LeafJ: Wtyczka ImageJ do półautomatycznego pomiaru kształtu liści

Celem tej procedury jest zautomatyzowanie pomiaru kształtu liści w eksperymentach o wysokiej przepustowości. Osiąga się to poprzez najpierw wypreparowanie liści i zobrazowanie ich za pomocą skanera płaskiego. Drugim krokiem procedury jest użycie wtyczki leaf J do wykrycia i zmierzenia liści.

Trzecim krokiem jest przygotowanie liści do mikroskopii i sfotografowanie ich za pomocą mikroskopu złożonego. Ostatnim krokiem jest prześledzenie linii sprzedaży na pozyskanych obrazach za pomocą tabletu z ekranem dotykowym. Ostatecznie wyniki mogą pokazać różnice w kształcie liści, wielkości komórek i liczbie komórek dzięki tej kombinacji analizy obrazu.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami jest jej szybkość. To około sześć razy szybciej niż pomiar ręczny. Osoby wiedziały, że ta metoda może mieć problemy, ponieważ prawidłowe ułożenie liści ma kluczowe znaczenie dla dalszej analizy, a montaż liści na prowadnicach może być technicznie trudny.

Po raz pierwszy wpadłem na pomysł tej metody, gdy zdałem sobie sprawę, że mamy około 15 000 liści do analizy, a robienie tego ręcznie zajęłoby wiele miesięcy i byłoby niewiarygodnie nudne, pokazując, że technika preparowania roślin powodowałaby neuro zue. Naukowiec z mojego laboratorium Zacznij od przygotowania przezroczystych arkuszy o wymiarach 8,5 na 11 cali. Każdy arkusz powinien być podzielony na prostokątne ramki, wystarczająco duże, aby pomieścić liście z jednej rośliny, zwężając drugi arkusz przezroczystości do zadrukowanego arkusza, aby służył jako osłona zapobiegająca wysychaniu liści.

Etykieta z rośliną, genotypem i warunkami wzrostu. Wytnij liście 26. roślin dayla. Ułóż liście na przezroczystości w kolejności taktycznej od najmłodszego do najstarszego.

Ustaw liście pionowo w ramce, nie dotykając obramowania ani nie zachodząc na inne liście. W przeciwnym razie pojawią się problemy Podczas analizy, Ważne jest, aby orientalne liście nie stykały się pionowo, rama, nie zachodziły na siebie Z ułożonymi liśćmi. Ułóż je na kanapie z drugim pustym arkuszem przezroczystości i stojakiem, aby liście były płaskie.

Następnie wygeneruj obraz za pomocą skanera płaskiego o rozdzielczości co najmniej 600 punktów na cal. Zacznij od zainstalowania wtyczki. Pobierz obraz J i przeciągnij plik jja liścia do folderu wtyczek obrazu J. Gdy używany jest obraz J, wtyczka liścia J będzie teraz dostępna.

Kontynuuj otwieranie pliku obrazu liścia na obrazie J. Upewnij się, że obraz J jest w wersji 1.45 s lub nowszej. Podziel obraz na trzy kanały kolorów: czerwony, zielony i niebieski, klikając kanały podziału kolorów obrazu. Następnie zastosuj próg do obrazu w niebieskim kanale.

Teraz wybierz wszystkie liście z jednej rośliny za pomocą prostokątnego narzędzia do zaznaczania, a następnie wybierz wtyczkę liścia J. Wtyczka otworzy teraz okno, które pozwala na ustawienie różnych warunków eksperymentu, takich jak grupa eksperymentalna i genotyp. Zanim przejdziesz dalej, edytuj te opcje, a następnie wybierz warunki dla wybranych liści w obszarze zainteresowania i podaj opisową nazwę.

Naciśnij kontynuuj, a liść J automatycznie obrysuje każdy liść unikalnym obrazem ROI. Procedury J dopasowują się do elipsy do ostrza i w razie potrzeby obliczają główną i pomocniczą oś tej elipsy. Edytuj linie śledzenia za pomocą okna menedżera ROI.

Do tej procedury przydatny może być tablet z ekranem dotykowym podłączony jako monitor zewnętrzny. Po prawidłowym zdefiniowaniu granic wykonaj analizę, naciskając. Okej, teraz liść J wyświetla długość płatka i różne geometrie blaszki liściowej.

Na koniec wyeksportuj wyniki pomiarów i powiązane informacje do arkusza kalkulacyjnego. Po zeskanowaniu liści napraw je w F-A-A-F-A. Stałe liście można przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do sześciu miesięcy.

Idąc do przodu godzinę lub dwie przed obrazowaniem, liście usuwają liście, zmieniając utrwalacz FAA na roztwór chlorohydratu. Po oczyszczeniu zamontuj liście na szkiełkach z włoskami skierowanymi do góry, używając 40-krotnego powiększenia na złożonym obrazie mikroskopowym, warstwie mesil środka każdego liścia po obu stronach głównej żyły, unikając komórek w pobliżu trichomów lub żył. Aby uniknąć trudności w przetwarzaniu obrazu, ważne jest, aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza ze slajdów podczas montażu liści, a także uzyskać ostre obrazy w następnym kroku.

Po zebraniu żądanych obrazów otwórz jeden na obrazie J i obrysuj kontury komórek liścia za pomocą narzędzia do zarządzania JROI za pomocą tabletu z ekranem dotykowym i rysika. Nie korzysta to z wtyczki LEAF J. Przed użyciem LEAF J do eksperymentów, dokładność i szybkość wtyczki została porównana z dokładnością i szybkością doświadczonego badacza. Kombinezon.

Liść J zakończył się wynikiem 5,7 szybciej niż w obliczeniach ręcznych, a porównanie danych z obu metod wykazało, że wyniki były ściśle skorelowane dla wszystkich zmierzonych parametrów z 3 532 porównanych. Punkty danych 172 stanowiły wartości odstające. Spośród tych wartości odstających 29 zostało spowodowanych przez wtyczkę LEAF J, a liczba 143 została spowodowana błędem ludzkim.

Podczas ręcznego pomiaru liść J został zaktualizowany, aby jeszcze bardziej zmniejszyć liczbę błędów. Opierając się na pomiarach LEAF J, wykorzystano je do oceny unikania cienia przy użyciu modelu efektów mieszanych. Leczenie i liczba liści były efektami stałymi, a replikacja była efektem losowym.

Na wiele parametrów istotny wpływ miała obróbka kolorystyczna. Alternatywnie, na niektóre parametry nie miał znaczącego wpływu cień. Za pomocą obrazowej analizy parametrów komórkowych wspomaganej tabletkami zbadano 67 genotypów Arabidopsis ANA, w sumie 8 629 komórek z 877 liści 224 roślin.

Genotypy zostały następnie pogrupowane w sześć klas. Większość genotypów ma normalną wielkość i liczbę komórek. Jednak kilka z nich miało większy rozmiar komórki przy normalnej liczbie komórek.

Chociaż próba tej procedury jest ważna, aby stosować losowość i projektowanie eksperymentalne podczas uprawy roślin, pamiętaj, że praca z formaldehydem i chlorohydratem może być bardzo niebezpieczna. Dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zachować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i praca pod wyciągiem. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić wysokoprzepustowe badania przesiewowe fenotypów liści i komórek przy użyciu własnych warunków eksperymentalnych Postępując zgodnie z tą procedurą.

Dodatkowe metody, takie jak sekwencjonowanie RNA, można wykorzystać, aby odpowiedzieć na pytania, które geny skutecznie kształtują.