Name: C. elegans Test chemotaktyksy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Poznaj metodę oceny chemotaksji u Caenorhabditis elegans za pomocą prostego i taniego testu. Technika ta pozwala ilościowo zmierzyć odpowiedź robaków na różne związki chemiczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Life Sciences i Wydziałowi Nauk Ścisłych i Przyrodniczych na Uniwersytecie Królewskim za dofinansowanie tej pracy. Również dziękujemy laboratorium Chin-Sang za dostarczenie niezbędnych reagentów, sprzętu i wsparcia technicznego. Chcemy również podziękować QGEM 2011, szczególnie Tony He za jego wkład w dyskusję.

1. Przygotowanie/płukanie robaków
<ol>
 <li>Synchronizuj robaki na młode dorosłe11. </li>
 <li>Pipetą wymieszaj 2 ml S Basal na 5 cm płytce Chemotaxis z umieszczonymi na niej synchronizowanymi robakami, które właśnie opuściły dywan OP50 E. coli. Nachyl płytkę w miarę potrzeby, aby upewnić się, że robaki są spłukiwane z powierzchni płytki do buforu. </li>
 <li>Pipetą wymieszaj 1 ml roztworu robaków-S Basal w mikroprobówce. </li>
 <li>Wiruj przez 10 s w mikrowirusówce PicoFuge z prędkością 6600 obr./min.</li>
 <li>Zasosuj S Basal, pozostawiając osadu robaków w spokoju. </li>
 <li>Dodaj 1 ml roztworu S Basal do mikroprobówki, odwróć kilka razy, aby spłukać robaki. </li>
 <li>Powtórz kroki 1.4 do 1.6 jeszcze trzy razy.</li>
 <li>Wiruj po raz piąty przez 10 s, zasosowując tym razem nadstan do końcowej objętości ok. 100 μl.
 </li>
 <li>Pipetą uzyskaj 2 μl robaków na płytce NGM, aby upewnić się, że w każdej próbce 2 μl znajduje się od 50 do 250 robaków. Skoryguj stężenie robaków w S Basal w razie potrzeby, ponownie zawieszając robaki w mniejszej lub większej objętości S Basal. 
 </li>
 <li>Używaj robaków w badaniu natychmiast po ich płukaniu, do maks. 1 godziny. </li>
</ol>
2. Przygotowanie płytek testowych
<ol>
 <li>Zaznacz spodnia stronę 5 cm płytki, podzielając miskę na 4 równe ćwiartki. Można użyć agaru chemotaksycznego lub NGM. Wymagane jest minimum 3 próby na każdą badaną genetycznie odmianę.
 </li>
 <li>Zaznacz okrąg o promieniu 0,5 cm wokół początku (Rysunek 1).</li>
 <li>Zaznacz punkt w każdej ćwiartce albo "T" dla "Test" albo "C" dla "Kontrola", upewniając się, że punkty są równo oddalone od początku i od siebie. Punkty muszą znajdować się co najmniej 2 cm od początku. Zaznacz górne lewe i dolne prawe ćwiartki jako ćwiartki testowe, a górne prawe i dolne lewe ćwiartki jako kontrolne (Rysunek 1). </li>
</ol>
3. Przeprowadzanie badania
<ol>
 <li>Wymieszaj roztwór testowy, łącząc równe objętości związku testowego i 0,5 M azydu (znieczulającego środka używanego do zahamowania robaków po dotarciu do ćwiartki). Wymieszaj roztwór kontrolny, łącząc rozpuszczalnik użyty do rozcieńczenia związku testowego z 0,5 M azydu. </li>
 <li>Pipetą wymieszaj 2 μl roztworu robaków (przygotowanego w punkcie 1.8) z osadu na początek (gdzie linie się przecinają). </li>
 <li>Natychmiast potem, pipetą wymieszaj 2 μl roztworu testowego na dwóch punktach "T". Podobnie, pipetą wymieszaj tyle samo roztworu kontrolnego na dwóch punktach "C". </li>
 <li>Gdy krople robaków i środka zapachowego zostaną wchłonięte przez agar, zasuń pokrywki i odwróć płytki. </li>
 <li>Po 60 min. umieść robaki w inkubatorze 4 °C. Wyjmuj płytkę z inkubatora tylko wtedy, gdy można przeliczyć robaki. Pozostawienie robaków w temperaturze pokojowej może pozwolić im na ponowne ruchomy. </li>
 <li>Zapisz liczbę robaków w każdej ćwiartce, które w całości przeszły przez wewnętrzny okrąg. </li>
 <li> Powtórz kroki 3.2 do 3.6 używając roztworu kontrolnego zarówno na ćwiartkach testowych, jak i kontrolnych. To będzie służyło jako płytka kontrolna. Powinno się wykonać trzy takie płytki i przeprowadzić badanie, aby uzyskać odpowiednie dane kontrolne. </li>
</ol>
4. Interpretacja wyników/wyznaczanie indeksu chemotaksy
<ol>
 <li>Oblicz indeks chemotaksy za pomocą Równania 1. Wynik ten będzie wskazywał indeks chemotaksy w zakresie od -1,0 do +1,0.</li>
 </ol>
(1)
Indeks Chemotaxis = (# Robaków w obu ćwiartkach testowych - # Robaków w obu ćwiartkach kontrolnych) / (Całkowita liczba ocenowanych robaków) 
Wynik +1,0 wskazuje na maksymalną atrakcję dla celu i reprezentuje 100% robaków osiągających ćwiartki zawierające chemiczny cel. Indeks -1,0 jest dowodem maksymalnej odpychania. Podobne metody badań zostały już zastosowane 3 (Tabela 1).
<ol start="2">
 <li>Zgłoś średni indeks chemotaksy (CI) i błąd standardowy średniej (SEM). Wykonaj test Studenta porównując dane z płytek testowych i kontrolnych. </li>
 </ol>

<ol><li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Cell. 74, 515-527 (1993).</li>
<li>Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemosensory+neurons+with+overlapping+functions+direct+chemotaxis+to+multiple+chemicals+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans.</a> Neuron. 7, 729-742 (1991).</li>
<li>Lee, J., Jee, C., McIntire, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+preference+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Brain+Behav%22%5BJournal%5D)">Ethanol preference in C. elegans.</a> Genes Brain Behav. 8, 578-585 (2009).</li>
<li>Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+behavioral+analysis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput behavioral analysis in C. elegans.</a> Nat. Methods. 8, 592-598 (2011).</li>
<li>Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+by+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+identification+of+attractants+and+analysis+of+the+response+by+use+of+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 817-821 (1973).</li>
<li>Colbert, H. A., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-specific+adaptation+pathways+generate+olfactory+plasticity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans.</a> Neuron. 14, 803-812 (1995).</li>
<li>Kauffman, A., Parsons, L., Stein, G., Wills, A., Kaletsky, R., Murphy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+Positive+Butanone+Learning%2C+Short-term%2C+and+Long-term+Associative+Memory+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays.</a> J. Vis. Exp. (49), e2490(2011).</li>
<li>Troemel, E. R., Kimmel, B. E., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+chemotaxis+responses%3A+sensory+neurons+define+olfactory+preferences+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming chemotaxis responses: sensory neurons define olfactory preferences in C. elegans.</a> Cell. 91, 161-169 (1997).</li>
<li>Pierce-Shimomura, J. T., Morse, T. M., Lockery, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fundamental+role+of+pirouettes+in+Caenorhabditis+elegans+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The fundamental role of pirouettes in Caenorhabditis elegans chemotaxis.</a> J Neurosci. 19, 9557-9569 (1999).</li>
<li>Frokjaer-Jensen, C., Ailion, M., Lockery, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ammonium-acetate+is+sensed+by+gustatory+and+olfactory+neurons+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Ammonium-acetate is sensed by gustatory and olfactory neurons in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 3, e2467(2008).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+Methods%3A+Synchronization+and+Observation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation.</a> J. Vis. Exp. (64), e4019(2012).</li>
<li>Sengupta, P., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fate+specification+and+differentiation+in+the+nervous+system+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Cell fate specification and differentiation in the nervous system of Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Genet. 18, 73-80 (1996).</li>
<li>Hart, A. C. Behavior. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHart%2C+AC+%22WormBook%22">WormBook</a>. , (1895).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Chemotaxis, choć kontrolowana przez złożony zestaw mechanizmów neuronowych i komórkowych, może być łatwo i obiektywnie zmierzona za pomocą testów chemotaksy. Aby uzyskać najlepsze wyniki z testów, należy podjąć pewne kluczowe kroki. Po pierwsze, ustalenie stadiów rozwojowych dżdżownic jest niezbędne do uzyskania spójnych wyników eksperymentalnych. Dżdżownice na różnych etapach życia zachowują się inaczej 13; więc mieszane stadiowo dżdżownice mogą zakłócić wyniki eksperymentu. Po drugie, upewnienie się, że ...

Ward jako pierwszy opracował test chemotaksyczny w 1973 roku 5, a od tego czasu ma on dalekosiężne zastosowania. Neurobiologia to jedna z dziedzin, która skorzystała na używaniu różnych testów chemotaksycznych. Adaptacja węchowa, prosta forma uczenia się i pamięci, została wykazana u C. elegans za pomocą testów chemotaksycznych 6. Były one również używane do wykazania, że C. elegans może rozwinąć tolerancję na etanol - wynik, który nie tylko pokazuje plasticzność zachowań robaków, ale również pokazuje, że robaki mogą być bardzo przydatne w badaniu uzależnienia od alkoholu u ludzi 3. Testy zostały nawet opracowane, aby wykazać zdolność C. elegans do przechowywania pamięci krótko- i długoterminowej, pokazując, że robaki nawiązują powiązania między chemoatraktantami a pokarmem (OP50) 7. Ponadto, biorąc pod uwagę ogromne informacje dostępne obecnie dotyczące genomu C. elegans, zachowanie chemotaksyczne C. elegans zostało wielokrotnie modyfikowane poprzez indukowanie mutacji 1,8. Umożliwia to wiele ekscytujących możliwości inżynieryjnych, takich jak opracowanie C. elegans jako narzędzia do bioremediacji. W ten sposób, od początkowego opracowania testu chemotaksycznego w 1973 roku, był on często modyfikowany i stosowany do wyjaśniania tajemnic w różnych dziedzinach. 
Pewne testy miały na celu odkrycie konkretnej ścieżki podejmowanej przez robaki w kierunku celu. Pierwowzór takiego testu został opracowany przez Warda 5. Trzy robaki umieszczano na stopionym agarze na 15 minut. Ich ruchy były śledzone przez ślad, jaki zostawiały podczas przemieszczania się od krawędzi płytki w górę gradientu do atrakcyjnego bodźca w centrum płytki. Wszystkie robaki na płytce były zatrzymywane za pomocą chloroformu pod koniec każdego eksperymentu. Jeden z potomków tej metody umieszczał pojedynczy robak na środku płytki z atrakcyjnym bodźcem i kontrolą w równych i przeciwległych odległościach od punktu początkowego 2.
Pierce-Shimomura et al. opracował test w celu obserwacji dokładnej natury ruchu zaangażowanego w chemotaksję9. Pojedyncze robaki umieszczano w 9 cm naczyniach Petriego zawierających jednolitą koncentrację atrakcyjnego bodźca lub radialny gradient, kończący się w źródle atrakcyjnego bodźca. Program komputerowy, który rozpoznawał robaka, był używany do rejestracji obserwowanego zachowania. Kamera wideo podłączona do mikroskopu pracowała w połączeniu z etapem, aby automatycznie dostosowywać naczynie Petriego podczas trwania testu, aby zapewnić, że robak pozostawał w polu widzenia. Z tego wynikało bardziej szczegółowe zrozumienie przyczyny piruetów wykonywanych przez C. elegans.
Inne testy, bardziej podobne do tego opisany tutaj, testowały reakcję dużej populacji robaków na badane związki. Testy chemotaksyczne dwudzielne były używane do zbadania ról, jakie odgrywały różne neurony, receptory i cząsteczki transdukcji sygnału, gdy C. elegans był narażony na różne związki 1. Pomiędzy 20-50 umytych robaków umieszczano w pobliżu środka płytki z atrakcyjnym bodźcem i kontrolą na przeciwległych końcach wraz z anestetykiem, azydem sodu (NaN3). Po 60 minutach generowano wskaźnik chemotaksyczny o wartościach od -1,0 do +1,0 w oparciu o różnicę między liczbą robaków przymocowanych do atrakcyjnego bodźca lub kontroli. Podobny wskaźnik chemotaksyczny był używany w teście opisanym w tym artykule, chociaż wcześniejszy test nie oceniał ściśle robaków bezruchowych. Test ten został następnie zastosowany do badania wpływu usunięcia neuronów na chemotaksję. 
Inna odmiana wspomnianego wcześniej testu została przeprowadzona, gdzie 100-200 robaków umieszczano na środku płytki zawierającej cztery kwatery 3. Przylegające kwatery zawierały albo substancję badaną albo kontrolną. Podobnie jak w poprzednich testach, robaki były unieruchomione działaniem azydu sodu przed wyliczeniem. Podobna metoda jest opisana tutaj jako sposób oceny reakcji C. elegans na różne związki. Jednakże, poniższa metoda ma dodatkową zaletę polegającą na ocenie tylko robaków, które przeszły próg odległości oddzielającej ruchome od nieruchomych robaków.
Inne testy włączyły podobne wytyczne do ignorowania nieruchomych robaków. Frøkjær-Jensen et al. opracował wszechstronny test, który może być używany do badania zarówno lotnych, jak i rozpuszczalnych w wodzie związków 10. Naczynie Petriego było podzielone na cztery kwatery. Górne i dolne kwatery nie zawierały rozpuszczalników. Lewa kwatera zawierała wodę, a prawa atrakcyjny bodźca. Podczas testowania lotnych substancji zapachowych, analizat był umieszczany na pokrywie naczynia, nad odpowiednią kwaterą, podczas gdy substancje rozpuszczalne w wodzie były umieszczane bezpośrednio na agarze.
Metody obecnie istniejące do oceny reakcji chemotaksycznej

<table><tbody><tr><td>S Basal (- cholesterol) [5.8 g NaCl; 1 M K phosphate buffer, pH 6.0; dH2O do 1 litra.] Autoklaw</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PicoFuge</td><td>Stratagene</td><td>400552</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopy</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Do sekcjonowania</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta P1000</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta P10</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 M Azyd sodu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar Chemotaxis [1.6% BBL-agar (Benton-Dickinson) lub 2% Difco-agar. Autoklaw. Dodaj 5 mM fosforanu potasu, pH 6.0; 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol/Woda destylowana</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Związki testowe (np. 0.5% diacetyl)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Bio-Rad</td><td>166-0600</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Amresco</td><td>CA97062-046</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>VWR</td><td>CA12001-120</td><td></td></tr><tr><td>NH4OH</td><td>BDH</td><td>CABDH8641-2</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Tween 20</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6531</td><td></td></tr></tbody></table>

c. elegans test chemotaktyksy

C. elegans Chemotaxis Assay

Wiele organizmów wykorzystuje chemotaksję do poszukiwania źródeł pokarmu, uniknięcia szkodliwych substancji i znalezienia partnerów. Caenorhabditis elegans ma imponujące zachowanie chemotaksyczne.
Założeniem testowania reakcji robaków na czynnik zapachowy jest umieszczenie ich w danym obszarze i obserwacja ruchu wywołanego w reakcji na czynnik zapachowy. Nawet z wieloma dostępnymi testami, optymalizacja początkowego położenia robaków względem zarówno obszarów kontrolnych, jak i testowych, minimalizując jednocześnie interakcję robaków między sobą, przy zachowaniu znaczącej wielkości próby, pozostaje nadal w trakcie prac 1-10. Opisana tu metoda ma na celu rozwiązanie tych problemów poprzez zmodyfikowanie testu opracowanego przez Bargmann et al.1. Podziemka jest podzielona na cztery kwadrany, dwa przeciwległe kwadrany oznaczone jako "Test" i dwa oznaczone jako "Kontrola". Anestetyk jest umieszczany we wszystkich miejscach testowych i kontrolnych. Robaki są umieszczane na środku płytki z zaznaczonym okręgiem wokół punktu początkowego, aby upewnić się, że nieruchome robaki zostaną zignorowane. Wykorzystanie systemu czterech kwadriantów zamiast jednego 2 lub dwóch 1 eliminuje zniekształcenie w ruchu robaków, ponieważ są one w równej odległości od próbek testowych i kontrolnych, niezależnie od tego, z której strony punktu początkowego się zaczynają. To eliminuje problem zmuszania robaków do przejścia przez skupisko innych robaków, aby odpowiedzieć na czynnik zapachowy, co może opóźniać robaki lub zmusić je do zajęcia bardziej krętej trasy, co prowadzi do niewłaściwej interpretacji ich zamierzonej ścieżki. Ta metoda ma również zalety praktyczne, ponieważ ma większą wielkość próby i pozwala badaczowi przeprowadzić test bez nadzoru i oceniać robaki po upływie wyznaczonego czasu.

Porównanie dzikiego typu (N2) C. elegans z mutantem odr-10(ky10).
Do porównania robaków dzikiego typu z mutantem pozbawionym receptora dla diacetylu użyliśmy diacetylu, znanego chemoatraktantowi C. elegans 1,12. Dla robaków dzikiego typu (N2) wskaźnik chemotaksyczny wynosił 0,100 ± 0,066 dla etanolu i 0,839 ± 0,031 dla 0,5% diacetylu. Jak było spodziewać się, diacetyl wywołał znaczącą reakcję chemotaksyczną u robaków dzikiego typu (P < 0,003). W przeciwieństw...

Opisano metodę ilościowej oceny reakcji chemotaktycznej Caenorhabditis elegans. Zastosowano wskaźnik chemotaksyczny (CI) jako sposób dokładnej oceny reakcji robaków na określone cele oraz jako platformę porównawczą między odmianami i związkami interesującymi.

C. elegans Test chemotaktyksy

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ilościowa ocena reakcji chemotaktycznej C. elegans przy użyciu prostego i niedrogiego testu. Osiąga się to poprzez odizolowanie spreparowanych robaków i umieszczenie ich na środku oznakowanej płytki. W równej odległości od wszystkich miejsc testowych i kontrolnych, złożonych w każdym miejscu, znajduje się związek docelowy lub związek kontrolny, oba połączone z anestetykiem, który zatrzymuje robaki podczas zbliżania się.Po 60 minutach, końcowa dystrybucja robaków na płytce jest liczona, a stosunek lokalizacji robaków jest używany do uzyskania indeksu testu. Ostatecznie, ilościowa ocena przyciągania C. elegans do określonych związków może być wykorzystana do oceny konsekwencji behawioralnych podłoża eksperymentu. Główną zaletą tej techniki jest to, że obejmuje wiele korzystnych aspektów swoich poprzedników, jednocześnie umożliwiając większą łatwość użycia.Ten test dostarcza informacji na temat zachowania C. elegans i jest szczególnie przydatny w połączeniu z manipulacjami neurogenetycznymi i innymi testami neurobiologicznymi. Zacznij od pięciocentymetrowych płytek z agarem chemotaksycznym lub NGM. Oznakuj spodnia stronę płytek na cztery równe ćwiartki.Przygotuj co najmniej trzy płytki na co najmniej trzy próby dla każdej testowanej szczepy genetycznej i dla każdej warunku testowanego. Następnie oznakuj koło o promieniu 0,5 centymetra wokół początku. Następnie oznakuj punkty w przeciwnych ćwiartkach literą T dla testu lub C dla kontroli, upewniając się, że miejsca są równo oddalone od początku i od siebie.Punkty muszą znajdować się co najmniej dwa centymetry od początku dla tego testu. Przygotuj młode dorosłe robaki w zsynchronizowanym rozwoju na pięciocentymetrowych płytkach chemotaksycznych. Robaki, które znajdują się w różnych fazach rozwoju, mogą reagować różnie na anality.W rezultacie bardzo ważne jest, aby wszystkie robaki zastosowane w teście były w tej samej fazie rozwoju. Gdy robaki wyczyszczą warstwę OP 50 e coli, za pomocą pipety wlej dwa mililitry buforu S na płytkę. Manipuluj płytką, aby wszystkie robaki znalazły się w buforze, aby przepłukać robaki.Za pomocą pipety wlej jeden mililitr robaków w buforze do mikrocentryfugującej tubki i wiruj przez 10 sekund. Używając pico fuge z prędkością 6600 RPM, zasysaj aż do ostatnich kropel, pozostawiając osad robaków nienaruszony. Teraz przepłukuj te robaki jeszcze trzy razy stosując tę samą metodę.Zacznij od dodania buforu S do tubki i odwrócenia jej, aby robaki wróciły do roztworu. Po ostatnim przepłukaniu wiruj robaki przez kolejne 10 sekund, a następnie zasysaj nadstan do końcowej objętości 100 mikrolitów. Następnie upewnij się, że gęstość robaków jest wystarczająca, pipetując dwa mikrolitry przepłukanych robaków z osadu na płytkę NGM.Musi być co najmniej 50 robaków, ale nie więcej niż 250 robaków. Jeśli jest zbyt wiele robaków, zwiększ objętość roztworu ESP. A jeśli jest zbyt mało robaków, odwiruj je i zawieś je w mniejszej objętości.Umieść tubkę z robakami w kapturze laboratoryjnym. Po przygotowaniu robaki są gotowe do użycia w teście chemotaksycznym przez maksymalnie godzinę. Najpierw przygotuj roztwory.Wymieszaj roztwór testowy, łącząc równe objętości związku testowego z anestetykiem 0,5 molarnego azydu. Następnie wymieszaj roztwór kontrolny rozpuszczalnika użytego do rozcieńczenia związku testowego z 0,5 molarnym azydem sodu. Teraz przygotuj płytkę testową.Po pierwsze, za pomocą pipety wlej dwa mikrolitry roztworu robaków z osadu na początek płytki testowej. Po drugie, dodaj odoranty pipetując dwa mikrolitry roztworu testowego na dwa miejsca T i pipetując dwa mikrolitry roztworu kontrolnego na dwa miejsca T. Gdy robaki i krople odorantów zostaną wchłonięte do agaru, nałóż pokrywki, odwróć płytki i pozwól na 60 minut na czas trwania testu.Aby czas dyfuzji ASI sodu był standaryzowany pomiędzy próbami. Ważne jest, aby robaki były dodawane natychmiast przed odorantami.Również każda płytka powinna być w pełni przygotowana i test rozpoczęty przed przygotowaniem kolejnej płytki. Po 60-minutowej próbie umieść robaki w lodówce o temperaturze czterech stopni Celsjusza. Później, wyjmij płytkę z lodówki, gdy można ją policzyć.Nie licz ich natychmiast i nie zostawiaj robaków w temperaturze pokojowej, co może pozwolić im na mobilizację.Znów. Odnotuj lokalizację robaków, które całkowicie przeszły przez wewnętrzny krąg, z danych. Oblicz indeks chemotaksyczny.Wartość będzie waha się od minus jednego do plus jednego, reprezentując maksimum odpychania do maksimum przyciągania. Powtórz proces używając roztworu kontrolnego zarówno w kwaterach testowych jak i kontrolnych. To będzie służyć jako płytka kontrolna. Trzy.Takie płytki powinny być wykonane i przeprowadzone dla każdego warunku eksperymentalnego. Diacetyl. Znany chemotaksyczny C. elegans czynnik przyciągający został użyty do porównania robaków typu dzikiego z mutantami pozbawionymi receptora dla diacetylu. Jak się spodziewano, diacetyl wywołał znaczącą reakcję chemotak

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym opracowaniu opisujemy metody testowania uczenia się warunkowego oraz krótkotrwałej i długotrwałej pamięci asocjacyjnej u C. elegans. Te populacyjne testy wykorzystują zdolność nicieni do chemotaksji w kierunku lotnych substancji zapachowych oraz tworzenie pozytywnych skojarzeń poprzez parowanie pożywienia z chemoatraktantem, jakim jest butanon. Zwiększenie liczby okresów warunkowania indukuje pamięć długotrwałą.

C. elegans: testy uczenia się pozytywnego względem butanonu oraz testy krótkotrwałej i długotrwałej pamięci asocjacyjnej

System ECIS/Taxis to zautomatyzowany test w czasie rzeczywistym, który służy do pomiaru chemotaksji komórkowej. W tym teście komórki przemieszczają się pod warstwą agarozy, aby dotrzeć do elektrody docelowej. Ruch komórkowy jest mierzony poprzez pojawienie się oporu dla prądu AC 0.

Pomiar chemotaksji komórkowej za pomocą systemu ECIS/Taxis

Ten film przedstawia chemotaksję u nicienia C. elegans i pokazuje przykładowy protokół testujący chemotaktyczną awersję do siarczanu miedzi.

C. elegans (C. elegans) Test chemotaksji: metoda testowania chemosensacji u robaków

Badacze mogą uruchomić ruch na żądanie u C. elegans, stosując pole elektryczne, które robaki wyczuwają i na które reagują. Ten film przedstawia zachowanie elektrotaktyczne i pokazuje przykładowy protokół, który jest wykonywany w urządzeniu mikroprzepływowym.

Test elektrotaksji: metoda obserwacji lokomocji u C. elegans

Opisano półautomatyczną metodę mikro-elektro-fluidyczną do wywoływania lokomocji na żądanie u Caenorhabditis elegans. Metoda ta opiera się na neurofizjologicznym zjawisku robaków reagujących na łagodne pola elektryczne ("elektrotaksję") wewnątrz kanałów mikroprzepływowych. Elektrotaksja mikroprzepływowa służy jako szybka, czuła, tania i skalowalna technika badań przesiewowych pod kątem czynników wpływających na zdrowie neuronów.

Elektrotaksja oparta na mikroprzepływach do analizy ilościowej na żądanie lokomocji Caenorhabditis elegans

Opisujemy metody badania aspektów amylopatii u robaka C. elegans. Pokazujemy, jak konstruować robaki wyrażające ludzkie Aβ42 w neuronach i jak testować ich funkcję w testach behawioralnych. Dalej pokazujemy, jak uzyskać pierwotne hodowle neuronów, które można wykorzystać do badań farmakologicznych.

System modelowy Caenorhabditis elegans do badania amylopatii

Prezentujemy konfigurację i protokół rejestracji zachowania, który umożliwia automatyczną analizę nicieni, preferencji Caenorhabditis elegans dla rozpuszczalnych związków w teście populacyjnym. W tym artykule opisano budowę komory behawioralnej, protokół testu behawioralnego i wykorzystanie oprogramowania do analizy wideo.

Zautomatyzowana analiza populacyjnego testu preferencji chemosensorycznej na podstawie populacji nicieni

Wcześniej opracowaliśmy protokoły dla Caenorhabditis elegans do tworzenia krótko- i długoterminowych wspomnień asocjacyjnych odpowiednio poprzez trening masowy i rozłożony w odstępach. Tutaj opisano szczegółowe protokoły warunkowania C. elegans poprzez parowanie 1-propanolu i kwasu solnego jako bodźców uwarunkowanych i bezwarunkowych, odpowiednio, w celu utworzenia awersyjnej pamięci asocjacyjnej.

Awersyjne uczenie się asocjacyjne i tworzenie pamięci poprzez połączenie dwóch substancji chemicznych w Caenorhabditis elegans

Tu przedstawiamy protokół do testowania uczenia się skojarzeniowego poprzez przeprowadzenie klasycznego uwarunkowywania u organizmu modelowego C. elegans. Paradygmat opiera się na łączeniu stężenia soli w środowisku z obecnością lub brakiem pokarmu, co zmienia ich chemotaksję w kierunku soli lub w jej kierunku przeciwnym.

Ocena uczenia się asocjacyjnego w chemotaksji nicienia Caenorhabditis elegans

Ten protokół ustanawia metody ekstrakcji i ilościowego określania reakcji na lotny feromon płciowy w C. elegans, zapewniając narzędzia do badania komunikacji chemicznej i trajektorii nawigacji.

Lotna ekstrakcja feromonów płciowych i test chemoatrakcji w Caenorhabditis elegans

Poznaj metodę oceny chemotaksji u Caenorhabditis elegans za pomocą prostego i taniego testu. Technika ta pozwala ilościowo zmierzyć odpowiedź robaków na różne związki chemiczne.

C. elegans Test chemotaktyksy

Przeglądaj więcej filmów