C. elegans Test chemotaktyksy
April 27th, 2013
Opisano metodę ilościowej oceny reakcji chemotaktycznej Caenorhabditis elegans. Zastosowano wskaźnik chemotaksyczny (CI) jako sposób dokładnej oceny reakcji robaków na określone cele oraz jako platformę porównawczą między odmianami i związkami interesującymi.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ilościowa ocena reakcji chemotaktycznej C. elegans przy użyciu prostego i niedrogiego testu. Osiąga się to poprzez odizolowanie spreparowanych robaków i umieszczenie ich na środku oznakowanej płytki. W równej odległości od wszystkich miejsc testowych i kontrolnych, złożonych w każdym miejscu, znajduje się związek docelowy lub związek kontrolny, oba połączone z anestetykiem, który zatrzymuje robaki podczas zbliżania się.
Po 60 minutach, końcowa dystrybucja robaków na płytce jest liczona, a stosunek lokalizacji robaków jest używany do uzyskania indeksu testu. Ostatecznie, ilościowa ocena przyciągania C. elegans do określonych związków może być wykorzystana do oceny konsekwencji behawioralnych podłoża eksperymentu. Główną zaletą tej techniki jest to, że obejmuje wiele korzystnych aspektów swoich poprzedników, jednocześnie umożliwiając większą łatwość użycia.
Ten test dostarcza informacji na temat zachowania C. elegans i jest szczególnie przydatny w połączeniu z manipulacjami neurogenetycznymi i innymi testami neurobiologicznymi. Zacznij od pięciocentymetrowych płytek z agarem chemotaksycznym lub NGM. Oznakuj spodnia stronę płytek na cztery równe ćwiartki.
Przygotuj co najmniej trzy płytki na co najmniej trzy próby dla każdej testowanej szczepy genetycznej i dla każdej warunku testowanego. Następnie oznakuj koło o promieniu 0,5 centymetra wokół początku. Następnie oznakuj punkty w przeciwnych ćwiartkach literą T dla testu lub C dla kontroli, upewniając się, że miejsca są równo oddalone od początku i od siebie.
Punkty muszą znajdować się co najmniej dwa centymetry od początku dla tego testu. Przygotuj młode dorosłe robaki w zsynchronizowanym rozwoju na pięciocentymetrowych płytkach chemotaksycznych. Robaki, które znajdują się w różnych fazach rozwoju, mogą reagować różnie na anality.
W rezultacie bardzo ważne jest, aby wszystkie robaki zastosowane w teście były w tej samej fazie rozwoju. Gdy robaki wyczyszczą warstwę OP 50 e coli, za pomocą pipety wlej dwa mililitry buforu S na płytkę. Manipuluj płytką, aby wszystkie robaki znalazły się w buforze, aby przepłukać robaki.
Za pomocą pipety wlej jeden mililitr robaków w buforze do mikrocentryfugującej tubki i wiruj przez 10 sekund. Używając pico fuge z prędkością 6600 RPM, zasysaj aż do ostatnich kropel, pozostawiając osad robaków nienaruszony. Teraz przepłukuj te robaki jeszcze trzy razy stosując tę samą metodę.
Zacznij od dodania buforu S do tubki i odwrócenia jej, aby robaki wróciły do roztworu. Po ostatnim przepłukaniu wiruj robaki przez kolejne 10 sekund, a następnie zasysaj nadstan do końcowej objętości 100 mikrolitów. Następnie upewnij się, że gęstość robaków jest wystarczająca, pipetując dwa mikrolitry przepłukanych robaków z osadu na płytkę NGM.
Musi być co najmniej 50 robaków, ale nie więcej niż 250 robaków. Jeśli jest zbyt wiele robaków, zwiększ objętość roztworu ESP. A jeśli jest zbyt mało robaków, odwiruj je i zawieś je w mniejszej objętości.
Umieść tubkę z robakami w kapturze laboratoryjnym. Po przygotowaniu robaki są gotowe do użycia w teście chemotaksycznym przez maksymalnie godzinę. Najpierw przygotuj roztwory.
Wymieszaj roztwór testowy, łącząc równe objętości związku testowego z anestetykiem 0,5 molarnego azydu. Następnie wymieszaj roztwór kontrolny rozpuszczalnika użytego do rozcieńczenia związku testowego z 0,5 molarnym azydem sodu. Teraz przygotuj płytkę testową.
Po pierwsze, za pomocą pipety wlej dwa mikrolitry roztworu robaków z osadu na początek płytki testowej. Po drugie, dodaj odoranty pipetując dwa mikrolitry roztworu testowego na dwa miejsca T i pipetując dwa mikrolitry roztworu kontrolnego na dwa miejsca T. Gdy robaki i krople odorantów zostaną wchłonięte do agaru, nałóż pokrywki, odwróć płytki i pozwól na 60 minut na czas trwania testu.
Aby czas dyfuzji ASI sodu był standaryzowany pomiędzy próbami. Ważne jest, aby robaki były dodawane natychmiast przed odorantami.
Również każda płytka powinna być w pełni przygotowana i test rozpoczęty przed przygotowaniem kolejnej płytki. Po 60-minutowej próbie umieść robaki w lodówce o temperaturze czterech stopni Celsjusza. Później, wyjmij płytkę z lodówki, gdy można ją policzyć.
Nie licz ich natychmiast i nie zostawiaj robaków w temperaturze pokojowej, co może pozwolić im na mobilizację.Znów. Odnotuj lokalizację robaków, które całkowicie przeszły przez wewnętrzny krąg, z danych. Oblicz indeks chemotaksyczny.
Wartość będzie waha się od minus jednego do plus jednego, reprezentując maksimum odpychania do maksimum przyciągania. Powtórz proces używając roztworu kontrolnego zarówno w kwaterach testowych jak i kontrolnych. To będzie służyć jako płytka kontrolna. Trzy.
Takie płytki powinny być wykonane i przeprowadzone dla każdego warunku eksperymentalnego. Diacetyl. Znany chemotaksyczny C. elegans czynnik przyciągający został użyty do porównania robaków typu dzikiego z mutantami pozbawionymi receptora dla diacetylu. Jak się spodziewano, diacetyl wywołał znaczącą reakcję chemotak
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł opisuje metodę ilościowej oceny reakcji chemotaktykcznej Caenorhabditis elegans przy użyciu prostego i niedrogiego testu. Podejście polega na pomiarze rozmieszczenia robaków w reakcji na różne związki, zapewniając indeks chemotaktykczny do porównania.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia behawioralna
- Testy eksperymentalne
Tło
- Caenorhabditis elegans jest organizmem modelowym stosowanym do badania reakcji behawioralnych.
- Chemotaktyka jest krytycznym zachowaniem, które można ilościowo ocenić.
- Poprzednie metody brakowały precyzji i łatwości użycia.
- To badanie ma na celu udoskonalenie istniejących technik oceny reakcji chemotaktykcznych.
Cel badania
- Ilościowa ocena reakcji chemotaktykcznej C. elegans na różne związki.
- Ustanowienie wiarygodnego indeksu chemotaktykcznego do porównania między różnymi szczepami i związkami.
- Ułatwienie oceny konsekwencji behawioralnych wynikających z eksperymentalnych manipulacji.
Zastosowane metody
- Izolacja stadium robaków do testowania.
- Umieszczenie robaków na środku oznaczonej płytki.
- Równomierne rozmieszczenie testowanych i kontrolnych związków w połączeniu z środkami znieczulającymi.
- Zliczanie rozmieszczenia robaków po 60 minutach, aby obliczyć indeks chemotaktykczny.
Główne wyniki
- Test skutecznie ilościowo ocenia przyciąganie robaków do określonych związków.
- Wyniki dostarczają jasnego indeksu chemotaktykcznego do porównania.
- Metoda wykazuje łatwość użycia w porównaniu z poprzednimi technikami.
- Konsekwencje behawioralne reakcji robaków mogą być oceniane na podstawie wyników.
Wnioski
- Opracowany metoda oferuje wiarygodny sposób oceny zachowania chemotaktykcznego w C. elegans.
- To podejście może poprawić zrozumienie reakcji behawioralnych w różnych kontekstach eksperymentalnych.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej metodzie, aby zbadać dodatkowe związki i warunki.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantifying chemotactic responses in model organisms enables early-stage target validation by linking genetic or pharmacological manipulations to measurable behavioral outputs. This assay supports mechanistic de-risking in neuroscience discovery by providing a quantitative, reproducible readout for sensory pathway function. Its simplicity and scalability enhance predictive confidence in target engagement studies prior to lead identification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking gene function to sensory behavior in a whole-organism context.
- Operational Value: Enables functional target validation through quantitative behavioral phenotyping.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by de-risking targets based on observable chemotactic phenotypes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, quantitative outputs suitable for compound screening campaigns.
- Scalability: Four-quadrant design increases sample size and reduces bias, enabling reliable replicate testing.
- Workflow Integration: Allows unattended operation and endpoint scoring, improving throughput in discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects genetic findings to behavioral outputs, supporting disease-relevant model validation.
- Mechanistic De-risking: Clarifies pathway function through dose- and genotype-dependent chemotactic responses.
- Preclinical Alignment: Enables evaluation of behavioral consequences from target modulation in a genetically tractable system.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead optimization by providing a functional behavioral readout that informs target credibility.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying behavioral responses to compounds or genetic perturbations.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative chemotactic indices that enable comparison across conditions and strains.
- Analytics: Generates a normalized chemotaxis index (−1 to +1) that facilitates data comparison and statistical evaluation.
- Translational Research: Links neurogenetic manipulations to phenotypic outcomes, supporting target-to-behavior translation.
- Enterprise Reuse: Represents a modular, low-cost behavioral assay adaptable across multiple discovery projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in behavioral phenotypes.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized worm staging, plate preparation, and blinded scoring.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early go/no-go decisions based on functional behavioral data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by identifying targets with strong phenotypic validation in vivo.
Implementation Considerations
- Requires expertise in worm handling, synchronization, and developmental staging.
- Depends on standard laboratory equipment including centrifuges, microcentrifuge tubes, and incubators.
- Necessitates cross-team standardization of worm preparation and assay timing for reproducible results.
- Adaptation to other model systems may require adjustments to arena design and anesthetic compatibility.
- Practical limitations include sensitivity to worm density and developmental stage variability, which must be controlled.
