Obrazowanie w superrozdzielczości maszynerii podziału bakteryjnego

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest uzyskanie ilościowych informacji strukturalnych na temat białek podziału komórek E. coli w ich naturalnym środowisku. Osiąga się to poprzez ekspresję fotoaktywnego fluorescencyjnego białka fuzyjnego w żywych komórkach i unieruchomienie tych komórek na podkładce acro gel. Komórki są następnie obrazowane za pomocą strumieniowego przesyłania wideo.

Podczas gdy lasery wzbudzające i aktywacyjne są stosowane do wizualizacji lokalizacji pojedynczych cząsteczek, powstałe filmy są analizowane obliczeniowo w celu wyodrębnienia pozycji cząsteczek z nanometrową dokładnością i nałożenia ich w celu wygenerowania obrazu o super rozdzielczości. Obraz ten może być następnie analizowany za pomocą różnych pomiarów ilościowych, które opisują strukturę będącą przedmiotem zainteresowania, w tym jej wymiary i gęstość cząsteczek. Lokalizacja aktywowana zdjęciem, mikroskopia lub dłoń to łatwa do wdrożenia technika mikroskopii fluorescencyjnej o super rozdzielczości.

Oprzyrządowanie jest proste, ale do uzyskania wiarygodnych wyników wymagana jest staranna optymalizacja pozyskiwania i analizy danych. Kolejnym kluczowym krokiem jest zakres charakterystyki białka fuzyjnego i poziomu ekspresji, aby upewnić się, że wyniki są biologicznie istotne. Poniższy protokół został zoptymalizowany dla Muse Two z białkiem FTSZ i powinien być dostosowany do interesującego Cię białka.

Aby rozpocząć, należy zaszczepić pożywkę LB pojedynczą kolonią interesującego nas szczepu, zawierającą fluorescencyjnie sczepiane białko przygotowane zgodnie z opisem w pisemnym protokole. Dołączając ten film, następnego dnia uprawiaj przez noc w shakerze w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Rozcieńczyć kulturę od jednego do 1000 w M dziewięć plus minimalna pożywka.

Hodować do połowy fazy logarytmicznej w obecności odpowiedniego antybiotyku w temperaturze pokojowej, a następnie indukować kulturę do produkcji białka za pomocą 20 mikromolowych IPTG przez dwie godziny. W międzyczasie zmontuj komorę obrazowania, przygotowując 3% roztwór agro w pożywce M nine minus. Rozpuść agros w temperaturze 70 stopni Celsjusza w stołowym bloku grzewczym przez 40 minut.

Przechowuj stopiony agros w temperaturze 50 stopni Celsjusza do pięciu godzin. Umieść czysty szkiełko mikroakweduktu w górnej połowie komory obrazowania elektrodami skierowanymi w dół. Dopasuj dolną uszczelkę do zjeżdżalni mikroakweduktu tak, aby zakryć kanały perfuzyjne.

Nałóż około 50 mikrolitrów stopionego aros na środek szklanki. Natychmiast nasuń kroplę żelu Agros czystym, suchym szkiełkiem nakrywkowym. Pozostawić żel do zestalenia się w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut po indukcji białka.

Osadzaj kulturę w mikrowirówce. Resus. Zawiesić osad w równej objętości M dziewięć plus powtórne wirowanie i zawiesinę rezu po drugim zawieszeniu rezu. Kontynuuj wzrost w temperaturze pokojowej przez dwie godziny.

Następnie utrwal indukowaną kulturę, dodając aldehyd paraform do PBS, aby uzyskać końcowe stężenie 4% aldehydu paraformowego. W przypadku obrazowania żywych komórek należy zapoznać się z pisemnym protokołem dołączonym do tego filmu, aby zapoznać się z różnicami w procedurze, pozostawić hodowlę do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 40 minut. Osadzać kulturę i ponownie zawiesić w równej objętości PBS.

Następnie rozcieńczyć 50 nanometrowych złotych kulek, od jednego do 10 za pomocą ponownie zawieszonej kultury. Aby nanieść próbkę do przygotowanej komory obrazowania, ostrożnie usuń szkiełko nakrywkowe, pozostawiając podkładkę żelową na szkiełku mikroakweduktu. Natychmiast dodaj jeden mikrolitr próbki kultury komórkowej do górnej części podkładki żelowej.

Odczekaj około dwóch minut, aż roztwór zostanie wchłonięty przez podkładkę żelową i przykryj podkładkę żelową nową, czystą, suchą szkiełkiem nakrywkowym. Kontynuuj montaż całej komory obrazowania zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi akwizycji obrazu. Włącz kamerę mikroskopu i lasery.

Otwórz oprogramowanie metamorficzne za pomocą urządzeń molekularnych. Umieść odpowiednie filtry wzbudzenia i emisji na ścieżce obrazowania, jak pokazano na tym schemacie mikroskopu, który można znaleźć w pisemnej procedurze dołączonej do tego filmu. Następnie ustaw moce lasera i ustawienia akwizycji.

Odpowiednio zablokuj komorę obrazowania w stoliku za pomocą adaptera stopnia uzupełniającego. Skoncentruj się na powierzchni komórek znajdujących się najbliżej wargi szkiełka nakrywkowego. Wyznacz odpowiedni obszar obrazowania, który jest jednorodnie oświetlony przez wszystkie trzy lasery.

Zidentyfikuj obszar próbki, który zawiera zarówno komórki, jak i znaczniki odniesienia, którymi są złote koraliki znajdujące się w bliskiej odległości, ale nie nakładające się na siebie. Uzyskaj jeden obraz w jasnym polu z czasem integracji 50 milisekund i przenieś ostrość o 0,5 mikrometra w głąb próbki. Następnie uzyskaj zespołowy obraz zielonej fluorescencji ze wzbudzeniem z lasera o długości 488 nanometrów, wykorzystując 50-milisekundowy czas integracji.

Następnie uzyskaj strumieniowe wideo z ciągłym oświetleniem z laserów 405 nanometrów i 561 nanometrów. W przypadku komórek stałych używana jest szybkość odświeżania 50 milisekund, co daje łącznie 20 000 klatek. Przy zwiększanej mocy lasera 405 nm o około 10% co 1000 klatek, pokazywane jest tutaj pierwsze 500 klatek.

Należy zauważyć, że liczba pozyskanych ramek została zoptymalizowana dla tego systemu i zależy od konkretnej struktury komórkowej. Szybkość aktywacji gęstości etykietowania i to, czy wyczerpanie całej puli podłóg podłogowych jest ważne dla analizy Aby wykonać konstrukcję obrazu. Po pierwsze, zidentyfikuj prospektywne punkty w strumieniu obrazu, ponieważ trzy sąsiadujące ze sobą piksele o intensywności powyżej empirycznie określonego progu dopasowują intensywność każdego prospektywnego punktu do dwuwymiarowej funkcji Gaussa.

Aby określić pozycję cząsteczki i całkowitą liczbę wyemitowanych fotonów, oblicz pozycję lokalizacyjną każdego miejsca na podstawie całkowitej liczby wykrytych fotonów. Następnie odrzuć słabo dopasowane plamki, stosując próg precyzji lokalizacji i usuń powtarzające się obserwacje tej samej cząsteczki, ignorując każdą plamkę, która znajduje się w promieniu 45 nanometrów i sześciu klatek od dowolnego postępującego miejsca prawidłowego dla dryfu próbki. Odejmując zależne od klatki przemieszczenie złotych koralików od każdej pozycji cząsteczki, nałożono na siebie wszystkie skorygowane pozycje cząsteczek na pojedynczy obraz złożony z pikseli o wymiarach 15 na 15 nanometrów, wykreślając każdą unikalną cząsteczkę jako jednostkę powierzchni, dwuwymiarowy profil Gaussa z odchyleniem standardowym równym precyzji lokalizacji.

Wynikowy obraz jest mapą gęstości prawdopodobieństwa, na której intensywność piksela jest proporcjonalna do prawdopodobieństwa znalezienia cząsteczki. W tym Pixel zilustrowany. Oto dwuwymiarowe renderowanie ZR w super rozdzielczości wygenerowane za pomocą metody obrazowania dłoni.

Jakościowo zaobserwowano, że pierścień Z jest nieregularną strukturą, która przyjmuje wiele konfiguracji, takich jak pojedyncze pasma lub spiralne łuki, które nie są rozróżnialne na konwencjonalnych obrazach fluorescencyjnych. Obserwacje takie jak te można wykorzystać do określenia procentu populacji komórek, która wykazuje określoną konfigurację strukturalną. Wymiary ZR można również zmierzyć z tej działki.

Szerokość pierścienia określono na 113 nanometrów. Wartość ta jest szersza niż oczekiwana szerokość pojedynczego filamentu protograficznego FDSC, która wynosi od pięciu do 10 nanometrów w oparciu o mikroskopię elektronową in vitro. Tutaj średnica pierścienia jest mierzona jako 1050 nanometrów.

Średnica ta może być użyta do ilościowego opisania stopnia zwężenia podczas podziału komórki. Innym podejściem ilościowym jest obliczenie gęstości cząsteczek poprzez zliczenie liczby cząsteczek zlokalizowanych w określonym regionie. Ponieważ obrazy dłoni są projekcjami 2D obiektów 3D, należy zastosować całkowite odbicie wewnętrzne lub dłoń TIR, aby ograniczyć płaszczyznę wykrywania do jednej strony pierścienia Z.

Ponieważ wykreślone cząsteczki reprezentują podzbiór całkowitej populacji FDSC, wyznaczona gęstość jest dolną granicą rzeczywistej gęstości. Maksymalna gęstość zaobserwowana na zdjęciach TIR pierścienia Z sugeruje, że niektóre sekcje zawierają nakładające się na siebie włókna proto. Podczas tej procedury ważne jest, aby monitorować morfologię komórek i tempo wzrostu, aby upewnić się, że ekspresja białka fuzyjnego nie wpływa na żywotność komórek.

Po ustaleniu tej procedury dla interesującego Cię białka, można ją wykorzystać do zbadania zmian strukturalnych związanych z postępem cyklu komórkowego lub dalej rozszerzyć do obrazowania dwukolorowego w celu porównania rozkładu wielu białek na twarzy.