C. elegans Test chemotaktyksy

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ilościowa ocena reakcji chemotaktycznej C. elegans przy użyciu prostego i niedrogiego testu. Osiąga się to poprzez odizolowanie spreparowanych robaków i umieszczenie ich na środku oznakowanej płytki. W równej odległości od wszystkich miejsc testowych i kontrolnych, złożonych w każdym miejscu, znajduje się związek docelowy lub związek kontrolny, oba połączone z anestetykiem, który zatrzymuje robaki podczas zbliżania się.

Po 60 minutach, końcowa dystrybucja robaków na płytce jest liczona, a stosunek lokalizacji robaków jest używany do uzyskania indeksu testu. Ostatecznie, ilościowa ocena przyciągania C. elegans do określonych związków może być wykorzystana do oceny konsekwencji behawioralnych podłoża eksperymentu. Główną zaletą tej techniki jest to, że obejmuje wiele korzystnych aspektów swoich poprzedników, jednocześnie umożliwiając większą łatwość użycia.

Ten test dostarcza informacji na temat zachowania C. elegans i jest szczególnie przydatny w połączeniu z manipulacjami neurogenetycznymi i innymi testami neurobiologicznymi. Zacznij od pięciocentymetrowych płytek z agarem chemotaksycznym lub NGM. Oznakuj spodnia stronę płytek na cztery równe ćwiartki.

Przygotuj co najmniej trzy płytki na co najmniej trzy próby dla każdej testowanej szczepy genetycznej i dla każdej warunku testowanego. Następnie oznakuj koło o promieniu 0,5 centymetra wokół początku. Następnie oznakuj punkty w przeciwnych ćwiartkach literą T dla testu lub C dla kontroli, upewniając się, że miejsca są równo oddalone od początku i od siebie.

Punkty muszą znajdować się co najmniej dwa centymetry od początku dla tego testu. Przygotuj młode dorosłe robaki w zsynchronizowanym rozwoju na pięciocentymetrowych płytkach chemotaksycznych. Robaki, które znajdują się w różnych fazach rozwoju, mogą reagować różnie na anality.

W rezultacie bardzo ważne jest, aby wszystkie robaki zastosowane w teście były w tej samej fazie rozwoju. Gdy robaki wyczyszczą warstwę OP 50 e coli, za pomocą pipety wlej dwa mililitry buforu S na płytkę. Manipuluj płytką, aby wszystkie robaki znalazły się w buforze, aby przepłukać robaki.

Za pomocą pipety wlej jeden mililitr robaków w buforze do mikrocentryfugującej tubki i wiruj przez 10 sekund. Używając pico fuge z prędkością 6600 RPM, zasysaj aż do ostatnich kropel, pozostawiając osad robaków nienaruszony. Teraz przepłukuj te robaki jeszcze trzy razy stosując tę samą metodę.

Zacznij od dodania buforu S do tubki i odwrócenia jej, aby robaki wróciły do roztworu. Po ostatnim przepłukaniu wiruj robaki przez kolejne 10 sekund, a następnie zasysaj nadstan do końcowej objętości 100 mikrolitów. Następnie upewnij się, że gęstość robaków jest wystarczająca, pipetując dwa mikrolitry przepłukanych robaków z osadu na płytkę NGM.

Musi być co najmniej 50 robaków, ale nie więcej niż 250 robaków. Jeśli jest zbyt wiele robaków, zwiększ objętość roztworu ESP. A jeśli jest zbyt mało robaków, odwiruj je i zawieś je w mniejszej objętości.

Umieść tubkę z robakami w kapturze laboratoryjnym. Po przygotowaniu robaki są gotowe do użycia w teście chemotaksycznym przez maksymalnie godzinę. Najpierw przygotuj roztwory.

Wymieszaj roztwór testowy, łącząc równe objętości związku testowego z anestetykiem 0,5 molarnego azydu. Następnie wymieszaj roztwór kontrolny rozpuszczalnika użytego do rozcieńczenia związku testowego z 0,5 molarnym azydem sodu. Teraz przygotuj płytkę testową.

Po pierwsze, za pomocą pipety wlej dwa mikrolitry roztworu robaków z osadu na początek płytki testowej. Po drugie, dodaj odoranty pipetując dwa mikrolitry roztworu testowego na dwa miejsca T i pipetując dwa mikrolitry roztworu kontrolnego na dwa miejsca T. Gdy robaki i krople odorantów zostaną wchłonięte do agaru, nałóż pokrywki, odwróć płytki i pozwól na 60 minut na czas trwania testu.

Aby czas dyfuzji ASI sodu był standaryzowany pomiędzy próbami. Ważne jest, aby robaki były dodawane natychmiast przed odorantami.

Również każda płytka powinna być w pełni przygotowana i test rozpoczęty przed przygotowaniem kolejnej płytki. Po 60-minutowej próbie umieść robaki w lodówce o temperaturze czterech stopni Celsjusza. Później, wyjmij płytkę z lodówki, gdy można ją policzyć.

Nie licz ich natychmiast i nie zostawiaj robaków w temperaturze pokojowej, co może pozwolić im na mobilizację.Znów. Odnotuj lokalizację robaków, które całkowicie przeszły przez wewnętrzny krąg, z danych. Oblicz indeks chemotaksyczny.

Wartość będzie waha się od minus jednego do plus jednego, reprezentując maksimum odpychania do maksimum przyciągania. Powtórz proces używając roztworu kontrolnego zarówno w kwaterach testowych jak i kontrolnych. To będzie służyć jako płytka kontrolna. Trzy.

Takie płytki powinny być wykonane i przeprowadzone dla każdego warunku eksperymentalnego. Diacetyl. Znany chemotaksyczny C. elegans czynnik przyciągający został użyty do porównania robaków typu dzikiego z mutantami pozbawionymi receptora dla diacetylu. Jak się spodziewano, diacetyl wywołał znaczącą reakcję chemotak