Name: Oznaczanie uszkodzeń DNA w neuronach hipokampa za pomocą testu komety (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Poznaj oznaczanie uszkodzeń DNA w neuronach hipokampa za pomocą testu komety. Ta metoda pozwala ilościowo ocenić integralność DNA w pojedynczych neuronach przy użyciu elektroforezy i mikroskopii fluorescencyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta nagrodą IMPACT Award od Departamentu Radioterapii Onkologicznej, University of Alabama-Birmingham Comprehensive Cancer Center, Fighting Children's Cancer Foundation oraz Fundacji Gabrielle's Angel (do ESY.).

1. Hodowla komórkowa
 <ol>
 <li>Hodować komórki neuronalne i poddać je niezbędnym zabiegom.</li>
 <li>Zebrać komórki do probówek 15 ml: odessać pożywkę, wypłukać solą fizjologiczną w buforze fosforanowym (PBS, bez wapnia i magnezu), dodać trypsynę, zebrać do probówek 15 ml i zneutralizować trypsynę odpowiednią pożywką z surowicą.</li>
 <li>Wirować przy 1,000 x g przez 5 min.</li>
 <li>Odessać pożywkę.</li>
 <li>Resuspender komórki w PBS.</li>
 <li>Wirować przy 1,000 x g przez 5 min.</li>
 <li>Odessać pożywkę i resuspender komórki w świeżym PBS.</li>
 <li>Policzyć komórki za pomocą hemacytometru lub preferowanego licznika komórek.</li>
 <li>Próbki komórek należy przygotować bezpośrednio przed rozpoczęciem analizy.</li>
 <li>Wszystkie próbki należy obchodzić w ciemności lub w świetle żółtym, aby zapobiec uszkodzeniom DNA przez światło ultrafioletowe.</li>
 </ol>
 2. Test kometowy
 1. Przygotowanie preparatu
 <ol>
 <li>Rozpuść 1% agarozę (1 g / 100 ml w 1X Tris Base, Boric acid, EDTA, TBE) w mikrofalówce przez 3 min, aż wszystkie grudki znikną.</li>
 <li>Zanurz szkiełka w roztopionej agarozie, a następnie przetrzyj krawędź chusteczką Kimwipe. Pozostaw agarozę do wyschnięcia na powietrzu, aż powstanie przezroczysta warstwa. Czynność tę można wykonać z wyprzedzeniem, a szkiełka mogą być przechowywane.</li>
 </ol>
 2. Neutralny test kometowy
 <ol>
 <li>Schłodzić roztwór do lizy (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA pH 10, 10 mM Tris Base, 1% sarkozynianu sodio-laurylowego i 1% Triton X-100, pH 10) w temperaturze 4 °C przez co najmniej 1 h przed użyciem.</li>
 <li>2.2.2. Rozpuścić 1% agarozę niskotopliwą (1 g / 100ml w 1X Tris Base, kwas borowy, EDTA) w kuchence mikrofalowej przez 3 min, aż wszystkie grudki znikną. Agarozę należy schłodzić do 37 °C w kąpieli wodnej, aby uniknąć sztucznego indukowania ogona komety. Idealnie agarozę należy schłodzić przez pół godziny przed użyciem.</li>
 <li>2.2.3. Rozcieńczyć zawiesinę komórkową tak, aby uzyskać 100 000 komórek na ml. Połączyć zawiesinę komórkową z agarozą niskotopliwą (w 37 °C) w stosunku 1:10 (v/v), krótko wymieszać na wortexie i niezwłocznie nanieść 50 μl pipetą na slajd do testu komet. Użyć bocznej ścianki końcówki pipety, aby równomiernie rozprowadzić zawiesinę komórkową na obszarze próbki. Każda grupa badawcza powinna być wykonana w co najmniej trzech powtórzeniach.</li>
 <li>Umieścić slajdy na płasko w lodówce na 30 min, aż na obwodzie slajdu pojawi się okrąg.</li>
 <li>Wcześniej schłodzony roztwór do lizy przygotować i zanurzyć w nim slajdy na 30 min w ciemności w temperaturze 4 °C (lub w lodówce).</li>
 <li>Odlać lub odessać roztwór do lizy i dodać 1X neutralny bufor do elektroforezy (Tris base, kwas borowy, EDTA, 1X TBE). Pozostawić slajdy w tym buforze przez pół godziny w lodówce.</li>
 <li>Dodać uprzednio schłodzony 1X neutralny bufor do elektroforezy (TBE) do komory elektroforetycznej, a następnie umieścić slajdy w tacy do elektroforezy. Ustawić slajdy tak, aby znajdowały się w równej odległości od elektrod.</li>
 <li>Nalać 1X neutralny bufor do elektroforezy tak, aby poziom cieczy znajdował się 0,2 cala powyżej slajdów. Nadmiar buforu będzie zakłócał przebieg elektroforezy.</li>
 <li>Ustawić napięcie zasilacza na 1 V na cm (mierzone od elektrody do elektrody) i prowadzić proces przez 30 min w temperaturze 4 °C (lub w chłodni) w ciemności.</li>
 </ol>
 3. Alkaliczna próba kometowa
 <ol>
 <li>Schłodzić roztwór lizujący (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA pH 10, 10 mM Tris Base, 1% sodium lauryl sarcosinate i 1% Triton X-100, pH 10) w temperaturze 4 °C przez co najmniej 1 h przed użyciem.</li>
 <li>Roztopić 1% agarozę o niskiej temperaturze topnienia (1 g / 100 ml w 1X Tris Base, kwas borowy, EDTA) w mikrofalówce przez 3 min, aż wszystkie grudki znikną. Następnie schłodzić w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 min.</li>
 <li>Połączyć komórki w stężeniu 1 x 105 / ml z roztopioną agarozą o niskiej temperaturze topnienia (w 37 °C) w stosunku 1:10 (v/v), krótko wymieszać na wortexie i niezwłocznie nanieść 50 μl na szkiełko do testu Comet. Użyć boku końcówki pipety, aby równomiernie rozprowadzić zawiesinę komórkową po obszarze próbki. Każda grupa badawcza powinna być wykonana w co najmniej trzech powtórzeniach.</li>
 <li>Umieścić szkiełka płasko w lodówce na 30 min, aż na obrzeżach szkiełka pojawi się okrąg.</li>
 <li>Zanurzyć szkiełka w schłodzonym roztworze lizującym i pozostawić w temperaturze 4 °C od 1 h do całej nocy w ciemności.</li>
 <li>Wyjąć szkiełka z roztworu lizującego, odcedzić i jednokrotnie przepłukać zimnym buforem neutralizującym przez 5 min, aby usunąć pozostałości detergentu i soli przed etapem rozplatania alkalicznego.</li>
 <li>Umieścić szkiełka w komorze do elektroforezy żelowej wypełnionej schłodzonym, świeżo przygotowanym buforem do elektroforezy (300 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH&gt;13), tak aby poziom cieczy nie przekraczał 0,5 cm ponad szkiełkami. Ułożyć szkiełka w taki sposób, aby znajdowały się w równej odległości od elektrod.</li>
 <li>Pozostawić szkiełka w buforze alkalicznym przez 30 min w ciemności, aby umożliwić rozplatanie DNA i ujawnienie uszkodzeń wrażliwych na działanie alkaliów.</li>
 <li>Ustawić napięcie zasilacza na 1 V na cm (mierzone od elektrody do elektrody) i prowadzić elektroforezę przez 30 min w temperaturze 4 °C (lub w chłodni).</li>
</ol>
 4. Fixacja i barwienie komórek
 <ol>
 <li>Odlać nadmiar buforu do elektroforezy</li>
 <li>Zanurzyć preparaty w schłodzonej wodzie destylowanej na 5 min w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Zanurzyć preparaty w schłodzonym 70% etanolu na 5 min w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Suszyć próbki przez noc. Nie wystawiać preparatów na silne światło. Na tym etapie próbki mogą być przechowywane przez wiele miesięcy w temperaturze pokojowej przed oceną.</li>
 <li>Przebarwić preparaty, zanurzając je w Sybr green (rozcieńczonym 1X w PBS) na 20 min w lodówce.</li>
 <li>Wyjąć preparaty i pozostawić do całkowitego wyschnięcia w ciemności. Agaroza stanie się przezroczysta po całkowitym wyschnięciu.</li>
</ol>
4. Akwizycja i analiza obrazu
 <ol>
 <li>Nabyć obrazy przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego z ustawionym filtrem zielonym (Zeiss AxioVision) i przeanalizować je za pomocą oprogramowania Comet Assay (Perceptive Instruments).</li>
 <li>Kliknąć w „główkę komety” (jądro komórkowe), a oprogramowanie obliczy parametry, w tym średni moment ogona oraz ilość DNA w jądrze.</li>
 <li>Przeanalizować co najmniej 200 komórek dla każdej serii badawczej.</li>
 <li>Wyeksportować dane do programu Microsoft Excel.</li>
 <li>Obliczyć średni moment ogona dla każdej grupy badawczej i przedstawić dane na odpowiednim wykresie.</li>
 </ol>
 5. Reprezentatywne wyniki
 Przykład analizy testu kometowego na komórkach neuronalnych przedstawiono na Rysunku 2 i Rysunku 3. W tym przypadku napromieniowanie komórek neuronalnych indukuje uszkodzenia DNA. Pod wpływem pola elektrycznego DNA migruje z różną prędkością ze względu na różnice w wielkości fragmentów, co jest następnie analizowane przy użyciu oprogramowania Comet Assay. Im większe uszkodzenia DNA, tym dalej DNA migruje poza jądro komórkowe. Powoduje to spadek intensywności fluorescencji w jądrze, co jest rejestrowane przez oprogramowanie i skutkuje wyższą wartością momentu ogona. Tabela 1 przedstawia reprezentatywną tabelę z analizy testu kometowego, a Rysunek 4 przedstawia reprezentatywny wykres porównujący uszkodzenia DNA w komórkach neuronalnych po napromieniowaniu, zmierzone za pomocą testu kometowego.
 <img src="/files/ftp_upload/50049/50049fig1.jpg" alt="Schemat procesu testu kometowego; komórki w elektroforezie agarozowej; analiza za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat przebiegu testu kometowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50049/50049fig1large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy rysunek</a>.
 <img src="/files/ftp_upload/50049/50049fig2.jpg" alt="Wyniki testu kometowego w neuronach hipokampa, analiza uszkodzeń DNA, obraz mikroskopowy." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Reprezentatywne obrazy komórek neuronalnych (A) bez oraz (B) z ogonem komety.
 <img src="/files/ftp_upload/50049/50049fig3.jpg" alt="Schemat procesu mikroskopii fluorescencyjnej, analiza emisji, etapy obserwacji próbki A-C." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Analiza testu kometowego przy użyciu oprogramowania Comet Assay. (A) Reprezentatywne zrzuty ekranu obrazów pozyskanych za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego Carl Zeiss i przeanalizowanych w oprogramowaniu Comet Assay. (B) Kliknięcie w jądro komórkowe lub „główkę komety” (obwiedzione zieloną linią) generuje mapę fluorescencji i wykres (obwiedzione żółtą linią) oraz (C) tabelę danych (obwiedzioną czerwoną linią). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50049/50049fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycinię</a>.
 <img src="/files/ftp_upload/50049/50049fig4.jpg" alt="Wykres słupkowy; wpływ promieniowania na uszkodzenia DNA; porównanie średniego momentu ogona; wyniki dla IR vs. brak IR." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Reprezentatywny wykres przedstawiający średni moment ogona uzyskany w analizie uszkodzeń DNA w napromieniowanych i nienapromieniowanych komórkach neuronalnych z zastosowaniem neutralnego testu kometowego. Zgodnie z oczekiwaniami, promieniowanie 3Gy (promienie rentgenowskie) indukuje uszkodzenia DNA, co przejawia się wyższym średnim momentem ogona w napromieniowanych komórkach neuronalnych. Przedstawiono średni moment ogona (+/- błąd standardowy), **P&lt;0.01.
 <img src="/files/ftp_upload/50049/50049table1.jpg" alt="Tabela danych z wynikami testu kometowego: długość główki, intensywność ogona, całkowita powierzchnia i szczegóły dotyczące czasu." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Tabela 1"> 
Tabela 1. Reprezentatywna tabela uzyskana w wyniku analizy testem kometowym na naświetlonych i nienaświetlonych komórkach neuronalnych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50049/50049table1large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną figurę</a>.

<ol><li>Olive, P. L., Banath, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay%3A+a+method+to+measure+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells.</a> Nat. Protoc. 1, 23-29 (2006).</li>
<li>Hovhannisyan, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+in+combination+with+the+comet+assay+and+micronucleus+test+in+genetic+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization in combination with the comet assay and micronucleus test in genetic toxicology.</a> Mol. Cytogenet. 3, (2010).</li>
<li>Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay.+An+overview+of+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The comet assay. An overview of techniques.</a> Methods Mol. Biol. 203, 179-194 (2002).</li>
<li>Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+DNA+damage+in+individual+cells+by+analysis+of+histone+H2AX+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of DNA damage in individual cells by analysis of histone H2AX phosphorylation.</a> Methods Cell Biol. 75, 355-373 (2004).</li>
<li>Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+the+comet+assay+in+radiobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Impact of the comet assay in radiobiology.</a> Mutat. Res. 681, 13-23 (2009).</li>
<li>Olive, P. L., Banath, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+H2AX+phosphorylation+after+exposure+to+cisplatin%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+B+Clin.+Cytom%22%5BJournal%5D)">Kinetics of H2AX phosphorylation after exposure to cisplatin.</a> Cytometry B Clin. Cytom. 76, 79-90 (2009).</li>
<li>Olive, P. L., Durand, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+DNA+damage+using+the+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in DNA damage using the comet assay.</a> Cytometry A. 66, 1-8 (2005).</li>
<li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay+for+DNA+damage+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biotechnology%22%5BJournal%5D)">The comet assay for DNA damage and repair.</a> Molecular biotechnology. 26, 249-261 (2004).</li>
<li>Fairbairn, D. W., Olive, P. L., O'Neill, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay%3A+a+comprehensive+review%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FReviews+in+Genetic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The comet assay: a comprehensive review.</a> Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology. 339, 37-59 (1995).</li>
<li>Yang, E. S., Nowsheen, S., Wang, T., Thotala, D. K., Xia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+synthase+kinase+3B+inhibition+enhances+repair+of+DNA+double-strand+breaks+in+irradiated+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">Glycogen synthase kinase 3B inhibition enhances repair of DNA double-strand breaks in irradiated hippocampal neurons.</a> Neuro-Oncology. 13, 459-470 (2011).</li>
<li>Yang, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lithium-mediated+protection+of+hippocampal+cells+involves+enhancement+of+DNA-PK+dependent+repair+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Lithium-mediated protection of hippocampal cells involves enhancement of DNA-PK dependent repair in mice.</a> The Journal of clinical investigation. , 119-1124 (2009).</li>
<li>Collins, A. R., Harrington, V., Drew, J., Melvin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+modulation+of+DNA+repair+in+a+human+intervention+study%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Nutritional modulation of DNA repair in a human intervention study.</a> Carcinogenesis. 24, 511-515 (2003).</li>
<li>Smith, C. C., O'Donovan, M. R., Martin, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hOGG1+recognizes+oxidative+damage+using+the+comet+assay+with+greater+specificity+than+FPG+or+ENDOIII%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII.</a> Mutagenesis. 21, 185-190 (2006).</li>
<li>Rosenquist, T. A., Zharkov, D. O., Grollman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+a+mammalian+8-oxoguanine+DNA+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 7429-7434 (1997).</li>
<li>Radicella, J. P., Dherin, C., Desmaze, C., Fox, M. S., Boiteux, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+hOGG1%2C+a+human+homolog+of+the+OGG1+gene+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of hOGG1, a human homolog of the OGG1 gene of Saccharomyces cerevisiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 8010-8015 (1997).</li>
<li>Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+gammaH2AX+foci+as+an+indication+of+lethal+DNA+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions.</a> BMC Cancer. 10, 4(2010).</li>
<li>Banath, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+sensitivity%2C+H2AX+phosphorylation%2C+and+kinetics+of+repair+of+DNA+strand+breaks+in+irradiated+cervical+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines.</a> Cancer Res. 64, 7144-7149 (2004).</li>
<li>Bonner, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5Bgamma%5DH2AX+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">[gamma]H2AX and cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 8, 957-967 (2008).</li>
<li>Finney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+Field+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Pulsed Field Gel Electrophoresis.</a> Current protocols in molecular biology. , (2000).</li>
<li>Electrophoresis, F. I., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aElectrophoresis%2C+FI+%22Pulsed-field+gel+electrophoresis%22">Pulsed-field gel electrophoresis</a>. , (2000).</li>
<li>Nowsheen, S., Bonner, J. A., Yang, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+poly+%28ADP-Ribose%29+polymerase+inhibitor+ABT-888+reduces+radiation-induced+nuclear+EGFR+and+augments+head+and+neck+tumor+response+to+radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Radiotherapy+and+Oncology%22%5BJournal%5D)">The poly (ADP-Ribose) polymerase inhibitor ABT-888 reduces radiation-induced nuclear EGFR and augments head and neck tumor response to radiotherapy.</a> Radiotherapy and Oncology. , (2011).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Test kometarny ma unikalną zdolność analizowania pojedynczych komórek. Jest to korzystne w identyfikacji subpopulacji komórek, które wykazują zróżnicowaną odpowiedź na czynniki cytotoksyczne. Należy wziąć pod uwagę kilka ograniczeń praktycznych. Liczba komórek, które można ocenić indywidualnie, może się różnić w zależności od osoby. Wielkość próby należy zwiększyć, jeśli istnieje wariancja uszkodzeń DNA w populacji. Żywotna zawiesina jednokomórkowa ma kluczowe znaczenie dla tego testu, ponieważ dominująca obecność komóre...

<table><tbody><tr><td>Probówki 1,5 ml</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc</td><td>Sc-200271</td><td></td></tr><tr><td>10X TBE (zasada Tris, kwas borowy, EDTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP13331</td><td></td></tr><tr><td>Tubka 15 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>0553851</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Sigma</td><td>A5093</td><td></td></tr><tr><td>Folia aluminiowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>01213101</td><td></td></tr><tr><td>Zlewka</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB102300</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004261PR</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do oznaczania komety</td> Test <td>komety IV System</td><td></td><td></td>analizy obrazu</tr><tr><td>Cylinder</td><td>Fisher Scientific</td><td>08555F</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>GIBCO</td><td>15575</td><td></td></tr><tr><td>Komora do elektroforezy</td><td>Thermo Scientific</td><td>09528101</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A407P4</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Zeiss Axio Vision</td><td></td><td>Wystarczy dowolny mikroskop fluorescencyjny z zielonym filtrem</td></tr><tr><td>Hemacytometr</td><td>Fisher Scientific</td><td>0267152</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza o niskiej temperaturze topnienia</td><td>Promega</td><td>V2111</td><td></td></tr><tr><td>Kuchenki</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>mikrofaloweSól fizjologiczna buforowana fosforanami, bez wapnia, bez magnezu</td><td>HyClone</td><td>SH3025601</td><td></td></tr><tr><td>Zasilacz</td><td>BioRad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>Lodówka</td><td>Piec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Linijka</td><td>Zszywki</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Slide Fisher Scientific</td><td>12550143</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Sód wodorotlenek</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Lauryl sarkozynian sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S529</td><td></td></tr><tr><td>Sybr zielony</td><td>Invitrogen</td><td>S7585</td><td></td></tr><tr><td>Taca</td><td>Fisher Scientific</td><td>15242B</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>HyClon</td> <td>trypsyny</td><td></td><td></td>SH3023601</tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisher Scientific</td><td>02216108</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>Fisher Scientific</td><td>154622Q</td><td></td></tr></tbody></table>

oznaczanie uszkodzeń dna w neuronach hipokampa za pomocą testu komety

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

Wiele leków celuje w szlaki naprawy DNA i indukuje zabijanie komórek poprzez tworzenie uszkodzeń DNA. W związku z tym procesy bezpośredniego pomiaru uszkodzeń DNA zostały szeroko ocenione. Tradycyjne metody są czasochłonne, kosztowne, zasobochłonne i wymagają replikacji komórek. W przeciwieństwie do tego, test komet, test elektroforezy w żelu jednokomórkowym, jest szybszą, nieinwazyjną, niedrogą, bezpośrednią i czułą miarą uszkodzenia i naprawy DNA. Wszystkie formy uszkodzenia DNA, a także naprawa DNA mogą być wizualizowane na poziomie pojedynczej komórki za pomocą tej potężnej techniki.
	Zasada leżąca u podstaw testu komety polega na tym, że nienaruszone DNA jest wysoce uporządkowane, podczas gdy uszkodzenie DNA zakłóca tę organizację. Uszkodzone DNA przenika do matrycy agarozy, a pod wpływem pola elektrycznego ujemnie naładowane DNA migruje w kierunku katody, która jest naładowana dodatnio. Duże nieuszkodzone nici DNA nie są w stanie migrować daleko od jądra. Uszkodzenie DNA tworzy mniejsze fragmenty DNA, które przemieszczają się dalej niż nienaruszone DNA. Comet Assay, oprogramowanie do analizy obrazu, mierzy i porównuje ogólną intensywność fluorescencji DNA w jądrze z DNA, które wyemigrowało z jądra. Sygnał fluorescencyjny z migrowanego DNA jest proporcjonalny do uszkodzenia DNA. Dłuższy, jaśniejszy ogon DNA oznacza zwiększone uszkodzenia DNA. Niektóre z mierzonych parametrów to moment ogonowy, który jest miarą zarówno ilości DNA, jak i rozmieszczenia DNA w ogonie, długości ogona i procentowej zawartości DNA w ogonie. Ten test pozwala również zmierzyć naprawę DNA, ponieważ ustąpienie uszkodzenia DNA oznacza, że naprawa miała miejsce. Granica czułości wynosi około 50 pęknięć nici na diploidalną komórkę ssaka 1,2. Komórki poddane działaniu jakichkolwiek czynników uszkadzających DNA, takich jak etopozyd, mogą być stosowane jako kontrola pozytywna. Tak więc test kometarny jest szybką i skuteczną procedurą pomiaru uszkodzeń DNA.

Test komet jest skutecznym sposobem wykrywania pęknięć jedno- i dwuniciowych, w tym miejsc alkaliczno-labilnych i powiązań krzyżowych DNA-DNA/DNA-protein na DNA we wszystkich komórkach, w tym w neuronach hipokampa. Metoda wykorzystuje zróżnicowaną migrację DNA w polu elektrycznym ze względu na różnice w ilości uszkodzeń DNA.

Oznaczanie uszkodzeń DNA w neuronach hipokampa za pomocą testu komety

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Ogólnym celem tej procedury jest zmierzenie i ilościowe określenie ilości uszkodzeń DNA w neuronach za pomocą testu COMET. Osiąga się to poprzez najpierw wystawienie neuronów na różne warunki uszkadzające DNA, zebranie neuronów i zmieszanie ich z arosami o niskiej temperaturze topnienia. Drugim krokiem jest unieruchomienie neuronów na szkiełkach.Następnie neurony są poddawane lizie, a następnie poddawane elektroforezie w ostatnim etapie. DNA jest zabarwione cybernetyczną zielenią. Ostatecznie mikroskopia fluorescencyjna i oprogramowanie testowe COMET są wykorzystywane do wizualizacji i ilościowego określania poziomów uszkodzeń DNA w poszczególnych neuronach.Witam, nazywam się Eddie Yang i jestem adiunktem na Wydziale Radioterapii Onkologicznej na Uniwersytecie Alabama w Birmingham. Dzisiaj zademonstrujemy test COMET, który jest prostą metodą wykrywania uszkodzeń DNA w komórkach. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi istniejącymi metodami, takimi jak barwienie ogniskami Gamma H two A X, a także elektroforeza żelowa w polu pulsacyjnym, jest to, że technika ta jest bezpośrednią i czułą metodą pomiaru uszkodzeń DNA.Dodatkowo, przy niewielkich modyfikacjach tej techniki, można określić rodzaj uszkodzenia DNA, ponieważ wiele terapii przeciwnowotworowych działa poprzez indukowanie uszkodzeń DNA w guzach i często działa poprzez zmianę zdolności naprawy DNA. Implikacje tej techniki można rozszerzyć w kierunku skuteczności terapii przeciwnowotworowej. Dzisiejszą procedurę zademonstruje pani Samara Noshin, asystentka naukowa z mojego laboratorium. Zacznij od pobrania komórek nerwowych potraktowanych w pożądanych warunkach eksperymentalnych do 15-mililitrowych probówek.Wirować probówki przez pięć minut w temperaturze 1000 razy G i czterech stopniach Celsjusza po zassaniu resusa supernatantu. Zawieś osad w PBS, a następnie ponownie odwiruj komórki po drugim praniu. Resus zawiesza komórki w większej liczbie PBS, policz je i trzymaj w ciemności, dopóki nie zostaną użyte w teście kometowym.Aby uniknąć uszkodzenia DNA, przed rozpoczęciem testu rozpuść 1% aros w kuchence mikrofalowej przez trzy minuty, aż wszystkie granulki znikną. Następnie zanurz szkiełka w stopionym agrosie i wytrzyj jedną stronę do czysta chusteczką Kim. Pozostaw agros do wyschnięcia na powietrzu do przezroczystej folii, podczas gdy agros suszy chłodny roztwór do lizy w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej godzinę i rozpuść więcej.1% agros o niskiej temperaturze topnienia. Chłodny. Tę partię agros do 37 stopni Celsjusza w kąpieli wodnej przez pół godziny. Aby uniknąć sztucznego indukowania warkocza komety, należy teraz rozcieńczyć pobraną zawiesinę komórek nerwowych tak, aby na mililitr przypadało 100 000 komórek.Połącz zawiesinę komórek z agrosem o niskiej temperaturze topnienia o temperaturze topnienia 37 stopni Celsjusza w wirze o stosunku od 1 do 10 i natychmiast użyj boku końcówki pipety, aby równomiernie rozprowadzić 50 mikrolitrów zawiesiny komórek na powierzchni próbki wysuszonego powietrzem szkiełka komety. Umieść przygotowane szkiełka płasko w lodówce na 30 minut, aż na obrzeżach szkiełka pojawi się okrąg. Następnie zanurz szkiełka w schłodzonym roztworze do lizy w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po 30 minutach odessać roztwór do lizy. Następnie inkubować szkiełka w jednym buforze do elektroforezy obojętnej przez pół godziny w lodówce. Następnie dodaj wstępnie schłodzony jeden x neutralny bufor do elektroforezy do komory elektroforezy, a następnie umieść szkiełka w tacy do elektroforezy, wyrównując szkiełka tak, aby były w równej odległości od elektrod.Po napełnieniu komory na tyle, aby pokryć szkiełka 0,2 cala jednego x neutralnego bufora do elektroforezy, ustaw napięcie zasilania na jeden wolt na centymetr i uruchom test w ciemności przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zacznij od zanurzenia nowych szkiełek potraktowanych agros i komórkami neuronalnymi w świeżym, wstępnie schłodzonym roztworze do lizy, a następnie inkubuj je w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez godzinę do nocy. Następnie wyjmij szkiełka z roztworu do lizy, osusz je, a następnie przepłucz je raz zimnym buforem neutralizacyjnym przez pięć minut, aby usunąć wszelkie pozostałości przed etapem nawijania alkalicznego.Następnie umieść szkiełka w komorze do elektroforezy żelowej wypełnionej wstępnie schłodzonym, świeżo przygotowanym buforem do elektroforezy, tak aby nie przekraczał 0,5 centymetra nad szkiełkami. Inkubować szkiełka w buforze alkalicznym przez 30 minut w ciemności, aby umożliwić rozwinięcie DNA i ekspresję uszkodzenia podatnego na działanie zasad. Następnie uruchom test przy napięciu jednego wolta na centymetr przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po przeprowadzeniu testu komety należy opróżnić nadmiar buforu elektroforetycznego, a następnie zanurzyć szkiełka w wstępnie schłodzonej wodzie destylowanej o temperaturze pokojowej. Po pięciu minutach zanurz szkiełka we wstępnie schłodzonym, 70% etanolu, również o temperaturze pokojowej. Po kolejnych pięciu minutach pozostaw próbki do wyschnięcia na noc, trzymając je z dala od jasnego światła.Następnie zabarwij szkiełka na cyber green w lodówce przez 30 minut. Teraz wyjmij szkiełka i pozwól im całkowicie wyschnąć w ciemności. Po całkowitym wyschnięciu aros stanie się przezroczysty.Aby uzyskać obrazy z testu, należy użyć mikroskopu fluorescencyjnego ustawionego na zielony filtr. Następnie otwórz program testowy COMET, aby przeanalizować uzyskane obrazy. Klikając przycisk głowy komety, oprogramowanie obliczy parametry, w tym średni moment warkocza i ilość DNA w jądrze.Po przeanalizowaniu co najmniej 200 komórek na zabieg wyeksportuj dane do programu Microsoft Excel w celu obliczenia średniego momentu ogonowego i wykreślenia danych. Pierwszy rysunek przedstawia przykład analizy testowej COMET komórek nerwowych z warkoczem komety i bez niego. W tym drugim teście komet, analizowanym za pomocą oprogramowania testowego COMET, stwierdzono, że napromienianie komórek nerwowych indukuje uszkodzenie DNA, gdy komórki były poddawane działaniu pola elektrycznego.DNA migrowało w różnym tempie ze względu na różnice w wielkości, które były następnie analizowane za pomocą wspólnego oprogramowania testowego. Ten pierwszy zrzut ekranu przedstawia reprezentatywne obrazy uzyskane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego przy użyciu programu testowego COMET. Kliknięcie na jądro lub głowę komety na jednym zdjęciu generowało fluorescencyjną mapę, wykres i tabelę danych.Im większe uszkodzenie DNA, tym dalej DNA migrowało z jądra. Spowodowało to spadek intensywności fluorescencji w jądrze, na co wskazuje zielony kolor, a następnie jest wykrywane przez oprogramowanie, wytwarzając wyższy moment ogonowy. Na tym ostatnim rysunku reprezentatywny wykres średniego momentu ogonowego uzyskany przez analizę uszkodzeń DNA w napromieniowanych i nienapromieniowanych komórkach nerwowych przy użyciu neutralnego testu COMET pokazano zgodnie z oczekiwaniami trzy uszkodzenia DNA wywołane szarym promieniowaniem, na co wskazuje wyższy średni moment ogonowy w napromieniowanych komórkach neuronalnych.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o ostrożnym obchodzeniu się z komórkami, zapobiegając ekspozycji na bezpośrednie światło i kontrolując temperaturę pH. Dzieje się tak, aby komórki nie były poddawane dodatkowemu stresowi, który mógłby zmienić wyniki Po tej procedurze. Inne metody, takie jak analiza DNA, ogniska naprawy poprzez barwienie immunofluorescencyjne mogą być wykonane w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące tego, które szlaki naprawy DNA są zmienione.Na przykład barwienie immunofluorescencyjne dla ognisk RAD 51 lub fosfo, ognisk PK DNA można przeprowadzić w celu pomiaru naprawy rekombinacji homologicznej lub niehomologicznej i naprawy łączenia.

assaying-dna-damage-in-hippocampal-neurons-using-the-comet-assay

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ocena uszkodzenia DNA w neuronach hipokampu przy użyciu testu komet

Film demonstruje test komety do wykrywania uszkodzeń DNA po ekspozycji na szkodliwe czynniki. W warunkach zasadowych DNA rozwija się i denaturuje, a po elektroforezie nieuszkodzone i uszkodzone DNA migruje inaczej w żelu agarozowym, tworząc strukturę w kształcie komety. Wolno migrujące, nieuszkodzone DNA tworzy okrągłą głowę komety, podczas gdy szybko migrujące uszkodzone fragmenty DNA tworzą wydłużony warkocz komety.

Test komety do wykrywania uszkodzeń DNA w komórkach

Opisujemy tutaj platformę, która pozwala na wykrywanie uszkodzeń DNA metodą testów komet z niespotykaną dotąd wydajnością. Urządzenie tworzy modele komórek ssaków w mikromacierz i umożliwia równoległe przetwarzanie 96 próbek. Podejście to ułatwia analizę uszkodzeń DNA na poziomie podstawowym, uszkodzeń DNA wywołanych ekspozycją oraz kinetyki naprawy DNA.

CometChip: wysokowydajna, 96-dołkowa platforma do pomiaru uszkodzeń DNA w mikromacierzowanych komórkach ludzkich

Test Comet mierzy pęknięcia DNA, wywołane przez różne czynniki. Jeśli wszystkie czynniki (z wyjątkiem stresu oksydacyjnego) powodujące uszkodzenie DNA są utrzymywane na stałym poziomie, ilość uszkodzeń DNA jest dobrym pośrednim parametrem stresu oksydacyjnego. Celem tego protokołu jest wykorzystanie testu kometarnego do pośredniego pomiaru stresu oksydacyjnego.

Test komety jako pośrednia miara ogólnoustrojowego stresu oksydacyjnego

Alkaliczny test komet mierzy pęknięcia nici DNA w komórkach eukariotycznych. Dodając etap trawienia endonukleazy III lub ludzkiej 8-oksoguaniny-DNA-N-glikozylazy, test może skutecznie wykryć oksydacyjne uszkodzenie DNA. Opisujemy metody stosowania tych testów do wykrywania uszkodzeń DNA w wątrobie szczura.

In vivo (in vivo) Alkaliczny test kometologiczny i test alkaliczny komety modyfikowany enzymami do pomiaru pęknięć nici DNA i oksydacyjnych uszkodzeń DNA w wątrobie szczura

Test komet jest skuteczną metodą wykrywania uszkodzeń DNA, w tym jedno- i dwuniciowych pęknięć DNA. Opisujemy alkaliczne i neutralne testy komet w celu zmierzenia uszkodzeń DNA w komórkach nowotworowych w celu oceny efektu terapeutycznego chemioterapii.

Ocena uszkodzeń DNA in vitro za pomocą testu komety

Ten protokół opisuje kilka procedur przygotowania wysokiej jakości zamrożonych próbek tkanek podczas sekcji zwłok do użycia w teście kometarnym do oceny uszkodzeń DNA: 1) zmielona tkanka, 2) zeskrobane komórki nabłonkowe z przewodu pokarmowego, oraz 3) sześcienne próbki tkanek, wymagające homogenizacji za pomocą urządzenia do mielenia tkanek.

Wykorzystanie zamrożonej tkanki w teście komety do oceny uszkodzeń DNA

Test kometarny jest popularnym sposobem wykrywania uszkodzeń DNA. W tym badaniu opisano podejście do przeprowadzania slajdów w reprezentatywnych wariantach testu komety. Takie podejście znacznie zwiększyło liczbę próbek przy jednoczesnym skróceniu czasu trwania testu, liczby manipulacji szkiełkami i ryzyka uszkodzenia żeli.

Wysokoprzepustowy test kometowy do oceny uszkodzeń DNA komórkowego

Protokół ten opisuje skuteczną metodę ilościowego określania różnic w uszkodzeniach DNA wywołanych przez inhibitory typu I i typu II w zmutowanych komórkach FLT3 poprzez zastosowanie testu komety.

Test kometarny w celu ilościowego określenia uszkodzeń DNA w komórkach 32D z ekspresją mutanta FLT3 po ekspozycji na inhibitory FLT3 typu I i II

Intensywnie badany nicień Caenorhabditis elegans może zostać zmodyfikowany transgenicznie w celu ekspresji ludzkiego peptydu β-amyloidu (Aβ). Indukowana ekspresja Aβ w mięśniach C. elegans prowadzi do szybkiego, powtarzalnego fenotypu paraliżu, który może być wykorzystany do monitorowania terapii modulujących toksyczność Aβ.

Oznaczanie toksyczności β-amyloidu z wykorzystaniem transgenicznego modelu C. elegans

Opisujemy protokół umożliwiający obrazowanie mitochondriów w żywych neuronach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przez dłuższy czas. Obrazowanie w wydłużonych przedziałach czasowych osiągnięto dzięki ekspresji białka fluorescencyjnego skierowanego do mitochondriów za pomocą lentiwirusa oraz zastosowaniu niedrogiego inkubatora nakładanego na stolik mikroskopu, który został zaprojektowany i zbudowany w naszym laboratorium.

Neuromodulacja i transport mitochondriów: obrazowanie żywych neuronów hipokampa w długich odstępach czasu

Poznaj oznaczanie uszkodzeń DNA w neuronach hipokampa za pomocą testu komety. Ta metoda pozwala ilościowo ocenić integralność DNA w pojedynczych neuronach przy użyciu elektroforezy i mikroskopii fluorescencyjnej.

Oznaczanie uszkodzeń DNA w neuronach hipokampa za pomocą testu komety

Przeglądaj więcej filmów