do iniekcji wyłożonej metylocelulozą. Następnie larwy są delikatnie zanurzane w formie i ustawiane zgodnie z kątem igły do zgłębnika oraz mikromanipulatora.Następnie igłę wprowadza się do otworu gębowego larwy i manewruje w kierunku bańki jelitowej. Po dotarciu na miejsce materiał uwalnia się do światła jelita. Ostatnim krokiem jest wyjęcie larwy z metylocelulozy i umieszczenie jej w świeżej pożywce w celu wybudzenia z anestezji.Ostatecznie metoda ta może być wykorzystana do dostarczania substancji bezpośrednio do światła jelita larw zebrafish, co pozwala na badanie transportu w obrębie jelita lub w tkankach pozajelitowych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak zanurzenie w wodzie zawierającej interesującą substancję, jest możliwość rygorystycznej kontroli ilości dostarczonego materiału, jak również czasu i dawkowania. Zmniejsza to zmienność eksperymentalną, a w niektórych przypadkach toksyczność związaną z określonymi substancjami.Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy napot

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Mikropodawanie larw rybki klaun

W niniejszym filmie pokazano, w jaki sposób morpholino lub mRNA można wstrzyknąć do embrionów zebrafish w stadium jednej komórki, aby obniżyć lub zwiększyć poziom produktów konkretnych genów podczas dalszego rozwoju.

Mikroiniekcja embrionów ryb danio w celu analizy funkcji genów

Źródło: Li, J. i inni. Opracowanie modelu infekcji larwal danio pręgowanego dla Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (2020).Ten film demonstruje procedurę mikrogavage, w której znieczulona larwa danio jest unieruchomiona w agarozie i doustnie wstrzykiwana patogenną bakterią za pomocą igły prowadzonej przez śledzenie. Nieinwazyjne podanie naśladuje naturalne zakażenie, umożliwiając analizę replikacji bakterii, uwalniania toksyn oraz uszkodzeń nabłonka jelit.

Opracowanie modelu infekcji larw danio pręgowanego z wykorzystaniem mikrogawage

Coraz częstsze wykorzystanie danio pręgowanego jako modelu zwierzęcego wymaga opracowania skutecznych metod dostarczania znanych ilości związków i roztworów. Opisana poniżej procedura zgłębnika pozwala na doustne podawanie precyzyjnych objętości roztworu dorosłym rybom danio pręgowanym.

Dorastający dorosły danio pręgowany

Danio pręgowany jest doskonałym modelem do badań genetycznych i rozwojowych. Implantacja kulek jest cenną techniką manipulacji tkankami, którą można wykorzystać do badania mechanizmów rozwojowych poprzez wprowadzanie zmian w lokalnych środowiskach komórkowych. Protokół ten opisuje, w jaki sposób przeprowadzić implantację mikrogranulek w zarodku danio pręgowanego.

Implantacja mikrogranulek w zarodku danio pręgowanego

Ukierunkowane manipulacje mające na celu wywołanie ukierunkowanego stresu lub śmierci w poszczególnych komórkach były stosunkowo trudne do osiągnięcia. W tym artykule opisano metodę ablacji w rozdzielczości pojedynczej komórki, polegającą na selektywnym stresowaniu i zabijaniu pojedynczych komórek w hodowli komórkowej i żywych zwierzętach, w oparciu o standardowy konfokalny laser UV.

Wyzwalanie stresu i śmierci komórek za pomocą konwencjonalnej mikroskopii konfokalnej z laserem UV

Tutaj prezentujemy protokół izolacji tkanki gonad larw danio pręgowanego, który ułatwi badania różnicowania i utrzymania płci danio pręgowanego.

Rozwarstwienie larw tkanki gonad danio pręgowanego

Laserowa ablacja jest szeroko stosowaną technologią do badania regeneracji w systemach biologicznych. Prezentowany protokół opisuje zastosowanie standardowego laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego do ablacji laserowej, a następnie obrazowania poklatkowego regenerujących się komórek międzynerwowych w linii bocznej danio pręgowanego.

Test ablacji i regeneracji laserowej oparty na mikroskopie konfokalnym w komórkach międzynerwowych danio pręgowanego

Przejrzystość optyczna jest główną zaletą dla biologicznej i fizjologicznej pracy komórek u danio pręgowanego. Opisano solidne metody pomiaru wzrostu komórek u poszczególnych zwierząt, które pozwalają na nowy wgląd w to, w jaki sposób wzrost mięśni szkieletowych i sąsiednich tkanek jest zintegrowany ze wzrostem całego ciała.

Wielokrotne pomiary wzrostu mięśni szkieletowych w czasie rzeczywistym u poszczególnych żywych ryb danio pręgowanych poddanych zmienionej aktywności elektrycznej

Ten protokół demonstruje mikroiniekcję lipopolisacharydu do obszaru komorowego mózgu w modelu larwalnym danio pręgowanego w celu zbadania wynikowej reakcji neurozapalnej i neurotoksyczności.

Mikroiniekcje lipopolisacharydu do komór mózgowych larwom danio pręgowanego w celu oceny zapalenia nerwów i neurotoksyczności

Pokazujemy metodę, która wykorzystuje szybką skaningową mikroskopię konfokalną do wykonywania na żywo obrazowania komórek mikrogleju w rozwijającym się tektum wzrokowym danio pręgowanego, umożliwiając analizę dynamiki tych komórek in vivo.

Obrazowanie na żywo i charakterystyka dynamiki mikrogleju w zarodku danio pręgowanego

Ten protokół opisuje procedurę badania przesiewowego leków u larw danio pręgowanego 3-7 dni po zapłodnieniu, po której następuje ocena morfologiczna.

Badania przesiewowe małych cząsteczek i badania toksyczności u larw danio pręgowanego we wczesnym stadium rozwoju

Poznaj metodę mikrozgłębnika larw danio pręgowanego do precyzyjnego podawania substancji do światła jelita. Technika umożliwia kontrolowane badanie transportu w jelicie i tkankach pozajelitowych.

Mikrogaważ larw danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów