Name: Eksplantaty blastomerów do testowania zaangażowania w los komórki podczas rozwoju embrionalnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 8 s
Description: Poznaj metodę eksplantatów blastomerów do badania determinacji losu komórek w zarodkach Xenopus. Technika pozwala analizować czynniki wewnętrzne i zewnętrzne w biologii rozwoju.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować za wsparcie Paaqua Granta w ramach stypendium GWU Harlan Fellowship oraz Mona Herold w ramach stypendium GWU Luther Rice Fellowship. Praca ta została sfinansowana z grantu Narodowej Fundacji Nauki (National Science Foundation) nr MCB-1121711.

1. Przygotowanie instrumentów, pożywek i naczyń hodowlanych
<ol>
 <li>Naostrz cztery pęsety za pomocą folii ściernej z tlenkiem glinu. Czynność tę wykonaj pod mikroskopem stereoskopowym, aby kontrolować wielkość końcówek. Jedna pęseta służy jako zapasowa na wypadek uszkodzenia końcówki podczas procedury. Wszystkie cztery pęsety wysterylizuj w autoklawie i przechowuj w sterylnym pojemniku.</li>
 <li>Przygotuj po 500 ml pożywki hodowlanej o stężeniu 0.1X i 1.0X (może to być zmodyfikowany roztwór Ringera wg Marca [MMR] lub zmodyfikowana sól Bartha [MBS]; przepisy w 15) i wysterylizuj przez filtrację. Rutynowo stosujemy MBS (1X = 88 mM NaCl; 1 mM KCl, 0.7 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 5 mM HEPES [pH 7.8], 2.5 mM NaHCO3). Przechowywać w temperaturze 14-18 °C przez kilka miesięcy.</li>
 <li>Przygotuj 2% roztwór agarozy w pożywce hodowlanej (2 g agarozy klasy elektroforetycznej w 100 ml pożywki hodowlanej 1X w szklanej butelce z zakrętką). Wysterylizuj w autoklawie, aby rozpuścić agarozę. Roztwór ten można przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy i podgrzewać w kuchence mikrofalowej w celu upłynnienia agarozy przy kolejnym użyciu.</li>
 <li>Gdy agaroza jest jeszcze w stanie ciekłym, wlej około 0.5 ml na dno każdego dołka sterylnej płytki hodowlanej 24-dołkowej. Zapobiegnie to przywieraniu eksplantatów do plastiku.</li>
 <li>Gdy agaroza jest jeszcze w stanie ciekłym, wlej około 2-3 ml na dno dwóch lub trzech szalek Petriego o średnicy 60 mm i delikatnie zamieszaj okrężnie, aby upewnić się, że dno jest pokryte. Będą one służyć jako szalki do dyssekcji, a agaroza zapobiegnie przywieraniu zarodków do plastiku po usunięciu ich błon.</li>
 <li>Po ochłodzeniu i stwardnieniu agarozy, opal końcówkę 6-calowej pipety Pasteura, aż stopi się ona w kulkę, a następnie lekko dotknij powierzchni agarozy w każdym dołku płytki hodowlanej. Utworzy to płytkie wgłębienie, w którym zostanie umieszczony eksplantat.</li>
 <li>Napełnij każdy dołek płytki hodowlanej sterylną pożywką hodowlaną 1X.</li>
 <li>Po ochłodzeniu i stwardnieniu agarozy, napełnij szalkę do dyssekcji rozcieńczoną pożywką hodowlaną (0.1X MMR lub 0.1X MBS), aby ułatwić separację blastomerów.</li>
</ol>
2. Selekcja embrionów
<ol>
 <li>Pozyskać zapłodnione jaja i usunąć otoczki galaretowate zgodnie ze standardowymi protokołami 15. Przenieść je do 0,5X pożywki hodowlanej w 100 mm szalce Petriego.</li>
 <li>Gdy embriony osiągną stadium 2 komórek, wyselekcjonować do oddzielnej szalki te, w których pierwsza bruzda podziałowa przecina słabo pigmentowany obszar w półkuli zwierzęcej (Ryc. 1). Będą one służyć jako donory eksplantów. Pozostałe embriony w stadium 2 komórek przechowywać w oddzielnej szalce obok embrionów donora przez cały czas trwania procedury, aby służyły jako kontrole rodzeństwa do określania stadium rozwoju eksplantów.</li>
</ol>
3. Przygotowanie eksplantatów
<ol>
 <li>Umieść 5-10 embrionów w naczyniu do sekcji, jednak pracuj nad jednym embrionem w danym czasie.</li>
 <li>Ustaw pierwszy embrion tak, aby widoczna była przezroczysta błona witelinowa; jest ona oddzielona wyraźną przestrzenią (przestrzenią periwitelinową) nad powierzchnią bieguna zwierzęcego embrionu. Używając zaostrzonej pęsety w niedominującej ręce (lewej, jeśli osoba jest praworęczna), uchwyć błonę witelinową powyżej przestrzeni periwitelinowej. Używając zaostrzonej pęsety w drugiej ręce, uchwyć błonę blisko końcówki pierwszej pęsety i delikatnie pociągnij w przeciwnych kierunkach, aby odwarstwić błonę. Pierwszy chwyt wykonaj w pewnej odległości od komórki przeznaczonej do sekcji, aby komórka docelowa nie została uszkodzona podczas usuwania błony. O usunięciu błony można się dowiedzieć po tym, że embrion spłaszczy się.</li>
 <li>Uchwyć jedną sąsiednią komórkę pęsetą w niedominującej ręce i wykorzystaj tę komórkę jako „uchwyt”, aby nie dotykać bezpośrednio komórki przeznaczonej do sekcji. Pęsetą w drugiej ręce delikatnie odsun pozostałe sąsiednie komórki od pożądanego blastomeru. Jeśli celem są komórki linii środkowej, które mają ten sam los, można je usunąć razem w parze. Na koniec wysekcjonuj komórkę pełniąca rolę „uchwytu”.</li>
 <li>Pobierz blastomer (lub parę blastomerów) za pomocą sterylnej, szklanej pipety Pasteura, unikając pęcherzyków powietrza i nadmiernego ssania. Pipetę można wypalić w płomieniu, aby usunąć ostre krawędzie, które mogłyby uszkodzić komórkę, choć nie robimy tego rutynowo. Umieść końcówkę pipety Pasteura pod powierzchnią pożywki w dołku naczynia do hodowli eksplantów i delikatnie wypuść blastomer. Powinien on pod wpływem grawitacji wsunąć się do płytkiego wgłębienia. Te same blastomery z więcej niż jednego embrionu można połączyć w jeden eksplant.</li>
 <li>Powtórz tę procedurę z pozostałymi embrionami w naczyniu do sekcji, jeden po drugim. Po około 10 embrionach naczynie do sekcji zapełni się szczątkami komórkowymi. W takim przypadku zmień naczynie na nowe.</li>
 <li>Po zakończeniu wszystkich sekcji sprawdź, czy eksplanty znajdują się w płytkich wgłębieniach. Jeśli nie, można je delikatnie wsunąć do wgłębienia za pomocą pętelki z włosa, która została wysterylizowana w 70% etanolu i wysuszona powietrzem.</li>
 <li>Około godzinę po ostatniej sekcji usuń szczątki otaczające przytwierdzone eksplanty za pomocą sterylnej, szklanej pipety Pasteura.</li>
 <li>Inkubuj płytkę z eksplantami w temperaturze 14-20 °C obok szalki Petriego zawierającej rodzeńskie embriony kontrolne. Embriony rodzeńskie będą wskazywać stadium rozwoju eksplantów blastomerowych.</li>
</ol>
4. Pobieranie eksplantatów do analizy
<ol>
 <li>Zabierz eksplanty, gdy rodzeństwo osiągnie pożądany stopień rozwoju. Eksplanty te przeżywają całkiem dobrze, nawet jeśli niektóre z komórek ulegną dezintegracji. Dlatego, jeśli w studni hodowlanej znajduje się mętna masa, należy zbadać ją za pomocą pętelki z włosa lub pęsety, aby sprawdzić, czy wewnątrz znajduje się zdrowy eksplant.</li>
 <li>Pobierz eksplanty wraz z niewielką objętością roztworu hodowlanego za pomocą szklanej pipety Pasteura, a następnie delikatnie przenieś je do utrwalacza lub buforu lizującego odpowiedniego dla planowanego testu.</li>
</ol>

<ol><li>Dale, L., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+map+of+the+32-cell+stage+of+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fate map of the 32-cell stage of Xenopus laevis.</a> Development. 100, 279-295 (1987).</li>
<li>Masho, R., Kubota, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+fates+of+blastomeres+of+the+eight-cell+stage+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth%2C+Diff%22%5BJournal%5D)">Developmental fates of blastomeres of the eight-cell stage Xenopus embryo.</a> Dev. Growth, Diff. 30, 347-359 (1988).</li>
<li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fates+of+the+blastomeres+of+the+16-cell+stage+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fates of the blastomeres of the 16-cell stage Xenopus embryo.</a> Dev. Biol. 119, 560-578 (1987).</li>
<li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fates+of+the+blastomeres+of+the+32-cell+stage+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fates of the blastomeres of the 32-cell stage Xenopus embryo.</a> Dev. Biol. 122, 300-319 (1987).</li>
<li>Moody, S. A., Kline, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregation+of+fate+during+cleavage+of+frog+%28Xenopus+laevis%29+blastomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Embryol%22%5BJournal%5D)">Segregation of fate during cleavage of frog (Xenopus laevis) blastomeres.</a> Anat. Embryol. 182, 347-362 (1990).</li>
<li>Takasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fates+and+roles+of+the+presumptive+organizer+region+in+the+32-cell+embryos+in+normal+development+of+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth%2C+Diff%22%5BJournal%5D)">Fates and roles of the presumptive organizer region in the 32-cell embryos in normal development of Xenopus laevis.</a> Dev. Growth, Diff. 29, 141-152 (1987).</li>
<li>Sullivan, S. A., Moore, K. B., Moody, S. A. Chapter 20 Early events in frog blastomere fate determination. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSullivan%2C+SA+%22Cell+Fate+and+Lineage+Determination%22">Cell Fate and Lineage Determination</a>. Moody, S. A. , Academic Press. 297-321 (1999).</li>
<li>Moore, K. B., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal-vegetal+asymmetries+influence+the+earliest+steps+in+retinal+fate+commitment+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Animal-vegetal asymmetries influence the earliest steps in retinal fate commitment in Xenopus.</a> Dev. Biol. 212, 25-41 (1999).</li>
<li>Yan, B., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+competence+of+Xenopus+blastomeres+to+produce+neural+and+retinal+progeny+is+repressed+by+two+endo-mesoderm+promoting+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The competence of Xenopus blastomeres to produce neural and retinal progeny is repressed by two endo-mesoderm promoting pathways.</a> Dev. Biol. 305, 103-119 (2007).</li>
<li>Gallagher, B. C., Hainski, A. M., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+differentiation+of+dorsal+axial+structures+from+an+animal+cap+cleavage+stage+blastomere+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Autonomous differentiation of dorsal axial structures from an animal cap cleavage stage blastomere in Xenopus.</a> Development. 112, 1103-1114 (1991).</li>
<li>Hainski, A. M., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+maternal+mRNAs+from+a+dorsal+animal+blastomere+induce+a+secondary+axis+in+host+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Xenopus maternal mRNAs from a dorsal animal blastomere induce a secondary axis in host embryos.</a> Development. 116, 347-3345 (1992).</li>
<li>Godsave, S. F., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+of+mesoderm+formation+in+the+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis of mesoderm formation in the Xenopus embryo.</a> Development. 111, 523-530 (1991).</li>
<li>Hainski, A. M., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+activin-like+signal+activates+a+dorsal-specifying+RNA+between+the+8-+and+16-cell+stages+of+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genetics%22%5BJournal%5D)">An activin-like signal activates a dorsal-specifying RNA between the 8- and 16-cell stages of Xenopus.</a> Dev. Genetics. 19, 210-221 (1996).</li>
<li>Pandur, P. D., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+maternal+influences+on+dorsal-ventral+fate+of+Xenopus+animal+blastomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Multiple maternal influences on dorsal-ventral fate of Xenopus animal blastomeres.</a> Dev. Dyn. 225, 581-587 (2002).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22A+Laboratory+Manual%22">A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).</li>
<li>Sullivan, S. A., Akers, L., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((foxD5a%2C+a+Xenopus+winged+helix+gene%2C+maintains+an+immature+neural+ectoderm+via+transcriptional+repression+that+is+dependent+upon+the+C-terminal+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">foxD5a, a Xenopus winged helix gene, maintains an immature neural ectoderm via transcriptional repression that is dependent upon the C-terminal domain.</a> Dev. Biol. 232, 439-457 (2001).</li>
<li>Yan, B., Neilson, K. M., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxD5+plays+a+critical+upstream+role+in+regulating+neural+fate+and+onset+of+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">FoxD5 plays a critical upstream role in regulating neural fate and onset of differentiation.</a> Dev. Biol. 329, 80-95 (2009).</li>
<li>Vincent, J. -P., Gerhart, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcortical+rotation+in+Xenopus+eggs%3A+an+early+step+in+embryonic+axis+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Subcortical rotation in Xenopus eggs: an early step in embryonic axis specification.</a> Dev. Biol. 123, 526-539 (1987).</li>
<li>Peng, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appendix+A%3A+Solutions+and+Protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Appendix A: Solutions and Protocols.</a> Methods in Cell Biology. 36, 657-662 (1991).</li>
<li>Klein, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+cleavage+furrow+demarcates+the+dorsal-ventral+axis+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The first cleavage furrow demarcates the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos.</a> Dev. Biol. 120, 299-304 (1987).</li>
<li>Masho, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Close+correlation+between+the+first+cleavage+plane+and+the+body+axis+in+early+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Diff%22%5BJournal%5D)">Close correlation between the first cleavage plane and the body axis in early Xenopus embryos.</a> Dev. Growth Diff. 32, 57-64 (1990).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Kluczowe kroki dla pomyślnego hodowania pojedynczych blastomerów to: 1) prawidłowa identyfikacja wybranego blastomeru; 2) utrzymanie sterylnej i prawidłowej hodowli; 3) wyizolowanie komórek w odpowiedniej fazie cyklu komórkowego; oraz 4) wypracowanie niezbędnej sprawności manualnej, aby zapobiec uszkodzeniom podczas dyssekcji i przenoszenia do dołka hodowlanego.
Aby manipulować konkretnymi blastomerami, niezbędna jest możliwość zidentyfikowania głównych osi. W embrionach Xenopus stron...

Xenopus laevis embriony są szeroko wykorzystywane do identyfikacji mechanizmów, dzięki którym komórki embrionalne nabywają swoje specyficzne przeznaczenie, ponieważ ich jaja są wystarczająco duże, aby umożliwić zastosowanie metod mikrochirurgicznych. Ponadto rozwijają się one zewnętrznie bez konieczności suplementacji odżywczej pożywki hodowlanej, gdyż każda komórka zawiera bogaty wewnątrzkomórkowy zapas płytek żółtkowych, które stanowią wewnętrzny magazyn energii. Ważnym atutem w badaniu mechanizmów determinacji przeznaczenia komórek jest kompleksowy zestaw map przeznaczenia blastomerów w stadium podziału (od stadium 2- do 32-komórkowego) 1, 2, 3, 4, 5, 6. Mapy te zostały opracowane poprzez mikroiniekcję wykrywalnej cząsteczki do pojedynczego, identyfikowalnego blastomeru i monitorowanie w późniejszych etapach rozwoju, które tkanki są zasiedlane przez znakowane potomstwo. Spójne mapy przeznaczenia są możliwe dzięki temu, że główne osie embrionów można niezawodnie zidentyfikować w wielu osobnikach. Po pierwsze, we wszystkich embrionach typu dzikiego półkula zwierzęca jest pigmentowana, podczas gdy półkula roślinna nie jest. Po drugie, wniknięcie plemnika podczas zapłodnienia powoduje przesunięcie pigmentacji półkuli zwierzęcej w stronę przyszłej strony brzusznej; w wielu embrionach różnica w pigmentacji może zatem służyć do rozróżnienia strony grzbietowej od brzusznej. Po trzecie, pierwsza bruzda podziałowa w większości embrionów odpowiada płaszczyźnie pośrodkowej strzałkowej, a zatem może być wykorzystana do identyfikacji prawej i lewej strony embrionu. Mapy przeznaczenia opierają się również na fakcie, że naturalnie zapłodnione jaja często dzielą się według regularnych wzorców, co sprawia, że każdy blastomer jest identyfikowalny w dużej populacji embrionów. Chociaż występuje zmienność w obrębie i pomiędzy partiami jaj w zakresie pigmentacji i wzorców podziału, zastosowanie opisanych tutaj procedur selekcyjnych pozwala na identyfikację komórek o określonym przeznaczeniu z dokładnością około 90%.
Losy komórek mogą być determinowane podczas embriogenezy przez kilka mechanizmów. Czynniki wewnętrzne, takie jak różnicowo dziedziczone mRNA cytoplazmatyczne lub białka, przyczyniają się do wielu aspektów wczesnego wzorowania. Na przykład specyficzne macierzyńskie mRNA determinują, które komórki utworzą linię zarodkową, staną się endodermą lub przyczynią się do powstania grzbietowej osi ciała (przegląd w 7). Czynniki zewnętrzne dostarczane lokalnie przez sąsiednie komórki lub z większej odległości z embrionalnego centrum sygnalizacyjnego odpowiadają za indukcję specyficznych typów tkanek i wzorowanie niemal każdego układu narządowego. Przykładami centrów sygnalizacyjnych są organizator/węzeł w gastruli, który indukuje ektodermę neuralną i wzoruje mezodermę, oraz strefa aktywności polaryzującej, która wzoruje oś przednio-tylną pączka kończyny. Chociaż mapy losów pozwalają zidentyfikować prekursory różnych narządów i ujawniają ścieżkę rozwojową ich potomstwa w normalnym embrionie, nie potrafią one odróżnić wpływu czynników wewnętrznych od zewnętrznych na te komórki. Nie ujawniają one również pełnego potencjału rozwojowego komórki, której potomstwo różnicuje się w złożonym środowisku sygnalizacyjnym embrionu. Dwa podejścia eksperymentalne pozwalają sprawdzić, czy los komórki jest determinowany przez czynniki wewnętrzne, czy jest następnie modyfikowany przez czynniki zewnętrzne: 1) transplantacja komórki w nowe miejsce w embrionie; lub 2) usunięcie komórki z embrionu, a następnie hodowla w warunkach braku egzogennych sygnałów.
Oba podejścia eksperymentalne są możliwe do zastosowania u Xenopus, ponieważ komórki są wystarczająco duże, aby można było je rozdzielić ręcznie. Na przykład w licznych badaniach usuwano pojedyncze komórki z embrionów (aby zmienić oddziaływania międzykomórkowe) lub przeszczepiano komórki w nowe miejsca w embrionach biorcy w celu przetestowania zmian w ich losie (przegląd w 7, 8, 9). Ponadto drugie podejście, polegające na eksplantacji niewielkiej liczby komórek z różnych regionów embrionu do hodowli w celu wyjaśnienia indukcyjnych oddziaływań tkankowych w przypadku braku czynników egzogennych, jest możliwe dzięki temu, że komórki embrionu Xenopus są wypełnione wewnątrzkomórkowym zapasem składników odżywczych – płytkami żółtka. W związku z tym mogą być one hodowane przez kilka dni w zdefiniowanym medium solnym bez konieczności uzupełniania pożywki o składniki odżywcze lub czynniki wzrostu. Wykorzystaliśmy to podejście, aby wykazać, że grzbietowe blastomery zwierzęce posiadają autonomiczną zdolność do wytwarzania tkanek neuronalnych i grzbietowych mezo-dermalnych dzięki matczynie dziedziczonym mRNA 10, 11, a inni wykazali, że specyfikacja mezodermy blastomerów w stadium 32 komórek zależy zarówno od informacji wewnętrznych, jak i zewnętrznych 12. Zaletą hodowania komórek jako eksplantów jest możliwość uzupełnienia medium o zdefiniowane czynniki sygnałowe, aby określić, która ścieżka komunikacji międzykomórkowej może wpływać na los eksplantowanej komórki 12, 13, 14. Dodatkowo, przed rozpoczęciem hodowli, do blastomeru można wstrzyknąć mRNA w celu nadekspresji genu lub oligonukleotydy antysensowne, aby zapobiec translacji endogennych mRNA. Takie analizy funkcji zyskanej (gain-of-function) i utraconej (loss-of-function) pozwalają zidentyfikować cząsteczki niezbędne do autonomicznie wyrażanego losu komórki. Aby przeanalizować los eksplantu, identyfikację specyficznych typów komórek można przeprowadzić za pomocą standardowych metod badania ekspresji genów (np. hybrydyzacja in situ, RT-PCR) oraz testów immunocytochemicznych. Niniejszy protokół stanowi prosty, a zarazem skuteczny sposób rozróżnienia między mechanizmami wewnętrznymi a zewnętrznymi, które regulują proces przekształcania się komórki embrionalnej w specyficzne tkanki.

<table><tbody><tr><td>Ścierna folia tlenkowa (alumina)</td><td>Thomas Scientific</td><td>#6775E-38</td><td>Gruboziarnista (12 &amp;mu;m), do głównych napraw końcówek pęset</td></tr><tr><td>Ścierna folia tlenkowa (alumina)</td><td>Thomas Scientific</td><td>#6775E-46</td><td>Średnioziarnista (3 &amp;mu;m), do precyzyjnego ostrzenia końcówek pęset</td></tr><tr><td>Ścierna folia tlenkowa (alumina)</td><td>Thomas Scientific</td><td>#6775E-54</td><td>Drobnoziarnista (0.3 &amp;mu;m), do polerowania końcówek pęset</td></tr><tr><td>Pęseta: Dumont, Dumoxel Biologie #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>#11252-30</td><td>Posiadają precyzyjne końcówki, które nie wymagają ostrzenia bezpośrednio po zakupie. Odporne na korozję, co umożliwia ich autoklawowanie.</td></tr><tr><td>Roztwór gentamycyny</td><td>Sigma</td><td>G1397</td><td>Dodać do pożywki w dniu użycia</td></tr></tbody></table>

eksplanty blastomerów do badania determinacji losów komórek podczas rozwoju embrionalnego

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Mapy losów, konstruowane na podstawie śledzenia linii wszystkich komórek embrionu, ujawniają, z których komórek embrionu pochodzą poszczególne tkanki. Chociaż mapy losów są bardzo użyteczne w identyfikacji prekursorów narządu oraz w wyjaśnianiu drogi rozwojowej, dzięki której komórki potomne zasiedlają ten narząd w normalnym embrionie, nie obrazują one pełnego potencjału rozwojowego komórki prekursorskiej ani nie identyfikują mechanizmów, za pomocą których ustalany jest jej los. Aby przetestować determinację losu komórki, porównuje się normalny zestaw jej potomków w nienaruszonym embrionie (mapę losów) z tymi, którzy pojawiają się po manipulacji eksperymentalnej. Czy los komórki jest ustalony (zdeterminowany) niezależnie od otaczającego środowiska komórkowego, czy też jest on wpływany przez czynniki zewnętrzne dostarczane przez sąsiednie komórki? Wykorzystując kompleksowe mapy losów embrionu Xenopus, opisujemy sposób identyfikacji, izolacji i hodowli pojedynczych prekursorów z etapu podziałów, nazywanych blastomerami. Podejście to pozwala ocenić, czy te wczesne komórki są zdeterminowane do losu, który nabywają w normalnym środowisku w nienaruszonym embrionie, czy wymagają interakcji z sąsiednimi komórkami, bądź czy mogą zostać skłonione do realizacji alternatywnych losów w przypadku narażenia na inne rodzaje sygnałów.

Zdolność tego testu do dokładnej oceny potencjału rozwojowego komórki opiera się na wypreparowaniu odpowiedniego blastomeru na podstawie map losów komórkowych 1, 2, 3, 4, 5, 6. Dlatego kluczowe jest wybranie embrionów o prawidłowym wzorcu pigmentacji w stadium 2-komórkowym, jak pokazano na Rysunku 1, które następnie wykazują prawidłowe wzorce podziałów, jak pokazano na Rysunku 2. Dokładność znacznie wzrasta, jeśli obserwuje się posortowane embriony w momencie osiągnięcia wymag...

Los pojedynczej komórki embrionalnej może być determinowany przez cząsteczki dziedziczne i/lub sygnały pochodzące od sąsiednich komórek. Wykorzystując mapy losów embrionu Xenopus w stadium podziałów, można zidentyfikować pojedyncze blastomery w celu ich izolowanej hodowli, aby ocenić wpływ cząsteczek dziedzicznych w stosunku do oddziaływań międzykomórkowych.

Eksplanty blastomerów do badania determinacji losów komórek podczas rozwoju embrionalnego

Mapy losów, sporządzone na podstawie śledzenia linii wszystkich komórek zarodka, ujawniają, z których komórek zarodka wywodzą się poszczególne tkanki. Chociaż mapy losów...

Metoda przedstawiona w tym filmie wykorzystuje mapy przeznaczenia zarodka opus w stadium podziałów, aby zidentyfikować pojedyncze blastomery i hodować je w izolacji w celu oceny, czy losy embrionalne są determinowane przez instrukcje wewnętrzne czy zewnętrzne. Najpierw zbiera się zarodki dwukomórkowe, w których pierwsza bruzda podziałowa przecina lekko pigmentowany obszar półkuli zwierzęcej. Zarodki te są następnie hodowane; gdy osiągną stadium 16 do 32 komórek, usuwa się błonę witelinową i oddziela sąsiednie komórki od komórki wybranej. Następnie wypreparowany blastomer przenosi się do wgłębienia w studzience hodowlanej powleczonej agarosem i poddaje hodowli.Gdy eksplant osiągnie pożądany etap rozwoju, jest on pobierany w celu oceny ekspresji genów lub białek za pomocą hybrydyzacji in situ, qPCR lub immunohistochemii. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi, takimi jak hodowla dużych grup komórek embrionalnych lub organoidów, jest możliwość hodowli pojedynczych blastomerów embrionalnych, których los rozwojowy jest znany z badań nad śledzeniem linii komórkowych, bez konieczności dodawania czynników wzrostu lub obecności sąsiednich komórek. Dzięki temu można bezpośrednio sprawdzić, czy czynniki wewnętrzne komórki kierują danym blastomerem, aby stał się prekursorem konkretnej tkanki, czy też wymaga on sygnałów z komórek otaczających.Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ sekcja blastocyst oraz ich przeniesienie do studzienek hodowlanych wymaga precyzyjnych manipulacji pod mikroskopem stereoskopowym. W tym filmie wykorzystam tę metodę, aby sprawdzić, czy mRNA pochodzenia matczynego ukierunkowuje komórki w stronę losu neuronalnego, pracując pod mikroskopem sekcyjnym. Naostrz cztery zestawy pęset, używając ściernej folii Illumina.Jedna para pęsety służy jako zapas na wypadek uszkodzenia końcówki podczas procedury; wysterylizuj w autoklawie wszystkie cztery pęsety i przechowuj je w sterylnym pojemniku. Przygotuj po 500 ml roztworów 0,1 x oraz 1,0 x zmodyfikowanej soli Bartha (MBS) i poddaj je sterylizacji przez filtrowanie. Przechowuj te roztwory przez kilka miesięcy w temperaturze od 14 do 18 °C w szklanej butelce z nakrętką. Przygotuj 2% agaru klasy elektroforetycznej w 100 ml pożywki hodowlanej 1 X. Wysterylizuj w autoklawie, aby rozpuścić agar; w razie potrzeby ponownie upłynnij agar w kuchence mikrofalowej, dopóki pozostaje on w stanie ciekłym.Wlej około 0,5 ml na dno każdej studni sterylnej płytki hodowlanej z 24 studniami. Zapobiegnie to przywieraniu implantów do plastiku. Następnie wlej około dwóch do trzech ml na dno dwóch szalek Petriego o średnicy 360 mm i delikatnie zakręć, aby rozprowadzić płyn.Będą one służyć jako naczynia do sekcji, a agar zapobiega przywieraniu embrionów do plastiku. Po usunięciu błon, gdy agar ostygnie i stwardnieje, należy opalić końcówkę sześciocalowej pipety pasterskiej, aż stopi się ona w kulkę. Ponownie krótko opalić kulkę, a następnie lekko dotknąć nią powierzchni agaru w dołku płytki hodowlanej.Doprowadzi to do powstania płytkiego wgłębienia, w którym zostanie umieszczony X explan. Powtórz tę czynność dla każdej studni w płytce. Następnie napełnij każdą studnię płytki hodowlanej 1 mL sterylnej pożywki hodowlanej 1x.Następnie należy napełnić szalkę do sekcji roztworem 0,1 XMBS, aby ułatwić oddzielenie blastomerów. Po przygotowaniu szalek do sekcji, zapłodnione jaja z usuniętymi otoczkami galaretowatymi należy przenieść do szalek Petriego o średnicy 100 mm zawierających 0,5 x pożywki hodowlanej. Jaja, których nie wykorzystano natychmiast, można hodować w temperaturze 14 °C, podczas gdy w pierwszej szalce poszukiwane są embriony w stadium dwóch komórek.Przejrzyj embriony w pierwszej szalce Petriego za pomocą mikroskopu stereoskopowego; używając plastikowej pipety transferowej, przenieś około 10 embrionów w stadium jednej i dwóch komórek do osobnej szalki wypełnionej 0,5 x pożywką hodowlaną. Umieść szalkę Petriego w inkubatorze w temperaturze 14 °C. Zdolność tego testu do dokładnej oceny potencjału rozwojowego komórki zależy od wypreparowania odpowiedniego blastomeru w oparciu o mapy losów komórek.Dlatego kluczowe jest wybranie embrionów o prawidłowym wzorcu pigmentacji w stadium dwóch komórek, które w konsekwencji wykazują regularne wzorce podziałów. Jak pokazano tutaj, regularne podziały często występują tylko po jednej stronie embrionu.Zarodki te nadal mogą służyć jako dawcy, jeśli komórka dawcy pochodzi z regularnej strony. Gdy zarodki osiągną stadium dwóch komórek, należy przenieść do osobnej szalki te, w których pierwsza bruzda podziałowa przecina obszar słabo pigmentowany w półkuli zwierzęcej; należy wyselekcjonować około pięciokrotnie więcej zarodków, niż planuje się poddać sekcji. Będą one stanowić dawców eksplantu.Pozostałe dwa embriony w stadium dwóch komórek należy trzymać w osobnej szalce obok embrionów donora przez całą procedurę, aby służyły jako kontrole rodzeństwa do określenia stadium eksplantu. Po posortowaniu i wysekcjonowaniu embrionów należy wrócić do szalek w inkubatorze, aby znaleźć więcej embrionów w stadium jednej i dwóch komórek. Ponieważ podział embrionów w stadium jednej komórki trwa około 90 minut, czynność tę można przeprowadzić do dwóch godzin po pobraniu komórek jajowych.Aby przygotować eksplant, należy umieścić od pięciu do 10 embrionów w szalce do sekcji. Następnie ustawić pierwszy embrion tak, aby przezroczystą błonę żółtkową można było uchwycić pęsetą. Jest ona zazwyczaj niewidoczna, ale można ją chwycić w obrębie bieguna zwierzęcego, gdzie jest oddzielona wyraźną przestrzenią perivitellinową nad powierzchnią embrionu.Używając zaostrzonej pincety w jednej ręce, chwyć blastulę przeznaczoną do sekcji w pewnej odległości od niej, aby uniknąć jej uszkodzenia. Następnie zaostrzoną pincetą w drugiej ręce chwyć błonę blisko końcówki pierwszej pincety i delikatnie pociągnij w przeciwnych kierunkach, aby oddzielić błonę. Po usunięciu błony embrion spłaszczy się.Następnie za pomocą pęsety chwyć sąsiednią komórkę i wykorzystaj ją jako uchwyt, aby uniknąć bezpośredniego dotykania pęsetą z drugiej ręki komórki przeznaczonej do wycięcia, a pozostałe komórki sąsiednie delikatnie odsuń od wybranego blastomeru. Jeśli celem są komórki linii środkowej o tym samym przeznaczeniu, można je usunąć razem jako parę. Na koniec wycięcie komórkę służącą jako uchwyt.Pobierz blastocystę lub parę blastocyst za pomocą sterylnej szklanej pipety pasteura, unikając pęcherzyków powietrza i nadmiernego zasysania. Umieść końcówkę pipety pasteura pod powierzchnią pożywki w dołku naczynia do hodowli typu X, a następnie delikatnie wypuść blastocystę. Powinna ona opaść do płytkiego wgłębienia pod wpływem grawitacji.Blastulary z więcej niż jednego embrionu można połączyć w jednym eksplantacie, umieszczając je w tym samym wgłębieniu w kulturze. Procedurę tę powtarzamy sukcesywnie dla pozostałych embrionów znajdujących się w naczyniu do sekcji. Po przeniesieniu około 10 embrionów naczynie do sekcji zostanie wypełnione resztkami komórkowymi.Gdy tak się stanie, należy przejść do kolejnej szalki do sekcji. Po zakończeniu wszystkich sekcji należy sprawdzić, czy eksplanty znajdują się w płytkich wgłębieniach. Jeśli nie, można je delikatnie przesunąć do wgłębienia za pomocą pętelki z włosa, która została wysterylizowana w 70% Ethanol i wysuszona powietrzem; implanty należy inkubować w temperaturze pokojowej na blacie przez około godzinę po ostatniej sekcji.Usuń zanieczyszczenia wokół zagojonego eksplantatu za pomocą sterylnej szklanej pipety Pasteura. Inkubuj płytkę z eksplantatem w temperaturze od 14 do 20 °C obok szalki Petriego zawierającej embriony kontrolne z tego samego miotu. Embriony te będą wskazywać stopień rozwoju eksplantatu blastodermy.Po około jednej do dwóch godzinach hodowli eksplantowane blastomery podzielą się około czterech razy i odrzucą większość zanieczyszczeń pozostałych z uszkodzonych sąsiednich komórek. Po 20 godzinach utworzą one małe, zwarte kule komórkowe. Gdy embriony osiągną pożądany stopień rozwoju, należy zebrać eksplant.Ekplanty te zachowują dobrą kondycję, nawet jeśli część komórek ulegnie dezintegracji. W związku z tym, jeśli w kulturze pojawi się zmętniała masa, należy ją zbadać za pomocą igły okularowej lub pęsety, aby sprawdzić, czy wewnątrz znajduje się zdrowy ekplant. Należy pobrać ekplant wraz z niewielką objętością roztworu hodowlanego za pomocą pipety szklanej i delikatnie przenieść go do utrwalacza lub buforu lizującego, odpowiedniego dla planowanego badania.Dwa embriony z blasphemią grzbietową lub dwa embriony z blasphemią brzuszną wypreparowano w stadium 16 komórek i hodowano w jednym roztworze XMBS w temperaturze 14 stopni Celsjusza, aż embriony rodzeństwa osiągnęły wczesne stadia płytki neuralnej. Każdą próbkę przebadano pod kątem ekspresji zygotycznego genu płytki neuralnej Sox two za pomocą hybrydyzacji in situ, co widoczne jest jako niebieski produkt reakcji.Wyniki tego testu wykazują, że większość grzbietowych blastomerów zwierzęcych, które są prekursorami płytki neuralnej, może autonomicznie ekspresować SOX2. Oznacza to, że proces ten zachodzi bez dodatkowego sygnałowania z innych obszarów zarodka. Blastomery, które nie wykazują ekspresji SOX2, mogły zostać błędnie zidentyfikowane w czasie sekcji.W przeciwieństwie do nich, żadna z brzusznych blastomerów zwierzęcych, które są prekursorami brzusznego nabłonka, nie wykazuje ekspresji SOX2. Dane te wskazują, że grzbietowe blastomerów zwierzęcych posiadają wewnętrzną zdolność do tworzenia tkanki nerwowej, podczas gdy brzuszne blastomerów zwierzęcych jej nie posiadają. Niektóre z grzbietowych blastomerów przybrały również wydłużoną morfologię, co wskazuje na formowanie się grzbietowego mezodermy.Blastomery te są również przeznaczone do tworzenia neuronów w nienaruszonym zarodku, a w hodowli eksplantacyjnej wyrażają białko markerowe neuronów, aby przetestować wpływ zmiany endogennych poziomów macierzyńskiego genu neuronalnego. mRNA Fox D5 wstrzyknięto do brzusznych blastomerów prekursorowych w stadium ośmiu komórek. Jak pokazano tutaj, większość implantów brzusznych wyrażała SOX2.Z kolei, gdy endogenny poziom Fox D five został obniżony poprzez wstrzyknięcie antysensownych morfolino-oligonukleotydów do grzbietowych blastomerów prekursorowych w stadium ośmiu komórek, tylko nieliczne grzbietowe eksplanty wykazywały ekspresję SOX two. Eksperymenty te wskazują, że macierzinna ekspresja Fox D five odgrywa rolę w wewnętrznej zdolności grzbietowych blastomerów do nabycia losu neuronalnego. Przed przeprowadzeniem tej procedury można zastosować inne metody, takie jak wstrzykiwanie do blastomerów przeznaczonych do wycięcia mRNA w celu uzyskania funkcji (gain of function) lub antysensownych morfolino-oligonukleotydów w celu utraty funkcji (loss of function), aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania.Na przykład, jakie geny biorą udział w wewnętrznej zdolności komórek do przyjmowania określonego losu rozwojowego? Dodatkowo, można testować znane czynniki sygnałowe, dodając oczyszczone czynniki do pożywki hodowlanej. Podejście to może być również wykorzystane do transplantacji pojedynczych blastomerów w nowe miejsca w nienaruszonym zarodku.Test ten pozwala sprawdzić, czy przeszczepiona komórka jest zdeterminowana do swojego pierwotnego losu rozwojowego; informacje te są kluczowe dla zdefiniowania mechanizmów komórkowych, dzięki którym pluripotencjalna komórka embrionalna staje się zdeterminowana do roli prekursora określonej tkanki.

blastomere-explants-to-test-for-cell-fate-commitment-during-embryonic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przeszczepy blastomerów w celu sprawdzenia zaangażowania komórek w określony los podczas rozwoju zarodkowego

Przewodnik krok po kroku po generowaniu ukierunkowanych chimerycznych zarodków danio przewrotnego poprzez transplantację w stadium blastuli lub gastruli.

Generowanie chimerycznych embrionów ryby danio przez transplantację

Technika mikrodysekcji eksplantów jest solidną i niezawodną metodą izolacji proliferujących komórek mięśni szkieletowych z mięśni młodocianych, dorosłych lub embrionalnych w celu pozyskania macierzystych komórek mięśni szkieletowych. Wyjątkowo komórki te zostały wyprowadzone klonalnie, co pozwoliło na stworzenie linii macierzystych komórek mięśni szkieletowych wykorzystywanych do transplantacji in vivo.

Kultura mikroeksplantów szkieletowych mięśni dorosłych i embrionalnych oraz izolacja komórek macierzystych mięśni szkieletowych

Mezenchyma czaszki ulega gwałtownym ruchom morfogenetycznym, które prawdopodobnie stanowią siłę napędową dla uniesienia fałdów neuronalnych.1,2W niniejszym opracowaniu opisujemy prostą ex vivo test z eksplantem w celu charakterystyki zachowań komórkowych mezenchymy czaszki podczas neurulacji. Metoda ta znajduje liczne zastosowania, w tym możliwość wprowadzania manipulacji farmakologicznych oraz przeprowadzania analiz z wykorzystaniem obrazowania na żywo.

Test eksplantacyjny do oceny zachowania komórkowego mezenchymy czaszki

W embrionach Xenopus, komórki z dachu blastocoelu są pluripotencjalne i mogą być zaprogramowane do generowania różnych tkanek. W tym miejscu opisujemy protokoły stosowania eksplantatów dachowych z blastocoelu jako systemu testowego do badania kluczowych cech in vivo i in vitro wczesnego rozwoju neuronalnego.

Podobne do komórek macierzystych eksplantaty embrionalne Xenopus do badania wczesnych cech rozwojowych neuronów in vitro i in vivo

Ten protokół opisuje przeprogramowanie pierwotnego płynu owodniowego i błonowych mezenchymalnych komórek macierzystych na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste przy użyciu nieintegrującego podejścia epizodycznego w pełni zdefiniowanych chemicznie warunkach. Szczegółowo opisano procedury ekstrakcji, hodowli, przeprogramowania i charakterystyki powstałych indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą rygorystycznych metod.

Przeprogramowanie pierwotnego płynu owodniowego i komórek błonowych do pluripotencji w warunkach wolnych od ksenotypów

Eksplantaty blastodermy danio pręgowanego są generowane przez izolowanie komórek embrionalnych od endogennych centrów sygnalizacyjnych we wczesnym zarodku, tworząc stosunkowo naiwne klastry komórek, które łatwo manipulować i hodować ex vivo. Ten artykuł zawiera instrukcje dotyczące tworzenia takich eksplantatów i demonstruje ich użyteczność, pytając o role sygnalizacji węzłowej podczas gastrulacji.

Wytwarzanie naiwnych eksplantatów blastodermy z zarodków danio pręgowanego

Test nasiąkniętych kulek polega na ukierunkowanym dostarczeniu odczynnika testowego w dowolnym momencie rozwoju w celu zbadania regulacji różnicowania i morfogenezy komórek. Przedstawiono szczegółowy protokół, mający zastosowanie do każdego doświadczalnego modelu zwierzęcego, dotyczący przygotowania trzech różnych rodzajów namoczonych koralików i wszczepienia ich w komórkę międzypalcową zarodka kurczaka.

Analiza różnicowania komórek, morfogenezy i wzorcowania podczas embriogenezy kurczaka przy użyciu testu z namoczonymi kulkami

Tutaj opisujemy opartą na spektrometrii mas proteomiczną charakterystykę linii komórkowych ze znanymi losami tkanek u zarodka kręgowca Xenopus laevis.

Proteomika spektrometrii mas sterowana linią komórkową w rozwijającym się zarodku (żaby)

Ole Isacson przedstawia zwięzły przegląd choroby Parkinsona, jej przyczyn, strategii terapeutycznych oraz postępów w badaniach nad tą chorobą.

Ole Isacson: Opracowanie nowych terapii choroby Parkinsona

Niniejszy protokół demonstruje sposób hodowli zdrowych, niezróżnicowanych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (ES).

Hodowla i utrzymanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Poznaj metodę eksplantatów blastomerów do badania determinacji losu komórek w zarodkach Xenopus. Technika pozwala analizować czynniki wewnętrzne i zewnętrzne w biologii rozwoju.

Eksplanty blastomerów do badania determinacji losów komórek podczas rozwoju embrionalnego

Przeglądaj więcej filmów