Obrazowanie pojedynczej cząsteczki regulacji genów in vivo przy użyciu aktywacji kotranslacyjnej przez rozszczepienie (CoTrAC)

Celem tej procedury jest uzyskanie poklatkowych obrazów fluorescencyjnych rosnących kolonii E. coli, wyrażających konstrukty kotorowe w celu identyfikacji liczby nowo wytworzonych cząsteczek białka. Osiąga się to poprzez przygotowanie najpierw próbki komórek, w których koex wyraża interesujące białko połączone z fluorescencyjnym reporterem Cora oraz proteazę, która specyficznie rozszczepia się między reporterem Cora a białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Drugim krokiem jest przygotowanie żelu o niskiej temperaturze topnienia Aris wykonanego z minimalnych mediów M nine.

Następnie przygotowuje się podkładkę żelową AROS do użycia z komorą na próbki o kontrolowanej temperaturze. Komórki E. coli umieszcza się na żelu i komorę montuje się. Ostatnim krokiem jest umieszczenie komory na mikroskopie fluorescencyjnym i zobrazowanie kilku rosnących kolonii komórek w regularnych odstępach czasu przez wiele pokoleń.

Fotowybielanie nowo wytworzonych cząsteczek raportowych TRE w każdym interwale wszystkich ostatecznie re służy do pozyskiwania śladów czasowych produkcji białek w żywych komórkach z rozdzielczością pojedynczej cząsteczki i pojedynczej komórki. Przewagą tej techniki nad pomiarami ex pojedynczych komórek wykorzystującymi fuzję białek fluorescencyjnych jest to, że wytwarzanie dowolnego raka cząsteczek białka można śledzić za pomocą procedury pojedynczej cząsteczki, a wynik wpływa na funkcjonowanie cząsteczek. Aby zaprojektować sekwencje wstawienia szczepu, kodując sekwencję lokalizacji błony, szybko dojrzewające białko fluorescencyjne oraz sekwencję rozpoznawania proteazy i zakończenie do i w ramce z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania w tym konkretnym przypadku, czynnikiem transkrypcyjnym lub tf.

W tej procedurze wykorzystano reporter żylny TSR ukierunkowany na błonę. Reporter został połączony z sekwencją rozpoznawania proteazy ubikwityną, aby policzyć liczbę eksprymowanych bakterii faga Lambda Repressor, cząsteczek białka C. Po włączeniu konstruktu do chromosomu E. coli, plazmid kodujący proteazę specyficzną dla sekwencji rozpoznawania jest przekształcany w szczep wyrażający fluorescencyjny reporter i białko będące przedmiotem zainteresowania w fuzji translacyjnej.

W tym protokole proteaza ubikwityny karboksylowa Hydro, która rozszczepia się natychmiast po wykorzystaniu reszty ubikwityny na końcu C. Aby rozpocząć ten protokół, wybierz jedną kolonię E. coli ze świeżo pokrytej płytki agarowej do jednego mililitra M dziewięć, minimalnej pożywki uzupełnionej jednym x minimum niezbędnych aminokwasów i odpowiednimi antybiotykami. Inkubacja wytrząsarki w żądanej temperaturze wystarczająco długo, aby osiągnąć gęstość optyczną przy 600 nanometrach lub OD 600 większą niż 1,0.

Następnie rozcieńczyć kulturę na jeden mililitr świeżej pożywki M 9 z odpowiednimi antybiotykami do OD 600 0,02. Inkubując wytrząsarkę w odpowiedniej temperaturze, początkową gęstość komórkową można zwiększyć, jeśli jest to konieczne do wzrostu w niskiej temperaturze. Gdy OD 600 jest równe 0,2 do 0,3, zacznij przygotowywać podkładkę żelową ARO, ważąc od 10 do 20 miligramów aros o niskiej temperaturze topnienia do mikroprobówki o pojemności 1,5 mililitra.

Dodać odpowiednią objętość M dziewięć, minimalną pożywkę bez antybiotyków, aby uzyskać 3% roztwór do powstania. Następnie podgrzewaj powstały roztwór przez 30 minut w temperaturze 70 stopni Celsjusza, aby się rozpuścił. Odwróć probówkę, aby upewnić się, że roztwór jest całkowicie stopiony i jednorodny.

W przypadku montażu podkładki żelowej należy przepłukać sterylną wodą jedną wstępnie oczyszczoną szklankę nakrywkową i jedną szkiełko mikroakweduktu. Osuszyć szkło nakrywkowe i przesunąć przez przedmuchiwanie sprężonym powietrzem. Umieść gumową uszczelkę na zjeżdżalni mikroakweduktu tak, aby zakrywała wloty i wyloty.

Na szklanej stronie szkiełka nałóż 50 mikrolitrów roztworu ARO na środek mikroakweduktu. Nasunąć roztwór ARO na wierzch oczyszczonym, suchym szkłem nakrywkowym. Pozostaw roztwór agro w temperaturze pokojowej na 30 minut.

Kiedy komórki osiągną OD 600 od 0,3 do 0,4, są gotowe do obrazowania. Przenieś jeden mililitr inkubowanej kultury do 1,5-mililitrowej wirówki z mikrowirówką o temperaturze 10 000 razy G przez jedną minutę w mikrowirówce stołowej. Po wyrzuceniu środka SUP dodać jeden mililitr świeżej pożywki M nine i resus.

Zawiesić osad, delikatnie odwirować zawiesinę ponownie przy 10 000 razy G na jedną minutę. Następnie powtórz jeszcze raz etap wirowania rezu, delikatnie ponownie zawieś osad w jednym mililitrze pożywki M nine. W tym momencie komórki można użyć do obrazowania mikroskopowego lub rozcieńczyć od 10 do 100 razy, aby zapewnić niską gęstość komórek do obrazowania poklatkowego.

Aby przygotować próbkę do obrazowania, ostrożnie odklej szkło nakrywkowe od górnej części podkładki żelowej. Dodaj jeden mikrolitr umytej kultury komórkowej na wierzch podkładki żelowej. Odczekaj około dwóch minut, aż posiew zostanie wchłonięty przez podkładkę żelową.

Ważne jest, aby nie czekać tak długo, aby podkładka żelowa wyschła. Idealny czas będzie się różnił w zależności od temperatury i wilgotności podczas oczekiwania na sucho. Kolejna wstępnie oczyszczona szklana osłona.

Po wysuszeniu próbki przykryj ją nową szkłem nakrywkowym, upewniając się, że szkło nakrywkowe i zjeżdżalnia mikroakweduktu są dobrze wyrównane. Zmontuj komorę wzrostu z kontrolowaną temperaturą zgodnie z instrukcjami producenta. Teraz może być używany do obrazowania pod mikroskopem.

Aby rozpocząć obrazowanie, włącz laser i mikroskop zgodnie z instrukcjami producenta. Zablokuj zmontowaną komorę do stage wkładka mikroskopu. Ustaw temperaturę komory wzrostowej i grzałki obiektywu na 37 stopni Celsjusza lub inną żądaną temperaturę wzrostu.

W przypadku obrazowania powyżej temperatury pokojowej ostrość lub wkładka żelowa zwykle znacznie dryfują przez około 15 minut po początkowej zmianie temperatury. W praktyce. Wykorzystaj ten czas, aby znaleźć interesujące obszary i w razie potrzeby zmodyfikować skrypty obrazowania.

Na eksperyment. Dostosuj intensywność wzbudzenia lasera tak, aby prawie wszystkie cząsteczki fluorescencyjne wybielały się w ciągu sześciu ekspozycji. Znajdź komórki pod mikroskopem i wyśrodkuj je w predefiniowanym i wyrównanym regionie obrazowania.

Następnie zapisz pozycję każdej komórki: więcej niż jedna komórka może być zobrazowana na każdym obrazie. Okno czasowe akwizycji dla obrazowania poklatkowego przez wiele pokoleń zapewnia, że komórki obrazu są początkowo oddzielone od innych komórek, ale co najmniej kilkaset mikronów, aby inne kolonie nie dostały się do obszaru obrazowania podczas wzrostu. Korzystając z automatycznego skryptu obrazowania, pobierz dane poklatkowe za pomocą algorytmu opisanego w tym eksperymentalnym przepływie pracy, który można znaleźć w protokole tekstowym dołączonym do tego filmu.

Te obrazy przedstawiają typowe dane poklatkowe z eksperymentu śledzenia kodu. Obrazy z pojedynczej kolonii są wyświetlane w odstępach 25-minutowych. W tym eksperymencie dane były zbierane co pięć minut z 12 różnych kolonii.

Obrazy te reprezentują obrazy w jasnym polu i obrazy fluorescencji Wenus YFP z odjętym średnim tłem w celu uwzględnienia zmian tła całego pola obrazowania. Z biegiem czasu, gdy obrazy są nakładane na siebie, ujawniają biegunową lokalizację żylnych cząsteczek reporterowych UB TSR i niejednorodność liczby cząsteczek wytwarzanych w ciągu pięciu minut w różnych komórkach. Pokazano tutaj typowe dane z pojedynczego punktu czasowego w eksperymencie ze ścieżką kodową: pokazano obrazy fluorescencji żylnej z sześciu 100-milisekundowych ekspozycji, które zostały uzyskane na początku każdego pięciominutowego interwału czasowego.

Każda z sześciu ekspozycji została oddzielona od siebie o 900 milisekund, aby dać czas przejściowo ciemnym cząsteczkom żylnym, które odmrugały, aby stały się fluorescencyjne do analizy. Obraz szósty jest odejmowany od obrazu pierwszego w celu skorygowania o niebielone cząsteczki i autofluorescencję. Plamy tła na tym obrazie są zlokalizowane w określonych liniach komórkowych i określone ilościowo przez ich zintegrowaną intensywność fluorescencji.

Średnia zintegrowana fluorescencja kolonii jest następnie wykreślana na sześciu obrazach dopasowujących tę linię do rozkładu wykładniczego. Dodatkowo stałe przesunięcie daje okres połowicznego zaniku wynoszący około jednej sekundy. W tym eksperymencie cząsteczki żylne fotowybielają znacznie szybciej niż autofluorescencja komórkowa.

Dlatego około połowa całkowitej liczby cząsteczek żylnych jest wybielana foto w każdej klatce. W przypadku tej procedury analizę obrazowania przewodnictwa można przeprowadzić w innych miejscach, aby uzyskać triki liczby cząsteczek białka wytwarzanych w pojedynczych komórkach.