Litografia sił kapilarnych w inżynierii tkankowej serca

Ogólnym celem tej procedury jest wytworzenie biomimetycznych substratów do hodowli komórkowych w celu inżynierii struktury i funkcji makroskopowych tkanek serca. Osiąga się to poprzez najpierw wytworzenie silikonowego wzorca o pożądanej architekturze topograficznej poprzez głębokie reaktywne trawienie jonowe. Drugim krokiem jest przeniesienie pożądanego wzoru topograficznego z wzorca krzemowego do formy PUA za pomocą litografii kapilarnej wspomaganej promieniowaniem UV

Następnie forma PUA jest używana jako szablon do wytwarzania substratów kultur komórkowych z różnych materiałów polimerowych, w zależności od pożądanego zastosowania za pomocą litografii kapilarnej wspomaganej promieniowaniem UV lub rozpuszczalnikiem. Ostatnim krokiem jest umieszczenie kardiomiocytów pierwotnych lub pochodzących z komórek macierzystych na podłożach hodowli komórkowych o wzorcu nano w celu późniejszej analizy. Ostatecznie wykorzystuje się mikroskopię jasnego pola i immunofluorescencji, aby pokazać zmiany w morfologii komórek i umownym ułożeniu białek w kardiomiocytach.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak druk mikrokontaktowy, jest to, że litografia z użyciem sił kapilarnych wytwarza podłoża do hodowli komórek o nanowzorze, które mogą indukować strukturalne wyrównanie monowarstw tkanki serca bez polegania na proliferacji lub migracji komórek. Chociaż metoda ta może być wykorzystana do uzyskania wglądu w związek między strukturą a funkcją tkanek serca, może być również stosowana do innych systemów, takich jak mechanobiologia nowotworów. Aby zbadać wpływ topografii matrycy na migrację komórek Be, rozpocznij tę procedurę od oczyszczenia głównej powierzchni krzemu 100% etanolem lub ksylenem i wysuszenia w gazowym tlenie.

Następnie umieść silikonowy wzór wzorcowy stroną do góry na szalce Petriego, aby uzyskać krzemowy wzór wzorcowy z pipetą o wymiarach dwa centymetry na dwa centymetry i wzór powierzchniowy 40 mikrolitrów PUA. Następnie umieść arkusz przezroczystej folii poliestrowej o wymiarach cztery centymetry na cztery centymetry na dozowanej prasie PUA na arkuszu PET i rozprowadź PUA pod arkuszem w poprzek powierzchni wzoru za pomocą rolki lub płaskiej powierzchni krawędziowej, tak aby cały wzór był pokryty prepolimerem PUA. Następnie umieść silikonowy główny polimer wstępny i PET około 10 centymetrów poniżej 20-watowego światła UV na 50 sekund.

Po utwardzeniu powoli usuń folię PET za pomocą kleszczyków. PUA należy dołączyć do folii PET z negatywem nanowzoru Silicon Master. Następnie utwardź nano wzory P-U-A-P-E-T w promieniowaniu UV przez co najmniej 12 godzin przed użyciem.

Aby wyczyścić Silicon Masters, umieść kolejną warstwę PET na wierzchu wzorca bez dodatku PUA. Wystaw go na działanie światła UV na 50 sekund i usuń folię PET. Następnie przepłucz silikonowy wzorzec 100% etanolem lub ksylenem i wysusz pod gazowym tlenem.

W tej procedurze należy potraktować okrągłe szkiełka szklane o średnicy 18 milimetrów, umieszczając je w komorze ozonowej na 10 minut. Następnie umieść prowadnice na blokach PDMS, aby tymczasowo je zabezpieczyć w celu łatwej obsługi. Następnie nałóż warstwę podkładu szklanego na powierzchnię szkiełka.

Pozostaw podkład do wyschnięcia na powietrzu przez 30 minut. Teraz umieść szklane szkiełka na kartce papieru do drukarki. Upuść 10 mikrolitrów wstępnego polimeru poliuretanowego na środek każdego szkiełka i upewnij się, że nie powstają żadne pęcherzyki.

Następnie umieść wzór formy PUA ekranem do dołu na szkiełku szkiełkowym, równomiernie rozprowadź prepolimer pu na powierzchni szkiełka, tocząc gumową rolkę cylindryczną wzdłuż formy PUA. Papier drukarki wchłonie nadmiar polimeru, a następnie utwardzi go promieniami UV przez 60 sekund pod 20-watową lampą UV. Następnie usuń próbkę ze źródła światła UV i ostrożnie oderwij formę PUA od szkiełka powlekanego PU, polimeryzacja szkiełka PU jest uważana za zakończoną.

Gdy forma PUA czysto odklei się od próbki, a szkiełko PU ma opalizujący wygląd, umieść próbki w osuszaczu do przechowywania przez miesiąc. Teraz przymocuj szkiełka nakrywkowe NFS do 35-milimetrowej milimetrowej dystki z polistyrenu do kultur tkankowych, pipety 20 mikrolitrów NOA do dna naczynia. Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe NPPU na wierzchu NOA i pozwól, aby klej się rozprowadził i przykryj całe dno szkiełka nakrywkowego po utwardzeniu NOA, wystawiając naczynie na działanie promieniowania UV przez 10 minut.

Następnie wysterylizuj NP SUBSTRATA, przepłukując go dwukrotnie dwoma mililitrami 70% wodnego roztworu etanolu każdy przez pięć minut. Usunąć etanol przez aspirację. Pozostaw A NFS do całkowitego wyschnięcia na powietrzu przez około godzinę pod lampą sterylizacyjną UV w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

Aby zwiększyć adhezję komórkową, pokryj A NFS w fibronektynie przez noc, najpierw rozcieńczając fibronektynę w wodzie do pięciu mikrogramów na mililitr. Następnie odpipetuj dwa mililitry roztworu fibronektyny do naczynia. Następnie umieść A NFS w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 na noc.

Uzyskaj NR VM, HESC CMS lub inne interesujące komórki serca, odwiruj próbkę komórek z prędkością 1000 obr./min przez trzy minuty, aby osadzać komórki. Ostrożnie usunąć supernatant przez aspirację i upewnić się, że nie naruszyć osadu. Następnie ponownie zawieś komórki w pożywce hodowlanej do stężenia 4,6 razy 10 do sześciu komórek na mililitr.

Ostrożnie odpipetować 200 mikrolitrów zawiesiny komórek na wysterylizowany A NFS i upewnić się, że zawiesina komórek pozostała na szkiełku nakrywkowym. Następnie umieść komórki w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 na cztery godziny, aby umożliwić komórkom przyłączenie się do NFS A. Następnie dodaj dwa mililitry dodatkowej ciepłej pożywki hodowlanej do naczynia i ponownie umieść komórki w inkubatorze w tych samych warunkach.

Po 24 godzinach wyjmij pożywkę i dwukrotnie przemyj dwoma mililitrami DPBS, aby usunąć nadmiar komórek. Następnie dodaj do naczynia dwa mililitry ciepłej pożywki hodowlanej. Umieść komórki w inkubatorze w tych samych warunkach i hodowli.

Komórki do zbiegania się wymieniają pożywkę co drugi dzień. Na tym rysunku przedstawiono reprezentatywne obrazy w jasnym polu maszyn wirtualnych NR po siedmiu dniach hodowli i CMS HESC. Po 48 godzinach hodowli maszyny wirtualne NR i CMS HESC na powierzchniach NP wykazują wyraźną anizotropię strukturalną i wyrównanie, podczas gdy kardiomiocyty na powierzchniach wzorca UN są zorientowane losowo.

Analiza immunohistochemiczna podkreśla wpływ nanotopografii na wyrównanie cytoszkieletu komórek, mikrofilamenty aktyny i aktyna alfa sarkomeryczna w komórkach hodowanych na NFS A ustawiają się wzdłuż nano grzbietów, ale pozostają losowo rozmieszczone w komórkach na podłożach niewzorzystych. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o wysterylizowaniu podłoża przed umieszczeniem komórek, ponieważ zanieczyszczenie może stanowić duży problem po jego rozwinięciu. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią sercowo-naczyniową do zbadania dojrzewania serca i kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wytworzyć biomimetyczne podłoże do hodowli komórek za pomocą litografii sił kapilarnych do zastosowań w inżynierii tkanek serca.