Wydajna immunoprecypitacja chromatyny przy użyciu ograniczonych ilości biomasy

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wykrycie wiązania białek wiążących DNA, takich jak czynniki transkrypcyjne, lub modyfikacji jego kamienia. Osiąga się to poprzez przygotowanie chromatyny jako drugiego etapu. Reakcja immunoprecypitacji chromatyny jest ustawiana w celu ściągnięcia fragmentów DNA związanych z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania.

Następnie fragment DNA związany z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania jest amplifikowany metodą PCR. Uzyskano wyniki, które wskazują na fałdowanie fragmentu DNA związanego z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania w porównaniu z regionem niezwiązanym na podstawie analizy QPCR. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie transkrypcji, chromatyny i epigenetyki, takie jak to, kiedy i gdzie obecne są różne zmodyfikowane lub niezmodyfikowane białka.

Na DNA Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w regulację genów limfocytów T. Może być również stosowany do innych układów, takich jak limfocyty B, próbki białaczki i unieśmiertelnione linie komórek. Chromatyna do tego eksperymentu zostanie przygotowana z mysich naiwnych limfocytów T CD 4 myszy.

Aby rozpocząć tę procedurę, dodaj 37% formaldehydu do końcowego stężenia 1% do zawiesiny czterech limfocytów T CD w DMEM i delikatnie kołysz w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Spowoduje to usieciowanie kompleksów białkowych DNA. Zatrzymaj sieciowanie, dodając jedną glicynę molową do końcowego stężenia 125 milimolów.

Kontynuuj kołysanie przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 200 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w pięciu mililitrach lodowatego PBS zawierającego inhibitory proteazy, ponownie odwirować, umyć komórki w ten sposób w sumie trzy razy po ostatnim płukaniu, wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze lodowatego buforu do lizy komórek zawierającego inhibitory proteazy.

Przenieś zawiesinę komórkową do mikroprobówki wirówkowej o pojemności 1,7 mililitra i inkubuj na lodzie przez 15 minut. Zebrać jądra przez odwirowanie w stężeniu 200 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ostrożnie wyrzucić supernatant ponownie zawiesić jądra w 500 mikrolitrach lizy jądrowej.

Bufor zawierający inhibitory proteazy inkubować na lodzie przez 15 minut. Następnie, sonikuj komórki za pomocą sondy 1,6 milimetra, a poziom wyjściowy 4 sonikuj przez 15 sekund. Schłodzić próbkę na lodzie przez jedną do dwóch minut, aby zapobiec przegrzaniu i ponownie poddać sonikacji przez 15 sekund.

Powtórz sonikację i chłodzenie, w sumie czterokrotnie wirując, chromatynę soniczną przy 16 000 G przez pięć minut. O czwartej czwartej i czterech stopniach Celsjusza. Zebrać klarowny supernatant w nowej probówce do mikrowirówki.

Usunąć 20 mikrolitrów podwielokrotności klarownego supernatantu. Dodaj barwnik ładujący DNA i sprawdź sonikowane DNA za pomocą elektroforezy przez 2% agrożel. Idealny rozmiar sonikowanego DNA dla większości zastosowań to od 200 do 500 par zasad.

Na koniec określ stężenie DNA za pomocą spektrofotometru UV. Chromatyna ze ściętymi zębami może być natychmiast użyta do wywołania reakcji immunoprecypitacji chromatyny lub przechowywana w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza do immunoprecypitacji chromatyny lub rozcieńczonej chromatyny sonikowanej do stężenia DNA A od pięciu do 10 mikrogramów na mililitr w całkowitej objętości dwóch mililitrów w buforze rozcieńczającym chip z inhibitorami proteazy. Wszystkie kroki tej procedury należy wykonać w temperaturze od zera do czterech stopni Celsjusza.

Zaoszczędź 10%, czyli 200 mikrolitrów w tym przykładzie rozcieńczonej sonikowanej chromatyny jako wkładu, przechowuj na lodzie pozostałą próbkę podwielokrotność 450 mikrolitrów do każdej z czterech 1,7 mililitrowych probówek mikrowizyjnych oznaczonych jako kontrola izotypu i przeciwciało będące przedmiotem zainteresowania. Jeśli stosuje się wiele przeciwciał o tym samym izotypie, wystarczy jedna kontrola izotypu Aby przeprowadzić tę analizę, dodaj od dwóch do pięciu mikrogramów swoistego przeciwciała w zależności od swoistości użytego przeciwciała lub kontroli izotypu do odpowiednich probówek. Kołysz probówkami przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby umożliwić tworzenie się kompleksów przeciwciał chromatyny następnego ranka.

Dodaj 25 mikrolitrów kulek magnetycznych białka G do każdej mieszanki i kołysz przez co najmniej dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie umieść rurki fuge na stojaku magnetycznym na 15 do 20 sekund, aby koraliki zebrały się po namagnesowanej stronie. Ostrożnie usuń roztwór przez aspirację, nie naruszając kulek.

Dodaj jeden mililitr roztworu do płukania o niskiej zawartości soli i delikatnie kołysz się na modyfikatorze przez pięć minut. Zbierz koraliki za pomocą stojaka magnetycznego i usuń roztwór myjący. Ponownie dodaj jeden mililitr roztworu do mycia o niskiej zawartości soli i delikatnie kołysz przez pięć minut.

Po usunięciu roztworu do płukania o niskiej zawartości soli dodaj jeden mililitr roztworu do płukania o wysokiej zawartości soli i kołysz przez pięć minut. Zbierz koraliki za pomocą stojaka magnetycznego i usuń roztwór myjący. Powtórz pranie roztworem do płukania o wysokiej zawartości soli.

Po usunięciu roztworu płuczącego o wysokiej zawartości soli dodaj jeden mililitr roztworu do płukania chlorku litu i kołysz się przez pięć minut. Zbierz koraliki za pomocą stojaka magnetycznego i usuń roztwór myjący. Powtórz mycie chlorkiem litu raz.

Dodaj jeden mililitr roztworu TE i kołysz przez pięć minut. Zbierz koraliki za pomocą stojaka magnetycznego i usuń roztwór myjący. Eluuj DNA z kulek, dodając 250 mikrolitrów elucjańskiej skały buforowej przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

Odpipetuj EIT i zapisz ten materiał w nowej tubie fuge o średnicy 1,7 milimetra. Powtórz jeszcze raz i połącz oba elu, wyrzuć koraliki, aby odwrócić ogniwa krzyżowe. Do wymykającego się DNA dodać pięć molowych roztworów chlorku sodu do końcowego stężenia 0,3 mola i jednego mikrolitra RNA.

Dodać 400 mikrolitrów buforu elucyjnego do zapisanych wcześniej wejść. Aby uzyskać objętość 500 mikrolitrów na każde wejście, dodaj chlorek sodu do 0,3 mola jeden mikrolitr RNA, 10 mikrolitrów 0,5 molowego EDTA 20 mikrolitrów jednego molowego tris, HCL pH 6,5 i jeden mikrolitr proteinazy K. Uszczelnij probówki i inkubuj je przez noc w temperaturze 65 stopni Celsjusza w suchym bloku grzewczym następnego ranka, Pozwól rurkom ostygnąć do temperatury pokojowej. Następnie dodaj jeden mililitr 100% etanolu i inkubuj przez dwie godziny do nocy w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Aby wytrącić wirówkę DNA, probówki o stężeniu 16 000 G przez 15 minut. Aby przepłukać DNA, osad DNA raz z 70% etanolem i wysuszyć na powietrzu, osad ponownie zawiesić, osad DNA w 100 mikrolitrach wody destylowanej w autoklawie, oczyścić DNA za pomocą kajaka, kolumn szybkiego wirowania i wymyć w całkowitej objętości 50 mikrolitrów buforu elucyjnego. To DNA jest teraz gotowe do użycia do amplifikacji PCR.

Najważniejszym aspektem tego protokołu jest analiza rezerw QPCR w celu uzyskania pełnego wzbogacenia w kontrolnym regionie niezwiązanym. Za pomocą oprogramowania QPCR przejdź do edytora i oznacz studzienki zawierające próbki wejściowe różnych rozcieńczeń ich standardowymi wartościami krzywej. Oznacz również studzienki nieznanymi próbkami wiórów dokładnie tak, jak ułożona jest płytka PCR.

Zastosowanie krzywej wzorcowej do interpolacji ilości DNA w nieznanych próbkach specyficznych i izotypowych pozwala na ocenę i dopasowanie jakości i skuteczności wszystkich zestawów starterów w zakresie stężeń stwierdzonych w próbkach. Przejdź do edytora podzbiorów i zaznacz podzbiory, w tym studzienki z próbkami wejściowymi, a także nieznane próbki chipów. Nieznane próbki zostaną określone ilościowo przy użyciu krzywej wzorcowej uzyskanej ze znanych stężeń próbek wejściowych do analizy.

Po zakończeniu amplifikacji PCR należy przeprowadzić analizę za pomocą kwantu ABS. Druga pochodna max. Wybierz podzbiór do analizy i naciśnij. Porządku.

Naciśnij oblicz, który wygeneruje krzywą wzorcową przy użyciu znanych stężeń próbek wejściowych i wyświetli bezwzględną ilość DNA obecnego w nieznanych próbkach, jeśli jakość DNA jest dobra i jeśli startery wiążą się specyficznie z regionem docelowym, wydajność PCR powinna być bliska dwóm. Wykonaj analizę krzywej topnienia z TM wywołując ten sam podzestaw, jeśli jest dostępny. Pojedynczy pik oznacza, że tylko jeden konkretny produkt został wzmocniony.

Amplifikację specyficznego DNA można również przetestować za pomocą elektro produktu PCR, wraz z drabinką DNA za pomocą żelu AROS. Uzyskane dane są następnie eksportowane jako plik tekstowy rozdzielany tabulatorami, który można otworzyć w programie Microsoft Excel w celu dalszej analizy. Podzielić ilość DNA dla specyficznego przeciwciała z kontrolą izotypu dla docelowych starterów.

Powtórz ten krok dla podkładów regionu kontrolnego. Jeśli wiele przeciwciał tego samego izotypu jest używanych do różnych wytrąceń immunologicznych, znormalizuj każde z nich wartościami z tej samej kontroli izotypu. Ponadto, jeśli stosuje się wiele docelowych par starterów, do normalizacji każdego celu należy użyć ilości DNA z pojedynczego zestawu naprawczego startera kontrolnego.

Wartości wyjściowe reprezentują swoiste wzbogacenie fałdu immunoprecypitacji przeciwciał w każdym miejscu w stosunku do przeciwciała nieswoistego Immunoprecypitacja tła dzieli wzbogacenie fałdowania dla starterów celowanych przez wzbogacenie fałdowania dla starterów regionu kontrolnego, aby uzyskać wzbogacenie względem kontrolnego regionu niezwiązanego. Co ważne, należy zauważyć, że ze względu na generowanie krzywych wzorcowych z całkowitym wejściowym DNA dla każdej próbki, każda z wartości immunoprecypitacji interpolowanych od wzorca jest już znormalizowana i wyrażona jako ułamek całkowitego wkładu przez oprogramowanie maszyny. Protokół immunoprecypitacji chromatyny wykazał tutaj kontrolę różnic, jeśli takie występują, w ilości DNA użytego w PCR poprzez zastosowanie pary starterów, która amplifikuje niezwiązany region genomu, służąc w ten sposób jako kontrola obciążenia.

W tym przykładzie region kodujący mysiego genu beta aktyny został użyty jako region niezwiązany z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania, a czynnikiem transkrypcyjnym i miejscem wiązania tłuszczu na myszy, jako region docelowy użyto promotora IL dwa. Ta migawka arkusza kalkulacyjnego programu Excel przedstawia użycie protokołu obliczeniowego opisanego w danych analizy z trzech powtórzeń eksperymentalnych w polach w kolorach żółtym, zielonym i fioletowym z trzema powtórzeniami technicznymi. Każdy z nich został użyty do obliczenia wzbogacenia fałdowania.

Względne wzbogacenie białka związanego z różnymi regionami genomu można porównać, jeśli wybrano ten sam zestaw kontroli izotypu i specyficzne przeciwciała. Jeśli swoistość przeciwciała jest dobra, zwykle obserwuje się od dwóch do dziesięciu razy wzbogacenie w niezwiązanym regionie kontrolnym. Rysunek ten przedstawia wyniki eksperymentu z chipem z konwencjonalnymi limfocytami T CD 4 i regulatorowymi limfocytami T CD 4 wyizolowanymi od myszy.

Niewielka frakcja konwencjonalnych limfocytów T była stymulowana PMA i mycyną jonową przez 30 minut. Zaobserwowano względne wzbogacenie czynników transkrypcyjnych NFA, N tłuszczu C jeden i NFA C dwa w promotorze IL dwa i jest tutaj przedstawione jako wzbogacenie fałdowania w niezwiązanym regionie Zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak ChIP-seq, mogą być stosowane w celu rozwiązania problemu globalnego zajmowania czynników transkrypcyjnych lub globalnych zmian w znacznikach epigenetycznych w odpowiedzi na bodziec.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić immunoprecypitację chromatyny przy użyciu ograniczonej liczby komórek oraz analizować dane QPCI w celu określenia pasm czynnika transkrypcyjnego w porównaniu z kontrolnym regionem niezwiązanym.