Litografia sił kapilarnych w inżynierii tkankowej serca
June 10th, 2014
W tym protokole demonstrujemy wytwarzanie biomimetycznych substratów do hodowli komórek serca wykonanych z dwóch różnych materiałów polimerowych za pomocą litografii kapilarnej. Opisane metody zapewniają skalowalną, opłacalną technikę inżynierii struktury i funkcji makroskopowych tkanek serca do zastosowań in vitro i in vivo.
Ogólnym celem tej procedury jest wytworzenie biomimetycznych substratów do hodowli komórkowych w celu inżynierii struktury i funkcji makroskopowych tkanek serca. Osiąga się to poprzez najpierw wytworzenie silikonowego wzorca o pożądanej architekturze topograficznej poprzez głębokie reaktywne trawienie jonowe. Drugim krokiem jest przeniesienie pożądanego wzoru topograficznego z wzorca krzemowego do formy PUA za pomocą litografii kapilarnej wspomaganej promieniowaniem UV
.Następnie forma PUA jest używana jako szablon do wytwarzania substratów kultur komórkowych z różnych materiałów polimerowych, w zależności od pożądanego zastosowania za pomocą litografii kapilarnej wspomaganej promieniowaniem UV lub rozpuszczalnikiem. Ostatnim krokiem jest umieszczenie kardiomiocytów pierwotnych lub pochodzących z komórek macierzystych na podłożach hodowli komórkowych o wzorcu nano w celu późniejszej analizy. Ostatecznie wykorzystuje się mikroskopię jasnego pola i immunofluorescencji, aby pokazać zmiany w morfologii komórek i umownym ułożeniu białek w kardiomiocytach.
Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak druk mikrokontaktowy, jest to, że litografia z użyciem sił kapilarnych wytwarza podłoża do hodowli komórek o nanowzorze, które mogą indukować strukturalne wyrównanie monowarstw tkanki serca bez polegania na proliferacji lub migracji komórek. Chociaż metoda ta może być wykorzystana do uzyskania wglądu w związek między strukturą a funkcją tkanek serca, może być również stosowana do innych systemów, takich jak mechanobiologia nowotworów. Aby zbadać wpływ topografii matrycy na migrację komórek Be, rozpocznij tę procedurę od oczyszczenia głównej powierzchni krzemu 100% etanolem lub ksylenem i wysuszenia w gazowym tlenie.
Następnie umieść silikonowy wzór wzorcowy stroną do góry na szalce Petriego, aby uzyskać krzemowy wzór wzorcowy z pipetą o wymiarach dwa centymetry na dwa centymetry i wzór powierzchniowy 40 mikrolitrów PUA. Następnie umieść arkusz przezroczystej folii poliestrowej o wymiarach cztery centymetry na cztery centymetry na dozowanej prasie PUA na arkuszu PET i rozprowadź PUA pod arkuszem w poprzek powierzchni wzoru za pomocą rolki lub płaskiej powierzchni krawędziowej, tak aby cały wzór był pokryty prepolimerem PUA. Następnie umieść silikonowy główny polimer wstępny i PET około 10 centymetrów poniżej 20-watowego światła UV na 50 sekund.
Po utwardzeniu powoli usuń folię PET za pomocą kleszczyków. PUA należy dołączyć do folii PET z negatywem nanowzoru Silicon Master. Następnie utwardź nano wzory P-U-A-P-E-T w promieniowaniu UV przez co najmniej 12 godzin przed użyciem.
Aby wyczyścić Silicon Masters, umieść kolejną warstwę PET na wierzchu wzorca bez dodatku PUA. Wystaw go na działanie światła UV na 50 sekund i usuń folię PET. Następnie przepłucz silikonowy wzorzec 100% etanolem lub ksylenem i wysusz pod gazowym tlenem.
W tej procedurze należy potraktować okrągłe szkiełka szklane o średnicy 18 milimetrów, umieszczając je w komorze ozonowej na 10 minut. Następnie umieść prowadnice na blokach PDMS, aby tymczasowo je zabezpieczyć w celu łatwej obsługi. Następnie nałóż warstwę podkładu szklanego na powierzchnię szkiełka.
Pozostaw podkład do wyschnięcia na powietrzu przez 30 minut. Teraz umieść szklane szkiełka na kartce papieru do drukarki. Upuść 10 mikrolitrów wstępnego polimeru poliuretanowego na środek każdego szkiełka i upewnij się, że nie powstają żadne pęcherzyki.
Następnie umieść wzór formy PUA ekranem do dołu na szkiełku szkiełkowym, równomiernie rozprowadź prepolimer pu na powierzchni szkiełka, tocząc gumową rolkę cylindryczną wzdłuż formy PUA. Papier drukarki wchłonie nadmiar polimeru, a następnie utwardzi go promieniami UV przez 60 sekund pod 20-watową lampą UV. Następnie usuń próbkę ze źródła światła UV i ostrożnie oderwij formę PUA od szkiełka powlekanego PU, polimeryzacja szkiełka PU jest uważana za zakończoną.
Gdy forma PUA czysto odklei się od próbki, a szkiełko PU ma opalizujący wygląd, umieść próbki w osuszaczu do przechowywania przez miesiąc. Teraz przymocuj szkiełka nakrywkowe NFS do 35-milimetrowej milimetrowej dystki z polistyrenu do kultur tkankowych, pipety 20 mikrolitrów NOA do dna naczynia. Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe NPPU na wierzchu NOA i pozwól, aby klej się rozprowadził i przykryj całe dno szkiełka nakrywkowego po utwardzeniu NOA, wystawiając naczynie na działanie promieniowania UV przez 10 minut.
Następnie wysterylizuj NP SUBSTRATA, przepłukując go dwukrotnie dwoma mililitrami 70% wodnego roztworu etanolu każdy przez pięć minut. Usunąć etanol przez aspirację. Pozostaw A NFS do całkowitego wyschnięcia na powietrzu przez około godzinę pod lampą sterylizacyjną UV w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
Aby zwiększyć adhezję komórkową, pokryj A NFS w fibronektynie przez noc, najpierw rozcieńczając fibronektynę w wodzie do pięciu mikrogramów na mililitr. Następnie odpipetuj dwa mililitry roztworu fibronektyny do naczynia. Następnie umieść A NFS w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 na noc.
Uzyskaj NR VM, HESC CMS lub inne interesujące komórki serca, odwiruj próbkę komórek z prędkością 1000 obr./min przez trzy minuty, aby osadzać komórki. Ostrożnie usunąć supernatant przez aspirację i upewnić się, że nie naruszyć osadu. Następnie ponownie zawieś komórki w pożywce hodowlanej do stężenia 4,6 razy 10 do sześciu komórek na mililitr.
Ostrożnie odpipetować 200 mikrolitrów zawiesiny komórek na wysterylizowany A NFS i upewnić się, że zawiesina komórek pozostała na szkiełku nakrywkowym. Następnie umieść komórki w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 na cztery godziny, aby umożliwić komórkom przyłączenie się do NFS A. Następnie dodaj dwa mililitry dodatkowej ciepłej pożywki hodowlanej do naczynia i ponownie umieść komórki w inkubatorze w tych samych warunkach.
Po 24 godzinach wyjmij pożywkę i dwukrotnie przemyj dwoma mililitrami DPBS, aby usunąć nadmiar komórek. Następnie dodaj do naczynia dwa mililitry ciepłej pożywki hodowlanej. Umieść komórki w inkubatorze w tych samych warunkach i hodowli.
Komórki do zbiegania się wymieniają pożywkę co drugi dzień. Na tym rysunku przedstawiono reprezentatywne obrazy w jasnym polu maszyn wirtualnych NR po siedmiu dniach hodowli i CMS HESC. Po 48 godzinach hodowli maszyny wirtualne NR i CMS HESC na powierzchniach NP wykazują wyraźną anizotropię strukturalną i wyrównanie, podczas gdy kardiomiocyty na powierzchniach wzorca UN są zorientowane losowo.
Analiza immunohistochemiczna podkreśla wpływ nanotopografii na wyrównanie cytoszkieletu komórek, mikrofilamenty aktyny i aktyna alfa sarkomeryczna w komórkach hodowanych na NFS A ustawiają się wzdłuż nano grzbietów, ale pozostają losowo rozmieszczone w komórkach na podłożach niewzorzystych. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o wysterylizowaniu podłoża przed umieszczeniem komórek, ponieważ zanieczyszczenie może stanowić duży problem po jego rozwinięciu. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią sercowo-naczyniową do zbadania dojrzewania serca i kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wytworzyć biomimetyczne podłoże do hodowli komórek za pomocą litografii sił kapilarnych do zastosowań w inżynierii tkanek serca.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół demonstruje wytwarzanie biomimetycznych podłoży do kultury komórek sercowych za pomocą litografii sił kapilarnych. Przedstawione metody zapewniają skalowalne i opłacalne podejście do inżynierii makroskopowych tkanek sercowych dla różnych zastosowań.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Inżynieria tkanki sercowej
- Techniki kultury komórek
- Materiały polimerowe
Tło
- Biomimetyczne podłoża są niezbędne do badania komórek sercowych.
- Litografia sił kapilarnych pozwala na precyzyjne formowanie wzorców.
- Inżynieria tkanek sercowych może poprawić badania in vitro i in vivo.
- Wykorzystanie różnych materiałów polimerowych może dostosować zastosowania.
Cel badania
- Wyprodukować biomimetyczne podłoża do kultury komórek.
- Inżynierować strukturę i funkcję tkanek sercowych.
- Ułatwić analizę zachowania kardiomiocytów.
Zastosowanie metod
- Wytwarzanie formy silikonowej za pomocą głębokiego reaktywnego trawienia jonowego.
- Przeniesienie wzorców topograficznych na formu PUA za pomocą litografii sił kapilarnych wspomaganej UV.
- Wytwarzanie podłoży do kultury komórek z różnych materiałów polimerowych.
- Umieszczanie kardiomiocytów do analizy za pomocą technik mikroskopowych.
Główne wyniki
- Skuteczna transmisja wzorców topograficznych na podłoża do kultury komórek.
- Obserwacja zmian w morfologii komórek.
- Analiza układu białek skurczu w kardiomiocytach.
- Demonstracja skuteczności biomimetycznych podłoży.
Wnioski
- Protokół zapewnia niezawodną metodę tworzenia biomimetycznych podłoży.
- Litografia sił kapilarnych jest wszechstronną techniką inżynierii tkankowej.
- Dalsze badania mogą poprawić zrozumienie zachowania komórek sercowych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Capillary force lithography enables scalable fabrication of biomimetic substrata that replicate nanoscale extracellular matrix cues critical for cardiac tissue maturation. This approach supports predictive modeling of cardiomyocyte structure-function relationships, reducing reliance on empirical screening in early discovery. By providing reproducible, alignment-inducing platforms, the method enhances target validation confidence and translational continuity in cardiovascular R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of nanotopography effects on cardiomyocyte alignment and contractile protein organization.
- Operational Value: Provides cost-effective, scalable substrates for high-throughput assessment of matrix-mediated cellular responses.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by isolating topographic variables in cardiac maturation pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable morphological and cytoskeletal readouts via brightfield and immunofluorescence microscopy.
- Operational Value: Delivers reproducible nanopatterned surfaces compatible with primary and stem cell-derived cardiomyocytes.
- Assay Readiness: Facilitates standardized evaluation of compound effects on tissue-level electromechanical coupling.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges nanoscale ECM mimicry to functional tissue phenotypes relevant to disease modeling.
- Preclinical Utility: Enables risk-adjusted assessment of regenerative candidates using aligned cardiomyocyte monolayers.
- Mechanistic Insight: Clarifies structure-function relationships without confounding effects from cell proliferation or migration.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery workflows by enabling hypothesis-driven evaluation of matrix topography effects prior to lead optimization stages.
- Discovery Biology: Supports functional target validation through controlled nanotopography-induced phenotypic modulation.
- Screening: Delivers standardized, alignment-inducing substrata for consistent compound screening in cardiac assays.
- Analytics: Provides quantitative imaging-based readouts for assessing cytoskeletal alignment and sarcomeric organization.
- Translational Research: Connects nanoscale substrate design to preclinical-relevant tissue maturation endpoints.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for cardiovascular target validation across multiple therapeutic modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in cardiac tissue engineering by decoupling topographic cues from biochemical signals.
- Operational Value: Ensures batch-to-batch reproducibility via UV-assisted and solvent-mediated capillary force lithography processes.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence by providing predictive, human-relevant in vitro models.
- Portfolio Impact: Enables risk-stratified advancement of cardiac regenerative candidates based on functional tissue metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nanofabrication, polymer chemistry, and cell culture techniques.
- Depends on UV curing equipment, precision molding tools, and sterile tissue culture infrastructure.
- Necessitates standardization of fibronectin coating and sterilization protocols across teams.
- Involves adaptation considerations when extending to non-cardiac cell types or disease models.
- Limited by the need for specialized masters and molds, though scalable via replication.
