Name: Ilościowy, wysokoprzepustowy test cytotoksyczności pojedynczej komórki dla limfocytów T (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Poznaj metodę ilościowego, wysokoprzepustowego testu cytotoksyczności limfocytów T na poziomie pojedynczej komórki z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej i nano studni.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez National Cancer Institute of the National Institutes of Health pod numerem nagrody R01CA174385. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

1. Przygotowanie odczynników
<ol>
 <li>Przygotuj RPMI-PLGH, mieszając po 500 ml RPMI-1640 i po 5 ml roztworu penicyliny-streptomycyny, L-glutaminy i HEPES.</li>
 <li>Przygotować roztwór R10, mieszając RPMI-PLGH z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS). FBS jest inaktywowany termicznie w temperaturze 56 °C przez 30 minut przed dodaniem.</li>
 <li>Wstępnie podgrzać w temperaturze 37 °C 50 ml RPMI-PLGH, 15 ml PBS i 15 ml R10 w sterylnych stożkowych probówkach.</li>
 <li>Wytwarzanie matryc nanodołków w PDMS: Krzemowy wzorzec jest wytwarzany przy użyciu fotolitografii, zasadniczo tak, jak opisano wcześniej10. Dokładnie wymieszaj bazę zestawu elastomerowego Sylgard 184 i utwardzacz w stosunku wagowym 10:1 w jednorazowym kubku za pomocą plastikowego noża. Odgazować mieszaninę w komorze próżniowej przez 1 godzinę. Wlej mieszaninę na matrycę nanostudzienek, zamknij szkiełkiem i pozostaw na 30 minut. Przenieść zestaw do piekarnika nastawionego na 80 °C na 2 godziny i pozostawić do ostygnięcia w temperaturze pokojowej na 1 godzinę. Elastomer utwardzi się w tym okresie i zwiąże się ze szkiełkiem. Szklane szkiełko zawierające matrycę nanostudzienek PDMS jest ostrożnie zdejmowane z matrycy silikonowej, przykrywane taśmą klejącą i przechowywane do przyszłego użycia.</li>
</ol>
2. Etykietowanie komórek docelowych (T)
<ol>
 <li>Policz 5 milionów komórek docelowych z hodowli komórkowej za pomocą hemocytometru i umieść komórki w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 15 ml przez odwirowanie przy 340 x g przez 5 minut. Hodowlę komórkową dzieli się poprzedniego dnia na 5 ml całkowitej objętości (gęstość = 1 milion/ml) i hoduje w kolbie T-25 (VWR). Protokoły zliczania komórek za pomocą hemocytometru zostały szczegółowo opisane wcześniej11</li>
 <li>Odessać nadmiar pożywki, pozostawiając około 50 μl pożywki.</li>
 <li>Przygotuj roztwór roboczy Cell Tracker Red (CTR), mieszając 0,5 μl materiału CTR (1 mM) z 150 μl RPMI-PLGH (stężenie końcowe 2,5 μM). Dodać 150 μl roztworu roboczego do komórek docelowych i dokładnie wymieszać za pomocą pipety P200. Alternatywnie można użyć PKH 26 (stężenie końcowe 2 μM) do oznakowania komórek docelowych zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
 <li>Inkubować w temperaturze 37 °C/5% CO2 przez 20 minut.</li>
</ol>
3. Etykietowanie komórek efektora (E)
<ol>
 <li>Odliczyć 5 milionów komórek efektorowych z hodowli komórkowej za pomocą hemacytometru i umieścić komórki w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 15 ml przez odwirowanie przy 340 x g przez 5 minut.</li>
 <li>Odsysanie nadmiaru pożywki</li>
 <li>Przygotować roztwór roboczy roztworu Vybrant DyeCycleViolet Stain poprzez dodanie 1 μl 5 mM bulionu Vybrant Violet do 1 ml pożywki R10 (końcowe stężenie 5 μM). Dodać roztwór roboczy do komórek i ponownie zawiesić za pomocą pipety P200. Alternatywnie można użyć PKH 67 (stężenie końcowe 2 μM) oznaczając komórki docelowe zgodnie z instrukcjami producenta. Jeśli używany jest PKH 67, nie należy stosować SYTOX Green, ponieważ znajdują się one w tym samym kanale fluorescencyjnym. Wyliczanie celów apoptotycznych odbywa się w tym przypadku wyłącznie przy użyciu barwienia AnnexinV. 
 nuta: W przypadku wykonywania pomiarów poklatkowych, a nie końcowych, należy unikać barwników UV, takich jak Vybrant Violet.</li>
 <li>Inkubować w temperaturze 37 °C/5% CO2 przez 20 minut.</li>
</ol>
4. Oddzielanie żywych i martwych komórek za pomocą gradientu gęstości
<ol>
 <li>Dodać 6,8 ml i 6,0 ml RPMI-PLGH odpowiednio do komórek docelowych i efektorowych, a następnie wymieszać, delikatnie pipetując w górę i w dół.</li>
 <li>Nałożyć 3,5 ml FICOLL-Paque Plus na spód każdej stożkowej probówki zawierającej komórki docelowe i efektorowe. Nakładaj FICOLL powoli, aby zapewnić dobre tworzenie warstw między FICOLL a podłożem.</li>
 <li>Odwirować obie probówki przy ciśnieniu 340 x g przez 30 minut bez hamowania i przyspieszania.</li>
 <li>Podczas wirowania przenieść 7 ml wstępnie podgrzanego PBS na płytkę 4-dołkową. Przygotuj matrycę nanostudzienek (wyprodukowaną w PDMS): oczyść dno szkiełka etanolem i utlenij PDMS przy wysokim ustawieniu RF za pomocą utleniacza plazmowego przez 1 minutę. Ten krok wysterylizuje matrycę nanostudzienek, jednocześnie sprawiając, że PDMS stanie się hydrofilowy. Natychmiast przenieś matrycę nanostudzienek do płytki zawierającej PBS.</li>
 <li>Przenieść płytkę do komory bezpieczeństwa biologicznego i odessać nadmiar PBS. Przygotuj 10 ml 1% szlachetnego agaru, dodając 100 mg proszku agarowego do 10 ml wody DI, a następnie podgrzewaj w kuchence mikrofalowej przez 30-45 sekund. Nałóż ciepły 1% szlachetny agar na górną i dolną krawędź szkiełka zawierającego matrycę nanostudzienek, aby unieruchomić matrycę i odczekaj 10 minut, aż agar zastygnie. Dodać 3 ml PBS i odessać nadmiar agaru.</li>
 <li>Dodaj 3 ml R10 na wierzch matrycy nanostudzienek i pozwól mu się zrównoważyć przez ~ 10 minut.</li>
 <li>Po odwirowaniu FICOLL należy odessać 5 ml pożywki z górnej warstwy każdej probówki. Uważaj, aby nie zassać warstwy zawierającej komórki.</li>
 <li>Pobrać komórki (biała warstwa), odzyskując 1-2 ml z warstwy między FICOLL a pożywką za pomocą pipety P1,000 i przenieść do nowych sterylnych probówek stożkowych. Powtórz to dla obu zestawów komórek, upewniając się, że maksymalizujesz komórki odzyskiwania.</li>
 <li>Dodać 3 ml wstępnie podgrzanego RPMI-PLGH do każdej probówki, wymieszać pipetując i osad przez odwirowanie przy 340 x g przez 5 minut przy pełnym przyspieszeniu i hamowaniu.</li>
 <li>Odessać nadmiar pożywki, dodać 5 ml wstępnie podgrzanego RPMI-PLGH do każdej probówki i powtarzać wirowanie przy 340 x g przez 5 minut.</li>
 <li>Odessać nadmiar pożywki i ponownie zawiesić osad komórkowy w 500 μl R10.</li>
 <li>Policz żywe komórki za pomocą metody wykluczenia błękitu trypana na hemacytometrze.</li>
</ol>
5. Ładowanie komórek do Nanowell Array
<ol>
 <li>Odessać nadmiar pożywki z matrycy nanostudzienek i dodać 2 ml świeżego R10 do matrycy. Odessać ponownie, upewniając się, że górna część matrycy nanostudzienek nie jest zbyt mokra/sucha, ponieważ wpłynie to na rozmieszczenie komórek.</li>
 <li>Umieść 1 x 105 komórek efektorowych w 200 μl R10 na powierzchni matrycy nanostudzienkowej (gęstość = 5 x 105 komórek/ml).</li>
 <li>Pozwól komórkom osiąść przez 5 minut i za pomocą standardowego mikroskopu kultur tkankowych sprawdź, czy rozmieszczenie komórek jest pożądane. W razie potrzeby dodaj więcej komórek.</li>
 <li>Umieść 1 x 105 komórek docelowych w 200 μl R10 na powierzchni nanostudzienki (gęstość = 5 x 105 komórek/ml).</li>
 <li>Pozwól komórkom osiąść przez 5 minut i za pomocą standardowego mikroskopu kultur tkankowych sprawdź, czy rozmieszczenie komórek jest pożądane. W razie potrzeby dodaj więcej komórek.</li>
 <li>Ostrożnie przepłukać układ nanostudzienek 2 ml R10 i odessać nadmiar pożywki.</li>
 <li>Przygotuj 3 ml wstępnie podgrzanego R10 w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Dodać 3 μl 0,5 mM SYTOX Green Nucleic Acid Stain (końcowe stężenie 0,5 μM) i 60 μl Annexin V-Alexa Fluor 647, aby przygotować roztwór roboczy. Ostrożnie dodaj roztwór roboczy na płytkę 4-dołkową, upewniając się, że komórki nie są przemieszczane z dołków.</li>
 <li>Inkubować w temperaturze 37 °C/5% CO2 przez 15 minut.</li>
</ol>
6. Obrazowanie 1
<ol>
 <li>Uzyskanie obrazów matrycy nanostudzienkowej za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego: W tym przykładzie używamy mikroskopu ZEISS Observer Z-1 wyposażonego w zmotoryzowany stolik i Lambda-DG4.</li>
 <li>Zainicjuj oprogramowanie i mikroskop i sprawdź natężenie sygnału w przesyłanym świetle i innych kanałach fluorescencyjnych. Ogólnie rzecz biorąc, będzie pięć kanałów odpowiadających: światłu przechodzącemu, Annexin V-647 (filtr Cy5), CTR (filtr DsRed), SYTOX Green (filtr FITC) i Vybrant Violet (filtr DAPI). Upewnij się, że mikroskop jest ustawiony tak, aby zapewnić maksymalny stosunek sygnału do szumu, unikając nasycenia.</li>
 <li>Ustaw pozycje X i Y dla macierzy nanostudzienek. Rozpocznij proces od ustawienia pozycji zerowej i zainicjowania ostrości na środku bloku matrycy nanodołkowej 7 x 7 w lewym górnym rogu stempla macierzy nanowell. Ustaw pozycje x,y tak, aby pokrywały się ze środkiem każdego bloku, a wartość z dokładnie odzwierciedlała ostrość na każdym bloku.</li>
 <li>Po ustawieniu pozycji i ostrości upewnij się, że akwizycja obrazu jest ustawiona w trybie liniowym i rejestruje obrazy. nuta: W razie potrzeby włączyć inkubator i CO2 pod mikroskopem co najmniej 30 minut przed eksperymentem.</li>
</ol>
7. Po obrazowaniu
Przenieś 4-dołkową płytkę zawierającą matrycę nanowell do inkubatora (37 °C/5% CO2) na 6 godzin.
8. Obrazowanie 2
Zdobądź obrazy w drugim punkcie czasowym, jak opisano w kroku 6.
9. Analiza obrazu
<ol>
 <li>Zajętość komórek w nanostudzienkach jest określana przez zastosowanie odpowiednich programów do segmentacji obrazu (np. ImageJ, <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a>) zasadniczo tak, jak opisano wcześniej9,12 .</li>
 <li>Analiza początkowego zestawu obrazów mikroskopowych (t = 0 godz.; t0) służy do generowania bazy danych poszczególnych nanostudzienek zawierających dokładnie jedną żywą komórkę docelową (zidentyfikowaną przez CellTracker Red; czerwoną) i brak martwych komórek (zidentyfikowanych przez barwienie Aneksyną V, kolor zielony) [nanostudzienki T1t0].</li>
 <li>Analiza drugiego zestawu obrazów mikroskopowych (t = 6 godz.; t6) służy do niezależnego określenia drugiej bazy danych nanodołków zawierających 1 komórkę docelową (czerwoną) [T1t6 nanostudzienek]. Kontrola integralności (zapytanie do bazy danych) jest implementowana w celu zapewnienia, że wszystkie żywe cele w t0 są dopasowywane do celów w t6 w celu wytworzenia końcowego zestawu dopasowanych celów (zaimplementowanych jako nanodołki, które mają T1t0 = T1t6, oznaczone jako T1match)</li>
 <li>Liczbę komórek efektorowych w nanostudzienkach określa się za pomocą barwienia fioletem Vybrant w t0 [E1 nanostudzienkach]</li>
 <li>Zadane zapytanie do bazy danych jest implementowane w celu identyfikacji nanodołków zawierających pojedyncze efektory współinkubowane z pojedynczymi celami (zdefiniowanymi jako nanodołki, które majądopasowanie E1 i T1, oznaczone jako E1T1)</li>
 <li>Apoptozę indukowaną efektorem ocenia się, identyfikując cele, które są ujemne pod względem anektyny V przy t0 i dodatnie pod względem anektyny V przy t4 (E1T1 z barwieniem celu anektyny V przy t6).</li>
</ol>
10. Opcjonalne obrazowanie poklatkowe zabijania za pomocą komunikatora BioStation firmy Nikon
<ol>
 <li>Weź szalkę Petriego z dnem szkiełka nakrywkowego i wytnij mały kawałek chipa nanowell (przygotowanego w kroku 5), który dokładnie zmieści się na szkiełku nakrywkowym. Upewnij się, że wiór pozostaje mokry podczas cięcia.</li>
 <li>Wymieszać 1 x 106 tarcz i 1 x 106 limfocytów T w pożywce o objętości 100 μl i pipetować na szkiełko nakrywkowe.</li>
 <li>Odczekaj około 15-30 minut, aby komórki się uspokoiły.</li>
 <li>Szybko odwróć mały chip nanowell i umieść go na szkiełku nakrywkowym.</li>
 <li>Aby upewnić się, że chip nie będzie mógł się poruszać podczas obrazowania, umieść jedno lub dwa szkiełka nakrywkowe o wymiarach 20 mm x 20 mm na górze chipa. Delikatnie dociśnij, aby docisnąć frytek do dna naczynia.</li>
</ol>
Uwaga: Spód układu nanowell array jest zbyt gruby do obrazowania w wysokiej rozdzielczości i dlatego musi być odwrócony do góry nogami. W tym czasie wiele komórek jest wypłukiwanych. Ponieważ nie można tego łatwo kontrolować, liczba komórek w kroku 9.2 i czas inkubacji w kroku 9.3 muszą zostać zoptymalizowane.

<ol><li>Louis, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumor+activity+and+long-term+fate+of+chimeric+antigen+receptor-positive+T+cells+in+patients+with+neuroblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Antitumor activity and long-term fate of chimeric antigen receptor-positive T cells in patients with neuroblastoma.</a> Blood. 118, 6050-6056 (2011).</li>
<li>Savoldo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD28+costimulation+improves+expansion+and+persistence+of+chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+lymphoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">CD28 costimulation improves expansion and persistence of chimeric antigen receptor-modified T cells in lymphoma patients.</a> J. Clin. Invest. 121, 1822-1826 (2011).</li>
<li>Kalos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+with+chimeric+antigen+receptors+have+potent+antitumor+effects+and+can+establish+memory+in+patients+with+advanced+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia.</a> Sci. Transl. Med. 3, 95ra73(2011).</li>
<li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells in Chronic Lymphoid Leukemia. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPorter%2C+DL+%22N.+Engl.+J.+Med%22">N. Engl. J. Med</a>. , (2011).</li>
<li>Restifo, N. P., Dudley, M. E., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+immunotherapy+for+cancer%3A+harnessing+the+T+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response.</a> Nat. Rev. Immunol. 12, 269-281 (2012).</li>
<li>Pittet, M. J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging.</a> Cell. 147, 983-991 (2011).</li>
<li>Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy%3A+visualizing+immunity+in+context%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy: visualizing immunity in context.</a> Immunity. 21, 315-329 (2004).</li>
<li>Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+cytokine+optimization+and+standard+operating+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure.</a> Nat. Protoc. 1, 1507-1516 (2006).</li>
<li>Varadarajan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+single-cell+analysis+of+human+CD8%2B+T+cell+functions+reveals+discordance+for+cytokine+secretion+and+cytolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">A high-throughput single-cell analysis of human CD8+ T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis.</a> J. Clin. Invest. 121, 4322-4331 (2011).</li>
<li>Ogunniyi, A. O., Story, C. M., Papa, E., Guillen, E., Love, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+individual+hybridomas+by+microengraving+to+discover+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Screening individual hybridomas by microengraving to discover monoclonal antibodies.</a> Nat. Protoc. 4, 767-782 (2009).</li>
<li>Streeck, H., Frahm, N., Walker, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+IFN-gamma+Elispot+assay+in+HIV+vaccine+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">The role of IFN-gamma Elispot assay in HIV vaccine research.</a> Nat. Protoc. 4, 461-469 (2009).</li>
<li>Varadarajan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+efficient+functional+characterization+and+recovery+of+HIV-specific+human+CD8%2B+T+cells+using+microengraving%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Rapid, efficient functional characterization and recovery of HIV-specific human CD8+ T cells using microengraving.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3885-3890 (2012).</li>
<li>Makedonas, G., Betts, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Living+in+a+house+of+cards%3A+re-evaluating+CD8%2B+T-cell+immune+correlates+against+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Living in a house of cards: re-evaluating CD8+ T-cell immune correlates against HIV.</a> Immunol. Rev. 239, 109-124 (2011).</li>
<li>Telford, W. G., Komoriya, A., Packard, B. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+analysis+of+apoptosis+by+flow+and+image+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiparametric analysis of apoptosis by flow and image cytometry.</a> Methods Mol. Biol. 263, 141-160 (2004).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Nakreśliliśmy protokół wysokoprzepustowego jednokomórkowego testu cytolitycznego możliwego poprzez jednoczesną inkubację efektorów i celów w układach nanodołków (Figura 1). Oprócz przepustowości, główną zaletą tej techniki jest możliwość monitorowania cytotoksyczności za pośrednictwem efektorów w stosunku do pożądanych komórek docelowych bez konieczności inżynierii komórek docelowych, co z kolei pozwala na wykorzystanie autologicznych lub dopasowanych/pierwotnych komórek nowotworowych jako komórek docel...

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640 bez L-glutaminy</td><td>Cellgro</td><td>15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td>10 000 I.U. Penicylina 10 000 &mu; g / ml Streptomycyna</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Cellgro</td><td>25-005-CI</td><td>200 mM roztwór</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3537</td><td>1M</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>Lot testowany</td></tr><tr><td>Cell Tracker Red Stain</td><td>Invitrogen</td><td>C34552</td><td>50 &mu; g</td></tr><tr><td>Vybrant DyeCycle Violet Stain</td><td>Invitrogen</td><td>V35003</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>SYTOX green Barwnik kwasów nukleinowych</td><td>Invitrogen</td><td>S7020</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>Annexin V-Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A23204</td><td>500 &mu; l</td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS</td><td>Cellgro</td><td>21-031-CV</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Szlachetny agar</td><td>DIFCO</td><td>2M220</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8154</td><td>0,4% płynny, sterylny filtrowany</td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Hausser Scientifics</td><td>1492</td><td>Jasna linia</td></tr><tr><td>4-dołkowa płytka</td><td>Thermo Fisher</td><td>167603</td><td></td></tr><tr><td>Harrick Plasma Cleaner</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td>Podstawowa myjka plazmowa</td></tr><tr><td>Observer.Z1</td><td>ZEISS</td><td></td><td>Mikroskop fluorescencyjny (współpracuje z trzema poniższymi częściami)</td></tr><tr><td>Lambda 10-3</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td>Kontroler filtra</td></tr><tr><td>Lambda DG-4</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td>Ultra-High-Speed Wavelength</td></tr><tr><td>Switcher Hamamatsu EM-CCD Kamera</td><td>Hamamatsu</td><td>C9100-13</td><td>Kamera mikroskopowa CCD</td></tr><tr><td>15 ml rurka stożkowa</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 ml rurka stożkowa</td><td>VWR</td><td>3282-345-300</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Biostation</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>Biostation IM</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli zwierząt ze szklanym dnem</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0</td><td>szalka Petriego 35 mm, mikrostudzienka 10 mm</td></tr></tbody></table>

ilościowy, wysokoprzepustowy test cytotoksyczności pojedynczej komórki dla limfocytów t

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Immunoterapia nowotworów może wykorzystać specyfikę odpowiedzi immunologicznej do zwalczania i eliminowania nowotworów. Adoptywna terapia komórkowa (ACT) oparta na adoptywnym transferze limfocytów T zmodyfikowanych genetycznie w celu ekspresji chimerycznego receptora antygenowego (CAR) okazała się bardzo obiecująca w badaniach klinicznych1-4. Istnieje kilka zalet stosowania limfocytów T CAR+ w leczeniu nowotworów, w tym zdolność do celowania w antygeny nieograniczone MHC i funkcjonalizacji limfocytów T w celu optymalnego przeżycia, naprowadzania i trwałości w gospodarzu; i wreszcie do indukowania apoptozy limfocytów T CAR+ w przypadku toksyczności gospodarza5.
Określenie optymalnych funkcji limfocytów T CAR+ związanych z korzyściami klinicznymi jest niezbędne do zaprojektowania następnej generacji badań klinicznych. Ostatnie postępy w obrazowaniu żywych zwierząt, takie jak mikroskopia wielofotonowa, zrewolucjonizowały badania funkcji komórek odpornościowych in vivo6,7. Podczas gdy badania te poszerzyły naszą wiedzę na temat funkcji komórek T in vivo, ACT oparty na komórkach T w badaniach klinicznych wymaga powiązania cech molekularnych i funkcjonalnych preparatów z komórek T przed infuzją ze skutecznością kliniczną po infuzji, poprzez wykorzystanie testów in vitro monitorujących funkcje komórek T, takie jak cytotoksyczność i wydzielanie cytokin. Opracowano standardowe testy oparte na cytometrii przepływowej, które określają ogólne funkcjonowanie populacji limfocytów T na poziomie pojedynczej komórki, ale nie są one odpowiednie do monitorowania powstawania koniugatów i czasu życia lub zdolności tej samej komórki do zabijania wielu celów8.
Mikrofabrykowane matryce zaprojektowane z biokompatybilnych polimerów, takich jak polidimetylosiloksan (PDMS), są szczególnie atrakcyjną metodą do przestrzennego ograniczania efektorów i celów w małych objętościach9. W połączeniu z automatyczną poklatkową mikroskopią fluorescencyjną, tysiące interakcji efektor-cel mogą być monitorowane jednocześnie poprzez obrazowanie pojedynczych dołków macierzy nanostudzienek. Przedstawiamy tutaj wysokoprzepustową metodologię monitorowania cytotoksyczności za pośrednictwem limfocytów T na poziomie pojedynczej komórki, która może być szeroko stosowana do badania cytolitycznej funkcjonalności limfocytów T.

Przykład zastosowania wysokoprzepustowego testu cytolitycznego przedstawiono na Rysunku 2. W skrócie, znakowane komórki CAR+ T specyficzne dla CD19 inkubowano wspólnie z znakowanymi mysimi komórkami docelowymi EL4 w poszczególnych studzienkach matrycy nanowell (Sekcje 1-5). Za pomocą zautomatyzowanego mikroskopu fluorescencyjnego zarejestrowano obraz początkowy, aby zidentyfikować zajętość (efektory i/lub cele) każdej pojedynczej nanowell w matrycy (Sekcja 6). Przetwarzanie obrazu wykorzystano...

Opisujemy jednokomórkowy test wysokoprzepustowy do pomiaru cytotoksyczności limfocytów T podczas inkubacji z komórkami docelowymi nowotworu. Metoda ta wykorzystuje gęsty, elastomerowy układ dołków sub-nanolitrowych (~ 100 000 dołków / tablicę) w celu przestrzennego ograniczenia limfocytów T i komórek docelowych w określonych proporcjach i jest sprzężona z mikroskopią fluorescencyjną w celu monitorowania koniugacji efektor-cel i późniejszej apoptozy.

Ilościowy, wysokoprzepustowy test cytotoksyczności pojedynczej komórki dla limfocytów T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Ten eksperymentalny system oferuje wysokoprzepustową metodologię monitorowania cytotoksyczności za pośrednictwem limfocytów T na poziomie pojedynczej komórki. Najpierw oznacz efektorowe limfocyty T i docelowe komórki nowotworowe barwnikami fluorescencyjnymi. Załaduj oba typy komórek do matryc nano studzienek i zanurz cały chip w pożywce zawierającej cyt zielony i znakowany fluorescencyjnie nexin. Pięć.Aby zidentyfikować zarówno komórki martwicze, jak i apoptotyczne, należy teraz zarejestrować początkowy obraz wstępny, aby określić zajętość studni i żywotność komórek na początku testu. Po sześciogodzinnej inkubacji nagraj drugi obraz. Następnie użyj automatycznej analizy obrazu, aby określić ilościowo specyficzną dla antygenu lizę EL four CD 19 dodatniego przez limfocyty T z dodatnim wynikiem samochodu.Wyniki uzyskane za pomocą tej wysokoprzepustowej metody mogą badać specyficzną dla antygenu lizę celów przez komórki efektorowe w oparciu o dodatnie barwienie cytoksyną. Pięć. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak test uwalniania chromu 51, jest to, że można osiągnąć prawdziwe skuteczne interakcje docelowe jeden do jednego i zmierzyć częstotliwość satelitarną Implikacje tej techniki rozciągają się na to, jaka terapia raka, ponieważ pozwala badać korelaty skuteczności w autologicznej terapii komórkowej Aby wytworzyć nano studzienki za pomocą mistrza krzemowego, najpierw dokładnie wymieszaj podstawę zestawu elastomerów cygaro 180 4 i utwardzacz w 10 do jednego stosunku wagowego w jednorazowym kubku za pomocą plastikowego noża. Odgazować mieszaninę w komorze próżniowej przez godzinę.Następnie wlej mieszaninę na silikonowy wzorzec i pozostaw na 30 minut. Teraz, aby utwardzić elastomer, podgrzej zespół w piekarniku o temperaturze 80 stopni Celsjusza przez dwie godziny po schłodzeniu w temperaturze pokojowej przez godzinę. Ostrożnie wyjmij matrycę nanostudzienek PDMS z matrycy krzemowej.Przykryj go taśmą klejącą do użycia dzień przed eksperymentem przejdź 5 milionów komórek docelowych w pięciu mililitrach. Dzień eksperymentu. Osad 5 milionów komórek w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów przez odwirowanie w temperaturze 340 g przez pięć minut.Odessać nadmiar pożywki, pozostawiając około 50 mikrolitrów pożywki w celu oznaczenia komórek. Dodać 150 mikrolitrów czerwonego roztworu roboczego do śledzenia świeżych komórek i dokładnie wymieszać za pomocą pipety P 200, inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Za pomocą hemocytometru wylicz komórki efektorowe pobrane z hodowli.Następnie osadź 5 milionów komórek w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów przez odwirowanie. Zassać nadmiar pożywki. Następnie dodać świeży roztwór roboczy z pięcioma mikromolowymi, żywymi fioletowymi plamami w cyklu D i zawiesić za pomocą pipety P 200.Inkubować komórki i umierać przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla w 6,8 mililitra i 6,0 mililitra R-P-M-I-P-L-G-H do komórek docelowych i efektorowych odpowiednio do komórek docelowych i efektorowych i wymieszać przez pipetowanie. Następnie powoli ułóż 3,5 mililitra pakietu fial plus na dnie każdej probówki, odwiruj obie probówki przy 340 GS przez 30 minut bez przerwy i przyspieszenia podczas wirowania, przygotuj matrycę nano dołków Najpierw przenieś siedem mililitrów przedwojennego PBS na płytkę czterodołkową. Oczyść spód szkiełka alkoholem etylowym za pomocą utleniacza plazmowego.Traktuj PDMS przy wysokim ustawieniu RF przez 30 do 45 sekund. Następnie umieść tablicę w PBS. Przenieś płytkę do komory bezpieczeństwa biologicznego i odessaj nadmiar PBS, nałóż ciepły 1% szlachetny agar na górną i dolną krawędź szkiełka w celu unieruchomienia matrycy.Upewnij się, że nie pozostawiasz PDMS do wyschnięcia po 10 minutach przy trzech mililitrach PBS i zasysaj nadmiar agaru. Następnie dodaj trzy mililitry R 10 na wierzch matrycy nanostudzienek i równoważ przez około 10 minut. Po odwirowaniu Fial odessać pięć mililitrów pożywki z górnej warstwy każdej probówki.Uważając, aby nie zassać warstwy zawierającej komórki pipetą P 1000. Zbierz białą warstwę komórek między fialem a pożywką. Przenieś komórki do nowych sterylnych stożkowych probówek.Teraz umyj zebrany efektor i komórki docelowe dwukrotnie trzema mililitrami przedwojennego R-P-M-I-P-L-G-H. Po końcowym odwirowaniu odessać nadmiar pożywki i ponownie zawiesić osad komórkowy. W 500 mikrolitrach R 10 policz żywe komórki za pomocą metody wykluczenia błękitu trianowego na cytometrze hemocytometrycznym, zasysaj nadmiar pożywki z macierzy nano.Następnie dodać dwa mililitry świeżego aspiratu R 10. Ponownie, upewnij się, że górna część układu nano nie jest ani zbyt mokra, ani zbyt sucha, ponieważ wpłynie to na rozmieszczenie komórek. Teraz umieść jeden razy 10 do jednej piątej komórek fektorowych w 200 mikrolitrach R 10 na powierzchni nano woli pozwoliło komórkom osiąść na pięć minut.Następnie za pomocą standardowego mikroskopu do hodowli tkankowych sprawdź pożądany rozkład komórek. Następnie umieść jedną razy 10 do piątej komórki docelowej w 200 mikrolitrach R 10 na powierzchni nanodołka zawierającej komórki efektorowe. Po pięciu minutach oceń rozmieszczenie komórek za pomocą mikroskopii.Następnie ostrożnie przepłucz układ nanostudzienek dwoma mililitrami R 10 i odessaj nadmiar pożywki w oddzielnej sterylnej stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów. Odpipetować trzy mililitry wstępnie rozgrzanego R 10 przy trzech mikrolitrach 0,5 milimolowego cyt, zielone zabarwienie kwasem nukleinowym i 60 mikrolitrów X w pięciu LOR 6 47 dokładnie wymieszać przez pipetowanie. Teraz delikatnie odpipetuj roztwór barwienia na płytkę czterodołkową, upewniając się, że komórki nie są przemieszczane z dołków, inkubuj przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenek węgla, uzyskaj obrazy matrycy nanostudzienek za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, takiego jak mikroskop zes observer Z one, wyposażony w zmotoryzowany stolik i Lambda DG cztery.Zainicjuj oprogramowanie i mikroskop. Sprawdź natężenie sygnału w przesyłanym świetle i innych kanałach fluorescencyjnych. Dostosuj konfigurację mikroskopu, aby zapewnić maksymalny stosunek sygnału do szumu, unikając nasycenia.Teraz otwórz listę pozycji x i Y dla tablicy nelle. Ustaw pozycję zerową XY i wyzeruj fokus na środku bloku tablicy nelle siedem na siedem w lewym górnym rogu stempla tablicy nelle. Ustaw pozycje XY tak, aby pokrywały się ze środkiem każdego bloku, a wartość Z dokładnie odzwierciedlała skupienie na każdym bloku.Teraz ustaw akwizycję obrazu w trybie liniowym i pobieraj obrazy. Po pierwszej serii obrazowania należy umieścić matryce nanostudzienek z powrotem w inkubatorze hodowli komórkowych na sześć godzin. Dbanie o mieszanie może prowadzić do przemieszczenia komórek.Następnie powtórz akwizycję obrazów w drugim punkcie czasowym. Ten wysokoprzepustowy test cytolityczny mierzy częstość lizy specyficznej dla antygenu, znakowanych specyficznymi dla CD 19 limfocytami T CAR dodatnimi, które inkubowano wspólnie ze znakowanymi mysimi EL czterema komórkami docelowymi w indywidualnych dołkach macierzy nano L. Wykresy histogramu komórki docelowej reprezentują studzienki zawierające pojedynczą komórkę efektorową i pojedynczą komórkę docelową.Po sześciu godzinach koinkubacji, dopasowane histogramy komórek docelowych bez efektorów wykorzystano jako kontrole ujemne w celu zgłoszenia częstości śmierci komórek w tle. Pożądane jest osiągnięcie niskich częstotliwości nieswoistej lizy w zakresie od dwóch do 4%Matryca nanodołków może być przystosowana do obrazowania poklatkowego, aby umożliwić obserwację efektora, koniugacji celu, a następnie śmierci komórki. Tutaj nieznakowane limfocyty T dodatnie pod względem car-dodatnim inkubowano wspólnie z sześcioma komórkami docelowymi NA LM GFP w NOL i poddano dynamicznemu monitorowaniu.Kiedy piątka Xin została dodana do pożywki hodowlanej, komórki apoptotyczne oznaczone jako czerwone Po opanowaniu. Tę technikę można wykonać prawidłowo w ciągu 10 do 12 godzin po tej procedurze. Inne metody, takie jak mikrochwytanie, mogą być stosowane do określenia profilu wydzielania cytokin w komórkach.

quantitative-high-throughput-single-cell-cytotoxicity-assay-for-t

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ilościowa metoda oceny cytotoksyczności komórek T o wysokiej wydajności dla pojedynczych komórek

Test uwalniania chromu, powszechnie stosowana metoda wykrywania aktywności cytotoksycznych limfocytów T, posiada kilka ograniczeń. W niniejszym artykule, wykorzystując antygenowo specyficzne limfocyty T CD8 oraz linię komórkową raka piersi u ludzi SKBR3, zbadano podejście oparte na impedancji pod kątem zdolności do wykrywania śmierci komórek.

Wyznaczenie optymalnej aktywności cytotoksycznej ludzkich limfocytów T CD8 specyficznych dla Her2neu poprzez porównanie testu uwalniania Cr51 z systemem xCELLigence

Ten film demonstruje metodę monitorowania aktywności komórek CAR T przeciwko komórkom nowotworowym poprzez pomiary impedancji elektrycznej w czasie rzeczywistym. Śledzenie zmian impedancji ocenia skuteczność limfocytów CAR T w indukowaniu cytolizy komórek nowotworowych, dostarczając informacji na temat ich zdolności cytotoksycznych.

Test cytolizy in vitro w czasie rzeczywistym w celu oceny siły działania limfocytów CAR T

Ten protokół opisuje czuły, komórkowy test cytotoksyczności. Wyliczając spadek częstości żywych docelowych limfocytów T CD4 + w obecności rosnącej liczby efektorowych limfocytów T CD8 +, test ten pozwala na bezpośrednią ocenę aktywności cytolitycznej limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu.

Test cytometrii przepływowej opartej na komórkach do pomiaru aktywności cytotoksycznej

Test cytotoksyczności krwi pełnej (WCA) jest testem cytotoksyczności opracowanym przez połączenie wysokoprzepustowej technologii pozycjonowania komórek z mikroskopią fluorescencyjną i automatycznym przetwarzaniem obrazu. Tutaj opisujemy, w jaki sposób komórki chłoniaka leczone przeciwciałem anty-CD20 mogą być analizowane w czasie rzeczywistym w ludzkiej krwi pełnej w celu zapewnienia ilościowej analizy cytotoksyczności komórkowej.

Testy cytotoksyczności w czasie rzeczywistym w ludzkiej krwi pełnej

Opracowano test czasu rzeczywistego o wysokiej przepustowości, aby jednocześnie zidentyfikować (1) środki przeciwdrobnoustrojowe penetrujące komórki eukariotyczne skierowane na wewnątrzkomórkowy patogen bakteryjny i (2) ocenić cytotoksyczność komórek eukariotycznych. Wariant tej samej technologii został następnie połączony z technologią cyfrowego dozowania, aby umożliwić łatwe badania w wysokiej rozdzielczości, zależności od dawki oraz dwu- i trójwymiarowej synergii.

Wysokowydajne testy w czasie rzeczywistym z podwójnym odczytem wewnątrzkomórkowej aktywności przeciwdrobnoustrojowej i cytotoksyczności komórek eukariotycznych

Prezentujemy w obecnym badaniu nowatorski test oparty na fluorescencji, wykorzystujący limfocyty pochodzące od transgenicznej myszy. Test ten nadaje się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych (HTS) małych cząsteczek obdarzonych zdolnością hamowania lub promowania aktywacji limfocytów.

Test limfocytów oparty na fluorescencji, odpowiedni do wysokoprzepustowych badań przesiewowych małych cząsteczek

Opisujemy ilościowy system testów cytolizy in vitro w czasie rzeczywistym, aby ocenić siłę działania limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenu ukierunkowanych na płynne i lite komórki nowotworowe. Protokół ten można rozszerzyć w celu oceny innych komórek efektorowych układu odpornościowego, a także leczenia skojarzonego.

Test siły działania w czasie rzeczywistym dla chimerycznych limfocytów T receptora antygenowego ukierunkowanych na stałe i hematologiczne komórki nowotworowe

Protokół do oceny ilościowego zabijania komórek nowotworowych przez komórki Jurkata wyrażające chimeryczny receptor antygenowy (CAR) ukierunkowany na pojedynczy antygen nowotworowy. Protokół ten może być wykorzystany jako platforma przesiewowa do szybkiej optymalizacji konstrukcji zawiasów CAR przed potwierdzeniem w limfocytach T pochodzących z krwi obwodowej.

Szybka ocena cytotoksyczności in vitro receptora antygenu chimerycznego z ekspresją Jurkata przy użyciu obrazowania fluorescencyjnego

Ten protokół opisuje szczegółową procedurę generowania przejściowych limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) przy użyciu nieintegrującego mRNA do immunoterapii nowotworów i dostarcza wiarygodnych metod oceny komórek CAR-T i ich funkcji cytotoksycznej.

Niewirusowe podejście do generowania przejściowych limfocytów T receptora chimerycznego antygenu przy użyciu mRNA do immunoterapii nowotworów

Tutaj opisujemy metodę tworzenia kropelek podwójnej emulsji otaczających jedną limfocyt T i komórkę docelową raka, aby zbadać zabijanie komórek na poziomie pojedynczej komórki. Metoda ta pozwala na podwójną kwantyfikację zarówno cząsteczek cytotoksycznych, jak i apoptozy komórek docelowych w dużej populacji limfocytów T.

Test cytotoksyczności oparty na kropelkach w celu oceny limfocytów T receptora antygenu chimerycznego na poziomie pojedynczej komórki

Poznaj metodę ilościowego, wysokoprzepustowego testu cytotoksyczności limfocytów T na poziomie pojedynczej komórki z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej i nano studni.

Ilościowy, wysokoprzepustowy test cytotoksyczności pojedynczej komórki dla limfocytów T

Przeglądaj więcej filmów