Ilościowy, wysokoprzepustowy test cytotoksyczności pojedynczej komórki dla limfocytów T

Ten eksperymentalny system oferuje wysokoprzepustową metodologię monitorowania cytotoksyczności za pośrednictwem limfocytów T na poziomie pojedynczej komórki. Najpierw oznacz efektorowe limfocyty T i docelowe komórki nowotworowe barwnikami fluorescencyjnymi. Załaduj oba typy komórek do matryc nano studzienek i zanurz cały chip w pożywce zawierającej cyt zielony i znakowany fluorescencyjnie nexin. Pięć.

Aby zidentyfikować zarówno komórki martwicze, jak i apoptotyczne, należy teraz zarejestrować początkowy obraz wstępny, aby określić zajętość studni i żywotność komórek na początku testu. Po sześciogodzinnej inkubacji nagraj drugi obraz. Następnie użyj automatycznej analizy obrazu, aby określić ilościowo specyficzną dla antygenu lizę EL four CD 19 dodatniego przez limfocyty T z dodatnim wynikiem samochodu.

Wyniki uzyskane za pomocą tej wysokoprzepustowej metody mogą badać specyficzną dla antygenu lizę celów przez komórki efektorowe w oparciu o dodatnie barwienie cytoksyną. Pięć. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak test uwalniania chromu 51, jest to, że można osiągnąć prawdziwe skuteczne interakcje docelowe jeden do jednego i zmierzyć częstotliwość satelitarną Implikacje tej techniki rozciągają się na to, jaka terapia raka, ponieważ pozwala badać korelaty skuteczności w autologicznej terapii komórkowej Aby wytworzyć nano studzienki za pomocą mistrza krzemowego, najpierw dokładnie wymieszaj podstawę zestawu elastomerów cygaro 180 4 i utwardzacz w 10 do jednego stosunku wagowego w jednorazowym kubku za pomocą plastikowego noża. Odgazować mieszaninę w komorze próżniowej przez godzinę.

Następnie wlej mieszaninę na silikonowy wzorzec i pozostaw na 30 minut. Teraz, aby utwardzić elastomer, podgrzej zespół w piekarniku o temperaturze 80 stopni Celsjusza przez dwie godziny po schłodzeniu w temperaturze pokojowej przez godzinę. Ostrożnie wyjmij matrycę nanostudzienek PDMS z matrycy krzemowej.

Przykryj go taśmą klejącą do użycia dzień przed eksperymentem przejdź 5 milionów komórek docelowych w pięciu mililitrach. Dzień eksperymentu. Osad 5 milionów komórek w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów przez odwirowanie w temperaturze 340 g przez pięć minut.

Odessać nadmiar pożywki, pozostawiając około 50 mikrolitrów pożywki w celu oznaczenia komórek. Dodać 150 mikrolitrów czerwonego roztworu roboczego do śledzenia świeżych komórek i dokładnie wymieszać za pomocą pipety P 200, inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Za pomocą hemocytometru wylicz komórki efektorowe pobrane z hodowli.

Następnie osadź 5 milionów komórek w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów przez odwirowanie. Zassać nadmiar pożywki. Następnie dodać świeży roztwór roboczy z pięcioma mikromolowymi, żywymi fioletowymi plamami w cyklu D i zawiesić za pomocą pipety P 200.

Inkubować komórki i umierać przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla w 6,8 mililitra i 6,0 mililitra R-P-M-I-P-L-G-H do komórek docelowych i efektorowych odpowiednio do komórek docelowych i efektorowych i wymieszać przez pipetowanie. Następnie powoli ułóż 3,5 mililitra pakietu fial plus na dnie każdej probówki, odwiruj obie probówki przy 340 GS przez 30 minut bez przerwy i przyspieszenia podczas wirowania, przygotuj matrycę nano dołków Najpierw przenieś siedem mililitrów przedwojennego PBS na płytkę czterodołkową. Oczyść spód szkiełka alkoholem etylowym za pomocą utleniacza plazmowego.

Traktuj PDMS przy wysokim ustawieniu RF przez 30 do 45 sekund. Następnie umieść tablicę w PBS. Przenieś płytkę do komory bezpieczeństwa biologicznego i odessaj nadmiar PBS, nałóż ciepły 1% szlachetny agar na górną i dolną krawędź szkiełka w celu unieruchomienia matrycy.

Upewnij się, że nie pozostawiasz PDMS do wyschnięcia po 10 minutach przy trzech mililitrach PBS i zasysaj nadmiar agaru. Następnie dodaj trzy mililitry R 10 na wierzch matrycy nanostudzienek i równoważ przez około 10 minut. Po odwirowaniu Fial odessać pięć mililitrów pożywki z górnej warstwy każdej probówki.

Uważając, aby nie zassać warstwy zawierającej komórki pipetą P 1000. Zbierz białą warstwę komórek między fialem a pożywką. Przenieś komórki do nowych sterylnych stożkowych probówek.

Teraz umyj zebrany efektor i komórki docelowe dwukrotnie trzema mililitrami przedwojennego R-P-M-I-P-L-G-H. Po końcowym odwirowaniu odessać nadmiar pożywki i ponownie zawiesić osad komórkowy. W 500 mikrolitrach R 10 policz żywe komórki za pomocą metody wykluczenia błękitu trianowego na cytometrze hemocytometrycznym, zasysaj nadmiar pożywki z macierzy nano.

Następnie dodać dwa mililitry świeżego aspiratu R 10. Ponownie, upewnij się, że górna część układu nano nie jest ani zbyt mokra, ani zbyt sucha, ponieważ wpłynie to na rozmieszczenie komórek. Teraz umieść jeden razy 10 do jednej piątej komórek fektorowych w 200 mikrolitrach R 10 na powierzchni nano woli pozwoliło komórkom osiąść na pięć minut.

Następnie za pomocą standardowego mikroskopu do hodowli tkankowych sprawdź pożądany rozkład komórek. Następnie umieść jedną razy 10 do piątej komórki docelowej w 200 mikrolitrach R 10 na powierzchni nanodołka zawierającej komórki efektorowe. Po pięciu minutach oceń rozmieszczenie komórek za pomocą mikroskopii.

Następnie ostrożnie przepłucz układ nanostudzienek dwoma mililitrami R 10 i odessaj nadmiar pożywki w oddzielnej sterylnej stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów. Odpipetować trzy mililitry wstępnie rozgrzanego R 10 przy trzech mikrolitrach 0,5 milimolowego cyt, zielone zabarwienie kwasem nukleinowym i 60 mikrolitrów X w pięciu LOR 6 47 dokładnie wymieszać przez pipetowanie. Teraz delikatnie odpipetuj roztwór barwienia na płytkę czterodołkową, upewniając się, że komórki nie są przemieszczane z dołków, inkubuj przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenek węgla, uzyskaj obrazy matrycy nanostudzienek za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, takiego jak mikroskop zes observer Z one, wyposażony w zmotoryzowany stolik i Lambda DG cztery.

Zainicjuj oprogramowanie i mikroskop. Sprawdź natężenie sygnału w przesyłanym świetle i innych kanałach fluorescencyjnych. Dostosuj konfigurację mikroskopu, aby zapewnić maksymalny stosunek sygnału do szumu, unikając nasycenia.

Teraz otwórz listę pozycji x i Y dla tablicy nelle. Ustaw pozycję zerową XY i wyzeruj fokus na środku bloku tablicy nelle siedem na siedem w lewym górnym rogu stempla tablicy nelle. Ustaw pozycje XY tak, aby pokrywały się ze środkiem każdego bloku, a wartość Z dokładnie odzwierciedlała skupienie na każdym bloku.

Teraz ustaw akwizycję obrazu w trybie liniowym i pobieraj obrazy. Po pierwszej serii obrazowania należy umieścić matryce nanostudzienek z powrotem w inkubatorze hodowli komórkowych na sześć godzin. Dbanie o mieszanie może prowadzić do przemieszczenia komórek.

Następnie powtórz akwizycję obrazów w drugim punkcie czasowym. Ten wysokoprzepustowy test cytolityczny mierzy częstość lizy specyficznej dla antygenu, znakowanych specyficznymi dla CD 19 limfocytami T CAR dodatnimi, które inkubowano wspólnie ze znakowanymi mysimi EL czterema komórkami docelowymi w indywidualnych dołkach macierzy nano L. Wykresy histogramu komórki docelowej reprezentują studzienki zawierające pojedynczą komórkę efektorową i pojedynczą komórkę docelową.

Po sześciu godzinach koinkubacji, dopasowane histogramy komórek docelowych bez efektorów wykorzystano jako kontrole ujemne w celu zgłoszenia częstości śmierci komórek w tle. Pożądane jest osiągnięcie niskich częstotliwości nieswoistej lizy w zakresie od dwóch do 4%Matryca nanodołków może być przystosowana do obrazowania poklatkowego, aby umożliwić obserwację efektora, koniugacji celu, a następnie śmierci komórki. Tutaj nieznakowane limfocyty T dodatnie pod względem car-dodatnim inkubowano wspólnie z sześcioma komórkami docelowymi NA LM GFP w NOL i poddano dynamicznemu monitorowaniu.

Kiedy piątka Xin została dodana do pożywki hodowlanej, komórki apoptotyczne oznaczone jako czerwone Po opanowaniu. Tę technikę można wykonać prawidłowo w ciągu 10 do 12 godzin po tej procedurze. Inne metody, takie jak mikrochwytanie, mogą być stosowane do określenia profilu wydzielania cytokin w komórkach.