Eksplantaty blastomerów do testowania zaangażowania w los komórki podczas rozwoju embrionalnego
26 stycznia 2013
Na los pojedynczej komórki embrionalnej mogą wpływać odziedziczone molekuły i/lub sygnały z sąsiednich komórek. Wykorzystując mapy losów zarodka Xenopus w stadium rozszczepienia, można zidentyfikować pojedyncze blastomery do hodowli w izolacji, aby ocenić udział odziedziczonych cząsteczek w interakcjach komórka-komórka.
Metoda pokazana w tym filmie wykorzystuje mapy losu zarodka opus w stadium rozszczepienia do identyfikacji pojedynczej kultury blasera w izolacji, aby ocenić, czy siarczan embrionalny jest określany przez instrukcje wewnętrzne czy zewnętrzne, najpierw zbiera się dwa zarodki komórkowe, w których pierwsza bruzda rozszczepienia przecina lekko pigmentowany obszar półkuli zwierzęcej. Zarodki te są hodowane, gdy zarodki osiągną od 16 do 32 komórek, błona vitel jest następnie usuwana, a sąsiednie komórki są wycinane z dala od wybranej komórki. Dla przykładu, wypreparowana maszyna do obróbki strumieniowo-ściernej jest następnie przenoszona do zagłębienia w kulturze pokrytej ślimakiem, dobrze i dobrze wyhodowanej.
Gdy explan osiągnie pożądany etap, jest zbierany w celu oceny ekspresji genów lub białek za pomocą hybrydyzacji in situ QPCR lub immunohistochemii. Główną przewagą tej techniki nad innymi, takimi jak hodowla, duże grupy komórek embrionalnych lub narządów po zalogowaniu, jest to, że pojedynczy embrionalni bluźniercy, których los rozwojowy jest znany z badań śledzenia linii, mogą być hodowane bez dodawania czynników wzrostu lub obecności sąsiednich komórek. W ten sposób można bezpośrednio sprawdzić, czy czynniki nieodłącznie związane z komórką instruują tę bluźnierstwo, aby stało się prekursorem określonej tkanki, czy też wymaga sygnałów z otaczających komórek.
Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ rozbiór Blairów i ich transfer do studni hodowlanych wymaga delikatnych manipulacji pod mikroskopem stereoskopowym. W tym filmie będę używał tej metody, aby zademonstrować, czy mRNA pochodzące od matki skłaniają komórki w kierunku losu neuronalnego Pracując pod mikroskopem preparacyjnym. Naostrz cztery zestawy kleszczy za pomocą folii ściernej Illumina.
Jedna para kleszczyków służy jako kopia zapasowa w przypadku uszkodzenia końcówki podczas zabiegu, autoklawuj wszystkie cztery kleszcze i przechowuj w sterylnym pojemniku, przygotuj po 500 mililitrów 0,1 x i 1,0 x modyfikowanej soli fizjologicznej Bartha lub MBS i wysterylizuj je przez filtr. Przechowuj te roztwory w temperaturze od 14 do 18 stopni Celsjusza przez miesiące w szklanej butelce z zakrętką, przygotuj 2% aros klasy elektroforetycznej w 100 mililitrach jednej kultury X. Średni autoklaw do rozpuszczenia kuchenki mikrofalowej aros, do skroplenia aros, gdy jest to następnym razem, gdy aros jest płynny.
Wlej około 0,5 mililitra na dno każdej studzienki sterylnej 24-dołkowej płytki hodowlanej. Zapobiegnie to przywieraniu implantów do plastiku. Następnie wlej około dwóch do trzech mililitrów na dno od dwóch do 360 milimetrów szalek Petriego i delikatnie zamieszaj, aby rozprowadzić.
Będą one służyć jako naczynia preparacyjne, a aros zapobiega przywieraniu zarodków do plastiku. Po usunięciu ich błon, gdy aros ostygnie i stwardnieje płomień, końcówka sześciocalowej pipety pastwiskowej, aż stopi się w kulkę. Krótko oprawić kulkę, a następnie delikatnie dotknąć jej powierzchnią aros w studzience płytki hodowlanej.
Spowoduje to powstanie płytkiego zagłębienia, w którym zostanie umieszczony plan X. Powtórz dla każdego dołka w talerzu. Następnie napełnij każdą studzienkę płytki hodowlanej jednym mililitrem jednego x sterylnego podłoża hodowlanego.
Następnie napełnij naczynie rozwarstwiające 0,1 XMBS, aby ułatwić separację dyszy. Po przygotowaniu szalek separacyjnych przenieś zapłodnione jaja z usuniętymi galaretkami na 100-milimetrowe szalki Petriego zawierające 0,5 x pożywki hodowlanej. Te, które nie są natychmiast używane, można hodować w temperaturze 14 stopni Celsjusza, podczas gdy pierwsze danie jest badane pod kątem zarodków dwukomórkowych.
Zbadaj zarodki na pierwszej szalce Petriego za pomocą mikroskopu preparacyjnego za pomocą plastikowej pipety transferowej, przenieś około 101 komórek i dwa zarodki komórkowe do oddzielnego naczynia wypełnionego 0,5 x hodowla. Średni. Umieść szalkę Petriego w inkubatorze o temperaturze 14 stopni Celsjusza. Zdolność tego testu do dokładnej oceny potencjału rozwojowego komórki opiera się na wycięciu prawidłowego bluźnierstwa na podstawie map losu.
Dlatego tak ważne jest, aby wybierać zarodki o prawidłowym wzorcu pigmentacji na etapie dwukomórkowym, które w konsekwencji są zgodne z regularnymi wzorcami rozszczepienia. Jak pokazano tutaj. Regularne rozszczepienia często występują tylko po jednej stronie zarodka.
Zarodki te mogą być nadal wykorzystywane jako dawcy, jeśli komórka dawcy pochodzi ze zwykłej strony. Kiedy zarodki osiągną stadium dwukomórkowe, posortuj te, w których pierwsza bruzda rozszczepienia przecina lekko zabarwiony obszar na półkuli zwierzęcej, do osobnego naczynia, posortuj około pięć razy więcej zarodków, niż zostanie wypreparowane. Będą to darczyńcy planu.
Pozostałe dwa zarodki komórkowe należy przechowywać w osobnym naczyniu obok zarodków dawcy przez cały czas trwania procedury, aby służyły jako kontrola rodzeństwa w celu przeprowadzenia planu. Po posortowaniu i wypreparowaniu zarodków wróć do szalek w inkubatorze, aby znaleźć więcej zarodków jednokomórkowych i dwukomórkowych. Ponieważ podział zarodków jednokomórkowych trwa około 90 minut, można to zrobić do dwóch godzin po pobraniu komórek jajowych.
Aby przygotować explan, umieść od pięciu do 10 zarodków w naczyniu separacyjnym. Następnie ustaw pierwszy zarodek tak, aby przezroczystą błonę witelową można było chwycić kleszczami. Zwykle nie można go zobaczyć, ale można go uchwycić na biegunie zwierzęcia, gdzie jest oddzielony wyraźną przestrzenią peralną nad powierzchnią zarodka.
Używając zaostrzonych kleszczy w jednej ręce, chwyć w pewnej odległości od blastera, który ma być rozcięty, aby go nie uszkodzić. Następnie za pomocą zaostrzonych kleszczy, w drugiej ręce, chwyć membranę blisko czubka innych kleszczy i delikatnie pociągnij w przeciwnych kierunkach, aby oderwać membranę. Zarodek spłaszczy się po usunięciu błony.
Następnie chwyć sąsiednią komórkę kleszczami i użyj tej komórki jako uchwytu, aby komórka do sekcji nie była bezpośrednio dotykana kleszczami w drugiej ręce, delikatnie odciągnij pozostałe sąsiednie komórki od pożądanego bluźnierstwa. Jeśli celem są komórki linii środkowej, które dzielą ten sam los, można je usunąć razem jako parę. Na koniec odetnij komórkę uchwytu.
Podnieś bluźnierczą lub amere parę sterylną szklanką za pipetą, unikając pęcherzyków powietrza i nadmiernego ssania. Umieścić końcówkę pipety pastwiskowej pod powierzchnią pożywki hodowlanej w studzience z naczyniem do hodowli X explan i delikatnie usunąć blaster. Powinien zsunąć się w płytkie zagłębienie grawitacyjne.
Bluźniercy z więcej niż jednego embrionu mogą być połączeni w jeden plan poprzez umieszczenie ich w tym samym zagłębieniu w kulturze. Cóż, powtórz tę procedurę z pozostałymi zarodkami w naczyniu separacyjnym jeden po drugim. Po około 10 zarodkach naczynie separacyjne zostanie wypełnione resztkami komórkowymi.
Kiedy tak się stanie, przejdź do następnego naczynia preparacyjnego. Po wykonaniu wszystkich sekcji sprawdź, czy eksplan znajduje się w płytkich zagłębieniach. Jeśli nie, można je delikatnie wepchnąć do zagłębienia za pomocą pętli do włosów, która została wysterylizowana w 70% etanolu i wysuszone na powietrzu inkubować implanty w temperaturze pokojowej na stole około godziny po ostatnim rozwarstwieniu.
Usuń zanieczyszczenia otaczające zagojony eksplan za pomocą sterylnej szklanej kultury pipet pastwiskowych. Tabliczka z planem w temperaturze od 14 do 20 stopni Celsjusza obok szalki Petriego zawierającej siostrzane zarodki kontrolne. Zarodki rodzeństwa wskażą etap rozwoju bluźnierczego explanu.
Po około jednej do dwóch godzin w hodowli, eksplantowane blastomery podzieli się około cztery razy i złuszczy większość pozostałości po uszkodzonych sąsiednich komórkach. Po 20 godzinach tworzą małe, mocne kulki komórek. Kiedy rodzeństwo osiągnie pożądany etap rozwoju, zbierz explan.
Te explan przetrwały całkiem dobrze, nawet jeśli niektóre komórki się rozpadną. Dlatego, jeśli w kulturze znajduje się mętna masa, dobrze ją zbadaj za pomocą pętli do włosów lub kleszczy, aby ustalić, czy w środku zakopany jest zdrowy explan. Pobrać eksplan w małej objętości roztworu hodowlanego, przesypując go szklanką obok pipety i delikatnie wydalić do buforu utrwalającego lub buforu do lizy, odpowiedniego do przeprowadzanego testu.
Dwóch bluźnierców grzbietowych lub dwóch bluźnierców brzusznych zostało wypreparowanych w stadium 16 komórek i hodowanych w jednym XMBS w temperaturze 14 stopni Celsjusza, aż zarodki rodzeństwa osiągną wczesne stadium płytki nerwowej. Każda próbka została oznaczona pod kątem ekspresji jarzmowej płytki nerwowej. Gene Sox dwa przez hybrydyzację in situ, która jest postrzegana jako niebieski produkt reakcji.
Wyniki tego testu pokazują, że większość bluźnierców zwierzęcych grzbietowych, które są prekursorami płytki nerwowej, może autonomicznie wyrażać SOX dwa. To znaczy bez dodatkowej sygnalizacji z innych regionów zarodka. Te wyjaśnienia, które nie wyrażają SOX dwa, mogły zostać nieprawidłowo zidentyfikowane w czasie sekcji.
W przeciwieństwie do tego, żaden z bluźnierców zwierzęcych brzusznych, które są prekursorami naskórka brzusznego, nie wyraża SOX dwa. Dane te wskazują, że bluźniercy wobec zwierząt grzbietowych mają wrodzoną zdolność do tworzenia tkanki nerwowej, podczas gdy bluźniercy wobec zwierząt brzusznych tego nie zauważają. Niektóre z wypustek grzbietowych mają również wydłużone morfologię wskazującą na tworzenie się mezodermy grzbietowej.
Te blastomery są również blaknięte, tworząc Noor w nienaruszonym zarodku, a hodowla explan wyraża białko markerowe Noor w celu przetestowania efektu zmiany endogennych poziomów wyrażonego przez matkę genu neuronalnego. Pięć mRNA Fox D wstrzyknięto do ośmiu bluźnierców prekursorowych w komórkach. Jak pokazano tutaj, większość implantów brzusznych wykazywała ekspresję SOX dwa.
I odwrotnie, gdy endogenny poziom Fox D 5 został zmniejszony przez wstrzyknięcie oligonukleotydów morficznych antysensu do ośmiu komórkowych grzbietowych blasterów prekursorowych, tylko kilka grzbietowych eksplanów wyrażało SOX dwa. Eksperymenty te wskazują, że matczyna ekspresja Fox D 5 odgrywa rolę we wrodzonej zdolności grzbietowych bluźnierców do uzyskania neuronalnego losu przed tą procedurą. Inne metody, takie jak wstrzyknięcie do Blairów w celu wypreparowania, mRNA w celu wzmocnienia funkcji lub antysensownych oligonukleotydów morfologicznych w celu utraty funkcji, mogą być wykonane w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania.
Na przykład, jakie geny są zaangażowane w wewnętrzną zdolność komórek do spowodowania określonego losu rozwojowego? Ponadto można przetestować znane czynniki sygnalizacyjne, dodając oczyszczone czynniki do pożywki hodowlanej. Podejście to może być również wykorzystane do przeszczepiania indywidualnych bluźnierców do nowych miejsc w nienaruszonym zarodku.
W tym teście sprawdzamy, czy przeszczepiona komórka jest zaangażowana w swój pierwotny los rozwojowy, informacje te mają kluczowe znaczenie dla zdefiniowania mechanizmów komórkowych, dzięki którym pluripotencjalna komórka embrionalna staje się prekursorem określonej tkanki.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie bada wpływ dziedziczonych cząsteczek i interakcji między komórkami na los komórek embrionalnych w stadium podziału zarodków Xenopus. Dzięki wykorzystaniu map losu, naukowcy mogą hoować pojedyncze blastomery w izolacji, aby rozróżnić wkład czynników wewnętrznych i zewnętrznych.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Biologia rozwoju
- Biologia komórki
- Embriologia
Tło
- Los komórek embrionalnych może być wpłynięty zarówno przez dziedziczone cząsteczki, jak i sygnały z sąsiednich komórek.
- Rozumienie tych wpływów jest kluczowe dla biologii rozwoju.
- Zarodki Xenopus służą jako model do badania wczesnych procesów rozwojowych.
- Mapy losu dostarczają wizualnej reprezentacji linii komórkowych i wyznaczania losu.
Cel badania
- Ocenić, czy los komórek embrionalnych jest wyznaczany przez czynniki wewnętrzne czy sygnały zewnętrzne.
- Hoować pojedyncze blastomery w izolacji dla szczegółowej analizy.
- Wykorzystywać badania śledzenia linii komórkowych do identyfikacji wyników rozwojowych.
Zastosowanie metod
- Zbieranie zarodków Xenopus w stadium dwukomórkowym.
- Rozcinanie sąsiednich komórek z wybranych blastomerów.
- Hodowla izolowanych blastomerów w kontrolowanym środowisku.
- Ocena ekspresji genów lub białek za pomocą technik takich jak hybrydyzacja in situ i QPCR.
Główne wyniki
- Pojedyncze blastomery mogą być hodowane bez wpływu sąsiednich komórek.
- Badanie dostarcza wglądu w czynniki wewnętrzne i zewnętrzne w wyznaczaniu losu komórkowego.
- Analizy ekspresji genów i białek ujawniają potencjał rozwojowy izolowanych komórek.
Wnioski
- Czynniki wewnętrzne w komórkach embrionalnych odgrywają znaczącą rolę w ich losie rozwojowym.
- Sygnały zewnętrzne z sąsiednich komórek są również ważne, ale mogą być izolowane dla badania.
- Ta metoda pozwala na lepsze zrozumienie mechanizmów wyznaczania losu komórkowego.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables direct testing of intrinsic versus extrinsic factors in cell fate determination, providing mechanistic de-risking for target validation in developmental pathways. By isolating single blastomeres with known lineage, it supports predictive confidence in early discovery by clarifying whether cellular responses are cell-autonomous or dependent on microenvironmental cues. This approach aids in distinguishing true target engagement from indirect effects, improving go/no-go decisions in preclinical target selection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypothesis by testing whether a cell’s fate is fixed or influenced by extrinsic signals, informing target autonomy.
- Operational Value: Uses fate maps to identify and isolate single precursors with known developmental potential, enabling precise experimental design.
- Predictive Value: Supports phenotypic screening readiness by establishing baseline autonomous behavior in a controlled, neighbor-free system.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, single-cell resolution readouts (e.g., SOX2 expression via in situ hybridization or qPCR) for pathway-specific reporter assays.
- Operational Value: Enables standardized, reproducible culture of isolated blastomeres in defined media without exogenous factors, reducing variability.
- Scalability: Compatible with multi-well plate formats, allowing parallel testing of multiple conditions or genetic perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links early fate commitment mechanisms to later tissue formation, supporting biomarker-aligned preclinical models.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypes require cell-cell communication, helping de-risk targets dependent on niche signaling.
- Predictive Confidence: Distinguishes cell-autonomous drivers from non-autonomous effects, improving target selection for modulation strategies.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, particularly for pathways where cellular context influences phenotype expression.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating variables to determine if a target’s effect is intrinsic or requires intercellular signaling.
- Screening: Produces standardized, quantitative outputs (e.g., marker gene expression) suitable for high-content or multiplexed assay formats.
- Analytics: Enables statistical comparison of fate outcomes across conditions, supporting replication and cross-functional data interpretation.
- Translational Research: Connects early embryonic decisions to later developmental stages, aiding in disease-relevant system modeling when lineage conservation exists.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for testing genetic or pharmacological perturbations in a defined, isolated cellular context.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by isolating intrinsic cellular properties from extrinsic microenvironmental influences.
- Operational Value: Promotes standardization through defined dissection, culture, and readout procedures, enhancing reproducibility across teams.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets whose efficacy depends on cell-autonomous function.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted advancement by clarifying whether a target’s modulation requires combination with microenvironment-modulating agents.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical dissection and fluorescence- or marker-guided cell identification using fate maps.
- Dependent on sterile culture infrastructure, including controlled-temperature incubators and precision pipetting tools for blastomere transfer.
- Necessitates standardization of culture conditions (e.g., MBS concentration, temperature) to ensure comparability across experiments.
- Must account for variability in embryo quality and cleavage symmetry when selecting donor cells for isolation.
- Limited to species with well-established fate maps and ex utero culture feasibility (e.g., Xenopus), restricting direct translation to mammalian systems without adaptation.
