Name: Litografia sił kapilarnych w inżynierii tkankowej serca (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Odkryj litografię sił kapilarnych w inżynierii tkankowej serca. Ta metoda umożliwia wytwarzanie biomimetycznych podłoży do hodowli komórek kardiomiocytów z precyzyjnym nanorzeźbieniem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

D. H. Kim dziękuje Wydziałowi Bioinżynierii Uniwersytetu Waszyngtońskiego za nowy fundusz startowy. D. H. Kim jest również wspierany przez Perkins Coie Award for Discovery, Wallace H. Coulter Foundation Translational Research Partnership Award, Washington State Life Science Discovery Fund oraz American Heart Association Scientist Development Grant (13SDG14560076). J. Macadangdang i A. Jiao dziękują za wsparcie ze strony NIH Bioengineering Stypendium na trening sercowo-naczyniowy. Dodatkowe wsparcie dla tych prac pochodzi z grantu National Institutes of Health (NIH) R01HL111197 dla M. Regniera.

Wszystkie procedury są przeprowadzane w temperaturze pokojowej (~23 °C), chyba że zaznaczono inaczej.
1. Produkcja Silicon Master
<ol>
	<li>Oczyść płytkę krzemową 100% etanolem lub ksylenem i wysusz w gazie O2 / N2.</li>
	<li>Umieść wafel krzemowy w powlekarce wirowej z prędkością obrotową 2,000-4,000 obr./min, aby uzyskać film o grubości 0,3-0,5 μm.</li>
	<li>Ułóż folię fotorezystową o odpowiednich wymiarach za pomocą systemu fotolitograficznego</li>
	<li>Całkowicie zanurz wzorzyste płytki krzemowe pokryte fotorezystem w odpowiedniej objętości roztworu wywołującego fotorezystu.</li>
	<li>Opracowane płytki krzemowe pokryte fotorezystem przepłukać wodą dejonizowaną.</li>
	<li>Aby utworzyć układy submikronowych grzbietów skali z prawie pionowymi ściankami bocznymi, głęboko reaktywne jony wytrawiają odsłonięty krzem za pomocą systemu wytrawiania.</li>
	<li>Usuń pozostały fotorezyst, umieszczając płytkę krzemową w systemie ashera plazmowego.</li>
	<li>Wytnij wafle krzemowe za pomocą noża z diamentową końcówką na wzorce silikonowe o odpowiedniej wielkości w celu późniejszego formowania repliki.</li>
</ol>
2. Produkcja formy PUA z Silicon Master
UWAGA: Objętość, która ma zostać dodana do wzorca krzemowego do nanoprodukcji, będzie się różnić w zależności od obszaru wzorca nanowzorzecego, który ma być replikowany, jak również od lepkości roztworu akrylanu poliuretanu (PUA).
<ol>
	<li>Oczyść główną powierzchnię krzemu 100% etanolem lub ksylenem i wysusz w gazieO2/N2.</li>
	<li>Umieść silikonowy wzór wzorcowy stroną do góry na szalce Petriego.</li>
	<li>W przypadku wzorca silikonowego o wzorze powierzchni 2 cm x 2 cm, należy odpipetować 40 μl PUA do powierzchni wzoru.</li>
	<li>Umieść arkusz przezroczystej folii poliestrowej (PET) o wymiarach 4 cm x 4 cm na dozowanym PUA.</li>
	<li>Dociśnij arkusz PET i rozprowadź PUA pod arkuszem w poprzek powierzchni wzoru za pomocą wałka lub powierzchni o płaskich krawędziach (takiej jak karton), tak aby cały wzór był pokryty prepolimerem PUA.</li>
	<li>Umieść silikonowy master, prepolimer i PET około 10 cm poniżej światła UV o mocy 20 W (115 V) (λ = 365 nm) na 50 sekund. Aby być skutecznym, długość fali światła UV może wynosić od 310 do 400 nm. Natężenie światła wynosi 10-15 mW/cm2 na powierzchni podłoża.</li>
	<li>Po utwardzeniu powoli usuwaj folię PET za pomocą kleszczy. PUA powinien dołączyć do folii PET z negatywem wzorca krzemowego wzorca.</li>
	<li>Utwardź nanowzory PUA/PET w promieniowaniu UV przez co najmniej 12 godzin przed użyciem. Nadmierna ekspozycja nie stanowi problemu.</li>
	<li>Aby oczyścić wzorce silikonowe, umieść kolejną folię PET na wierzchu wzorca bez dodatku PUA i wystaw na działanie światła UV (λ = 365 nm) na 50 sekund i usuń folię PET. Spowoduje to usunięcie wszelkich nieprzereagowanych monomerów.</li>
	<li>Wypłukać wzorzec silikonowy 100% etanolem lub ksylenem i wysuszyć w gazieO2/N2.</li>
</ol>
3a. Nanowzorcowy polimer poliuretanowy
<ol>
	<li>Przygotować okrągłe szkiełka podstawowe o średnicy 25 mm, umieszczając je w komorze do obróbki ozonem na 10 minut.</li>
	<li>Umieść szkiełka nasączone ozonem na małym bloku PDMS, aby ułatwić obsługę.</li>
	<li>Nałożyć cienką warstwę promotora przyczepności powierzchniowej za pomocą pędzla do szkiełek szkiełkowych. Szkiełka suche na powietrzu przez 30 min.</li>
	<li>Umieść szklane szkiełko na kawałku papieru do drukarki.</li>
	<li>Upuść 10 μl prepolimeru poliuretanowego (PU) (NOA 76) na środek szkiełka podstawowego. Upewnij się, że po dodaniu nie ma bąbelków.</li>
	<li>Umieść formę PUA, wzorem skierowanym w dół, na szklanym szkiełku. Rozprowadź PU równomiernie na powierzchni szkiełka szklanego, tocząc gumową rolkę cylindryczną wzdłuż formy PUA. Papier drukarki wchłonie nadmiar polimeru.</li>
	<li>Lampa UV o mocy Watt. Czas polimeryzacji poliuretanu zależy od mocy źródła UV.</li>
	<li>Usuń próbkę ze źródła światła UV i ostrożnie oderwij formę PUA od szkiełka powlekanego PU. Polimeryzacja PU jest uważana za zakończoną, gdy forma PUA czysto odkleja się od próbki, a szkiełko PU ma opalizujący wygląd.</li>
	<li>Gotowe próbki umieścić w eksykatorze w celu przechowywania przez okres do miesiąca.</li>
</ol>
3b. Nanowzorzec Hydrożel z poli(laktydu-ko-glikolidu)
<ol>
	<li>Stwórz płaską formę PDMS, energicznie mieszając bazę z elastomeru silikonowego i utwardzacz z elastomeru silikonowego w stosunku 10:1.</li>
	<li>Wlać zmieszany roztwór prekursora PDMS do płytki Petriego tak, aby prekursor PDMS sięgał 5 mm w górę krawędzi szalki (tj. tak, aby PDMS miał grubość 5 mm).</li>
	<li>Umieść szalkę Petriego i prekursor PDMS w eksykatorze na 1 godzinę w celu odgazowania.</li>
	<li>Przenieść szalkę Petriego i prekursor PDMS do piekarnika o temperaturze 65 °C na co najmniej 2 godziny w celu utwardzenia.</li>
	<li>Po utwardzeniu PDMS użyj brzytwy, aby pociąć płaski PDMS na kwadratowe odcinki o wymiarach 3 cm x 3 cm. Będą to płaskie formy PDMS używane w dalszej części procesu modelowania.</li>
	<li>Okrągłe szkiełka podstawowe należy oczyścić metodą o średnicy 25 mm, umieszczając je w alkoholu izopropylowym na 30 minut w sonikatorze wodnym.</li>
	<li>Szkiełka szkiełkowe czyszczone na sucho w gazie O2/N2.</li>
	<li>Upuść 100 μl roztworu PLGA (15% w/v PLGA w chloroformie) na szkiełko podstawowe.</li>
	<li>Umieść płaską formę PDMS na dozowanej PLGA, aby wchłonąć rozpuszczalnik i uzyskać płaską powierzchnię PLGA. Zastosuj lekki nacisk (~10 kPa), umieszczając ciężarek o wadze 200 g na wierzchu PDMS na 5 minut.</li>
	<li>Powoli oderwij płaską formę PDMS i umieść szkło nakrywkowe na rozgrzanej płycie (120 °C) na 5 minut, aby usunąć resztki rozpuszczalnika i zwiększyć przyczepność między PLGA a szkłem nakrywkowym.</li>
	<li>Umieść formę NP PUA na płaskim PLGA i zastosuj stały nacisk (~100 kPa) i podgrzej (120 °C), umieszczając ciężarek o wadze 1 kg na wierzchu formy PUA na płycie grzewczej przez 15 minut.</li>
	<li>Usuń ciężar ze szkiełka pokrywowego PLGA i pozwól substratom ostygnąć do temperatury pokojowej. Nie usuwaj pleśni PUA, dopóki podłoże nie ostygnie.</li>
	<li>Gdy podłoże wystarczająco ostygnie, ostrożnie oderwij formę NP PUA, odsłaniając podłoże NP PLGA. Podłoże NP PLGA powinno mieć opalizujący wygląd.</li>
	<li>Gotowe próbki umieścić w eksykatorze w celu przechowywania przez okres do miesiąca.</li>
</ol>
4. Sadzenie komórek i hodowla
UWAGA: Ten protokół opisuje hodowlę noworodków szczurzych miocytów komorowych (NRVM) i ludzkich kardiomiocytów pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych H7 (hESC-CMs), ale można użyć innych źródeł komórek.
<ol>
	<li>Przymocuj szkiełka nakrywkowe ANFS (PU lub PLGA) do naczyń z polistyrenu o średnicy 35 mm. Odpipetuj 20 μl kleju optycznego Norland (NOA83H) na dno naczynia i delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe ANFS na wierzchu naczynia. Pozwól, aby klej się rozprowadził i przykryj całe dno szkiełka nakrywkowego. Utwardź NOA, wystawiając naczynie na działanie promieniowania UV przez 10 minut.</li>
	<li>Wysterylizuj ANFS, dwukrotnie spłukując 2 ml 70% wodnego roztworu etanolu przez 5 minut. Usuń etanol przez aspirację. Pozostaw ANFS do całkowitego wyschnięcia na powietrzu przez ~1 godzinę pod lampą sterylizacyjną UV (λ = 200-290 nm) w komorze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	<li>Adhezja komórkowa jest wzmocniona przez powlekanie ANFS fibronektyną przez noc. Rozcieńczyć fibronektynę w wodzie DI do 5 μg/ml. Odpipetować pipetą 2 ml roztworu fibronektyny do naczynia. Umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez noc (co najmniej 6 godzin).</li>
	<li>Uzyskaj NRVM, hESC-CM lub inne komórki serca będące przedmiotem zainteresowania zgodnie z poprzednimi protokołami22.</li>
	<li>Odwirować próbkę komórek z prędkością 1 000 obr./min przez 3 minuty w celu osadzenia komórek.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć supernatant przez aspirację. Uważaj, aby nie naruszyć pelletu.</li>
	<li>Zawiesić komórki w odpowiednich pożywkach hodowlanych do stężenia 4,6 x 106 komórek/ml.</li>
	<li>Ostrożnie odpipetować 200 μl zawiesiny komórek na wysterylizowany ANFS. Upewnij się, że zawiesina komórek pozostała na szkiełku nakrywkowym.</li>
	<li>Umieścić komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 4 godziny, aby umożliwić komórkom przyłączenie się do ANFS.</li>
	<li>Dodać 2 ml ciepłej pożywki hodowlanej do naczynia i w tych samych warunkach umieścić komórki w inkubatorze.</li>
	<li>Po 24 godzinach usuń pożywkę i przemyj dwukrotnie 2 ml DPBS w celu usunięcia nadmiaru komórek.</li>
	<li>Dodać 2 ml ciepłej pożywki hodowlanej do naczynia i w tych samych warunkach umieścić komórki w inkubatorze. Hoduj komórki do zbiegu. Wymieniaj nośniki co drugi dzień.</li>
</ol>

<ol><li>Lozano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+and+regional+mortality+from+235+causes+of+death+for+20+age+groups+in+1990+and+2010%3A+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2010%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010.</a> The Lancet. 380, 2095-2128 (2012).</li>
<li>Kim, D. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+cues+regulate+the+structure+and+function+of+macroscopic+cardiac+tissue+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Nanoscale cues regulate the structure and function of macroscopic cardiac tissue constructs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 565-570 (2010).</li>
<li>Tulloch, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+Engineered+Human+Myocardium+With+Mechanical+Loading+and+Vascular+Coculture%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Growth of Engineered Human Myocardium With Mechanical Loading and Vascular Coculture.</a> Circulation Research. 109, 47-59 (2011).</li>
<li>Bursac, N., Parker, K., Irvanian, S., Tung, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+Cultures+With+Controlled+Macroscopic+Anisotropy%3A+A+Model+for+Functional+Electrophysiological+Studies+of+Cardiac+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte Cultures With Controlled Macroscopic Anisotropy: A Model for Functional Electrophysiological Studies of Cardiac Muscle.</a> Circulation Research. 91, (2002).</li>
<li>Fink, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+stretch+of+engineered+heart+tissue+induces+hypertrophy+and+functional+improvement%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement.</a> The FASEB Journal. 14, 669-679 (2000).</li>
<li>Stevens, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+and+Engineering+the+Cell+Surface+Interface%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Exploring and Engineering the Cell Surface Interface.</a> Science. 310, (2005).</li>
<li>Mark, K., Park, J., Bauer, S., Schmuki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+engineering+of+biomimetic+surfaces%3A+cues+from+the+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Nanoscale engineering of biomimetic surfaces: cues from the extracellular matrix.</a> Cell Tissue Res. 339, 131-153 (2009).</li>
<li>Lü, J. -M., Wang, X., Marin-Muller, C., Wang, H., Lin, P. H., Yao, Q., Chen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+advances+in+research+and+clinical+applications+of+PLGA-based+nanotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Rev.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Current advances in research and clinical applications of PLGA-based nanotechnology.</a> Expert. Rev. Mol. Diagn. 9, 325-341 (2009).</li>
<li>Kim, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+Methods+for+Polymers+in+Cell+and+Tissue+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Patterning Methods for Polymers in Cell and Tissue Engineering.</a> Ann Biomed Eng. 40, 1339-1355 (2012).</li>
<li>Kim, D. -H., Provenzano, P. P., Smith, C. L., Levchenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+nanotopography+as+a+regulator+of+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Matrix nanotopography as a regulator of cell function.</a> The Journal of Cell Biology. 197, 351-360 (2012).</li>
<li>Park, J., Kim, H. -N., Kim, D. -H., Levchenko, A., Kahp-Yang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Analysis+of+the+Combined+Effect+of+Substrate+Rigidity+and+Topographic+Guidance+on+Cell+Morphology%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.on+Nanobioscience%22%5BJournal%5D)">Quantitative Analysis of the Combined Effect of Substrate Rigidity and Topographic Guidance on Cell Morphology.</a> IEEE Trans.on Nanobioscience. 11, 28-36 (2012).</li>
<li>Kim, D. -H., Lee, H., Lee, Y. K., Nam, J. -M., Levchenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+Nanopatterns+as+Enabling+Tools+for+Analysis+and+Control+of+Live+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Biomimetic Nanopatterns as Enabling Tools for Analysis and Control of Live Cells.</a> Adv. Mater. 22, 4551-4566 (2010).</li>
<li>Kim, D. -H., Wong, P. K., Park, J., Levchenko, A., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microengineered+Platforms+for+Cell+Mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Microengineered Platforms for Cell Mechanobiology.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 11, 203-233 (2009).</li>
<li>Kim, D. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopatterned+cardiac+cell+patches+promote+stem+cell+niche+formation+and+myocardial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">Nanopatterned cardiac cell patches promote stem cell niche formation and myocardial regeneration.</a> Integr Biol. 4, 1019 (2012).</li>
<li>Kim, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+nanostructures+of+polyethylene+glycol+for+applications+to+protein+adsorption+and+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Fabrication of nanostructures of polyethylene glycol for applications to protein adsorption and cell adhesion.</a> Nanotechnology. 16, 2420-2426 (2005).</li>
<li>Hwang, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+Assays+of+Endothelial+Cells+on+Nanopatterned+Surfaces+within+a+Microfluidic+Channel%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Adhesion Assays of Endothelial Cells on Nanopatterned Surfaces within a Microfluidic Channel.</a> Anal. Chem. 82, 3016-3022 (2010).</li>
<li>Heidenreich, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forecasting+the+Future+of+Cardiovascular+Disease+in+the+United+States%3A+A+Policy+Statement+From+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Forecasting the Future of Cardiovascular Disease in the United States: A Policy Statement From the American Heart Association.</a> Circulation. 123, 933-944 (2011).</li>
<li>Legrice, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+structure+of+the+heart%3A+ventricular+myocyte+arrangement+and+connective+tissue+architecture+in+the+dog%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Laminar structure of the heart: ventricular myocyte arrangement and connective tissue architecture in the dog.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 269, 1-12 (2002).</li>
<li>Sosnovik, D. E., Wang, R., Dai, G., Reese, T. G., Wedeen, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+MR+tractography+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Magn+Reson%22%5BJournal%5D)">Diffusion MR tractography of the heart.</a> J Cardiovasc Magn Reson. 11, 47 (2009).</li>
<li>Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Fluxes+Involved+in+Control+of+Cardiac+Myocyte+Contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Calcium Fluxes Involved in Control of Cardiac Myocyte Contraction.</a> Circulation Research. 87, 275-281 (2000).</li>
<li>Mohrman, D. E., Heller, L. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMohrman%2C+DE+%22Cardiovascular+Physiology%22">Cardiovascular Physiology</a>. , McGraw Hill Medical. (2010).</li>
<li>Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+De+Novo+Cardiomyocytes%3A+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Differentiation+and+Direct+Reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Production of De Novo Cardiomyocytes: Human Pluripotent Stem Cell Differentiation and Direct Reprogramming.</a> Stem Cell. 10, 16-28 (2012).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Cardiomyocytes+Derived+From+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Functional Cardiomyocytes Derived From Human Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Circulation Research. 104, (2009).</li>
<li>Qian, J. -Y., Guo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+cytosolic+Ca2%2B+dynamics+in+cultured+Guinea+pig+cardiomyocytes+as+an+in+vitro+model+to+identify+potential+cardiotoxicants%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+Vitro%22%5BJournal%5D)">Altered cytosolic Ca2+ dynamics in cultured Guinea pig cardiomyocytes as an in vitro model to identify potential cardiotoxicants.</a> Toxicology in Vitro. 24, 960-972 (2010).</li>
<li>You, M. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistically+Enhanced+Osteogenic+Differentiation+of+Human+Mesenchymal+Stem+Cells+by+Culture+on+Nanostructured+Surfaces+with+Induction+Media%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Synergistically Enhanced Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells by Culture on Nanostructured Surfaces with Induction Media.</a> Biomacromolecules. 11, 1856-1862 (2010).</li>
<li>Kim, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotopography-guided+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Nanotopography-guided tissue engineering and regenerative medicine.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 536-558 (2013).</li>
<li>Mannix, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomagnetic+actuation+of+receptor-mediated+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotech%22%5BJournal%5D)">Nanomagnetic actuation of receptor-mediated signal transduction.</a> Nature Nanotech. 3, 36-40 (2007).</li>
<li>Karuri, N. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+length+scale+topography+enhances+cell-substratum+adhesion+of+human+corneal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Biological length scale topography enhances cell-substratum adhesion of human corneal epithelial cells.</a> J Cell Sci. 117, 3153-3164 (2007).</li>
<li>Cavalcanti-Adam, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Spreading+and+Focal+Adhesion+Dynamics+Are+Regulated+by+Spacing+of+Integrin+Ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands.</a> Biophysical Journal. 92, 2964-2974 (2007).</li>
<li>Koo, L. Y., Irvine, D. J., Mayes, A. M., Lauffenburger, D. A., Griffith, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-regulation+of+cell+adhesion+by+nanoscale+RGD+organization+and+mechanical+stimulus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Co-regulation of cell adhesion by nanoscale RGD organization and mechanical stimulus.</a> J Cell Sci. 115, 1-11 (2002).</li>
<li>Yim, E. K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopattern-induced+changes+in+morphology+and+motility+of+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Nanopattern-induced changes in morphology and motility of smooth muscle cells.</a> Biomaterials. 26, 5405-5413 (2008).</li>
<li>Dalby, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+control+of+human+mesenchymal+cell+differentiation+using+nanoscale+symmetry+and+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">The control of human mesenchymal cell differentiation using nanoscale symmetry and disorder.</a> Nat Mater. 6, 997-1003 (2007).</li>
<li>Park, J., Bauer, S., Mark, von der K., Schmuki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanosize+and+Vitality%3A+TiO+2Nanotube+Diameter+Directs+Cell+Fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Nanosize and Vitality: TiO 2Nanotube Diameter Directs Cell Fate.</a> Nano Lett. 7, 1686-1691 (2007).</li>
<li>Entcheva, E., Bien, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroscopic+optical+mapping+of+excitation+in+cardiac+cell+networks+with+ultra-high+spatiotemporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 92, 232-257 (2006).</li>
<li>Tung, L., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+arrhythmias+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Electrocardiology%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of arrhythmias in tissue culture.</a> Journal of Electrocardiology. 39, (2006).</li>
<li>Himel, H. D., Bub, G., Lakireddy, P., El-Sherif, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+arrhythmias+in+the+cardiomyocyte+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of arrhythmias in the cardiomyocyte monolayer.</a> Heart Rhythm. 9, 2077-2082 (2012).</li>
<li>Kim, J., Hayward, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimicking+dynamic+in+vivo+environments+with+stimuli-responsive+materials+for+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Mimicking dynamic in vivo environments with stimuli-responsive materials for cell culture.</a> Trends in Biotechnology. 30, 426-439 (2012).</li>
<li>Henderson, D. J., Anderson, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Development+and+Structure+of+the+Ventricles+in+the+Human+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Cardiol%22%5BJournal%5D)">The Development and Structure of the Ventricles in the Human Heart.</a> Pediatr Cardiol. 30, 588-596 (2009).</li>
<li>Badie, N., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Micropatterned+Cardiac+Cell+Cultures+with+Realistic+Ventricular+Microstructure%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysj%22%5BJournal%5D)">Novel Micropatterned Cardiac Cell Cultures with Realistic Ventricular Microstructure.</a> Biophysj. 96, 3873-3885 (2009).</li>
<li>Badrossamay, M. R., McIlwee, H. A., Goss, J. A., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanofiber+Assembly+by+Rotary+Jet-Spinning%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Nanofiber Assembly by Rotary Jet-Spinning.</a> Nano Lett. 10, 2257-2261 (2010).</li>
<li>Rao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+microgrooved+culture+substrates+on+calcium+cycling+of+cardiac+myocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of microgrooved culture substrates on calcium cycling of cardiac myocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Biomaterials. 34, 2399-2411 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Brakuje funkcjonalnie dojrzałych tkanek serca zarówno do zastosowań in vivo , jak i in vitro w inżynierii tkankowej serca. Opisane tutaj metody nanowytwarzania CFL są solidnymi technikami osiągania wyrównania komórkowego i wpływania na makroskopową funkcję tkanki ze względu na skalowalność systemu. Duże obszary można łatwo wzorzyste i wykorzystane do hodowli komórkowej. Makroskopowe wyrównanie komórkowe jest niezbędne w inżynierii tkankowej serca w celu stworzenia biomimetycznej, funkcjonalnej tkanki, p...

Choroby układu krążenia są główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności na świecie i stanowią poważne obciążenie społeczno-ekonomiczne dla i tak już napiętego globalnego systemu opieki zdrowotnej1,17. Inżynieria tkankowa serca ma dwa odrębne cele: (1) regenerację uszkodzonego mięśnia sercowego po chorobie niedokrwiennej lub kardiomiopatii lub (2) stworzenie modelu serca o wysokiej wierności do badań przesiewowych leków in vitro lub modelowania choroby.
Serce to złożony organ, który musi nieustannie pracować, aby dostarczać krew do organizmu. Gęsto upakowane struktury laminarne kardiomiocytów i tkanek podporowych są ułożone w spiralne wzory w całej ścianie serca18,19. Serce jest również sprzężone elektromechanicznie20 w wysoce skoordynowany sposób, aby skutecznie wyrzucać krew do organizmu21. Pozostaje jednak jeszcze kilka poważnych przeszkód, które należy rozwiązać, zanim skomplikowany projekt natury będzie mógł zostać wiarygodnie odtworzony in vitro. Po pierwsze, chociaż nadal opracowywane są solidne metody różnicowania kardiomiocytów22, hPSC-CM nadal wykazują raczej niedojrzałe fenotypy. Ich właściwości elektromechaniczne i morfologia są najbardziej zbliżone do poziomu płodu23. Po drugie, gdy są trzymane w tradycyjnych warunkach hodowli, zarówno kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych, jak i pierwotne nie łączą się w natywne struktury przypominające tkanki. Komórki stają się raczej zorientowane losowo i nie wykazują pręcikowatego wyglądu dorosłego mięśnia sercowego24.
Środowisko macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), z którym komórki oddziałują, odgrywa znaczącą rolę w licznych procesach komórkowych11,13,25. ECM składa się ze złożonych, dobrze zdefiniowanych sygnałów molekularnych i topograficznych, które znacząco wpływają na strukturę i funkcję komórek6,26. W sercu wyrównanie komórkowe ściśle podąża za leżącymi pod spodem włóknami ECM w skali nanometrowej2. Wpływ tych nanotopograficznych wskazówek na funkcjonowanie komórek i tkanek jest jednak daleki od pełnego zrozumienia. Wstępne badania interakcji komórka-biomateriał w skali nanometrowej wskazują na potencjalne znaczenie i wpływ submikronowych wskazówek topograficznych na sygnalizację komórkową27, adhezję28-30, wzrost31 i różnicowanie32,33. Jednak ze względu na trudności w opracowaniu powtarzalnych i skalowalnych nanowytwarzanych substratów, takie badania nie były w stanie odtworzyć wieloskalowych efektów komórkowych złożonego środowiska ECM in vivo. W niniejszym protokole opisano prostą i opłacalną technikę nanowytwarzania do wytwarzania rusztowań do hodowli komórkowych naśladujących natywne wyrównanie włókien ECM serca, co pozwala na szeroki zakres nowatorskich badań interakcji kardiomiocytów z biomateriałem. Zrozumienie, w jaki sposób kardiomiocyty oddziałują ze środowiskiem ECM w nanoskali, może pozwolić na kontrolowanie zachowania komórek w celu ściślejszego naśladowania natywnych funkcji tkanek. Co więcej, monowarstwy komórkowe są uproszczonym systemem eksperymentalnym w porównaniu ze strukturami 3D, ale nadal wykazują złożone zachowanie wielokomórkowe dla wnikliwych badań i funkcjonalnych badań przesiewowych2,34-36. Wreszcie, takie rusztowania mogą być wykorzystane do poprawy funkcji przeszczepu komórkowego po wszczepieniu do serca w celach regeneracyjnych37.

<table><tbody><tr><td>Fibronektyna</td><td>BD Biosciences</td><td>354008</td><td></td></tr><tr><td>NOA 76</td><td>Norland Products, Inc.</td><td>7606B</td><td></td></tr><tr><td>Promotor przyczepności powierzchniowej (podkład szklany)</td><td>Minuta Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PUA</td><td>Minuta Tech</td><td>MINS-311RM</td><td></td></tr><tr><td>Miękki gumowy wałek</td><td>Speedball</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wafle silikonowe</td><td>NOVA Materiały elektroniczne</td><td>FA01-9900</td><td></td></tr><tr><td>Photoresist</td><td>Shipley</td><td>SPRT510</td><td></td></tr><tr><td>Photoresist Developer</td>System litografii wiązką elektronów <td>Shipley</td><td>MF320</td><td></td></tr><tr><td></td><td>JEOL</td><td>JBX-9300FS</td><td></td></tr><tr><td>System trawienia</td><td>Systemy technologii powierzchni</td><td>NP10 8UJ</td><td></td></tr><tr><td>System Asher plazmowy</td><td>BMR Technology Co.</td><td>DSF-200</td><td></td></tr><tr><td>System utwardzania ozonem</td><td>Minuta Tech</td><td>MT-UV-O-08</td><td></td>System utwardzania</tr><tr><td>ozonem</td><td>Minuta Tech</td><td>MT-UV-A 11</td><td></td></tr><tr><td>NOA 83H</td><td>Norland Products, Inc.</td><td>8301</td><td></td></tr><tr><td>Powlekarka wirowa</td><td>Laurel Technology</td><td>WS-400-6NPP</td><td></td></tr><tr><td>Skyrol PET Film</td><td>SKC Co., Ltd.</td><td>23038-59-9</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka szklane 25 mm</td><td>Corning</td><td>2948</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowych</td><td>Dow Corning</td><td>6/5/2553</td><td></td></tr><tr><td>Poli(D,L-laktyd-ko-glikolid)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2191-1G</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>372978-1L</td><td></td></tr><tr><td>500 g Odważniki</td><td>Global Insustrial</td><td>T9FB503120</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol izopropylowy</td><td>EMD Millipore</td><td>PX1835-2</td><td></td></tr><tr><td>Płyta grzejna</td><td>Corning</td><td>PC-420D</td><td></td></tr><tr><td>Sonikator</td><td>Branson</td><td>B2510MTH</td><td></td></tr></tbody></table>

litografia sił kapilarnych w inżynierii tkankowej serca

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Choroby układu krążenia pozostają główną przyczyną zgonów na całym świecie1. Inżynieria tkankowa serca jest bardzo obiecująca, jeśli chodzi o przełomowe odkrycia medyczne mające na celu opracowanie funkcjonalnych tkanek do regeneracji serca, a także badań przesiewowych in vitro. Jednak możliwość tworzenia modeli tkanki serca o wysokiej wierności okazała się trudna. Macierz zewnątrzkomórkowa serca (ECM) jest złożoną strukturą składającą się zarówno z sygnałów biochemicznych, jak i biomechanicznych w skali od mikro do nanometrowej2. Lokalne warunki obciążenia mechanicznego i interakcje komórka-ECM zostały ostatnio uznane za kluczowe elementy inżynierii tkankowej serca3-5.
Duża część ECM serca składa się z wyrównanych włókien kolagenowych o średnicach w skali nano, co znacząco wpływa na architekturę tkanek i sprzężenie elektromechaniczne2. Niestety, niewiele metod było w stanie naśladować organizację włókien ECM w skali nanometrowej. Ostatnie postępy w technikach nanowytwarzania umożliwiły jednak zaprojektowanie i wytworzenie skalowalnych rusztowań, które naśladują wskazówki in vivo dotyczące struktury i sztywności podłoża ECM w sercu6-9.
Tutaj prezentujemy rozwój dwóch powtarzalnych, opłacalnych i skalowalnych procesów nanowzorcowania do funkcjonalnego wyrównania komórek serca przy użyciu biokompatybilnego polimeru poli(laktyd-ko-glikolid) (PLGA)8 i polimeru na bazie poliuretanu (PU). Te anizotropowo nanowytwarzane podłoża (ANFS) naśladują leżące u podstaw ECM dobrze zorganizowanych, wyrównanych tkanek i mogą być wykorzystane do zbadania roli nanotopografii na morfologię i funkcję komórki10-14.
Używając wzorca krzemowego z nanowzorzystym (NP) jako szablonu, wytwarzana jest forma z poliuretanu akrylowego (PUA). Ta forma PUA jest następnie używana do modelowania hydrożelu PU lub PLGA za pomocą litografii kapilarnej wspomaganej promieniowaniem UV lub rozpuszczalnikiem (CFL), odpowiednio15,16. Krótko mówiąc, prepolimer PU lub PLGA jest dozowany kroplowo na szklane szkiełko nakrywkowe, a forma PUA jest umieszczana na wierzchu. W przypadku świetlówek kompaktowych wspomaganych promieniowaniem UV poliurat jest następnie wystawiany na działanie promieniowania UV (λ = 250-400 nm) w celu utwardzenia. W przypadku świetlówek kompaktowych ze scaloną elektroniką, PLGA jest wytłaczany przy użyciu ciepła (120 °C) i ciśnienia (100 kPa). Po utwardzeniu pleśń PUA jest odklejana, pozostawiając ANFS do hodowli komórkowej. Komórki pierwotne, takie jak miocyty komorowe noworodków szczurów, a także ludzkie kardiomiocyty pochodzące z pluripotencjalnych komórek macierzystych, mogą być utrzymywane w ANFS2.

Rysunek 1 przedstawia schematyczny przegląd procesu produkcji dla dwóch metod wytwarzania. Ze względu na dyfrakcję światła spowodowaną topografią w skali nanometrycznej, nanopatterning powinien skutkować uzyskaniem iryzującej powierzchni ANFS. Rysunek 2 przedstawia tę iryzującą powierzchnię na dobrze wypatternowanym szkiełku nakrywkowym NP-PU o średnicy 25 mm (Rysunek 2A) z szerokością grzbietów i rowków wynoszącą 800 nm (Rysunek 2B). Iryzujący wygląd AN...

W tym protokole demonstrujemy wytwarzanie biomimetycznych substratów do hodowli komórek serca wykonanych z dwóch różnych materiałów polimerowych za pomocą litografii kapilarnej. Opisane metody zapewniają skalowalną, opłacalną technikę inżynierii struktury i funkcji makroskopowych tkanek serca do zastosowań in vitro i in vivo.

Litografia sił kapilarnych w inżynierii tkankowej serca

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie biomimetycznych podłoży do hodowli komórkowych w celu inżynierii struktury i funkcji makroskopowych tkanek serca. Osiąga się to najpierw poprzez wykonanie krzemowej matrycy o pożądanej architekturze topograficznej za pomocą głębokiego trawienia jonowego. Drugim krokiem jest przeniesienie pożądanego wzoru topograficznego z matrycy krzemowej na formę z PUA przy użyciu litografii sił kapilarnych wspomaganej promieniowaniem UV.Następnie forma z PUA służy jako szablon do wytwarzania substratów do hodowli komórkowych z różnych materiałów polimerowych, w zależności od zamierzonego zastosowania, z wykorzystaniem litografii sił kapilarnych wspomaganej promieniami UV lub rozpuszczalnikiem. Końcowym etapem jest wysiew kardiomiocytów pierwotnych lub pochodzących z komórek macierzystych na nanowzorowane substraty do hodowli komórkowej w celu przeprowadzenia dalszych analiz. Ostatecznie wykorzystuje się mikroskopię w jasnym polu oraz immunofluorescencję, aby wykazać zmiany w morfologii komórek oraz rozmieszczeniu białek kurczliwych w kardiomiocytach.Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak mikrokontaktowy druk, jest to, że litografia sił kapilarnych wytwarza nanowzorowane podłoża do hodowli komórek, które mogą indukować strukturalne uporządkowanie monowarstw tkanki sercowej bez polegania na proliferacji lub migracji komórek. Chociaż metodę tę można wykorzystać do uzyskania wglądu w relację między strukturą a funkcją tkanek serca, można ją również zastosować w innych systemach, takich jak mechanobiologia nowotworów. Aby zbadać wpływ topografii macierzy na migrację komórek, należy rozpocząć tę procedurę od oczyszczenia powierzchni krzemowej matrycy 100% etanolem lub ksylenem, a następnie osuszyć ją strumieniem gazu azotowego.Następnie umieść formę matrycy krzemowej stroną z wzorem do góry w szalce Petriego; w przypadku matrycy krzemowej o wzorze powierzchni o wymiarach 2 cm na 2 cm, nanieś na nią pipetą 40 µL PUA. Następnie na dozowane PUA połóż arkusz przezroczystej folii poliestrowej o wymiarach 4 cm na 4 cm, dociśnij arkusz PET i rozprowadź PUA pod folią po całej powierzchni wzoru, używając wałka lub płaskiej krawędzi, tak aby cały wzór został pokryty prepolimerem PUA. Następnie umieść matrycę silikonową z prepolimerem i folią PET w odległości około 10 cm pod lampą UV o mocy 20 W na 50 sekund.Po utwardzeniu powoli usuń folię PET za pomocą pęsety. PUA powinna przylgnąć do folii PET, tworząc negatyw nanowzorca z silikonowej matrycy. Następnie utwardzaj nanowzorce P-U-A-P-E-T pod wpływem promieniowania UV przez co najmniej 12 godzin przed użyciem.Aby oczyścić matryce silikonowe, należy nałożyć kolejną folię PET na wierzch matrycy, nie dodając PUA. Naświetlać promieniami UV przez 50 sekund, a następnie usunąć folię PET. Następnie opłukać matrycę silikonową 100% etanolem lub ksylenem i osuszyć strumieniem azotu.W tej procedurze szklane podstawki okrągłe o średnicy 18 mm należy poddać działaniu ozonu w komorze ozonowej przez 10 minut. Następnie podstawki należy umieścić na blokach PDMS, aby tymczasowo je zabezpieczyć i ułatwić manipulację. W kolejnym kroku na powierzchnię szklanej podstawki należy nanieść warstwę podkładu do szkła.Pozostaw primer do wyschnięcia na powietrzu przez 30 minut. Następnie umieść szkiełka przedmiotowe na arkuszu papieru do drukarki. Nanieś 10 µL prepolimeru poliuretanowego na środek każdego szkiełka, upewniając się, że nie powstały pęcherzyki powietrza.Następnie należy położyć formę z PUA wzorem skierowanym do dołu na szkiełko przedmiotowe i równomiernie rozprowadzić prepolimer PU po powierzchni szkiełka, przesuwając gumowy wałek po formie z PUA. Papier drukarski wchłonie nadmiar polimeru. Następnie próbki należy utwardzać promieniami UV przez 60 sekund pod lampą UV o mocy 20 watt. Po tym czasie należy wyjąć próbkę spod źródła światła UV i ostrożnie oddzielić formę z PUA od szkiełka pokrytego PU; w tym momencie polimeryzację PU uznaje się za zakończoną.Gdy forma z PUA zostanie czysto oddzielona od próbki, a szkiełko PU uzyska opalizujący wygląd, należy umieścić próbki w eksykatorem i przechowywać je do miesiąca. Następnie przymocuj szkiełka nakrywkowe NFS do 35 milimetrowej polistyrenowej szalki do hodowli tkankowej, pipetując 20 µL NOA na dno szalki. Delikatnie połóż szkiełko nakrywkowe NPPU na NOA i pozwól klejowi rozpłynąć się i pokryć całe dno szkiełka, a następnie utwardź NOA, naświetlając szalkę promieniami UV przez 10 minut.Następnie wysterylizuj NP SUBSTRATA, płucząc go dwukrotnie 2 mL 70% wodnego roztworu etanolu przez pięć minut w każdym cyklu. Usuń etanol za pomocą aspiratora. Pozostaw A NFS do całkowitego wyschnięcia przez około jedną godzinę pod lampą sterylizacyjną UV w komorze z laminarnym przepływem powietrza.Aby zwiększyć adhezję komórkową, pokryj A NFS fibronektyną przez noc, najpierw rozcieńczając fibronektynę w wodzie destylowanej do stężenia 5 µg/mL. Następnie pipetuj 2 mL roztworu fibronektyny do naczynia. Potem umieść A NFS w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez noc.Należy pozyskać NR VM, HESC CMS lub inne interesujące komórki serca, a następnie odwirować próbkę komórek przy 1000 RPM przez trzy minuty w celu osadzenia komórek. Należy ostrożnie usunąć nadsącz za pomocą aspiratora, dbając o to, aby nie naruszyć osadu. Następnie komórki należy zawiesić ponownie w pożywce hodowlanej do stężenia 4,6 × 10⁶ komórek na ml.Ostrożnie nanieś pipetą 200 µL zawiesiny komórkowej na wysterylizowane A NFS, upewniając się, że zawiesina pozostała na szkiełku nakrywce. Następnie umieść komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 na cztery godziny, aby umożliwić ich przyleganie do A NFS. Następnie dodaj do naczynia dwa ml dodatkowej, ogrzanej pożywki hodowlanej i ponownie umieść komórki w inkubatorze w tych samych warunkach.Po 24 godzinach usunąć medium i dwukrotnie przemyć dwiema mililitrami DPBS, aby usunąć nadmiar komórek. Następnie do szalki dodać dwa mililitry podgrzanego medium hodowlanego. Umieścić komórki w inkubatorze w tych samych warunkach i inkubować.Hodować komórki do osiągnięcia konfluencji, wymieniając medium co drugi dzień. Rysunek przedstawia reprezentatywne obrazy w polu jasnym dla NR VMs po siedmiu dniach hodowli oraz HESC cms. Po 48 godzinach hodowli, NR VMs i HESC CMS na powierzchniach NP wykazują wyraźną anizotropię strukturalną i uporządkowanie, podczas gdy kardiomiocyty na powierzchniach UN są zorientowane w sposób losowy.Analiza immunohistochemiczna uwidacznia wpływ nanotopografii na orientację cytoszkieletu komórkowego; mikrofilamenty aktynowe i aktyna sarkomeryczna alfa w komórkach hodowanych na A NFS ustawiają się wzdłuż nanoprążków, podczas gdy w komórkach na podłożach nieustrukturyzowanych pozostają rozłożone losowo. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o sterylizacji podłoży przed wysianiem komórek, ponieważ kontaminacja może stanowić poważny problem po ich namnożeniu. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie biologii układu sercowo-naczyniowego do zgłębiania procesów dojrzewania serca oraz kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat tego, jak wytworzyć biomimetyczne podłoże do hodowli komórkowej za pomocą litografii sił kapilarnych w zastosowaniach inżynierii tkanki serca.

capillary-force-lithography-for-cardiac-tissue-engineering

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Litografia sił kapilarnych do inżynierii tkanki sercowej

Generowanie wyrównanej tkanki mięśnia sercowego jest kluczowym wymogiem dla dostosowania najnowszych osiągnięć w biologii komórek macierzystych do klinicznie użytecznych celów. W tym artykule opisujemy podejście do druku mikrokontaktowego w celu precyzyjnej kontroli kształtu i funkcji komórki. Korzystając z wysoce oczyszczonych populacji embrionalnych komórek progenitorowych serca pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych, generujemy anizotropową funkcjonalną tkankę mięśnia sercowego.

Generowanie wyrównanej funkcjonalnej tkanki mięśnia sercowego poprzez drukowanie mikrokontaktowe

Prezentujemy metodę mikroprzepływowego osadzania wzorzystej genipiny i fibronektyny na podłożach PDMS, pozwalając na przedłużoną żywotność tkanek gęstych od komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych. Ta metoda wytwarzania tkanek jest połączona z poprzednią technologią cienkich warstw naczyń mięśniowych w celu pomiaru kurczliwości naczyń w czasie istotnym dla choroby.

Technika mikroprzepływowego osadzania genipiny do rozszerzonej hodowli cienkich warstw mięśniowych naczyń krwionośnych

Ten manuskrypt opisuje tworzenie zdefiniowanych tkanek serca za pomocą ekspresji markerów powierzchniowych i sortowania komórek. Zdefiniowane tkanki mogą być następnie wykorzystane w bioreaktorze wielotkankowym do zbadania mechanizmów terapii komórkami serca w celu zapewnienia funkcjonalnego, a jednocześnie kontrolowanego systemu modelowego ludzkiego serca.

Budowa zdefiniowanych tkanek serca zaprojektowanych przez człowieka w celu zbadania mechanizmów terapii komórkami serca

Ten protokół opisuje biodrukowanie 3D tkanki serca bez użycia biomaterials. 3D biodrukowane plastry serca wykazują mechaniczną integrację sferoid składowych i są bardzo obiecujące w regeneracji tkanki serca oraz jako modele 3D chorób serca.

Tworzenie tkanki serca wykazującej mechaniczną integrację sferoid za pomocą biodruku 3D

Dostarczamy uogólniony protokół oparty na strategii mikroprzepływowego biodruku do inżynierii mikrowłóknistego łożyska naczyniowego, gdzie wtórny typ komórek może być dalej umieszczany w przestrzeni śródmiąższowej tej mikrofibrowej struktury w celu wytworzenia unaczynionych tkanek i organoidów.

Bioprinting mikroprzepływowy do inżynierii unaczynionych tkanek i organoidów

Tutaj prezentujemy szybką, łatwą i tanią metodę wytwarzania niestandardowych form polidimetylosiloksanowych, które mogą być używane do produkcji hydrożelowych tkanek inżynieryjnych o skomplikowanej geometrii. Dodatkowo opisujemy wyniki ocen mechanicznych i histologicznych przeprowadzonych na zmodyfikowanych tkankach serca wytworzonych tą techniką.

Specjalnie zaprojektowane formy do kultur tkankowych od mistrzów trawionych laserowo

Ten protokół wprowadza metodę mikrowzorowania bez litografii, która jest prosta i dostępna dla osób z ograniczonym doświadczeniem w bioinżynierii. Metoda ta wykorzystuje spersonalizowane, wycinane laserowo szablony do mikromodelowania białek macierzy zewnątrzkomórkowej w kształcie interesującym do modulowania morfologii komórek. Procedura mikrowzorcowania została zademonstrowana przy użyciu indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych.

Proste, wolne od litografii mikromodelowanie pojedynczych komórek przy użyciu szablonów wycinanych laserowo

Zmodyfikowane tkanki w dużym stopniu polegają na odpowiednich sieciach naczyniowych, które dostarczają niezbędnych składników odżywczych i gazów oraz usuwają odpady metaboliczne. W tej pracy protokół stopniowego wysiewu komórek śródbłonka i komórek podporowych tworzy wysoce zorganizowane sieci naczyniowe na wysokoprzepustowej platformie do badania rozwijającego się zachowania naczyń w kontrolowanym środowisku 3D.

Stopniowe wysiewanie komórek na mozaikowych rusztowaniach w celu zbadania kiełkujących naczyń krwionośnych

Trójwymiarowe tkanki serca bioinżynieryjne wykorzystujące kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych okazały się obiecującymi modelami do badania zdrowego i chorego ludzkiego mięśnia sercowego in vitro, jednocześnie podsumowując kluczowe aspekty rodzimej niszy sercowej. Manuskrypt ten opisuje protokół wytwarzania i analizy zmodyfikowanych tkanek serca o wysokiej zawartości wygenerowanych z ludzkich pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych.

Projektowanie bioreaktora w celu usprawnienia pozyskiwania danych i modelowania przepustowości zmodyfikowanych tkanek serca

Użycie światła do kontrolowania komórek i tkanek serca umożliwia bezkontaktową stymulację, zachowując w ten sposób naturalny stan i funkcję komórek, co czyni ją wartościowym podejściem zarówno do badań podstawowych, jak i zastosowań terapeutycznych.

Mikrofizjologiczny system serca do badania propagacjiCa2+ za pomocą niegenetycznej stymulacji optycznej

Przedstawiono powtarzalną metodę generowania 3D tkanek mięśnia sercowego, łączących rusztowania polikaprolaktonu (PCL) i hydrożele fibrynowe pochodzące z hiPSC. Technika ta zapewnia precyzyjną kontrolę nad architekturą rusztowania i może być stosowana w przedklinicznych testach leków i modelowaniu chorób serca.

Generowanie 3D ludzkiej tkanki mięśnia sercowego przy użyciu elektroprzędzenia stopionego zapisu rusztowań polikaprolaktonowych i komórek serca pochodzących z hiPSC

Odkryj litografię sił kapilarnych w inżynierii tkankowej serca. Ta metoda umożliwia wytwarzanie biomimetycznych podłoży do hodowli komórek kardiomiocytów z precyzyjnym nanorzeźbieniem.

Litografia sił kapilarnych w inżynierii tkankowej serca

Przeglądaj więcej filmów