Jednoczesne zapisy całych komórek z fotoreceptorów i neuronów drugiego rzędu w preparacie plastra siatkówki

Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie cienkich wycinków tkanki z siatkówki wodnej salamandry tygrysiej i wykorzystanie ich do jednoczesnego zapisu napięcia całych komórek z fotoreceptorów oraz komórek poziomych i dwubiegunowych drugiego rzędu. Osiąga się to poprzez najpierw wypreparowanie oka salamandry i odizolowanie siatkówki na kawałku błony nitrocelulozowej. Drugim krokiem jest wycięcie cienkich plasterków siatkówki i umieszczenie ich w komorze nagrywającej.

Następnie komora jest umieszczana na pionowym mikroskopie stałopozycyjnym, a pipety plastrowe są umieszczane nad plastrami siatkówki. Ostatnim krokiem jest uzyskanie zapisów całych komórek z presynaptycznej, fotoreceptorowej i postsynaptycznej komórki poziomej lub dwubiegunowej. Ostatecznie, sparowane nagrania całych komórek mogą być wykorzystane do manipulowania uwalnianiem synaptycznym i badania interakcji między komórkami w siatkówce.

Preparat plastrów siatkówki został pierwotnie opracowany w laboratoriach Franka Werblina i Sama Wu.W przeciwieństwie do preparatów jednokomórkowych, preparaty warstwowe zachowywały nienaruszony kontakt z siatkówką, a w przeciwieństwie do preparatów z całą siatkówką, cięcie siatkówki odsłania różne warstwy siatkówki, umożliwiając łatwy dostęp do wszystkich różnych typów komórek. W plastrze siatkówki. Preparaty mogą być stosowane do zapisów elektrofizjologicznych, w tym jednoczesnego zapisu dla wielu komórek oraz do eksperymentów obrazowych.

Preparat ten okazał się niezwykle cenny w badaniu oddziaływań synaptycznych między neuronami siatkówki. W tym filmie opisujemy przygotowanie plastrów przy użyciu siatkówki salamandry tygrysiej i podkreślamy niektóre drobne szczegóły, które mogą zadecydować o sukcesie lub porażce. Rozpocznij tę procedurę od zmontowania komory.

Umieść dwie kulki smaru próżniowego w odstępach od 8 do 10 milimetrów w poprzek komory nagrywania, aby utworzyć kanał dla super fase i osadzić plastry retinolu przy drugim uderzeniu smaru, kilka milimetrów za każdą z tych dwóch kulek tłuszczu, aby działały jako opłata ograniczająca rozlewanie się. Następnie umieść mały trójkątny kawałek chusteczki Kim na końcu komory, aby zapewnić kontakt płynu z elektrodą referencyjną. Następnie dociśnij kawałek membrany nitrocelulozowej płasko do szklanego mikroskopu.

Wsuń na dwie małe kulki smaru próżniowego. Aby przygotować krajalnicę do tkanek. Połam obosieczną żyletkę na cztery części.

Następnie przymocuj jeden z nich do ramienia do krojenia. Upewnij się, że krawędź tnąca żyletki przylega płasko do komory nagrywania, przecinając cienki plasterek bibuły filtracyjnej nitrocelulozy. Następnie, po eutanazji salamandry przez dekapitację, zarodkuje oko za pomocą pary małych nożyczek weneckich pod mikroskopem, przetnij skórę łączącą oko z otaczającą ją orbitą.

Następnie pociągnij oko do przodu i wsuń pod nie nożyczki, aby przeciąć mięśnie oka i nerw wzrokowy. Następnie umieść wyłuszczone oko na łóżku z bawełny na bloku linoleum. Teraz wykonaj małe nacięcie na środku rogówki ostrym ostrzem chirurgicznym.

Usuń rogówkę, wsuwając cienkie nożyczki Venice w nacięcie i rozciągając cięcie promieniście w kierunku aury Serrata. Następnie przetnij obwodowo wokół aury serrata, obracając blok linoleum lub bawełnę między nacięciami. Po przecięciu całego oka usuń rogówkę i soczewkę, wyciągając je z boku muszli ocznej.

Przenieś pozostałą muszlę oczną na twardą powierzchnię bloku linoleum zwilżoną roztworem soli fizjologicznej. Pokrój go na trzy części ostrą żyletką delikatnym ruchem piłowania, aby upewnić się, że przetnie całą twardówkę. Następnie umieść jeden lub dwa kawałki IUP na membranie nitrocelulozowej powierzchnią siatkówki skierowaną w dół.

Zanurz pozostałe kawałki w dodatkowej soli fizjologicznej. Następnie umieść je w lodówce na wypadek, gdyby później pokroić dodatkowe plasterki. Teraz delikatnie dociśnij kawałek IUP do membrany nitrocelulozowej za pomocą cienkich kleszczyków.

Zanurz membranę nitrocelulozową i kawałek IUP w kilku kroplach zimnej soli fizjologicznej. Następnie odcedź roztwór soli fizjologicznej, dotykając kawałka chusteczki Kim na krawędziach membrany nitrocelulozowej i iup. Następnie zanurz IUP w membranie nitrocelulozowej z kilkoma kroplami zimnego roztworu soli fizjologicznej.

Ponownie, następnie oderwij nabłonek barwnikowy siatkówki twardówki, naczyniówki, aby wyizolować siatkówkę. Jeśli siatkówka nie przylega szczelnie, odcedź sól fizjologiczną chusteczką kim. W celu mocniejszego naciągnięcia siatkówki na błonę nitrocelulozową należy wymienić sól fizjologiczną i w razie potrzeby powtórzyć procedurę.

Następnie napełnij komorę zimną solą fizjologiczną z. Przenieś go na etap krajalnicy do tkanek. Następnie pokrój błonę siatkówki i nitrocelulozy na cienkie paski o grubości 125 mikronów, delikatnie, ale mocno wciskając w nie żyletkę.

Po pocięciu całej siatkówki na plastry, przenieś wycinki siatkówki jeden po drugim do głównego kanału komory nagraniowej. Aby przenieść plasterek, przytrzymaj pasek membrany na miejscu, jednocześnie wsuwając komorę pod niego. Pamiętaj, aby plasterek był zanurzony, gdy znajduje się powyżej środkowej części komory.

Osadź krawędzie membrany nitrocelulozowej w paskach smaru próżniowego i obróć ją o 90 stopni. Aby wyświetlić warstwy siatkówki, dociśnij membranę nitrocelulozową płasko do powierzchni szkła, nawet jeśli na każdym elemencie nie ma siatkówki. Umieść paski membrany nitrocelulozowej w regularnych odstępach około milimetra, aby pomóc rozbić napięcie powierzchniowe, a tym samym poprawić przepływ płynu.

Kontynuuj przenoszenie plastrów jeden po drugim, aż plasterki zostaną umieszczone na całej długości kanału perfuzyjnego. Po przeniesieniu wszystkich warstw przenieś komorę zapisu na stolik pionowego mikroskopu stałostopniowego. Podłącz przewód elektrody odniesienia do przewodu uziemiającego na amplifier głowica stage.

Skoncentruj się na plastrach, korzystając z dużej odległości roboczej, zanurzenia w wodzie od 40 do 60 x obiektyw. Następny super. Stopij plastry z szybkością jednego milimetra na minutę z roztworem soli fizjologicznej z bąbelkami tlenu.

Podłącz przewód ssawny do przewodu wyjściowego komory. Następnie wyreguluj odpływ, aby zrównoważyć dopływ, obracając skośny koniec igły ssącej lub przesuwając chusteczkę kim na końcu komory bliżej lub dalej od otworu na końcu igły odpływowej. Sprawdź plastry w słabym świetle lub w podczerwieni.

Następnie zidentyfikuj parę komórek, fotoreceptor i pobliską komórkę poziomą lub dwubiegunową do sprzedaży hurtowej. Nagrywając pipetę Philip przygotowaną przed eksperymentami z roztworem wewnątrzkomórkowym, zamontuj ją na uchwycie elektrody. Następnie nieznacznie podnieś obiektyw mikroskopu.

Umieść pipetę fotoreceptorową pod obiektywem. Następnie opuść go tak, aby końcówka znajdowała się tuż nad plasterkiem i jednocześnie wyreguluj ostrość. Aby nie posuwać się za daleko.

Powtórz tę procedurę z drugą pipetą. Następnie sprawdź rezystancję pipety za pomocą impulsu depolaryzującego o napięciu od 5 do 10 miliwoltów. Dostosuj dowolne przesunięcie w podstawowym poziomie prądu na amplifier.

Następnie zastosuj lekkie nadciśnienie, a w międzyczasie ustaw pipetę postsynaptyczną tak, aby stykała się z poziomym lub dwubiegunowym korpusem komórki. Następnie umieść pipetę presynaptyczną tak, aby stykała się z ciałem komórki fotoreceptora pręcikowego lub czopkowego. Podczas monitorowania uwalniania rezystancji, nadciśnienia na pipecie postsynaptycznej, czasami uwolnienie nadciśnienia jest wystarczające do utworzenia uszczelki giga omów.

Gdy rezystancja końcówki wzrośnie do ponad 100 megaomów, zastosuj potencjał trzymania minus 60 miliwoltów. Następnie, gdy zostanie uzyskana uszczelka giga om, anuluj przejściową pojemność pipety. Korzystając z obwodu kompensacji pojemności wzmacniacza patch clamp, powtórz procedurę sufitu z pipetą fotoreceptorową, stosując potencjał podtrzymania minus 70 miliwoltów i anuluj pojemność pipety.

Przejściowy, a następnie rozerwij łatkę, przysysając do każdej komórki. Pęknięcie łatki jest widoczne po pojawieniu się przejściowej pojemności całego ogniwa. Teraz potwierdź fizjologicznie tożsamość komórki postsynaptycznej, stosując błysk świetlny i dostarczając serię kroków napięcia od minus 120 do plus 40 miliwoltów w przyrostach co 20 miliwoltów.

Aby ocenić, czy komórki są połączone synaptycznie, dostarcz od 25 do 100 milisekund 60 miliwoltów. Stopniowa depolaryzacja do fotoreceptora i szukanie prądów postsynaptycznych. W neuronie drugiego rzędu, oto reprezentatywne ślady reakcji świetlnych neuronów w pionowych wycinkach siatkówki salamandry.

Stożkowa komórka pozioma i wyłączone ogniwo bipolarne wyświetlają prąd na zewnątrz w odpowiedzi na nadejście światła. Wyraźny prąd wewnętrzny po błysku światła w poziomych i dwubiegunowych nagraniach komórek jest spowodowany zwiększonym uwalnianiem glutaminianu z fotoreceptorów, gdy depolaryzują się one przy przesunięciu światła. Komórka dwubiegunowa reaguje prądem wewnętrznym na początku światła, co wynika ze znaku odwracającego kaskadę sygnalizacyjną metabotropowego receptora glutaminianu i aktywacji kanałów tripm one.

Ogniwa poziome i ogniwa bipolarne można odróżnić od siebie na podstawie ich aktualnych relacji napięciowych. Ogniwa poziome mają zazwyczaj liniowe lub prostowane do wewnątrz zależności napięcia prądu o rezystancji wejściowej mniejszej niż 500 megaomów, ogniwa bipolarne mają prostowaną na zewnątrz zależność napięcia prądu i wyższą rezystancję wejściową od 0,5 do dwóch gigaomów. Rysunek ten przedstawia reprezentatywne wyniki z zapisów poziomej pary komórek stożkowych i dwubiegunowej pary komórek stożkowych.

W każdym przypadku depolaryzacja stożka do minus 10 miliwoltów z potencjału utrzymywania minus 70 miliwoltów wywołała bramkowany napięciem prąd wapnia w stożku i szybki postsynaptyczny do wewnątrz. Prąd w poziomym lub dwubiegunowym wycinku siatkówki komórki. Preparaty znalazły zastosowanie w setkach badań nad anatomią i fizjologią siatkówki.

Są one szczególnie przydatne do badania odpowiedzi wielu komórek jednocześnie, ponieważ ułatwiają rejestrowanie i obrazowanie z wielu komórek w tym samym czasie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak rozciąć siatkówkę, wyciąć cienkie plasterki siatkówki, umieścić je w komorze nagraniowej i uzyskać hurtowe nagrania z par synaptycznie połączonych jaźni.