Name: Obrazowanie w superrozdzielczości maszynerii podziału bakteryjnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Odkryj mikroskopię PALM do badania struktury pierścienia FtsZ w komórkach E. coli. Ta metoda superrozdzielcza pozwala na precyzyjne obrazowanie białek cytoszkieletowych bakterii z dokładnością nanometryczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Grant: 5RO1GM086447-02.

1. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Zaszczepić pożywkę LB pojedynczą kolonią szczepu JB281 [BW25113 / pJB042 (PLac:FtsZ-mEos2)]. Rosnąć przez noc w shakerze w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Rozcieńczyć kulturę w stosunku 1:1,000 w minimalnej pożywce M9+ [sole M9, 0,4% glukozy, 2 mMMgSO4, 0,1 mM CaCl2, aminokwasy MEM i witaminy] i rośnić do środkowej fazy logarytmicznej (OD600 = 0,2-0,3) w obecności chloramfenikolu (150 μg / ml) w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Wywołaj hodowlę za pomocą 20 μM IPTG przez 2 godziny (patrz Uwaga #1).</li>
	<li>Hodowlę osadów w mikrowirówce (8 000 obr./min, 1 min) i ponowne zawieszenie w równej objętości M9+; powtórzyć. Po drugim podwieszeniu kontynuować wzrost w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.</li>
	<li>Utrwalić indukowaną hodowlę za pomocą 4% paraformaldehydu w PBS (pH = 7,4) w temperaturze pokojowej przez 40 min. Hodowla osadów i ponownie zawiesić w równej objętości PBS; powtórzyć. W przypadku obrazowania żywych komórek należy pominąć utrwalanie, hodowlę osadów i ponownie zawiesić z równą objętością M9- [sole M9, 0,4% glukozy, 2 mMMgSO4, 0,1 mM CaCl2, aminokwasy MEM]; powtórzyć.</li>
	<li>Rozcieńczyć złote koraliki w stosunku 1:10 z ponownie zawieszoną kulturą. Pobrać próbkę do przygotowanej komory obrazowania (patrz krok 2.4).</li>
</ol>
[1] Uwaga: Powyższy protokół indukcji (kroki 1.1-1.3) został zoptymalizowany dla systemu ekspresji szczepu JB281. Szczegółowe warunki indukcji mogą się różnić w przypadku innych systemów ekspresji lub białek będących przedmiotem zainteresowania.
2. Montaż komory obrazowania
<ol>
	<li>Przygotować 3% (w/v) roztwór agarozy w M9-. Rozpuść agarozę w temperaturze 70 °C w stołowym bloku grzewczym przez 40 minut. Stopioną agarozę należy przechowywać w temperaturze 50 °C do 5 godzin.</li>
	<li>Umieść czysty szkiełko mikroakweduktu w górnej połowie komory obrazowania elektrodami skierowanymi w dół. Dopasuj dolną uszczelkę na zjeżdżalni mikroakweduktu tak, aby zakryć kanały perfuzyjne.</li>
	<li>Nałóż ~50 μl stopionej agarozy na środek szkiełka podstawowego. Natychmiast przykryj kroplę żelu agarozowego czystym, suchym szkiełkiem nakrywkowym. Pozostawić żel do zastygnięcia w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
	<ol>
		<li>Aby wyczyścić szkiełka nakrywkowe: ułóż szkiełka nakrywkowe w ceramicznym uchwycie i sonikuj przez 20 minut w obrotowych kąpielach acetonu, etanolu i 1M KOH w szklanych słoikach. Powtórz cykl trzy razy, w sumie 9 soników, a następnie pojedynczą sonikację w dH2O. Oczyszczone szkiełka nakrywkowe przechowuj w świeżej dH2O. Przed użyciem wysusz szkiełka nakrywkowe suszarką przefiltrowanym powietrzem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ostrożnie zdejmij szkiełko nakrywkowe, pozostawiając podkładkę żelową na zjeżdżalni mikroakweduktu. Natychmiast dodać 1 μl próbki kultury komórkowej (patrz krok 1.6) do górnej części wkładki żelowej. Odczekać ~2 min, pozwalając roztworowi wchłonąć się przez podkładkę żelową. Górna podkładka żelowa z nowym, czystym, suchym szkiełkiem nakrywkowym. Zmontuj całą komorę obrazowania zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>
3. Akwizycja obrazu
<ol>
	<li>Włącz mikroskop, kamerę i lasery. Otwórz oprogramowanie MetaMorph (Molecular Devices).</li>
	<li>Umieść odpowiednie filtry wzbudzenia/emisji w ścieżce obrazowania (rysunek 1).</li>
	<li>Ustaw odpowiednio moce lasera i ustawienia akwizycji.
	<ol>
		<li>Laser 488-nm = 15 mW (patrz Uwaga #2)</li>
		<li>Laser 561 nm = 75 mW</li>
		<li>Laser 405 nm = 2 mW ± filtr o neutralnej gęstości (patrz Uwaga #3)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zablokuj komorę obrazowania w stoliku za pomocą uzupełniającego adaptera stopnia.</li>
	<li>Wyznacz odpowiedni obszar obrazowania (100x100 pikseli), który jest równomiernie oświetlony przez wszystkie trzy lasery.</li>
	<li>Zidentyfikuj obszar próbki, który zawiera zarówno komórki, jak i znaczniki odniesienia (złote koraliki) w bliskiej odległości, ale nie nakładające się na siebie.</li>
	<li>Skoncentruj się na powierzchni komórek znajdujących się najbliżej szkiełka nakrywkowego. Uzyskać jeden obraz w jasnym polu o czasie integracji 50 ms i przesunąć ostrość o 0,5 μm w głąb próbki (rysunek 3Ai).</li>
	<li>Uzyskaj zespołowy obraz zielonej fluorescencji ze wzbudzeniem z lasera 488 nm, wykorzystując czas całkowania 50 ms (rysunek 3Aii).</li>
	<li>Rejestruj strumieniowe wideo w kanale czerwonym z ciągłym oświetleniem z laserów 405 nm i 561 nm. W przypadku komórek stacjonarnych szybkość odświeżania 50 ms jest używana dla łącznie 20 000 klatek (łącznie ~17 minut) przy mocy lasera 405 nm zwiększanej o ~10% co 1000 klatek (patrz Uwaga #4). W przypadku aktywnych komórek używana jest szybkość odświeżania 10 ms, co daje łącznie 3 000 klatek (łącznie ~30 s) przy stałej mocy lasera 405 nm.</li>
	<li>Przenieś fokus z powrotem na dolną powierzchnię komórek i uzyskaj kolejny obraz w jasnym polu, jak w kroku 3.7.</li>
</ol>
[2] Uwaga: Zintegrowana intensywność zielonej fluorescencji komórki jest wprost proporcjonalna do całkowitej liczby cząsteczek FtsZ-mEos2 wyrażonych w komórce. Ustawienia mocy wzbudzenia 488 nm i akwizycji fluorescencji zespołowej powinny być stałe dla wszystkich komórek, aby można było porównać względne poziomy ekspresji FtsZ-mEos2 w różnych komórkach.
[3] Uwaga: Stałe komórki są obrazowane za pomocą filtra o neutralnej gęstości (ND) (Rysunek 1, Komponent optyczny #5) w celu osiągnięcia powolnego tempa aktywacji, tak aby każda pojedyncza cząsteczka mogła być dokładnie zidentyfikowana. Filtr ND jest usuwany podczas obrazowania żywych komórek w celu zwiększenia szybkości aktywacji, przy jednoczesnym zachowaniu niskiego prawdopodobieństwa jednoczesnej aktywacji dwóch cząsteczek w obszarze ograniczonym dyfrakcją. Szybsze tempo stosowane do obrazowania żywych komórek jest potrzebne, aby skrócić całkowity czas akwizycji, a tym samym "zamrozić" pierścień Z w czasie i ograniczyć efekt fotouszkodzenia komórki.
[4] Uwaga: Liczba pozyskanych ramek została zoptymalizowana dla naszego systemu i zależy od konkretnej struktury komórkowej, gęstości znakowania, szybkości aktywacji i tego, czy wyczerpanie całej puli fluoroforów jest ważne dla analizy. W żywych komórkach ważne jest, aby uzyskać wystarczającą liczbę lokalizacji w jak najkrótszym czasie, aby uniknąć rozmycia obrazu z powodu ruchu struktury komórkowej.
4. Budowa obrazu PALM
<ol>
	<li>Określ położenie środka ciężkości każdego wykrytego miejsca.
	<ol>
		<li>Załaduj stos obrazów do Matlaba (MathWorks, Inc).</li>
		<li>Przytnij stos obrazów do obszaru wokół jednej komórki, który wyklucza wszystkie koraliki odniesienia.</li>
		<li>Wybierz próg intensywności wykrywania punktowego, który znajduje się powyżej poziomu tła, ale poniżej średniej intensywności plamki. Uwzględniamy różnice w poziomie tła w całym eksperymencie, obliczając średnią bieżącą maksymalnej intensywności przy użyciu okna 150 klatek. Próg intensywności dla każdej klatki jest następnie interpolowany od wartości średniej bieżącej.</li>
		<li>Odejmij odpowiedni próg od każdej klatki. Punkty prospektywne są identyfikowane jako trzy sąsiadujące ze sobą piksele o intensywności powyżej progu.</li>
		<li>Dopasuj intensywność fluorescencji każdej potencjalnej plamki do dwuwymiarowej funkcji Gaussa [Równanie #1] za pomocą nieliniowego algorytmu najmniejszych kwadratów (Rysunek 2). Precyzja lokalizacji każdej plamki jest obliczana na podstawie całkowitej liczby wykrytych fotonów [Równanie #2]. Każda źle dopasowana plamka o precyzji lokalizacji większej niż 20 nm (stałe komórki) lub 45 nm (żywe komórki) jest odrzucana (patrz Uwaga #5). Każde miejsce o natężeniu większym niż dwukrotność średniej intensywności, prawdopodobnie z powodu nakładających się na siebie emiterów, jest również odrzucane.</li>
		<li>W przypadku komórek stałych należy usunąć powtarzające się obserwacje tej samej cząsteczki, ignorując każdą plamkę, której położenie środka ciężkości znajduje się w odległości 45 nm od dowolnego innego miejsca, które poprzedzało je o 6 ramek lub mniej. W przypadku żywych komórek wszystkie plamki są zachowywane.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kalibracja dryftu próbki za pomocą ruchu znacznika odniesienia.
	<ol>
		<li>Wytnij obszar o wymiarach 10x10 pikseli wokół znacznika odniesienia.</li>
		<li>Odjąć odpowiedni próg określony w ppkt 4.1.3 od każdej ramki.</li>
		<li>Dopasuj profil intensywności w każdej klatce za pomocą algorytmu dopasowania najmniejszych kwadratów, przyjmując dwuwymiarowy kształt Gaussa.</li>
		<li>Obliczanie przemieszczenia między położeniami środka ciężkości względem klatki 1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skorygować położenie środka ciężkości każdej unikalnej cząsteczki zidentyfikowanej w ppkt 4.1 przy odpowiednim dryfcie próbki obliczonym w ppkt 4.2. Porównaj obrazy w jasnym polu uzyskane w 3.7 i 3.10. Jeśli zaobserwuje się, że komórki poruszają się względem markerów odniesienia, dane są odrzucane.</li>
	<li>Nałóż wszystkie skorygowane pozycje środka ciężkości na pojedynczy obraz złożony z pikseli 15x15 nm. Wykreśl każdą unikalną cząsteczkę jako dwuwymiarowy profil Gaussa o powierzchni jednostkowej wyśrodkowany w położeniu środka ciężkości z odchyleniem standardowym równym precyzji lokalizacji [Równanie #2]. W ten sposób powstaje mapa gęstości prawdopodobieństwa, na której intensywność piksela jest proporcjonalna do prawdopodobieństwa znalezienia cząsteczki w tym pikselu (rysunek 3Aiv).</li>
	<li>Porównywanie obrazów PALM z obrazami zespołowymi.
	<ol>
		<li>Powtórz położenie środka ciężkości jak w ppkt 4.4, ale na płaszczyźnie z pikselami 150x150 nm i odchyleniem standardowym równym 250 nm. W ten sposób generowany jest obraz PALM, który naśladuje obraz z ograniczoną dyfrakcją, który można wykorzystać do porównania z ograniczonym dyfrakcyjnie, zespołowym obrazem uzyskanym w 3.8 (Rysunek 3Aiii).</li>
		<li>Aby potwierdzić, że wykryte cząsteczki są reprezentatywne dla całej populacji, porównaj zrekonstruowany obraz zespołu (Rysunek 3Aiii, krok 4.5.1) z eksperymentalnym obrazem fluorescencji zespołowej (Rysunek 3Aii, krok 3.8), aby potwierdzić, że oba obrazy pokazują struktury o podobnym kształcie, orientacji i względnej intensywności.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
[5] Uwaga: Minimalna wymagana precyzja lokalizacji została określona empirycznie dla każdej metody obrazowania, poprzez wykreślenie dokładności wszystkich cząsteczek dla danej próbki i wybranie odpowiedniego punktu odcięcia.
5. Analiza obrazu PALM
<ol>
	<li>Pomiar szerokości i średnicy pierścienia Z.
	<ol>
		<li>Obróć obraz PALM tak, aby ustawić w pionie długą oś komórki (Rysunek 4A).</li>
		<li>Wytnij obszar komórkowy zawierający pierścień Z.</li>
		<li>Oblicz skumulowaną intensywność, rzutując profil intensywności wzdłuż długiej osi komórki.</li>
		<li>Dopasuj profil intensywności do rozkładu Gaussa. Szerokość pierścienia definiuje się jako maksymalną połowę szerokości całkowitej (FWHM) dopasowanego rozkładu Gaussa (rysunek 4B).</li>
		<li>Rzutować skumulowany profil intensywności z ppkt 5.1.2 wzdłuż krótkiej osi ogniwa. Średnicę pierścienia definiuje się jako pełną długość profilu intensywności (rysunek 4C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykreślanie gęstości FtsZ (patrz uwaga #6).
	<ol>
		<li>Powtórz pozycje środka ciężkości, jak w (4.4), ale bez profilu Gaussa, tak aby każdej unikalnej cząsteczce nadano wartość 1 i przypisano ją do pojedynczego piksela odpowiadającego jej położeniu środka ciężkości. W ten sposób intensywność każdego piksela reprezentuje całkowitą liczbę cząsteczek wykrytych w tym pikselu. Obraz Density PALM można również wizualizować jako wykres konturowy (Rysunek 5E).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określanie rozdzielczości przestrzennej.
	<ol>
		<li>Teoretycznie osiągalna rozdzielczość przestrzenna: utwórz reprezentatywny PSF dla całej próbki, korzystając ze średniej wyznaczonej precyzji lokalizacji wszystkich wykrytych cząsteczek i oblicz FWHM (równanie #3).</li>
		<li>Eksperymentalnie uzyskana rozdzielczość przestrzenna: oblicz średnie przemieszczenie między powtarzającymi się obserwacjami tej samej cząsteczki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
[6] Uwaga: Użyliśmy całkowitego wewnętrznego odbicia PALM (TIR-PALM, Rysunek 1 i 5), aby ograniczyć aktywację i wzbudzenie do cienkiej warstwy (~200 nm) powyżej granicy faz komórka/szkło. tak, że wykrywane będą tylko cząsteczki FtsZ związane z membraną znajdującą się najbliżej szkiełka nakrywkowego.

<ol><li>Buddelmeijer, N., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+cell+division+proteins+at+the+E.+coli+cell+center%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assembly of cell division proteins at the E. coli cell center.</a> Curr. Opin. Microbiol. 5, 553-557 (2002).</li>
<li>de Boer, P., Crossley, R., Rothfield, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essential+bacterial+cell-division+protein+FtsZ+is+a+GTPase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The essential bacterial cell-division protein FtsZ is a GTPase.</a> Nature. 359, 254-256 (1992).</li>
<li>Lutkenhaus, J. F., Wolf-Watz, H., Donachie, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+genes+in+the+ftsA-envA+region+of+the+Escherichia+coli+genetic+map+and+identification+of+a+new+fts+locus+%28ftsZ%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Organization of genes in the ftsA-envA region of the Escherichia coli genetic map and identification of a new fts locus (ftsZ).</a> J. Bacteriol. 142, 615-620 (1980).</li>
<li>Bi, E. F., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FtsZ+ring+structure+associated+with+division+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">FtsZ ring structure associated with division in Escherichia coli.</a> Nature. 354, 161-164 (1991).</li>
<li>Erickson, H. P., Taylor, D. W., Taylor, K. A., Bramhill, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+cell+division+protein+FtsZ+assembles+into+protofilament+sheets+and+minirings%2C+structural+homologs+of+tubulin+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Bacterial cell division protein FtsZ assembles into protofilament sheets and minirings, structural homologs of tubulin polymers.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 519-523 (1996).</li>
<li>Osawa, M., Anderson, D. E., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+contractile+FtsZ+rings+in+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of contractile FtsZ rings in liposomes.</a> Science. 320, 792-794 (2008).</li>
<li>Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+FtsZ+filaments+in+vivo+suggests+a+force-generating+role+in+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division.</a> Embo J. 26, 4694-4708 (2007).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li>
<li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat. Methods. 6, 131-133 (2009).</li>
<li>Fu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vivo+FtsZ-ring+structure+revealed+by+Photoactivated+Localization+Microisocpy+%28PALM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">In-vivo FtsZ-ring structure revealed by Photoactivated Localization Microisocpy (PALM).</a> Plos One. , (2010).</li>
<li>Huecas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energetics+and+geometry+of+FtsZ+polymers%3A+nucleated+self-assembly+of+single+protofilaments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Energetics and geometry of FtsZ polymers: nucleated self-assembly of single protofilaments.</a> Biophys. J. , (2007).</li>
<li>Ma, X., Ehrhardt, D. W., Margolin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+of+cell+division+proteins+FtsZ+and+FtsA+to+cytoskeletal+structures+in+living+Escherichia+coli+cells+by+using+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Colocalization of cell division proteins FtsZ and FtsA to cytoskeletal structures in living Escherichia coli cells by using green fluorescent protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 12998-13003 (1996).</li>
<li>Dai, K., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proper+ratio+of+FtsZ+to+FtsA+is+required+for+cell+division+to+occur+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The proper ratio of FtsZ to FtsA is required for cell division to occur in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 174, 6145-6151 (1992).</li>
<li>Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clustering+artifacts+in+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).</li>
<li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Obrazy PALM zawierają informacje o liczbie i położeniu cząsteczek w komórce, co pozwala na szczegółową analizę rozmieszczenia i rozmieszczenia docelowych cząsteczek białka, co jest trudne do osiągnięcia w inny sposób. Poniżej przedstawiamy środki ostrożności, które należy podjąć, aby uzyskać dokładne informacje ilościowe przy jednoczesnym zachowaniu biologicznego znaczenia obrazów PALM. Badamy również informacje, które można najlepiej uzyskać przy użyciu komórek aktywnych i stałych. Na koniec sugerujemy sposoby uzyskania...

<table><tbody><tr><td>50 x MEM Aminokwasy</td><td>Sigma</td><td>M5550</td><td></td></tr><tr><td>100 x MEM Witaminy</td><td>Sigma</td><td>M6895</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Mediatech</td><td>46-102-RF</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyd</td><td>Mikrsokopia elektronowa Nauki</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>SeaPlaque GTG Agaroza</td><td>Lonzo</td><td>50111</td><td></td></tr><tr><td>50 nm Złote Koraliki</td><td>Mikrosfery-Nanosfery</td><td>790113-010</td><td></td></tr><tr><td>Komora obrazowania FCS2</td> Adapter <td>sceniczny Bioptechs</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>ASI</td><td>I-3017</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>1.45 NA, 60-krotny obiektyw</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IXON EMCCD Kamera</td><td>Andor Technology</td><td>DU897E</td><td></td></tr><tr><td>488-nm Szafirowy spójny laser</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>561-nm Szafirowy laser</td><td>koherentny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>405-nm CUBE</td><td>Koherentny</td><td></td><td></td> laserowy</tr></tbody></table>

obrazowanie w superrozdzielczości maszynerii podziału bakteryjnego

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Podział komórek bakteryjnych wymaga skoordynowanego składania więcej niż dziesięciu niezbędnych białek w środkowej komórce1,2. Kluczowe znaczenie dla tego procesu ma tworzenie pierścieniowatej suprastruktury (pierścienia Z) przez białko FtsZ w planie podziału3,4. Pierścień Z składa się z wielu jednoniciowych protofilamentów FtsZ, a zrozumienie układu protofilamentów wewnątrz pierścienia Z zapewni wgląd w mechanizm montażu pierścienia Z i jego funkcję jako generatora siły5,6. Informacje te pozostały nieuchwytne ze względu na obecne ograniczenia w konwencjonalnej mikroskopii fluorescencyjnej i mikroskopii elektronowej. Konwencjonalna mikroskopia fluorescencyjna nie jest w stanie zapewnić obrazu pierścienia Z o wysokiej rozdzielczości ze względu na granicę dyfrakcji światła (~200 nm). Obrazowanie kriotomograficzne elektronowe wykryło rozproszone protofilamenty FtsZ w małych komórkach C. crescentus 7, ale jest trudne do zastosowania do większych komórek, takich jak E. coli lub B. subtilis. W tym miejscu opisujemy zastosowanie metody mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości, Photoactivated Localization Microscopy (PALM), w celu ilościowego scharakteryzowania organizacji strukturalnej pierścienia Z8 E. coli.
	Obrazowanie PALM oferuje zarówno wysoką rozdzielczość przestrzenną (~35 nm), jak i specyficzne znakowanie, aby umożliwić jednoznaczną identyfikację docelowych białek. Oznaczyliśmy FtsZ fotoaktywowanym białkiem fluorescencyjnym mEos2, które przełącza się z zielonej fluorescencji (wzbudzenie = 488 nm) na czerwoną fluorescencję (wzbudzenie = 561 nm) po aktywacji przy 405 nm9. Podczas eksperymentu PALM pojedyncze cząsteczki FtsZ-mEos2 są aktywowane stochastycznie, a odpowiednie pozycje środka ciężkości pojedynczych cząsteczek są określane z dokładnością <20 nm. Obraz pierścienia Z o wysokiej rozdzielczości jest następnie rekonstruowany poprzez nałożenie pozycji środka ciężkości wszystkich wykrytych cząsteczek FtsZ-mEos2.
	Korzystając z tej metody, stwierdziliśmy, że pierścień Z ma stałą szerokość ~100 nm i składa się z luźnej wiązki protofilamentów FtsZ, które nakładają się na siebie w trzech wymiarach. Dane te stanowią punkt wyjścia do dalszych badań nad zależnymi od cyklu komórkowego zmianami pierścienia Z10 i mogą być stosowane do innych interesujących białek.

Na Rysunku 3Aiv przedstawiono dwuwymiarową renderację o wysokiej rozdzielczości pierścienia Z, wygenerowaną za pomocą opisanej powyżej metody obrazowania PALM. Poniżej podsumowano informacje jakościowe i ilościowe, jakie można z nich uzyskać.
	Jakościowo zaobserwowano, że pierścień Z jest nieregularną strukturą przyjmującą wiele konfiguracji (pojedynczy pas lub łuk helikalny), których nie można rozróżnić na konwencjonalnych obrazach fluorescencyjnych (porównać Rycina 3...

Opisujemy metodę obrazowania w super-rozdzielczości, aby zbadać strukturalną organizację bakteryjnego pierścienia FtsZ, niezbędnego aparatu do podziału komórek. Metoda ta opiera się na analizach ilościowych obrazów z mikroskopii lokalizacji aktywowanej fotoaktywowaną (PALM) i może być stosowana do innych bakteryjnych białek cytoszkieletu.

Obrazowanie w superrozdzielczości maszynerii podziału bakteryjnego

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest uzyskanie ilościowych informacji strukturalnych na temat białek podziału komórek E. coli w ich naturalnym środowisku. Osiąga się to poprzez ekspresję fotoaktywnego fluorescencyjnego białka fuzyjnego w żywych komórkach i unieruchomienie tych komórek na podkładce acro gel. Komórki są następnie obrazowane za pomocą strumieniowego przesyłania wideo.Podczas gdy lasery wzbudzające i aktywacyjne są stosowane do wizualizacji lokalizacji pojedynczych cząsteczek, powstałe filmy są analizowane obliczeniowo w celu wyodrębnienia pozycji cząsteczek z nanometrową dokładnością i nałożenia ich w celu wygenerowania obrazu o super rozdzielczości. Obraz ten może być następnie analizowany za pomocą różnych pomiarów ilościowych, które opisują strukturę będącą przedmiotem zainteresowania, w tym jej wymiary i gęstość cząsteczek. Lokalizacja aktywowana zdjęciem, mikroskopia lub dłoń to łatwa do wdrożenia technika mikroskopii fluorescencyjnej o super rozdzielczości.Oprzyrządowanie jest proste, ale do uzyskania wiarygodnych wyników wymagana jest staranna optymalizacja pozyskiwania i analizy danych. Kolejnym kluczowym krokiem jest zakres charakterystyki białka fuzyjnego i poziomu ekspresji, aby upewnić się, że wyniki są biologicznie istotne. Poniższy protokół został zoptymalizowany dla Muse Two z białkiem FTSZ i powinien być dostosowany do interesującego Cię białka.Aby rozpocząć, należy zaszczepić pożywkę LB pojedynczą kolonią interesującego nas szczepu, zawierającą fluorescencyjnie sczepiane białko przygotowane zgodnie z opisem w pisemnym protokole. Dołączając ten film, następnego dnia uprawiaj przez noc w shakerze w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Rozcieńczyć kulturę od jednego do 1000 w M dziewięć plus minimalna pożywka.Hodować do połowy fazy logarytmicznej w obecności odpowiedniego antybiotyku w temperaturze pokojowej, a następnie indukować kulturę do produkcji białka za pomocą 20 mikromolowych IPTG przez dwie godziny. W międzyczasie zmontuj komorę obrazowania, przygotowując 3% roztwór agro w pożywce M nine minus. Rozpuść agros w temperaturze 70 stopni Celsjusza w stołowym bloku grzewczym przez 40 minut.Przechowuj stopiony agros w temperaturze 50 stopni Celsjusza do pięciu godzin. Umieść czysty szkiełko mikroakweduktu w górnej połowie komory obrazowania elektrodami skierowanymi w dół. Dopasuj dolną uszczelkę do zjeżdżalni mikroakweduktu tak, aby zakryć kanały perfuzyjne.Nałóż około 50 mikrolitrów stopionego aros na środek szklanki. Natychmiast nasuń kroplę żelu Agros czystym, suchym szkiełkiem nakrywkowym. Pozostawić żel do zestalenia się w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut po indukcji białka.Osadzaj kulturę w mikrowirówce. Resus. Zawiesić osad w równej objętości M dziewięć plus powtórne wirowanie i zawiesinę rezu po drugim zawieszeniu rezu. Kontynuuj wzrost w temperaturze pokojowej przez dwie godziny.Następnie utrwal indukowaną kulturę, dodając aldehyd paraform do PBS, aby uzyskać końcowe stężenie 4% aldehydu paraformowego. W przypadku obrazowania żywych komórek należy zapoznać się z pisemnym protokołem dołączonym do tego filmu, aby zapoznać się z różnicami w procedurze, pozostawić hodowlę do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 40 minut. Osadzać kulturę i ponownie zawiesić w równej objętości PBS.Następnie rozcieńczyć 50 nanometrowych złotych kulek, od jednego do 10 za pomocą ponownie zawieszonej kultury. Aby nanieść próbkę do przygotowanej komory obrazowania, ostrożnie usuń szkiełko nakrywkowe, pozostawiając podkładkę żelową na szkiełku mikroakweduktu. Natychmiast dodaj jeden mikrolitr próbki kultury komórkowej do górnej części podkładki żelowej.Odczekaj około dwóch minut, aż roztwór zostanie wchłonięty przez podkładkę żelową i przykryj podkładkę żelową nową, czystą, suchą szkiełkiem nakrywkowym. Kontynuuj montaż całej komory obrazowania zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi akwizycji obrazu. Włącz kamerę mikroskopu i lasery.Otwórz oprogramowanie metamorficzne za pomocą urządzeń molekularnych. Umieść odpowiednie filtry wzbudzenia i emisji na ścieżce obrazowania, jak pokazano na tym schemacie mikroskopu, który można znaleźć w pisemnej procedurze dołączonej do tego filmu. Następnie ustaw moce lasera i ustawienia akwizycji.Odpowiednio zablokuj komorę obrazowania w stoliku za pomocą adaptera stopnia uzupełniającego. Skoncentruj się na powierzchni komórek znajdujących się najbliżej wargi szkiełka nakrywkowego. Wyznacz odpowiedni obszar obrazowania, który jest jednorodnie oświetlony przez wszystkie trzy lasery.Zidentyfikuj obszar próbki, który zawiera zarówno komórki, jak i znaczniki odniesienia, którymi są złote koraliki znajdujące się w bliskiej odległości, ale nie nakładające się na siebie. Uzyskaj jeden obraz w jasnym polu z czasem integracji 50 milisekund i przenieś ostrość o 0,5 mikrometra w głąb próbki. Następnie uzyskaj zespołowy obraz zielonej fluorescencji ze wzbudzeniem z lasera o długości 488 nanometrów, wykorzystując 50-milisekundowy czas integracji.Następnie uzyskaj strumieniowe wideo z ciągłym oświetleniem z laserów 405 nanometrów i 561 nanometrów. W przypadku komórek stałych używana jest szybkość odświeżania 50 milisekund, co daje łącznie 20 000 klatek. Przy zwiększanej mocy lasera 405 nm o około 10% co 1000 klatek, pokazywane jest tutaj pierwsze 500 klatek.Należy zauważyć, że liczba pozyskanych ramek została zoptymalizowana dla tego systemu i zależy od konkretnej struktury komórkowej. Szybkość aktywacji gęstości etykietowania i to, czy wyczerpanie całej puli podłóg podłogowych jest ważne dla analizy Aby wykonać konstrukcję obrazu. Po pierwsze, zidentyfikuj prospektywne punkty w strumieniu obrazu, ponieważ trzy sąsiadujące ze sobą piksele o intensywności powyżej empirycznie określonego progu dopasowują intensywność każdego prospektywnego punktu do dwuwymiarowej funkcji Gaussa.Aby określić pozycję cząsteczki i całkowitą liczbę wyemitowanych fotonów, oblicz pozycję lokalizacyjną każdego miejsca na podstawie całkowitej liczby wykrytych fotonów. Następnie odrzuć słabo dopasowane plamki, stosując próg precyzji lokalizacji i usuń powtarzające się obserwacje tej samej cząsteczki, ignorując każdą plamkę, która znajduje się w promieniu 45 nanometrów i sześciu klatek od dowolnego postępującego miejsca prawidłowego dla dryfu próbki. Odejmując zależne od klatki przemieszczenie złotych koralików od każdej pozycji cząsteczki, nałożono na siebie wszystkie skorygowane pozycje cząsteczek na pojedynczy obraz złożony z pikseli o wymiarach 15 na 15 nanometrów, wykreślając każdą unikalną cząsteczkę jako jednostkę powierzchni, dwuwymiarowy profil Gaussa z odchyleniem standardowym równym precyzji lokalizacji.Wynikowy obraz jest mapą gęstości prawdopodobieństwa, na której intensywność piksela jest proporcjonalna do prawdopodobieństwa znalezienia cząsteczki. W tym Pixel zilustrowany. Oto dwuwymiarowe renderowanie ZR w super rozdzielczości wygenerowane za pomocą metody obrazowania dłoni.Jakościowo zaobserwowano, że pierścień Z jest nieregularną strukturą, która przyjmuje wiele konfiguracji, takich jak pojedyncze pasma lub spiralne łuki, które nie są rozróżnialne na konwencjonalnych obrazach fluorescencyjnych. Obserwacje takie jak te można wykorzystać do określenia procentu populacji komórek, która wykazuje określoną konfigurację strukturalną. Wymiary ZR można również zmierzyć z tej działki.Szerokość pierścienia określono na 113 nanometrów. Wartość ta jest szersza niż oczekiwana szerokość pojedynczego filamentu protograficznego FDSC, która wynosi od pięciu do 10 nanometrów w oparciu o mikroskopię elektronową in vitro. Tutaj średnica pierścienia jest mierzona jako 1050 nanometrów.Średnica ta może być użyta do ilościowego opisania stopnia zwężenia podczas podziału komórki. Innym podejściem ilościowym jest obliczenie gęstości cząsteczek poprzez zliczenie liczby cząsteczek zlokalizowanych w określonym regionie. Ponieważ obrazy dłoni są projekcjami 2D obiektów 3D, należy zastosować całkowite odbicie wewnętrzne lub dłoń TIR, aby ograniczyć płaszczyznę wykrywania do jednej strony pierścienia Z.Ponieważ wykreślone cząsteczki reprezentują podzbiór całkowitej populacji FDSC, wyznaczona gęstość jest dolną granicą rzeczywistej gęstości. Maksymalna gęstość zaobserwowana na zdjęciach TIR pierścienia Z sugeruje, że niektóre sekcje zawierają nakładające się na siebie włókna proto. Podczas tej procedury ważne jest, aby monitorować morfologię komórek i tempo wzrostu, aby upewnić się, że ekspresja białka fuzyjnego nie wpływa na żywotność komórek.Po ustaleniu tej procedury dla interesującego Cię białka, można ją wykorzystać do zbadania zmian strukturalnych związanych z postępem cyklu komórkowego lub dalej rozszerzyć do obrazowania dwukolorowego w celu porównania rozkładu wielu białek na twarzy.

super-resolution-imaging-of-the-bacterial-division-machinery

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Superrozdzielcze obrazowanie maszyny dzielącej bakterie

Czasoprzestrzenne informacje o dynamicznych białkach wewnątrz żywych komórek są kluczowe dla zrozumienia biologii. Rodzaj mikroskopii superrozdzielczej, zwany szybką mikroskopią oświetlenia strukturalnego 3D (f3D-SIM), ujawnia unikalne informacje na temat cytokinetycznego pierścienia Z u bakterii: zarówno jego wygląd podobny do koralików, jak i szybką dynamikę FtsZ w pierścieniu.

Obrazowanie cytokinetycznego pierścienia Z w superrozdzielczości u żywych bakterii przy użyciu szybkiej mikroskopii oświetlenia strukturalnego 3D (f3D-SIM)

Ten artykuł przedstawia protokół wykrywania jednego lub więcej białek plazmy i/lub błony wewnątrzkomórkowej za pomocą mikroskopii superrozdzielczej GSD (Ground State Depletion) w komórkach ssaków. W tym miejscu omawiamy korzyści i rozważania dotyczące stosowania takich podejść do wizualizacji i kwantyfikacji białek komórkowych.

Obrazowanie w superrozdzielczości zubożenia stanu podstawowego w komórkach ssaków

Białka receptora germinantu skupiają się w 'germinosomach' w wewnętrznej błonie zarodników Bacillus subtilis. Opisujemy protokół wykorzystujący mikroskopię super rozdzielczości i fluorescencyjne białka reporterowe do wizualizacji germinosomów. Protokół identyfikuje również wewnętrzne domeny błony zarodnikowej, które są preferencyjnie barwione barwnikiem błonowym FM4-64.

Wizualizacja germinosomów i błony wewnętrznej w zarodnikach Bacillus subtilis

Ten artykuł zawiera przewodnik krok po kroku do badania dynamiki lokalizacji subkomórkowej białek i monitorowania zmian morfologicznych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości u Bacillus subtilis i Staphylococcus aureus.

Mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek w celu zbadania lokalizacji białek subkomórkowych i zmian morfologii komórek u bakterii

Ten protokół wyjaśnia, jak przygotować i zamontować próbki bakterii do trójwymiarowego obrazowania na żywo oraz jak zrekonstruować trójwymiarowy kształt E. coli na podstawie tych obrazów.

Trójwymiarowe obrazowanie komórek bakteryjnych w celu dokładnego odwzorowania komórek i precyzyjnej lokalizacji białek

Obrazowanie komórek bakteryjnych to nowe podejście do biologii systemowej, skoncentrowane na definiowaniu statycznych i dynamicznych procesów, które dyktują funkcjonowanie dużych maszyn makromolekularnych. W tym przypadku integracja ilościowego obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej jest wykorzystywana do badania architektury i funkcji systemu wydzielania Legionella pneumophila typu IV.

Zastosowanie obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej w celu określenia czasoprzestrzennych cech systemu wydzielania kropk/icm Legionella pneumophila

Prezentowany tutaj jest protokół do obrazowania żywych komórek w nienaruszonej tkance w superrozdzielczości. Ustandaryzowaliśmy warunki obrazowania bardzo wrażliwej populacji dorosłych komórek macierzystych w ich natywnym środowisku tkankowym. Technika ta polega na zrównoważeniu rozdzielczości czasowej i przestrzennej, aby umożliwić bezpośrednią obserwację zjawisk biologicznych w żywej tkance.

Obrazowanie żywych komórek w superrozdzielczości struktur subkomórkowych

Mikroskopia superrozdzielcza może dostarczyć szczegółowych informacji na temat organizacji komponentów w kompleksie synaptonemalnym w mejozie. Tutaj demonstrujemy protokół rozwiązywania poszczególnych białek kompleksu synaptonemalnego Caenorhabditis elegans.

Mikroskopia superrozdzielcza kompleksu synaptonemalnego w obrębie linii zarodkowej Caenorhabditis elegans

Ten artykuł zawiera prosty i przejrzysty protokół oznaczania efektorów wydzielanych przez Salmonellę za pomocą rozszerzenia kodu genetycznego (GCE) specyficznie dla miejsca i obrazowania subkomórkowej lokalizacji wydzielanych białek w komórkach HeLa za pomocą bezpośredniej stochastycznej mikroskopii rekonstrukcji optycznej (dSTORM)...

Obrazowanie w superrozdzielczości białek wydzielanych przez bakterie za pomocą ekspansji kodu genetycznego

Tutaj opisujemy procedurę, która umożliwia wykrywanie bakterii chorobotwórczych w całym narządzie podczas infekcji i ilościowe określanie aktywności fluorescencyjnego reportera.

Trójwymiarowa tomografia całego narządu o wysokiej rozdzielczości zakażeń bakteryjnych

Ten artykuł przedstawia obszerny protokół dla PmbExM, techniki mikroskopii ekspansyjnej zaprojektowanej specjalnie dla biofilmów Proteus mirabilis. PmbExM wykorzystuje stopniową obróbkę enzymatyczną próbek biofilmu w celu uzyskania izotropowej, 4,3-krotnej ekspansji, umożliwiającej analizę w superrozdzielczości organizacji przestrzennej struktur komórkowych i subkomórkowych w tych siedzących zbiorowiskach drobnoustrojów.

Obrazowanie biofilmu Proteus mirabilis w superrozdzielczości za pomocą mikroskopii ekspansyjnej

Odkryj mikroskopię PALM do badania struktury pierścienia FtsZ w komórkach E. coli. Ta metoda superrozdzielcza pozwala na precyzyjne obrazowanie białek cytoszkieletowych bakterii z dokładnością nanometryczną.

Obrazowanie w superrozdzielczości maszynerii podziału bakteryjnego

Przeglądaj więcej filmów