Name: Obrazowanie pojedynczej cząsteczki regulacji genów in vivo przy użyciu aktywacji kotranslacyjnej przez rozszczepienie (CoTrAC) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Poznaj metodę CoTrAC do obrazowania produkcji białek w żywych komórkach E. coli z precyzją pojedynczej cząsteczki. Technika ta umożliwia śledzenie dynamiki czynników transkrypcyjnych bez zakłócania ich funkcji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Plazmid pCG001 wyrażający Ubp1 został dzięki uprzejmości Rohana Bakera z John Curtin School of Medical Research. Ta praca została sfinansowana przez March of Dimes Research Grant 1-FY2011, March of Dimes Basil O'Connor Starter Scholar Research Award #5-FY20 oraz nagrodę NSF CAREER 0746796.

1. Przepływ pracy w inżynierii odkształceń
<ol>
	<li>Wstawić sekwencje kodujące (a) sekwencję lokalizacji błony, (b) szybko dojrzewające białko fluorescencyjne i (c) sekwencję rozpoznawania proteazy N-końcową do i w ramce z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania (np. czynnikiem transkrypcyjnym). Użyliśmy ukierunkowanego na błonę reportera Tsr-Venus 2 i połączyliśmy go z sekwencją rozpoznawania proteazy ubikwityną (Ub), aby policzyć liczbę eksprymowanych cząsteczek białka CI represora bakteriofagów λ. Szczegóły dotyczące tego, w jaki sposób skonstruowaliśmy białko fuzyjne Tsr-Venus-Ub-CI, zastępując region kodujący CI typu dzikiego i włączając konstrukt do chromosomu E. coli za pomocą rekombinacji λ Red 3, opisano szczegółowo w odnośniku 1.</li>
	<li>Sprawdź wszystkie modyfikacje przez sekwencjonowanie.</li>
	<li>Przekształć plazmid kodujący proteazę specyficzną dla sekwencji rozpoznawania użytej powyżej w szczep wyrażający fluorescencyjny reporter i białko będące przedmiotem zainteresowania w fuzji translacyjnej. Użyliśmy proteazy Ubp1, która rozszczepia się natychmiast po C-końcowej reszcie ubikwityny 4.</li>
</ol>
2. Hodowla komórek i przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Wybierz jedną interesującą kolonię E. coli ze świeżo pokrytej płytki agarowej do 1 ml minimalnej pożywki M9 5 uzupełnionej 1X aminokwasami MEM i odpowiednimi antybiotykami. Inkubować w wytrząsarce w żądanej temperaturze wystarczająco długo, aby osiągnąć OD600 > 1,0 (gęstość optyczna przy 600 nm).</li>
	<li>Rozcieńczyć kulturę w 1 ml świeżej pożywki M9 odpowiednimi antybiotykami do OD600 = 0,02. Inkubować w wytrząsarce w odpowiedniej temperaturze. Początkową gęstość komórkową można zwiększyć, jeśli jest to konieczne do wzrostu w niskiej temperaturze.</li>
	<li>Gdy OD600 = 0,2-0,3 (w 37 °C z początkową hodowlą komórkową w OD600 = 0,02, zajmie to 3-4 godziny), zacznij przygotowywać podkładkę z żelu agarozowego (krok 3).</li>
	<li>Komórki są gotowe do obrazowania, gdy OD600 = 0,3-0,4.</li>
	<li>Przenieść 1 ml inkubowanej kultury do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, odwirować przy 10 000 x g przez 1 minutę w mikrowirówce stołowej.</li>
	<li>Odrzucić sklarowany osad i dodać 1 ml świeżej pożywki M9 i delikatnie zawiesić osad.</li>
	<li>Wirować przy 10 000 x g przez 1 min.</li>
	<li>Powtórz kroki 1.6 i 1.7. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Delikatnie zawiesić ponownie w 1 ml pożywki M9. Komórki mogą być bezpośrednio używane do obrazowania mikroskopowego lub rozcieńczane od 10 do 100 razy, aby zapewnić niską gęstość komórek do obrazowania poklatkowego. Należy pamiętać, że niskie gęstości komórek są ważne w przypadku rozszerzonego obrazowania poklatkowego. Komora obrazowania (krok 4) jest uszczelniona podczas eksperymentu. Ze względu na wykładniczy wzrost komórek, wysokie początkowe stężenia komórek mogą znacznie zubożyć tlen w komorze po długotrwałym wzroście w podkładce żelowej, zmniejszając dojrzewanie białek fluorescencyjnych i wpływając na wzrost komórek.</li>
</ol>
3. Przygotuj roztwór agarozy
<ol>
	<li>Odważyć 10-20 mg agarozy o niskiej temperaturze topnienia do 1,5 ml probówki do mikrowirówki.</li>
	<li>Dodaj odpowiednią objętość minimalnej pożywki M9 bez antybiotyków, aby uzyskać 3% roztwór agarozy.</li>
	<li>Podgrzewać roztwór agarozy przez 30 minut w temperaturze 70 °C do stopienia, odwracając probówkę, aby upewnić się, że roztwór jest całkowicie stopiony i jednorodny. W tym momencie można wylać wkładkę żelową (krok 4) lub obniżyć temperaturę do 50 °C i trzymać przez kilka godzin do późniejszego użycia.</li>
</ol>
4. Przygotuj podkładkę żelową na komorze
<ol>
	<li>Około 50 minut przed obrazowaniem spłucz zjeżdżalnię Microaqueduct wodą.</li>
	<li>Opłucz jedną oczyszczoną szklankę nakrywkową (przy użyciu rygorystycznej metody czyszczenia, takiej jak opisana w punkcie 6) i szkiełko Microaqueduct sterylną wodą i wysusz, przedmuchując sprężonym powietrzem.</li>
	<li>Umieść gumową uszczelkę na zjeżdżalni mikroakweduktu tak, aby zakrywała wloty i wyloty po szklanej stronie zjeżdżalni mikroakweduktu (można ją zmodyfikować w przypadku zastosowań, w których media są przepuszczane przez próbkę). Nałóż 50 μl roztworu agarozy (krok 3) na środek zjeżdżalni mikroakweduktu.</li>
	<li>Na wierzch roztworu agarozy wyczyszczoną, suchą szklanką nakrywkową.</li>
	<li>Pozostaw roztwór agarozy w temperaturze pokojowej na 30 minut.</li>
	<li>W międzyczasie przygotuj próbkę komórki (krok 2).</li>
	<li>Ostrożnie zdejmij szklankę nakrywkową z górnej części podkładki żelowej. Dodaj 1,0 μl przemytej kultury komórkowej na wierzch podkładki żelowej. Odczekaj ~2 min, aż kultura zostanie wchłonięta przez podkładkę żelową. Ważne jest, aby nie czekać tak długo, aby podkładka żelowa wyschła, ale wystarczająco długo, aby komórki prawidłowo przylegały do podkładki żelowej. Idealny czas oczekiwania będzie się różnić w zależności od temperatury i wilgotności.</li>
	<li>Czekając, wysusz kolejną wstępnie oczyszczoną szklankę nakrywkową.</li>
	<li>Przykryj próbkę nową szklaną pokrywą, upewniając się, że szkło nakrywkowe i suwak mikroakweduktu są dobrze wyrównane.</li>
	<li>Zmontuj komorę wzrostu z kontrolowaną temperaturą zgodnie z instrukcjami producenta. Można go teraz używać do obrazowania pod mikroskopem (krok 5).</li>
</ol>
5. Obrazowanie i pozyskiwanie filmów poklatkowych
<ol>
	<li>Włącz laser i mikroskop zgodnie z instrukcjami producenta (np. laser może wymagać rozgrzania przez ~0.5 godziny przed eksperymentem).</li>
	<li>Zablokuj zmontowaną komorę do stage wkładka mikroskopu. Ustawić temperaturę komory wzrostowej i grzałki obiektywu na 37 °C lub inną żądaną temperaturę wzrostu.</li>
	<li>W przypadku obrazowania powyżej temperatury pokojowej ostrość lub podkładka żelowa zwykle znacznie dryfują przez ~15 minut po początkowej zmianie temperatury. W praktyce wykorzystaj ten czas na znalezienie interesujących obszarów i zmodyfikowanie skryptów obrazowania zgodnie z potrzebami eksperymentu.</li>
	<li>Znajdź komórki w mikroskopie i zapisz pozycję każdej komórki po wyśrodkowaniu jej w predefiniowanym i wyrównanym regionie obrazowania. W każdym oknie czasu pozyskiwania obrazu można obrazować więcej niż jedną komórkę. W przypadku obrazowania poklatkowego przez wiele pokoleń należy upewnić się, że obrazowane komórki są początkowo oddzielone od innych komórek o co najmniej kilkaset μm, aby inne kolonie nie weszły do obszaru obrazowania podczas wzrostu.</li>
	<li>Dostosuj intensywność wzbudzenia lasera tak, aby prawie wszystkie cząsteczki fluorescencyjne uległy fotowybielaniu w ciągu 6 ekspozycji (ryc. 5).</li>
	<li>Korzystając z automatycznego skryptu/dziennika obrazowania, uzyskaj dane poklatkowe przy użyciu algorytmu opisanego w eksperymentalnym przepływie pracy na rysunku 3.</li>
</ol>

<ol><li>Hensel, Z., Feng, H. D., Han, B., Hatem, C., Wang, J., Xiao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+expression+dynamics+of+transcription+factor+revealed+by+single-molecule+noise+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Stochastic expression dynamics of transcription factor revealed by single-molecule noise analysis.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 797-802 (2012).</li>
<li>Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+Gene+Expression+in+Live+Cells%2C+One+Protein+Molecule+at+a+Time%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Probing Gene Expression in Live Cells, One Protein Molecule at a Time.</a> Science. 311, 1600-1603 (2006).</li>
<li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).</li>
<li>Tobias, J. W., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+Functional+Analysis+of+the+Ubiquitin-specific+Protease+Gene+UBP1+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cloning and Functional Analysis of the Ubiquitin-specific Protease Gene UBP1 of Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Biol. Chem. 266, 12021-12028 (1991).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. , ed. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. A2.2(2001).</li>
<li>Xiao, J., Elf, J., Li, G., Yu, J., Xie, X. S. Imaging gene expression in living cells at the single-molecule level. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aXiao%2C+J+%22Single+Molecules%3A+a+laboratory+manual%22">Single Molecules: a laboratory manual</a>. , 149-169 (2007).</li>
<li>Nagai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nat. Biotechnol. 20, 87-90 (2002).</li>
<li>Stagaman, G., Forsyth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bright-field+microscopy+of+semitransparent+objects%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Opt.+Soc.+Am.+A%22%5BJournal%5D)">Bright-field microscopy of semitransparent objects.</a> J. Opt. Soc. Am. A. 5, 648-659 (1988).</li>
<li>Tobias, J. W., Shrader, T. E., Rocap, G., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-end+rule+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The N-end rule in bacteria.</a> Science. 254, 1374-137 (1991).</li>
</ol>

Nie mamy żadnych ujawnień.

Metodę CoTrAC można uogólnić w celu pomiaru produkcji innych białek, w przypadku których konwencjonalne N- lub C-końcowe fuzje białek fluorescencyjnych mogą zakłócać aktywność białek. Strategia CoTrAC ma trzy unikalne zalety w porównaniu z obecnymi metodami. Po pierwsze, fuzja kotranslacyjna zapewnia, że dla każdej cząsteczki białka będącego przedmiotem zainteresowania wytwarzana jest jedna cząsteczka reportera fluorescencyjnego, co umożliwia dokładne zliczanie produkcji białka w czasie rzeczywistym. Po drugie, ukierunko...

<table><tbody><tr><td>Agaroza (niska temperatura topnienia) </td><td>Lonza</td><td>50100</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5&#215; Sole</td><td></td><td></td> M9 <td>Zgodnie z przepisem opisanym w 9</td></tr><tr><td>20% glukozy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50&#215; Roztwór aminokwasów MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11130-051</td><td></td></tr><tr><td>Komora wzrostowa z kontrolowaną temperaturą Adapter stolika</td><td>Bioptechs</td><td>FCS-2</td><td></td></tr><tr><td>Podgrzewacz obiektywu</td><td>Bioptechs</td><td>Model zależy od obiektywu</td><td></td>mikroskopu</tr><tr><td>Zjeżdżalnia mikroakweduktu</td><td>Bioptechs</td><td>130119-5</td><td></td></tr><tr><td>Mikro okulary nakrywkowe</td><td>VWR</td><td>40CIR-1</td><td>Może być trudny do pozyskania; dostępne również w Bioptechs</td></tr><tr><td>Szkło osłonowe/uszczelka przesuwna</td> Mikroskop fluorescencyjny <td>Bioptechs</td><td>FCS2 0,75 mm</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Różne</td><td>Przykładowa konfiguracja: Koherentny laser argono-jonowy Innova 308C, mikroskop Olympus IX-81, obiektyw Olympus PlanApo 100X NA 1.45, oprogramowanie Metamorph</td><td>Musi mieć wzbudzenie laserowe, zautomatyzowany stolik xyz, oprogramowanie do automatyzacji zdolne do obrazowania skryptowego i autofokusa, optykę zdolną do rozdzielczości pojedynczej fluorescencji białka Kamera </td></tr><tr><td>EM-CCD</td><td>Różne</td><td>Przykładowa konfiguracja: Andor Ixon DU-898</td><td>Musi mieć wystarczająco niski poziom szumów, aby wykryć pojedyncze białka fluorescencyjne powyżej tła</td></tr></tbody></table>

obrazowanie pojedynczej cząsteczki regulacji genów in vivo przy użyciu aktywacji kotranslacyjnej przez rozszczepienie (cotrac)

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

Opisujemy metodę mikroskopii fluorescencyjnej, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), która obrazuje produkcję cząsteczek białka w żywych komórkach z precyzją pojedynczej cząsteczki bez zakłócania funkcjonalności białka. Metoda ta umożliwia zliczanie ilości cząsteczek białka wytworzonych w jednej komórce w sekwencyjnych, pięciominutowych oknach czasowych. Wymaga mikroskopu fluorescencyjnego o gęstości mocy wzbudzenia laserowego od ~0,5 do 1 kW/cm2, który jest wystarczająco czuły, aby wykryć pojedyncze cząsteczki białka fluorescencyjnego w żywych komórkach. Reporter fluorescencyjny stosowany w tej metodzie składa się z trzech części: sekwencji celującej w błonę, szybko dojrzewającego, żółtego białka fluorescencyjnego oraz sekwencji rozpoznawania proteazy. Reporter jest translacyjnie połączony z N-końcem białka będącego przedmiotem zainteresowania. Komórki są hodowane na stoliku mikroskopowym o kontrolowanej temperaturze. Co pięć minut cząsteczki fluorescencyjne w komórkach są obrazowane (a następnie zliczane przez analizę obrazów fluorescencyjnych), a następnie fotowybielane, tak aby w następnym pomiarze zliczane były tylko nowo translowane białka.
Obrazy fluorescencyjne wynikające z tej metody mogą być analizowane poprzez wykrywanie plamek fluorescencyjnych na każdym obrazie, przypisywanie ich do poszczególnych komórek, a następnie przypisywanie komórek do linii komórkowych. Liczbę białek wytworzonych w oknie czasowym w danej komórce oblicza się, dzieląc zintegrowaną intensywność fluorescencji plamek przez średnią intensywność pojedynczych cząsteczek fluorescencyjnych. Użyliśmy tej metody do pomiaru poziomów ekspresji w zakresie 0-45 cząsteczek w pojedynczych 5-minutowych oknach czasowych. Metoda ta umożliwiła nam zmierzenie szumu w ekspresji represora λ CI i ma wiele innych potencjalnych zastosowań w biologii systemów.

Typowe wyniki eksperymentu CoTrAC śledzącego produkcję represora λ CI przedstawiono na Rysunku 4 i 5. W tym eksperymencie obrazowano 12 kolonii w odstępach 5 min. W każdym punkcie czasowym kolonię najpierw ustawiano za pomocą autofokusa i centrowano w obszarze obrazowania. Następnie zapisywano wycentrowaną i ostrą pozycję, a potem pozyskiwano obraz w polu jasnym. Stolik przesuwano następnie o ~0,5 μm wzdłuż osi z, aby przejść z płaszczyzny ogniskowej pola jasnego do płaszczyzny przecinaj...

Opisujemy metodę mikroskopii fluorescencyjnej, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), do obrazowania produkcji cząsteczek białka w żywych komórkach z precyzją pojedynczej cząsteczki bez zakłócania funkcjonalności białka. Metoda ta została wykorzystana do śledzenia stochastycznej dynamiki ekspresji czynnika transkrypcyjnego, represora λ CI 1.

Obrazowanie pojedynczej cząsteczki regulacji genów in vivo przy użyciu aktywacji kotranslacyjnej przez rozszczepienie (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Celem tej procedury jest uzyskanie poklatkowych obrazów fluorescencyjnych rosnących kolonii E. coli, wyrażających konstrukty kotorowe w celu identyfikacji liczby nowo wytworzonych cząsteczek białka. Osiąga się to poprzez przygotowanie najpierw próbki komórek, w których koex wyraża interesujące białko połączone z fluorescencyjnym reporterem Cora oraz proteazę, która specyficznie rozszczepia się między reporterem Cora a białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Drugim krokiem jest przygotowanie żelu o niskiej temperaturze topnienia Aris wykonanego z minimalnych mediów M nine.Następnie przygotowuje się podkładkę żelową AROS do użycia z komorą na próbki o kontrolowanej temperaturze. Komórki E. coli umieszcza się na żelu i komorę montuje się. Ostatnim krokiem jest umieszczenie komory na mikroskopie fluorescencyjnym i zobrazowanie kilku rosnących kolonii komórek w regularnych odstępach czasu przez wiele pokoleń.Fotowybielanie nowo wytworzonych cząsteczek raportowych TRE w każdym interwale wszystkich ostatecznie re służy do pozyskiwania śladów czasowych produkcji białek w żywych komórkach z rozdzielczością pojedynczej cząsteczki i pojedynczej komórki. Przewagą tej techniki nad pomiarami ex pojedynczych komórek wykorzystującymi fuzję białek fluorescencyjnych jest to, że wytwarzanie dowolnego raka cząsteczek białka można śledzić za pomocą procedury pojedynczej cząsteczki, a wynik wpływa na funkcjonowanie cząsteczek. Aby zaprojektować sekwencje wstawienia szczepu, kodując sekwencję lokalizacji błony, szybko dojrzewające białko fluorescencyjne oraz sekwencję rozpoznawania proteazy i zakończenie do i w ramce z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania w tym konkretnym przypadku, czynnikiem transkrypcyjnym lub tf.W tej procedurze wykorzystano reporter żylny TSR ukierunkowany na błonę. Reporter został połączony z sekwencją rozpoznawania proteazy ubikwityną, aby policzyć liczbę eksprymowanych bakterii faga Lambda Repressor, cząsteczek białka C. Po włączeniu konstruktu do chromosomu E. coli, plazmid kodujący proteazę specyficzną dla sekwencji rozpoznawania jest przekształcany w szczep wyrażający fluorescencyjny reporter i białko będące przedmiotem zainteresowania w fuzji translacyjnej.W tym protokole proteaza ubikwityny karboksylowa Hydro, która rozszczepia się natychmiast po wykorzystaniu reszty ubikwityny na końcu C. Aby rozpocząć ten protokół, wybierz jedną kolonię E. coli ze świeżo pokrytej płytki agarowej do jednego mililitra M dziewięć, minimalnej pożywki uzupełnionej jednym x minimum niezbędnych aminokwasów i odpowiednimi antybiotykami. Inkubacja wytrząsarki w żądanej temperaturze wystarczająco długo, aby osiągnąć gęstość optyczną przy 600 nanometrach lub OD 600 większą niż 1,0.Następnie rozcieńczyć kulturę na jeden mililitr świeżej pożywki M 9 z odpowiednimi antybiotykami do OD 600 0,02. Inkubując wytrząsarkę w odpowiedniej temperaturze, początkową gęstość komórkową można zwiększyć, jeśli jest to konieczne do wzrostu w niskiej temperaturze. Gdy OD 600 jest równe 0,2 do 0,3, zacznij przygotowywać podkładkę żelową ARO, ważąc od 10 do 20 miligramów aros o niskiej temperaturze topnienia do mikroprobówki o pojemności 1,5 mililitra.Dodać odpowiednią objętość M dziewięć, minimalną pożywkę bez antybiotyków, aby uzyskać 3% roztwór do powstania. Następnie podgrzewaj powstały roztwór przez 30 minut w temperaturze 70 stopni Celsjusza, aby się rozpuścił. Odwróć probówkę, aby upewnić się, że roztwór jest całkowicie stopiony i jednorodny.W przypadku montażu podkładki żelowej należy przepłukać sterylną wodą jedną wstępnie oczyszczoną szklankę nakrywkową i jedną szkiełko mikroakweduktu. Osuszyć szkło nakrywkowe i przesunąć przez przedmuchiwanie sprężonym powietrzem. Umieść gumową uszczelkę na zjeżdżalni mikroakweduktu tak, aby zakrywała wloty i wyloty.Na szklanej stronie szkiełka nałóż 50 mikrolitrów roztworu ARO na środek mikroakweduktu. Nasunąć roztwór ARO na wierzch oczyszczonym, suchym szkłem nakrywkowym. Pozostaw roztwór agro w temperaturze pokojowej na 30 minut.Kiedy komórki osiągną OD 600 od 0,3 do 0,4, są gotowe do obrazowania. Przenieś jeden mililitr inkubowanej kultury do 1,5-mililitrowej wirówki z mikrowirówką o temperaturze 10 000 razy G przez jedną minutę w mikrowirówce stołowej. Po wyrzuceniu środka SUP dodać jeden mililitr świeżej pożywki M nine i resus.Zawiesić osad, delikatnie odwirować zawiesinę ponownie przy 10 000 razy G na jedną minutę. Następnie powtórz jeszcze raz etap wirowania rezu, delikatnie ponownie zawieś osad w jednym mililitrze pożywki M nine. W tym momencie komórki można użyć do obrazowania mikroskopowego lub rozcieńczyć od 10 do 100 razy, aby zapewnić niską gęstość komórek do obrazowania poklatkowego.Aby przygotować próbkę do obrazowania, ostrożnie odklej szkło nakrywkowe od górnej części podkładki żelowej. Dodaj jeden mikrolitr umytej kultury komórkowej na wierzch podkładki żelowej. Odczekaj około dwóch minut, aż posiew zostanie wchłonięty przez podkładkę żelową.Ważne jest, aby nie czekać tak długo, aby podkładka żelowa wyschła. Idealny czas będzie się różnił w zależności od temperatury i wilgotności podczas oczekiwania na sucho. Kolejna wstępnie oczyszczona szklana osłona.Po wysuszeniu próbki przykryj ją nową szkłem nakrywkowym, upewniając się, że szkło nakrywkowe i zjeżdżalnia mikroakweduktu są dobrze wyrównane. Zmontuj komorę wzrostu z kontrolowaną temperaturą zgodnie z instrukcjami producenta. Teraz może być używany do obrazowania pod mikroskopem.Aby rozpocząć obrazowanie, włącz laser i mikroskop zgodnie z instrukcjami producenta. Zablokuj zmontowaną komorę do stage wkładka mikroskopu. Ustaw temperaturę komory wzrostowej i grzałki obiektywu na 37 stopni Celsjusza lub inną żądaną temperaturę wzrostu.W przypadku obrazowania powyżej temperatury pokojowej ostrość lub wkładka żelowa zwykle znacznie dryfują przez około 15 minut po początkowej zmianie temperatury. W praktyce. Wykorzystaj ten czas, aby znaleźć interesujące obszary i w razie potrzeby zmodyfikować skrypty obrazowania.Na eksperyment. Dostosuj intensywność wzbudzenia lasera tak, aby prawie wszystkie cząsteczki fluorescencyjne wybielały się w ciągu sześciu ekspozycji. Znajdź komórki pod mikroskopem i wyśrodkuj je w predefiniowanym i wyrównanym regionie obrazowania.Następnie zapisz pozycję każdej komórki: więcej niż jedna komórka może być zobrazowana na każdym obrazie. Okno czasowe akwizycji dla obrazowania poklatkowego przez wiele pokoleń zapewnia, że komórki obrazu są początkowo oddzielone od innych komórek, ale co najmniej kilkaset mikronów, aby inne kolonie nie dostały się do obszaru obrazowania podczas wzrostu. Korzystając z automatycznego skryptu obrazowania, pobierz dane poklatkowe za pomocą algorytmu opisanego w tym eksperymentalnym przepływie pracy, który można znaleźć w protokole tekstowym dołączonym do tego filmu.Te obrazy przedstawiają typowe dane poklatkowe z eksperymentu śledzenia kodu. Obrazy z pojedynczej kolonii są wyświetlane w odstępach 25-minutowych. W tym eksperymencie dane były zbierane co pięć minut z 12 różnych kolonii.Obrazy te reprezentują obrazy w jasnym polu i obrazy fluorescencji Wenus YFP z odjętym średnim tłem w celu uwzględnienia zmian tła całego pola obrazowania. Z biegiem czasu, gdy obrazy są nakładane na siebie, ujawniają biegunową lokalizację żylnych cząsteczek reporterowych UB TSR i niejednorodność liczby cząsteczek wytwarzanych w ciągu pięciu minut w różnych komórkach. Pokazano tutaj typowe dane z pojedynczego punktu czasowego w eksperymencie ze ścieżką kodową: pokazano obrazy fluorescencji żylnej z sześciu 100-milisekundowych ekspozycji, które zostały uzyskane na początku każdego pięciominutowego interwału czasowego.Każda z sześciu ekspozycji została oddzielona od siebie o 900 milisekund, aby dać czas przejściowo ciemnym cząsteczkom żylnym, które odmrugały, aby stały się fluorescencyjne do analizy. Obraz szósty jest odejmowany od obrazu pierwszego w celu skorygowania o niebielone cząsteczki i autofluorescencję. Plamy tła na tym obrazie są zlokalizowane w określonych liniach komórkowych i określone ilościowo przez ich zintegrowaną intensywność fluorescencji.Średnia zintegrowana fluorescencja kolonii jest następnie wykreślana na sześciu obrazach dopasowujących tę linię do rozkładu wykładniczego. Dodatkowo stałe przesunięcie daje okres połowicznego zaniku wynoszący około jednej sekundy. W tym eksperymencie cząsteczki żylne fotowybielają znacznie szybciej niż autofluorescencja komórkowa.Dlatego około połowa całkowitej liczby cząsteczek żylnych jest wybielana foto w każdej klatce. W przypadku tej procedury analizę obrazowania przewodnictwa można przeprowadzić w innych miejscach, aby uzyskać triki liczby cząsteczek białka wytwarzanych w pojedynczych komórkach.

single-molecule-imaging-gene-regulation-vivo-using-cotranslational

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek regulacji genów in vivo przy użyciu aktywacji kotranslacyjnej przez rozszczepienie (CoTrAC)

Kinetykę transkrypcyjną polimerazy RNA II mierzy się na wybranych genach w żywych komórkach. mRNA transkrybowane z badanego genu są znakowane fluorescencyjnie, a za pomocą metody FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) wyznacza się kinetykę elongacji transkrypcji in vivo.

Pomiar kinetyki transkrypcji mRNA w pojedynczych żywych komórkach

Ratiometryczne dwumolekularne latarnie (RBMB) mogą być używane do obrazowania pojedynczych transkryptów RNA w żywych komórkach. W tym miejscu opisujemy przygotowanie i oczyszczanie RBMB, dostarczanie RBMB do komórek za pomocą mikroporacji i obrazowanie fluorescencyjne pojedynczych transkryptów RNA w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym pojedynczych zmodyfikowanych transkryptów RNA w żywych komórkach przy użyciu ratiometrycznych latarni bimolekularnych

Ten protokół opisuje strategię optogenetyczną do modulowania aktywności kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK) podczas różnicowania komórek i rozwoju embrionalnego Xenopus. Metoda ta pozwala na odwracalną aktywację szlaku sygnałowego MAPK w hodowli komórek ssaków oraz w wielokomórkowych organizmach żywych, takich jak zarodki Xendopus, z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową.

Odwracalna modulacja szlaku kinazy białkowej aktywowanej mitogenem za pośrednictwem światła podczas różnicowania komórek i rozwoju embrionalnego Xenopus

Ten protokół opisuje kombinatoryczne zastosowanie ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq i profilowania rybosomów dla linii komórkowych i komórek pierwotnych. Umożliwia śledzenie zmian w wiązaniu czynnika transkrypcyjnego, transkrypcji de novo, przetwarzaniu RNA, obrocie i translacji w czasie oraz wyświetlanie ogólnego przebiegu zdarzeń w aktywowanych i/lub szybko zmieniających się komórkach.

Analiza w czasie rzeczywistym wiązania czynników transkrypcyjnych, transkrypcji, translacji i obrotu w celu wyświetlenia globalnych zdarzeń podczas aktywacji komórkowej

Tutaj opisujemy standardowy protokół wykrywania aktywności β-galaktozydazy we wczesnych zarodkach całych myszy oraz metodę sekcji parafiny i przeciwbarwienia. Jest to łatwa i szybka procedura monitorowania ekspresji genów podczas rozwoju, która może być również stosowana do skrawków tkanek, narządów lub hodowanych komórek.

Śledzenie ekspresji genów poprzez wykrywanie aktywności β-galaktozydazy w całych zarodkach myszy

Regulacja środowiska chromatyny jest niezbędnym procesem niezbędnym do prawidłowej ekspresji genów. W tym miejscu opisujemy metodę kontrolowania ekspresji genów poprzez rekrutację maszynerii modyfikującej chromatynę w sposób specyficzny dla genu i odwracalny.

Tłumienie transkrypcji genów poprzez przekierowywanie maszynerii komórkowej za pomocą chemicznych modyfikatorów epigenetycznych

Ten protokół przedstawia kroki potrzebne do wygenerowania modelowego systemu, w którym transkrypcja interesującego nas endogennego genu może być warunkowo kontrolowana u żywych zwierząt lub komórek za pomocą ulepszonych systemów represora lac i/lub aktywatora tet.

Zastosowanie in vivo systemu REMOTE-control do manipulacji endogenną ekspresją genów

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) jest potężnym narzędziem do zrozumienia molekularnych mechanizmów regulacji genów. Metoda ta wiąże się jednak z trudnościami w uzyskaniu powtarzalnej fragmentacji chromatyny przez mechaniczne ścinanie. W tym miejscu przedstawiamy ulepszony protokół testu ChIP z wykorzystaniem trawienia enzymatycznego.

Test immunoprecypitacji chromatyny z wykorzystaniem nukleaz mikrokokowych w komórkach ssaków

Neuronalne komórki macierzyste/progenitorowe wykazują różną dynamikę ekspresji komponentów sygnalizacyjnych Notch, które prowadzą do różnych wyników zdarzeń komórkowych. Taką dynamiczną ekspresję można ujawnić poprzez monitorowanie w czasie rzeczywistym, a nie przez analizę statyczną, przy użyciu bardzo czułego systemu obrazowania bioluminescencyjnego, który umożliwia wizualizację szybkich zmian w ekspresji genów.

Obrazowanie bioluminescencyjne w czasie rzeczywistym dynamiki sygnalizacji Notch podczas neurogenezy myszy

Śledzenie indywidualnych zdarzeń translacji pozwala na badania kinetyczne w wysokiej rozdzielczości mechanizmów translacji zależnych od czapek. Tutaj demonstrujemy test pojedynczej cząsteczki in vitro oparty na obrazowaniu interakcji między fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami a powstającymi peptydami znakowanymi epitopami. Metoda ta umożliwia jednocząsteczkową charakterystykę kinetyki inicjacji i wydłużania peptydów podczas aktywnej translacji in vitro zależnej od kapu.

Test obrazowania pojedynczych cząsteczek in vitro do analizy kinetyki translacji zależnej od czapeczki

Badanie opisuje metodę eksperymentów o wysokiej przepustowości z wykorzystą matrycę LED drukowaną w 3D, aby zoptymalizować ekspresję genów indukowanych światłem w HEK293T komórkach.

Szybka optymalizacja systemu indukowalnego światłem do kontroli ekspresji genów ssaków

Poznaj metodę CoTrAC do obrazowania produkcji białek w żywych komórkach E. coli z precyzją pojedynczej cząsteczki. Technika ta umożliwia śledzenie dynamiki czynników transkrypcyjnych bez zakłócania ich funkcji.

Obrazowanie pojedynczej cząsteczki regulacji genów in vivo przy użyciu aktywacji kotranslacyjnej przez rozszczepienie (CoTrAC)

Przeglądaj więcej filmów