Name: Seryjne wzbogacanie spermatogonialnych komórek macierzystych i progenitorowych (SSC) w hodowli w celu uzyskania długoterminowych linii SSC dorosłych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: Poznaj metodę uzyskiwania długoterminowych hodowli spermatogonialnych komórek macierzystych i progenitorowych z dorosłych myszy. Technika wykorzystuje komórki podporowe z jąder dorosłych osobników.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Departament Zdrowia Stanu Nowy Jork (C026878). M.S. był stypendystą New York Stem Cell Foundation-Druckenmiller Fellow. Współfinansowany częściowo z grantu badawczego nr 5-FY11-571 z Fundacji March of Dimes.

1. Przygotowanie komórek zasilających
Proszę zauważyć, że wszystkie odczynniki opisane poniżej powinny być przygotowane w sterylny sposób (patrz Tabele 1 i 2). Protokół ten wykorzystuje linię komórkową JK1 (Cell Biolabs, Inc., katalog #CBA-315) jako podajniki, która jest przekształconą pochodną komórek somatycznych jąder dorosłych myszy i została opisana w innym miejscu3. Należy również pamiętać, że wszystkie zabiegi na zwierzętach powinny być wykonywane zgodnie z wytycznymi i przepisami instytucjonalnymi.
<ol>
 <li>Komórki JK1 mogą być utrzymywane w hodowli i z powodzeniem wykorzystywane jako żywiciele do pasażu 39. Hodowla komórek JK1 w naczyniu do hodowli komórkowej o średnicy 100 mm (BD Falcon, katalog #353003) z 10 ml sterylizowanej filtrem pożywki wzrostowej (DMEM uzupełniony 10% płodową surowicą bydlęcą [FBS], 2 mM L-glutaminą i antybiotykami). Gdy kultura osiągnie 95% konfluencji, podziel komórki w stosunku 1:6 -1:10.</li>
 <li>Usuń pożywkę z monowarstwy ogniwa zasilającego JK1.</li>
 <li>Raz przemyj warstwę komórkową PBS bez wapnia i magnezu.</li>
 <li>Dodaj wstępnie podgrzaną trypsynę/EDTA, 1x (0,05% trypsyny/0,53 mM EDTA; Corning Cellgro, katalog #25-051-CI) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5-10 min.</li>
 <li>Dezaktywuj trypsynę równą objętością pożywki wzrostowej. Zebrać komórki i odwirować przy 300 x g przez 5 minut. Ponownie zawieś komórki w pożywce wzrostowej podajnika.</li>
 <li>Wstępnie pokryć wielodołkowe płytki do hodowli komórkowych, dodając tyle 0,4% roztworu żelatyny, aby przykryć studzienkę i usunąć po 5 minutach w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Płytka ~250 komórek namm2 w pokrytej żelatyną płytce do hodowli komórkowej (np. w formacie 48-dołkowym lub 6-dołkowym). Inkubować kulturę w temperaturze 37 °C przez 16–24 godzin.</li>
 <li>Usuń pożywkę hodowlaną ze studzienek. UWAGA: Aby dezaktywować wzrost komórek, dodaj świeży roztwór mitomycyny-C w stężeniu 10 μg/ml rozcieńczony w DMEM do każdego dołka (np. 200 μl/dołek dla płytki 48-dołkowej). Mitomycyna-C jest toksyczna. Obchodź się z nim i utylizuj go ostrożnie. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 4 godziny.</li>
 <li>Usuń roztwór mitomycyny-C z komórek. Umyj 3 razy DMEM przed posiewem komórek macierzystych.</li>
 <li>Usunąć DMEM z dołków komórek zasilających i dodać wystarczającą ilość pożywki z komórek macierzystych (100 μl/dołek z płytki 48-dołkowej; patrz Tabela 3), aby zapobiec wysuszeniu karmników podczas pasażowania. Dodać SSC tego samego dnia, jak opisano poniżej w sekcjach 3.1 lub 3.4, używając wskazanych rozmiarów studzienek zawierających podajniki.</li>
</ol>
2. Dysocjacja tkanki jądra myszy w celu uzyskania komórek rozrodczych dawcy
<ol>
 <li>Zbierz jądra dorosłych myszy w sterylny sposób i tymczasowo przechowuj jądra na przykrytej szalce Petriego (bez dodawania płynu). Naczynie należy natychmiast umieścić na lodzie, aby zapobiec wysuszeniu i utrzymać żywotność komórek.</li>
 <li>Używając sterylnych cienkich kleszczyków i cienkich nożyczek w kapturze do hodowli komórkowych, wykonaj poprzeczne nacięcie w osłonce białawej bez całkowitego przenikania jądra (tj. Przeciąć ~ 1/2-3/4 odległości) i użyj kleszczy, aby wycisnąć kanaliki nasienne w róg płytki; wyrzuć osłonkę i przyczepioną tkankę. Utrzymuj płytkę na lodzie przez cały czas, aby utrzymać tkankę w chłodzie, zachowując w ten sposób jej integralność i zapobiegając parowaniu.</li>
 <li>Szybko miel kanaliki cienkimi nożyczkami sprężynowymi co najmniej 3 minuty na jądro, trzymając talerz na lodzie.</li>
 <li>Zebrać fragmenty kanalików do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i przemyć w ~ 40 ml schłodzonej PBS/1% albuminy surowicy bydlęcej.</li>
 <li>Wirować przy 60 x g przez 10 minut, aby oddzielić fragmenty kanalików od plemników i szczątków. Odrzucić supernatant.</li>
 <li>W stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawiesić osad w 3 ml na jądro wstępnie podgrzanego buforu dysocjacyjnego (DMEM, 0,05% trypsyna, 0,03% kolagenazy typu I, 80 j./ml DNAzy I i 0,5% albuminy surowicy bydlęcej; Patrz Tabela 2 w celu uzyskania bardziej szczegółowych informacji na temat bufora dysocjacyjnego).</li>
 <li>Umieść stożkową rurkę poziomo w stojaku w wytrząsarce ustawionej na 150 obr./min w temperaturze 37 °C przez 15 minut, aby zmaksymalizować mieszanie.</li>
 <li>Wiruj w dół z prędkością 60 x g przez 10 minut, aby oddzielić pojedyncze komórki od niezdysocjowanych kawałków.</li>
 <li>Zachowaj granulat zawierający kawałki do następnego kroku. Zebrać supernatant z kroku 2.8 i dodać 3 ml DMEM/10% płodowej surowicy bydlęcej, aby zneutralizować bufor dysocjacyjny. Umieść probówkę na lodzie tymczasowo.</li>
 <li>Powtórz kroki od 2.6 do 2.7 z zapisanym osadem z kroku 2.9, aby ponownie strawić kawałki pozostałe po kroku 2.8.</li>
 <li>Dodaj równą objętość DMEM/10% FBS, aby zneutralizować bufor dysocjacyjny.</li>
 <li>Ponownie połącz zawiesinę z kroku 2.11 z zapisaną zawiesiną komórek z kroku 2.9. Wirować przez 5 minut przy 300 x g.</li>
 <li>Zawiesić osad w podłożu z komórkami macierzystymi w objętości 16 ml na parę jąder (patrz Tabela 3).</li>
</ol>
3. Poszycie zawiesiny komórek jądra
<ol>
 <li>Płytkę 2 ml zawiesiny komórkowej na basenik na płytce 6-dołkowej zawierającej komórki karmiące mitotycznie inaktywowane mitomycyną-C i umieścić w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .</li>
 <li>Po 48 godzinach odessać pożywkę, dodać 2 ml świeżej pożywki i wrócić do inkubatora.</li>
 <li>Po 48 godzinach dodać 0,5 ml świeżej pożywki z komórek macierzystych do każdej studzienki i ponownie umieścić w inkubatorze.</li>
 <li>Po 48 godzinach należy następnie karmić komórki trzy razy w tygodniu w następujący sposób, aż pojawią się duże, dyskretne kolonie (>50 komórek) (w ciągu 7 do 21 dni). Przy pierwszym i drugim karmieniu każdego tygodnia (np. w poniedziałek i środę) należy usunąć ~50% pożywki i dodać z powrotem 50% objętości świeżej pożywki. Przy trzecim karmieniu (np. w piątek) odessać całe podłoże i zastąpić je 2 ml świeżego podłoża. Podejście to opiera się na założeniu, że unikanie całkowitych zmian pożywki minimalizuje wahania stężeń sygnałów parakrynnych, które są wydzielane do pożywki hodowlanej9.</li>
</ol>
4. Wybieranie kolonii do pierwszego przejścia
<ol>
 <li>Usuń pożywkę z dołków zawierających kolonie, które mają być pasażowane, i dodaj świeżą pożywkę z komórek macierzystych.</li>
 <li>Zidentyfikuj kolonie za pomocą celu 10x. Przy lekko rozogniskowanym mikroskopie, kolonie SSC na krawędzi studzienki pojawią się jako jednorodne jasne grudki, składające się z wielu komórek o średnicy 11-12 μm, w których trudno lub niewyraźnie można dostrzec granice poszczególnych komórek, ponieważ komórki wydają się zrośnięte ze sobą (ryc. 1A). Kolonie inne niż SSC mogą wydawać się ciemniejsze, bardziej ziarniste lub mniej jednorodne, z dostrzegalnymi granicami (ryc. 1A, wstawka).</li>
 <li>Używając końcówki do pipety o pojemności 200 μl, przy pipetowniku ustawionym na 50 μl, najpierw nabierz pożywkę ze studzienki i wygładź ją, aby zwilżyć końcówkę. Następnie delikatnie popchnij kolonię końcówką, a następnie szybko wycofaj 50 μl pożywki, aby usunąć kolonię przez zassanie do końcówki (ryc. 1B).</li>
 <li>Wydalić pożywkę zawierającą kolonię do jednego dołka 48-dołkowej płytki zawierającej inaktywowane komórki zasilające ze 100 μl pożywki z komórek macierzystych (ryc. 1C).</li>
 <li>Powtórzyć krok 4.3 i dodać do 8 kolonii do tego samego dołka, nie przekraczając 500 μl na studzienkę.</li>
 <li>Powtórz kroki od 4.3 do 4.5, aby przygotować dodatkowe studzienki na płytce 48-dołkowej z przejściem jednej kolonii SSC.</li>
 <li>Studzienki będą gotowe do rozszczepienia w ciągu 7-14 dni lub po pojawieniu się dużych grudek do 500 komórek (ryc. 1D).</li>
</ol>
5. Późniejsza ekspansja i przejście SSC przez roztarcie
<ol>
 <li>Komórki podczas pasażu pierwszego powinny być subhodowane na świeże karmniki po maksymalnie 14 dniach w stosunku podziału 1:2 przez pierwsze 3 pasaże, a następnie 1:4 do 1:6 (co 7 dni) w następujący sposób. Delikatnie rozcierać kolonie z dołka częściowo zlewającego się (np. ~300 000 SSC/studzienkę na płytce 6-dołkowej) za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 ml, przemłukując pożywkę przez komórki. Można zobaczyć, jak kolonie się odłączają. Zbyt duża siła działająca ze strumieniem cieczy spowoduje, że niechciane ogniwa podajnika również odpadną.</li>
 <li>Zebrać rozdrobnione komórki do stożkowej probówki i odwirować przy 300 x g przez 5 minut. Uwaga: W tym miejscu można bezpiecznie dodać etap trypsynizacji, jeśli badacz sobie tego życzy.</li>
 <li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić w świeżej pożywce z komórkami macierzystymi, dokładnie pipetując w górę i w dół, aby rozbić kolonie.</li>
 <li>Płytki SSC na świeżo przygotowanych komórkach zasilających inaktywowanych mitomycyną-C, jak opisano w sekcji 1.</li>
 <li>Karm komórki trzy razy w tygodniu w następujący sposób. Przy pierwszym i drugim karmieniu (np. w poniedziałek i środę) dodać 50% objętościowo świeżego podłoża. Przy trzecim karmieniu (np. w piątek) odessać całe podłoże i zastąpić je 2 ml świeżego podłoża. Płytki zlewają się w ciągu 7-10 dni. Hodowle powinny składać się z >98% komórek rozrodczych (tj. <1% zanieczyszczających komórek somatycznych) po 5-7 pasażach, w oparciu o barwienie immunologiczne (np. przy użyciu mysiego markera komórek rozrodczych GCNA) w celu odróżnienia komórek rozrodczych od komórek somatycznych10. Uwaga: Metody te zostały opracowane zgodnie z przepisami i wymaganiami określonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Weill Cornell Medical College.</li>
</ol>

<ol><li>Kanatsu-Shinohara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+proliferation+in+culture+and+germline+transmission+of+mouse+male+germline+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Long-term proliferation in culture and germline transmission of mouse male germline stem cells.</a> Biol. Reprod. 69, 612-616 (2003).</li>
<li>Seandel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+multipotent+adult+stem+cells+from+GPR125%2B+germline+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of functional multipotent adult stem cells from GPR125+ germline progenitors.</a> Nature. 449, 346-350 (2007).</li>
<li>Kim, J., Seandel, M., Falciatori, I., Wen, D., Rafii, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD34%2B+testicular+stromal+cells+support+long-term+expansion+of+embryonic+and+adult+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">CD34+ testicular stromal cells support long-term expansion of embryonic and adult stem and progenitor cells.</a> Stem Cells. 26, 2516-2522 (2008).</li>
<li>Ogawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+morphological+characterization+of+mouse+spermatogonial+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Histol.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Derivation and morphological characterization of mouse spermatogonial stem cell lines.</a> Arch. Histol. Cytol. 67, 297-306 (2004).</li>
<li>Schmidt, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+aging+is+detrimental+to+mouse+spermatogonial+stem+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro aging is detrimental to mouse spermatogonial stem cell function.</a> Biology of Reproduction. 84, 698-706 (2011).</li>
<li>Zhang, X., Ebata, K. T., Robaire, B., Nagano, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+of+male+germ+line+stem+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Aging of male germ line stem cells in mice.</a> Biology of Reproduction. 74, 119-124 (2006).</li>
<li>Hobbs, R. M., Seandel, M., Falciatori, I., Rafii, S., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plzf+regulates+germline+progenitor+selfrenewal+by+opposing+mTORC1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Plzf regulates germline progenitor selfrenewal by opposing mTORC1.</a> Cell. 142, 468-479 (2010).</li>
<li>Nagano, M., Ryu, B. Y., Brinster, C. J., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+mouse+male+germ+line+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Maintenance of mouse male germ line stem cells in vitro.</a> Biol. Reprod. 68, 2207-2214 (2003).</li>
<li>Csaszar, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+expansion+of+human+hematopoietic+stem+cells+by+automated+control+of+inhibitory+feedback+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Rapid expansion of human hematopoietic stem cells by automated control of inhibitory feedback signaling.</a> Cell Stem Cell. 10, 218-229 (2012).</li>
<li>Enders, G. C., May, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmentally+regulated+expression+of+a+mouse+germ+cell+nuclear+antigen+examined+from+embryonic+day+11+to+adult+in+male+and+female%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Developmentally regulated expression of a mouse germ cell nuclear antigen examined from embryonic day 11 to adult in male and female.</a> 163, 331-340 (1994).</li>
<li>Oatley, J. M., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+spermatogonial+stem+cell+self-renewal+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of spermatogonial stem cell self-renewal in mammals.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 263-286 (2008).</li>
<li>Brinster, R. L., Zimmermann, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spermatogenesis+following+male+germ-cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Spermatogenesis following male germ-cell transplantation.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 91, 11298-11302 (1994).</li>
<li>Tang, L., Rodriguez-Sosa, J. R., Dobrinski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+Cell+Transplantation+and+Testis+Tissue+Xenografting+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice.</a> J. Vis. Exp. (60), e3545(2012).</li>
<li>Arnold, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2%28%2B%29+adult+stem+and+progenitor+cells+are+important+for+tissue+regeneration+and+survival+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Sox2(+) adult stem and progenitor cells are important for tissue regeneration and survival of mice.</a> Cell Stem Cell. 9, 317-329 (2011).</li>
<li>Yeh, J. R., Zhang, X., Nagano, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+short-term+in+vitro+assay+for+mouse+spermatogonial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Establishment of a short-term in vitro assay for mouse spermatogonial stem cells.</a> Biology of Reproduction. 77, 897-904 (2007).</li>
</ol>

M.S. otrzymuje tantiemy od Weill Cornell Medical College poprzez licencję dla Cell Biolabs, Inc. na dystrybucję komórek JK1.

Ta metoda wyprowadzania dorosłych SSC przy użyciu dorosłych komórek żywicielskich pochodzących z jąder jest solidna i odniosła sukces, gdy zastosowano wspólne tła genetyczne (np. FVB, C57Bl6 i mieszane 129SV/C57Bl/6) oraz różne zmutowane szczepy2,3,7,14. W rzeczywistości mikrośrodowisko stworzone przez system hodowli jest wystarczające do pokonania niektórych barier genetycznych utrudniających utrzymanie dorosłych SSC in vivo (np. w przypadku zwierząt plzf-/- )7...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-013</td><td>Rozcieńczalnik do buforu dysocjacyjnego</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Mediatech</td><td>25-051-CI</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka na bazie komórek macierzystych (StemPro-34)</td><td>Life Technologies</td><td>10639-011</td><td>Wymaga suplementacji zgodnie z Shinohara et al. (2003)*</td></tr> <tr><td>Pożywka z komórkami macierzystymi suplementuje</td><td>różne</td><td>patrz Tabela 3</td><td>Wymaga suplementacji zgodnie z Shinohara et al. (2003)*</td></tr> <tr><td>Komórki JK1</td><td>Cell Biolabs, Inc.</td><td>CBA-315</td><td>Może zastąpić dorosłymi komórkami zrębu jąder zgodnie z Seandel et al. (2007)</td></tr><tr><td>mitomycyna-C (UWAGA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4287</td><td>Toksyczny; Obchodź się ostrożnie.</td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td>0,4% roztwór w wodzie</td></tr><tr><td>Cyfrowy mikroskop odwrócony EVOS xl Zaawansowana</td><td>grupa mikroskopowa</td><td>-</td><td colspan=<td></td></tr><tr>"4">Tabela 1. Specjalne odczynniki i sprzęt. *Patrz Tabela 3</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-013</td><td>Rozcieńczalnik do buforu dysocjacyjnego</td></tr><tr><td>trypsyny (1:250)</td><td>Life Technologies</td><td>27250-018</td><td>Bufor dysocjacyjny: Końcowa kolagenaza 0,05% wag./obj</td></tr>., <tr><td>typ I, 235 U/ml</td><td>Bufor</td> dysocjacyjny Worthington <td>CLS1 235</td>: <td>Końcowa 0,03% wag./obj</td></tr>. <tr><td>DNAzyza I</td><td>Sigma-Aldrich</td>Bufor dysocjacyjny <td>DN25</td><td>: Końcowa 80 U/ml</td></tr><tr><td>albuminy surowicy bydlęcej</td><td>ICP Bio</td><td>ABRE-100g</td><td>Bufor dysocjacyjny: Końcowy 0,5% wag./obj</td></tr><tr><td colspan="4"><silny>Tabela 2. Bufor dysocjacyjny</td></tr><tr><td>StemPro-34 SFM</td><td>Life Technologies</td><td>10639-011</td><td></td></tr><tr><td>StemPro-34 Suplement odżywczy</td><td>Life Technologies</td><td>10639-011</td><td></td></tr><tr><td><silny>Dodatkowe suplementy**</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7145</td><td>1X</td></tr><tr><td>MEM Witamina roztwór</td><td>Life Technologie</td><td>11120-052</td><td>1X</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Mediatech</td><td>25-005</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>albumina surowicy bydlęcej</td><td>ICP Bio</td><td>ABRE</td><td>0,50%</td></tr> <tr><td>roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy</td><td>Mediatech</td><td>30-004-CI</td><td>1X</td></tr><tr><td>D(+)glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8769</td><td>6 mg/ml</td></tr><tr><td>&#946;-estradiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2758</td><td>30 ng/ml</td></tr><tr><td>progesteron</td><td>Calbiochem</td><td>5341</td><td>60 ng / ml</td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca</td><td>zmienna</td><td>n/a</td><td>1%</td></tr> <tr><td>bydlęca holotransferyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1283</td><td>100 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>insuliny</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>700-112P</td><td>25 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>ludzki GDNF</td><td>Life Technologies</td><td>PHC7041</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>ludzki bFGF</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0023</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>mysi EGF</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0313</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>putrescyny</td><td>Research Organics</td><td>0778P</td><td>60 &mu; M</td></tr><tr><td>Selenin sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5261</td><td>30 nM</td></tr><tr><td>Kwas pirogronowy</td><td>Alfa Aesar</td><td>A13875</td><td>30 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Kwas DL-mlekowy</td><td>J.T. Baker</td><td>0196-04</td><td>1 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>&#946;-mercapt&#8211; tanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td>50 &mu; M</td></tr><tr><td>kwas askorbinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td>100 &mu; M</td></tr><tr><td>D-biotyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4639</td><td>10 &mu; g/ml</td></tr><tr><td colspan="4"><silny>Tabela 3. Pożywka z komórkami macierzystymi </td></tr><tr><td colspan="4">*Uwaga: Dodaj suplementy poniżej przed użyciem pożywki. Filtruj, sterylizuj i utrzymuj w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Pożywka jest stabilna przez co najmniej 2 tygodnie.</td></tr><tr><td colspan="4">**Użyliśmy różnych producentów, preparatów i/lub numerów partii tych odczynników bez żadnych widocznych szkodliwych skutków. Ogólnie rzecz biorąc, należy stosować odczynniki do hodowli komórkowych.</td></tr></tbody></table>

seryjne wzbogacanie spermatogonialnych komórek macierzystych i progenitorowych (ssc) w hodowli w celu uzyskania długoterminowych linii ssc dorosłych myszy

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells (SSCs) in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Spermatogonialne komórki macierzyste i progenitorowe (SSC) jądra reprezentują klasyczny przykład komórek macierzystych dorosłych ssaków i zachowują płodność przez prawie całe życie zwierzęcia. Chociaż dokładne mechanizmy rządzące samoodnawianiem i różnicowaniem in vivo są trudne do zbadania, wcześniej opracowano różne systemy do rozmnażania mysich SSC in vitro przy użyciu kombinacji specjalistycznych pożywek hodowlanych i komórek zasilających1-3.
Większość prób in vitro w dziedzinie biologii SSC wywodzi linie komórkowe od noworodków, prawdopodobnie z powodu trudności w uzyskaniu linii komórek dorosłych4. Jednak jądro dojrzewa do ~5 tygodnia życia u większości szczepów myszy. We wczesnym okresie poporodowym zachodzą dramatyczne zmiany w architekturze jądra oraz w biologii zarówno komórek somatycznych, jak i plemnikotwórczych, w tym zmiany w poziomach ekspresji licznych genów związanych z komórkami macierzystymi. W związku z tym linie SSC pochodzące od noworodków mogą nie oddawać w pełni biologii dorosłych SSC, które utrzymują się po osiągnięciu przez dorosłe jądro stanu równowagi.
Kilka czynników historycznie utrudniało produkcję dorosłych linii SSC. Po pierwsze, odsetek funkcjonalnych komórek macierzystych może zmniejszyć się w wieku dorosłym, zarówno z powodu czynników wewnętrznych, jak i zewnętrznych5,6. Ponadto, podobnie jak w przypadku innych dorosłych komórek macierzystych, trudno było wystarczająco wzbogacić SSC z całkowitej liczby dorosłych komórek jąder bez zastosowania kombinacji immunoselekcji lub innych strategii sortowania7. Powszechnie stosowane strategie obejmują wykorzystanie myszy z wnętrostwem jako źródła komórek dawcy ze względu na wyższy stosunek komórek macierzystych do innych typów komórek8. Opierając się na hipotezie, że usunięcie komórek somatycznych z początkowej hodowli zakłóca interakcje z niszą komórek macierzystych, które są niezbędne do przeżycia SSC, wcześniej opracowaliśmy metody uzyskiwania dorosłych linii, które nie wymagają immunoselekcji ani dawców wnętrostwa, ale raczej wykorzystują seryjne wzbogacanie SSC w hodowli, zwane dalej SESC2,3.
Metoda opisana poniżej obejmuje prostą procedurę wyprowadzania linii SSC dla dorosłych poprzez dysocjację kanalików nasiennych dorosłego dawcy, a następnie posiewanie komórek na karmnikach składających się z linii komórek zrębu jądra (JK1)3. Poprzez seryjne pasażowanie, silnie przylegające, zanieczyszczające komórki nierozrodcze są wyjmowane z hodowli z jednoczesnym wzbogacaniem SSC. Kultury wyprodukowane w ten sposób zawierają mieszaninę spermatogonii na różnych etapach różnicowania, które zawierają SSC, w oparciu o długoterminową zdolność do samoodnawiania. Istotą metody SESC jest to, że umożliwia ona SSC trudne przejście od samoodnawiania się in vivo do długotrwałej samoodnawiania in vitro w radykalnie odmiennym mikrośrodowisku, wytwarza długoterminowe linie SSC, wolne od zanieczyszczeń komórek somatycznych, a tym samym umożliwia późniejszą eksperymentalną manipulację SSC.

Wygląd kolonii dorosłych SSC typu dzikiego w pasażu zero po 7 dniach przedstawiono na Rysunku 1. Trójwymiarowe kolonie składają się z warstwy płaskich komórek przytwierdzonych do komórek karmicielskich lub podścielonej macierzy zewnątrzkomórkowej zdeponowanej przez komórki karmicielskie, z wieloma warstwami SSC rosnącymi na górze. Podczas gdy zdrowe SSC są silnie refrakcyjne i mają jednorodną średnicę 11-12 μm, granice komórek są trudne do rozróżnienia, a wielkość kolonii może być wysoce zmienna, zarówno...

Prosta metoda pozyskiwania i utrzymywania linii komórek macierzystych i progenitorowych spermatogoniów od dorosłych myszy jest przedstawiona tutaj. Metoda wykorzystuje komórki zasilające pochodzące z przedziału komórki somatycznej jądra dorosłej myszy. Ta technika ma zastosowanie do popularnych szczepów myszy, w tym myszy transgenicznych, nokautujących i knock-in.

Seryjne wzbogacanie spermatogonialnych komórek macierzystych i progenitorowych (SSC) w hodowli w celu uzyskania długoterminowych linii SSC dorosłych myszy

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly ...

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie długoterminowych kultur dorosłych komórek myszy, spermatogonii, komórek macierzystych i progenitorowych lub SSC. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie inaktywowanych tonicznie komórek zasilających. Następnie przygotowuje się zawiesinę komórek jądra przez enzymatyczną dysocjację dorosłej tkanki jądra.Następnie komórki jąder są umieszczane na komórkach zasilających, aby umożliwić utworzenie kolonii SSC. Ostatnim krokiem procedury jest ręczne wybranie przypuszczalnych kolonii SSC do subkultury w małych studniach hodowlanych. Ostatecznie długoterminowa odnowa komórkowa i ekspansja SSC w wielu pasażach in vitro może być potwierdzona przez barwienie immunologiczne dla markerów o szerokiej ekspresji komórek rozrodczych, a dokładniej SSC.Oraz poprzez analizę funkcjonalną z wykorzystaniem przeszczepu SSC in vivo. Ogólnie rzecz biorąc, osoby początkujące w tej metodzie będą miały trudności, ponieważ identyfikacja małych kolonii SSC za pomocą mikroskopii fazowej jest niezwykle trudna. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy pobierania kolonii są trudne do nauczenia, ponieważ może być trudno zobaczyć kolonie SSC na złożonym tle innych typów komórek, które są obecne we wcześniejszych stadiach hodowli.Aby rozpocząć, przygotuj komórki karmicielskie poprzez hodowlę komórek JK w 100-milimetrowym naczyniu do hodowli komórek z 10 mililitrami wysterylizowanej pożywki wzrostowej z filtrem. Gdy kultura osiągnie 95% konfluencji, podziel komórki w stosunku jeden do sześciu do jednego do 10, najpierw myjąc komórki raz PBS nie zawierającym wapnia ani magnezu w Prewarm. Wypróbuj trypsynę EDTA i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć do 10 minut z równą objętością wzrostu karmnika.Pożywka dezaktywuje trypsynę, zbiera komórki i wiruje w temperaturze 300 razy G przez pięć minut. Następnie ponownie zawieś komórki we wzroście podajnika. Średnio preco wielodołkowe płytki do hodowli komórkowych, dodając tyle 0,4% roztworu żelatyny, aby przykryć studzienkę, inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Następnie usuń nadmiar płytki z roztworem około 250 komórek na milimetr kwadratowy z płytek pokrytych żelatyną i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 do 24 godzin. Następnie usuń pożywkę hodowlaną z dołków. Następnie dezaktywuj wzrost komórek, dodając świeży roztwór mitomycyny C. Inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery godziny.Następnie usuń roztwór mitomycyny C z komórek i umyj je trzykrotnie DMEM. Po usunięciu końcowego płukania DMEM, dodaj wystarczającą ilość pożywki z komórek macierzystych, aby zapobiec wysuszeniu karmników podczas pakowania. Dodać SSC tego samego dnia po pobraniu jąder dorosłych myszy w sterylny sposób, tymczasowo.Przechowuj je na przykrytej szalce Petriego i natychmiast umieść na lodzie, aby zapobiec wysuszeniu i utrzymać żywotność komórek w kapturze do hodowli komórkowych. Używając sterylnych cienkich kleszczyków i cienkich nożyczek, wykonaj poprzeczne nacięcie w osłonce brzucha bez całkowitego przenikania jąder i użyj kleszczy, aby wycisnąć kanaliki nasienne w róg płytki, trzymając płytkę na lodzie. Użyj cienkich nożyczek sprężynowych, aby szybko wybić kanaliki przez co najmniej trzy minuty na parę jąder.Zebrać fragmenty kanalików w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów i przemyć w około 40 mililitrach schłodzonego 1% BSA w wirówce PBS w temperaturze 60 razy G przez 10 minut. Aby oddzielić fragmenty kanalików od plemników i szczątków, odrzuć supernatant dla każdej pary jąder. Resus zawiesza osad w trzech mililitrach swobodnie ogrzanego buforu dysocjacyjnego.Umieść rurkę stożkową poziomo w stojaku w wytrząsarce ustawionej na 150 obr./min w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 15 minut. Aby zmaksymalizować pobudzenie. Obracaj w dół z prędkością 60 razy G przez 10 minut, aby oddzielić pojedyncze komórki od niepowiązanych fragmentów.Zebrać supernatant w oddzielnej stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów zawierającej trzy mililitry DMEM 10% FBS w celu zneutralizowania buforu dysocjacyjnego. Umieść probówkę na lodzie, tymczasowo poddaj niepowiązane kawałki kolejnej rundzie dysocjacji, a następnie neutralizacji i połącz pierwszą probówkę z drugą wirówką probówkową na pięć minut po 300 razy. G resus.Zawiesić osad w podłożu z komórkami macierzystymi w objętości 16 mililitrów na płytkę jądra. Dwa mililitry zawiesiny komórek na studzienkę w sześciodołkowej płytce zawierającej komórki zasilające. Inaktywowany mitotycznie mitomycyną C. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla po 48 godzinach.Zassać pożywkę. Dodać dwa mililitry świeżej pożywki i umieścić próbki z powrotem w inkubatorze. 48 godzin później.Dodaj 0,5 mililitra świeżej pożywki z komórek macierzystych do każdej studzienki i wróć do inkubatora po dodatkowych 48 godzinach. Karm komórki trzy razy w tygodniu w następujący sposób, aż pojawią się duże, dyskretne kolonie liczące więcej niż 50 komórek do rutynowego karmienia i karmienia. Dwa. Usuń około 50% pożywki i dodaj z powrotem równoważną objętość świeżego podłoża dla trzeciego. Żywienie.Odessać całą pożywkę pod miejscem z dwoma milimetrami świeżego podłoża. Po zastąpieniu pożywki świeżym pasażem z komórek macierzystych, komórki najpierw używają obiektywów 10 x i 20 x do identyfikacji kolonii za pomocą mikroskopu lekko nieostrych. Kolonie SSC na krawędzi studni będą wyglądały jak jednorodne, jasne grudki składające się z wielu komórek o średnicy od 11 do 12 mikronów, w których trudno lub nie można dostrzec granic poszczególnych komórek.Ponieważ komórki wydają się ze sobą zrośnięte, kolonie inne niż SSE mogą wydawać się ciemniejsze, bardziej ziarniste lub mniej jednorodne z dostrzegalnymi granicami. Używając końcówki do pipety o pojemności 200 mikrolitrów z pipetownikiem wysłanym do 50 mikrolitrów, pobierz pożywkę ze studzienki i wyrzuć ją, aby zwilżyć końcówkę. Następnie za pomocą końcówki delikatnie popchnij kolonię, a następnie szybko wycofaj 50 mikrolitrów pożywki, aby usunąć kolonię przez zassanie do końcówki, wyrzuć pożywkę zawierającą kolonię do jednego dołka 48-dołkowej płytki zawierającej inaktywowane komórki karmiące 100 mikrolitrami pożywki z komórek macierzystych.Dodaj do ośmiu kolonii do tej samej studzienki, nie przekraczając 500 mikrolitrów na studzienkę i przygotuj dodatkowe dołki z 48-dołkowej płytki. Wraz z przejściem jednej kolonii SSC w ciągu siedmiu do 14 dni lub po pojawieniu się dużych kęp do 500 sztuk, studnie będą gotowe do podziału na subkultury komórek, które przejdą. Jeden na świeże tłumiki.Użyj jednomililitrowej końcówki pipety, aby dobrze zlać kolonie półzlewu, delikatnie przemywając pożywkę w poprzek komórek, aby poluzować kolonie, nie zakłócając jednocześnie niechcianych komórek zasilających. Zebrać rozdrobnione komórki do stożkowej probówki i wirować w temperaturze 300 razy G przez pięć minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w świeżej pożywce z komórek macierzystych, dokładnie pipetując w górę iw dół, aby rozbić kolonie.Płytki SSC na świeżo przygotowanych komórkach zasilających inaktywowanych mitomycyną C, jak opisano wcześniej w tym filmie, dzieląc je w stosunku jeden do dwóch przez pierwsze trzy przejścia, a następnie jeden do czterech do jednego do sześciu. Następnie stosuj harmonogram trzech karmień w tygodniu, jak opisano wcześniej. Płytki powinny zlewać się po siedmiu do 10 dniach po pięciu do siedmiu przejściach.Hodowle powinny składać się z więcej niż 98% pokazanych tutaj komórek rozrodczych jest pasażem. Zero kolonii dorosłych SSC typu dzikiego po siedmiu dniach, trójwymiarowe kolonie składają się z warstwy płaskich komórek przyczepionych do karmników lub leżącej pod spodem macierzy zewnątrzkomórkowej zdeponowanej przez karmniki z wieloma warstwami SSC rosnącymi na wierzchu. Podczas gdy zdrowe SSC mają jasno załamujące się płytki i jednolicie średnicę od 11 do 12 mikronów, granice komórek są trudne do odróżnienia, a wielkość kolonii może być bardzo zmienna, zarówno w studzince, jak i między studzienkami przygotowanymi z różnych myszy.Należy zauważyć, że morfologia komórek karmiciela będzie się stopniowo zmieniać po przejściu z DMEM 10% na pożywkę do hodowli komórek macierzystych po inaktywacji mitomycyną C. Pokazano tutaj duże kolonie większe niż 50 komórek, które są ręcznie przenoszone do nowej studzienki. struktura to dla porównania końcówka pipety. Inaktywowane komórki podajnika JK one są pokazane tutaj.Bez SSC duże, ciasno upakowane kolonie będą obecne przed rutynową subkulturą, jak pokazano na tym obrazie, i mogą być ciasno lub luźno zakotwiczone w leżącej poniżej powierzchni. Przy odrobinie praktyki takie kolonie można zbierać, tując lub delikatnie myjąc płytkę bez poważnego zakłócania komórek zasilających. Pod spodem zebrane kolonie można rozbić mechanicznie, pipetując w górę iw dół lub postępując zgodnie z tą procedurą.Inne metody, takie jak przeszczep komórek macierzystych spermatogonii, można przeprowadzić, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, jaka frakcja komórek rozrodczych w określonym zestawie warunków hodowli reprezentuje autentyczne funkcjonalne SSC in vivo. Po obejrzeniu tego filmu będziesz dobrze wiedział, jak wizualnie identyfikować kolonie i zakładać długoterminowe kultury.

serial-enrichment-spermatogonial-stem-progenitor-cells-sscs-culture

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Serialne wzbogacanie komórek macierzystych i progenitorowych jąder plemnikowych (SSC) w hodowli w celu uzyskania długoterminowych linii SSC dorosłych myszy

Zdolność embrionalnych komórek zarodkowych do różnicowania się w pierwotne komórki płciowe podczas wczesnych etapów rozwoju stanowi idealny model do zweryfikowania naszej hipotezy dotyczącej nowotworów i niepłodności. Niniejszy protokół przedstawia sposób izolacji pierwotnych komórek płciowych z rozwijających się gonad w embrionach myszy w 10,5–11,5 dniu po zapłodnieniu (post coitum).

Izolacja i hodowla zarodkowych komórek macierzystych myszy

Technika mikrodysekcji eksplantów jest solidną i niezawodną metodą izolacji proliferujących komórek mięśni szkieletowych z mięśni młodocianych, dorosłych lub embrionalnych w celu pozyskania macierzystych komórek mięśni szkieletowych. Wyjątkowo komórki te zostały wyprowadzone klonalnie, co pozwoliło na stworzenie linii macierzystych komórek mięśni szkieletowych wykorzystywanych do transplantacji in vivo.

Kultura mikroeksplantów szkieletowych mięśni dorosłych i embrionalnych oraz izolacja komórek macierzystych mięśni szkieletowych

Niniejszy protokół wideo demonstruje zastosowanie testu neurosfer do izolacji i ekspansji komórek macierzystych mózgu z eminencji zwojowych mózgu myszy w 14. dniu embrionalnym.

Ustanowienie hodowli embrionalnych neuralnych komórek macierzystych myszy z wykorzystaniem testu neurosferowego

Generowanie linii indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych (iPSC) prowadzi do powstania linii o różnym potencjale rozwojowym, nawet jeśli przechodzą one standardowe testy na pluripotencję. W niniejszym materiale opisujemy protokół otrzymywania myszy pochodzących w całości z iPSC, co definiuje linie iPSC jako posiadające pełną pluripotencję1.

Generowanie myszy pochodzących z indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół jednoczesnego generowania kultur neuronalnych komórek prekursorowych, jako przylegających monowarstw lub neurosfer, ze strefy podkomorowej i zakrętu zębatego poszczególnych dorosłych myszy.

Jedna mysz, dwie kultury: izolacja i hodowla dorosłych nerwowych komórek macierzystych z dwóch stref neurogennych poszczególnych myszy

Ustanowienie systemów hodowli do ekspansji dorosłych nerwowych komórek macierzystych (aNSC) pozwala na badanie i zastosowanie aNSC w terapii. Strefa podmodzelowa (SCZ) została niedawno uznana za nowy region tworzący neuroblasty u dorosłych myszy. W tym miejscu opisano metody izolacji, ekspansji i różnicowania SCZ-aNSC.

Izolacja i hodowla dorosłych nerwowych komórek macierzystych ze strefy podmodzelowej myszy

Ten artykuł opisuje protokół efektywnego pozyskiwania i hodowli pluripotencjalnych linii komórek macierzystych z embrionów myszy w stadium blastocysty.

Pozyskiwanie linii komórek macierzystych z zarodków myszy przed implantacją

Tutaj wprowadzamy nowatorską technikę mikrochirurgiczną do izolacji nerwowych komórek macierzystych z wyniosłości zwojowej zarodka myszy E13.

Izolacja i hodowla embrionalnych mysich nerwowych komórek macierzystych

Prezentowany tutaj jest protokół wzbogacania spermatocytów pachytenowych, okrągłych spermatyd i wydłużania spermatyd z jąder dorosłych myszy za pomocą nieciągłego gradientu gęstości albuminy surowicy bydlęcej za pomocą standardowego sprzętu laboratoryjnego.

Wzbogacanie spermatocytów pachytenowych i spermatydów z jąder myszy przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego

Tutaj prezentujemy prostą i skuteczną metodę izolowania żywych mejotycznych i postmejotycznych komórek rozrodczych od jąder dorosłych myszy. Korzystając z barwnika wiążącego DNA o niskiej cytotoksyczności, wzbudzonego fioletem i sortowania komórek aktywowanego fluorescencją, można wyizolować wysoce wzbogacone populacje komórek spermatogennych do wielu dalszych zastosowań.

Izolacja mysich komórek spermatogennych za pomocą fioletowo-wzbudzonego, przepuszczalnego dla komórek barwnika wiążącego DNA

Tutaj wprowadzamy metodę wykonywania okrągłych wstrzyknięć spermatyd (ROSI) u myszy, technikę o obiecujących zastosowaniach klinicznych i użyteczność do badania mechanizmów leżących u podstaw rozwoju embrionalnego.

Wstrzyknięcie okrągłego plemnika myszy

Poznaj metodę uzyskiwania długoterminowych hodowli spermatogonialnych komórek macierzystych i progenitorowych z dorosłych myszy. Technika wykorzystuje komórki podporowe z jąder dorosłych osobników.

Seryjne wzbogacanie spermatogonialnych komórek macierzystych i progenitorowych (SSC) w hodowli w celu uzyskania długoterminowych linii SSC dorosłych myszy (Wideo) | JoVE Journal

Seryjne wzbogacanie spermatogonialnych komórek macierzystych i progenitorowych (SSC) w hodowli w celu uzyskania długoterminowych linii SSC dorosłych myszy

Przeglądaj więcej filmów