Name: Antygeny chroniły funkcjonalne czerwone krwinki przez szczepienie błonowe zwartych, hiperrozgałęzionych poligliceroli (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Poznaj modyfikację erytrocytów hiperrozgałęzionym poliglicerolem w celu ochrony antygenów powierzchniowych. Metoda obejmuje szczepienie błonowe i analizę cytometrią przepływową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane przez Kanadyjskie Służby Krwi (CBS) oraz Fundusz Partnerstwa Badawczego Kanadyjskich Instytutów Nauk o Zdrowiu (CIHR). Autorzy dziękują LMB Macromolecule Hub w Centrum Badań nad Krwią UBC za korzystanie z ich obiektów badawczych. Infrastruktura jest wspierana przez Kanadyjską Fundację Innowacji (CFI) oraz Fundację Michaela Smitha na rzecz Badań nad Zdrowiem (MSFHR). R. Chapanian jest stypendystą (CIHR/CBS) w dziedzinie transfuzjologii oraz stypendystą stażu podoktorskiego MSFHR. J.N. Kizhakkedathu jest laureatem nagrody MSFHR Career Investigator Scholar Award.

A. Modyfikacja hiperrozgałęzionego poliglicerolu (SS-HPG)
<ol>
 <li>Umieścić liofilizowany HPG 60 kDa (0,5 g, 0,0083 mmol) w kolbie okrągłodennej i wysuszyć przez noc w próżni w temperaturze 90 °C.</li>
 <li>Wstaw kolbę do lodówki do temperatury pokojowej i rozpuść wysuszony HPG w bezwodnej pirydynie (3 ml).</li>
 <li>Aby funkcjonalizować około ośmiu grup hydroksylowych na HPG z grupami karboksylowymi, dodaj katalityczną ilość dimetyloaminopirydyny (jedna kropla 5 mg/ml roztworu w pirydynie) do roztworu HPG. Do tej mieszaniny dodać bezwodnik bursztynowy (0,0067 g, 0,0664 mmol) rozpuszczony w 0,5 ml pirydyny kroplami przez 10 minut. Mieszaj mieszaninę przez noc w temperaturze pokojowej pod argonem.</li>
 <li>Wytrącić mieszaninę w 40 ml zimnego acetonu (4 °C) w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml i odwirować za pomocą wirówki Beckman J2-MC przy 27 000 x g przez 15 minut. Zdekantować supernatant i usunąć pozostałości acetonu przez przepłukanie argonem w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Aby aktywować grupy karboksylowe grupami bursztynianu sukcynimidylu (SS), należy rozpuścić funkcjonalizowany karboksylem HPG w 3 ml bezwodnego DMF. Dodać N-hydroksysukcynimid (0,0077 g, 0,0664 mmol) i N'-diizopropylokarbodimid (0,0084 g, 0,0664 mmol) do roztworu HPG i mieszać mieszaninę przez noc w temperaturze pokojowej pod argonem.</li>
 <li>Oczyść SS-HPG przez wytrącanie w zimnym acetonie.</li>
 <li>Usuń resztki acetonu przez przepłukanie argonem.</li>
 <li>Określić czystość zmodyfikowanego HPG oraz stopień funkcjonalizacji karboksylu i SS za pomocą analizy protonowej (1H)-NMR.</li>
</ol>
B. Pobieranie krwi pełnej i separacja czerwonych krwinek (RBC)
<ol>
 <li>Pobrać krew pełną (40% hematokrytu, 3 ml) od zdrowych dawców, którzy wyrazili na to zgodę, do probówki próżniowej z cytrynianem.</li>
 <li>Odwirować probówkę z cytrynianem o stężeniu 1 000 x g przez 4 minuty.</li>
 <li>Za pomocą pipety Pasteura usunąć supernatant zawierający osocze i płytki krwi oraz pośredni kożuszek zawierający białe krwinki i płytki krwi.</li>
 <li>Przenieść zapakowane erytrocyty (80% hematokrytu, 1,2 ml) do probówki wirówkowej Falcon o pojemności 12 ml i dodać bufor PBS (8 ml, pH = 8,0) w celu przepłukania krwinek czerwonych.</li>
 <li>Wymieszaj erytrocyty przez inwersję, aby uzyskać równomierny rozkład komórek.</li>
 <li>Odwirować probówkę Falcona o sile 1 000 x g przez 4 minuty i usunąć supernatant.</li>
 <li>Umyj erytrocyty PBS jeszcze dwa razy, powtarzając kroki 5 i 6.</li>
 <li>Umieścić wypełnione erytrocyty (100 μl) w 1,6 ml probówki Eppendorfa i dodać bufor PBS (300 μl, pH = 8,0) w celu uzyskania 20 % hematokrytu krwinek czerwonych.</li>
</ol>
C. Szczepienie HPG do RBC
<ol>
 <li>Natychmiast po wytrąceniu zmodyfikowanego HPG w acetonie w kroku A6 umieścić SS-HPG (150 mg) w szklanej fiolce (1 dram) i rozpuścić w buforze PBS (300 μl, pH = 8,0).</li>
 <li>Dodaj roztwór polimeru SS-HPG do 20% krwinek czerwonych przemytych hematokrytem, aby uzyskać końcową objętość 400 μl i stężenie SS-HPG w zakresie od 0,5 mM do 3 mM. Na przykład, aby przygotować erytrocyty potraktowane 0,5 mM SS-HPG, należy usunąć 36 μl PBS z przemytych RBC i umieścić 36 μl roztworu polimeru SS-HPG.</li>
 <li>Delikatnie przemieszać zawiesinę i umieścić probówki Eppendorfa na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej na 1 godzinę.</li>
 <li>Odwirować probówki Eppendorfa o stężeniu 1 000 x g przez 4 minuty i odpipetować supernatant.</li>
 <li>Dodać 1 ml PBS do przepłukania erytrocytów, odwirować i usunąć supernatant.</li>
 <li>Dodaj 1 ml soli fizjologicznej i umyj krwinki czerwone dwa razy, jak w kroku 5.</li>
 <li>Dodać 300 μl soli fizjologicznej do 100 μl upakowanych krwinek czerwonych (80% hematokrytu) do końcowego stężenia 20% hematokrytu.</li>
</ol>
D. Charakterystyka krwinek czerwonych modyfikowanych HPG
I. Liza za pośrednictwem dopełniacza
<ol>
 <li>Zebrać około 8 ml krwi pełnej od zdrowych dawców ludzkich do szklanej probówki z surowicą próżniową BD i pozostawić krew do krzepnięcia w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
 <li>Odwirować probówkę o masie 2 000 x g przez 10 minut i zebrać około 3 ml surowicy.</li>
 <li>Jeden mililitr surowicy umieszczono w łaźni wodnej o temperaturze 60 °C na 30 minut w celu przygotowania inaktywowanej termicznie surowicy.</li>
 <li>Dodaj 60 μl świeżej surowicy lub surowicy inaktywowanej termicznie do probówki Eppendorfa, która zawiera 60 μl 20% krwinek czerwonych modyfikowanych HPG lub niemodyfikowanych krwinek czerwonych.</li>
 <li>Inkubować erytrocyty przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
 <li>Aby określić ilościowo ilość hemoglobiny w zawiesinie komórek, umieść 5,9 μl 20% hematokrytu krwinek czerwonych zmodyfikowanych HPG lub niezmodyfikowanych komórek w trzech egzemplarzach na płytce 96-dołkowej. Dodać 294 μl odczynnika Drabkina (odczynnika, który służy do ilościowego oznaczania ilości hemoglobiny spektrofotomerycznie). Wymieszać komórki z odczynnikiem Drabkina, pipetując i pipetując. Zmierz absorbancję cyjanodywatu hemoglobiny przy długości fali 540 nm za pomocą czytnika płytek SPECTRA MAX 190.</li>
 <li>Aby określić ilościowo ilość hemoglobiny w supernatancie, odwiruj komórki przy 13 000 x g przez 1 minutę. Umieść 50 μl supernatantu w trzech kroplach na 96-dołkowej płytce. Dodać 250 μl odczynnika Drabkina. Wymieszać komórki z odczynnikiem Drabkina, pipetując i pipetując. Zmierz absorbancję cyjanodywatu hemoglobiny przy długości fali 540 nm za pomocą czytnika płytek SPECTRA MAX 190.</li>
 <li>Określić ilościowo ilość zlizowanych komórek na podstawie stosunku hemoglobiny w supernatancie (etap 7) do całkowitej hemoglobiny w próbce (krok 6) 8, 11, 12.</li>
</ol>
II. Kamuflaż głównych i drugorzędnych antygenów za pomocą kart MTS
<ol>
 <li>Umieścić 50 μl zmodyfikowanych HPG krwinek czerwonych (10 % hematokrytu) w probówce Eppendorfa, odwirować przy 1 000 x g przez 1 minutę i usunąć supernatant.</li>
 <li>Dodać 110 μl rozcieńczalnika MTS do osadu komórkowego i homogenizować zawiesinę komórkową przez pipetowanie i odpipetowanie.</li>
 <li>Dodać 11 μl zawiesiny komórkowej do każdej mini kolumny żelowej. Unikaj dotykania żelu podczas dodawania.</li>
 <li>Umieść karty MTS w uchwycie na karty wirówki i wiruj przy 156 x g przez 6 minut.</li>
 <li>Ochronę antygenów powierzchniowych określa się na podstawie lokalizacji erytrocytów w mini kolumnie żelowej, na podstawie opisu producenta.</li>
</ol>
III. Pomiary wodnego podziału dwufazowego
<ol>
 <li>Przygotować dwufazowy system separacji Dekstran 500 kDa/PEG 8 kDa składający się z (5% dekstranu 500k, 4% PEG 8K, 150 mM NaCl, 10 mM fosforanu) zgodnie z 13.</li>
 <li>Wirować przy 433 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej w celu uzyskania układu dwufazowego (dekstran na dnie).</li>
 <li>Ostrożnie oddziel te dwie fazy.</li>
 <li>Porcję 1,0 ml górnej fazy PEG do oznakowanej probówki (z wklęsłym dnem), dodać 20 μl 20% krwinek czerwonych modyfikowanych HPG hematokrytem i delikatnie wymieszać komórki, trzepiąc.</li>
 <li>Dodać 0,5 ml górnej fazy zawierającej komórki do 0,5 ml dolnej fazy i delikatnie wymieszać system, trzepiąc.</li>
 <li>Umieść rurkę na stole na ~ 2 minuty, aby system się oddzielił, i określ położenie komórek w systemie. Lokalizacja erytrocytów (w górnej fazie PEG, w dolnej fazie dekstranu lub w obu) zależy od stopnia modyfikacji i masy cząsteczkowej HPG.</li>
</ol>
IV. Pomiary kruchości osmotycznej
<ol>
 <li>Przygotować roztwory NaCl o stężeniach w zakresie od 0 do 0,9 (w/v) %.</li>
 <li>Umieścić 0,4 ml roztworów NaCl w 1,5 ml probówkach Eppendorfa.</li>
 <li>Dodaj 20 μl erytrocytów (20% hematokrytu) do roztworów NaCl.</li>
 <li>Dokładnie wymieszać komórki przez odwrócenie i umieścić je w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 30 minut.</li>
 <li>Ostrożnie zawieś komórki przez odwrócenie. Pobrać 50 μl zawiesiny RBC i dodać ją do 1 ml odczynnika Drabkina, umieszczonego w kuwecie. Wymieszać komórki z odczynnikiem Drabkina, pipetując i pipetując. Zmierzyć absorbancję cyjanoderywatu hemoglobiny przy długości fali 540 nm za pomocą czytnika UV/VIS BECKMAN COULTER DU 730.</li>
 <li>Aby określić ilościowo ilość hemoglobiny w supernatancie, odwirować komórki przy 1000 x g przez 1 minutę. Dodać 200 μl supernatantu do 1 ml odczynnika Drabkina w kuwecie. Wymieszać komórki z odczynnikiem Drabkina, pipetując i pipetując. Zmierzyć absorbancję cyjanoderywatu hemoglobiny przy długości fali 540 nm za pomocą czytnika UV/VIS BECKMAN COULTER DU 730.</li>
 <li>Obliczyć ilość komórek poddanych lizie w różnych roztworach NaCl ze stosunku ilości hemoglobiny w supernatancie (krok 6) do całkowitej ilości hemoglobiny w zawiesinie komórki (krok 5).</li>
</ol>
V. Pomiary cytometrii przepływowej - Ochrona antygenu Rhesus-D (RhD)
<ol>
 <li>Dodać 5 μl kontrolnych lub zmodyfikowanych HPG erytrocytów (20% hematokrytu) w trzech powtórzeniach do buforu PBS uzupełnionego 0,5% BSA, do całkowitej objętości 25 μl.</li>
 <li>Dodać 25 μl monoklonalnego anty-Rh D (RhD) FITC zakupionego w Quotient Biodiagnostics (PA, USA).</li>
 <li>Inkubować mieszaninę przez 30 minut w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.</li>
 <li>Przemyć mieszaninę dwukrotnie 1,5 ml buforu PBS. Wirować przy 1 000 x g przez 1 minutę w celu usunięcia supernatantu.</li>
 <li>Zawiesić erytrocyty w 1 ml soli fizjologicznej i przenieść zawiesinę do probówki do cytometrii przepływowej BD o przepływie 4 ml.</li>
 <li>Analizuj za pomocą cytometru przepływowego FACSCanto II, uzyskując 5,000 zdarzeń na bramce sterującej RBC i wykorzystuj całe zdarzenia do analizy.</li>
</ol>
VI. Pomiary cytometrii przepływowej - Ekspresja CD47
<ol>
 <li>Dodać 1,54 μl kontrolnych lub zmodyfikowanych HPG krwinek czerwonych (20 % hematokrytu) w trzech powtórzeniach do buforu PBS uzupełnionego 0,5% BSA, do całkowitej objętości 44 μl.</li>
 <li>Dodać 6 μl mysiej anty-ludzkiej CD47 znakowanej fikoerytryną (PE) zakupionej w BD Biosciences (NJ, USA).</li>
 <li>Inkubować mieszaninę przez 30 minut w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.</li>
 <li>Przemyć mieszaninę 1,5 ml buforu PBS dwa razy. Wirować przy 1 000 x g przez 1 minutę w celu usunięcia supernatantu.</li>
 <li>Zawiesić erytrocyty w 1 ml soli fizjologicznej i przepuścić przez igłę 26 G 5/8, aby zminimalizować zbrylanie się komórek.</li>
 <li>Przenieść zawiesinę do probówki do cytometrii przepływowej BD o pojemności 4 ml.</li>
 <li>Analizuj za pomocą cytometru przepływowego FACSCanto II, uzyskując 10 000 zdarzeń na bramce sterującej RBC.</li>
</ol>

<ol><li>Bradley, A. J., Murad, K. L., Regan, K. L., Scott, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+consequences+of+linker+chemistry+and+polymer+size+on+stealth+erythrocytes%3A+size+does+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Biophysical consequences of linker chemistry and polymer size on stealth erythrocytes: size does matter.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1561 (2), 147-158 (2002).</li>
<li>Murad, K. T., Mahany, K. L., Brugnara, C., Kuypers, F. A., Eaton, J. W., Scott, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+consequences+of+antigenic+modulation+of+red+blood+cells+with+methoxypoly%28ethylene+glycol%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Structural and functional consequences of antigenic modulation of red blood cells with methoxypoly(ethylene glycol.</a> Blood. 93 (6), 2121-2127 (1999).</li>
<li>Scott, M. D., Murad, K. L., Koumpouras, F., Talbot, M., Eaton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+camouflage+of+antigenic+determinants%3A+Stealth+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Chemical camouflage of antigenic determinants: Stealth erythrocytes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94 (14), 7566-7571 (1997).</li>
<li>Daniels, G., Reid, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+groups%3A+the+past+50+years%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Blood groups: the past 50 years.</a> Transfusion. 50 (2), 281-289 (2010).</li>
<li>Murad, K. L., Gosselin, E. J., Eaton, J. W., Scott, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stealth+cells%3A+Prevention+of+major+histocompatibility+complex+class+II-mediated+T-cell+activation+by+cell+surface+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Stealth cells: Prevention of major histocompatibility complex class II-mediated T-cell activation by cell surface modification.</a> Blood. 94 (6), 2135-2141 (1999).</li>
<li>Kainthan, R. K., Hester, S. R., Levin, E., Devine, D. V., Brooks, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+biological+evaluation+of+high+molecular+weight+hyperbranched+polyglycerols%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">In vitro biological evaluation of high molecular weight hyperbranched polyglycerols.</a> Biomaterials. 28 (31), 4581-4590 (2007).</li>
<li>Kainthan, R. K., Janzen, J., Levin, E., Devine, D. V., Brooks, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatibility+testing+of+branched+and+linear+polyglycidol%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Biocompatibility testing of branched and linear polyglycidol.</a> Biomacromolecules. 7 (3), 703-709 (2006).</li>
<li>Chapanian, R., Constantinescu, I., Brooks, D. E., Scott, M. D., Kizhakkedathu, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+circulation%2C+clearance%2C+and+biodistribution+of+polyglycerol+grafted+functional+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">In vivo circulation, clearance, and biodistribution of polyglycerol grafted functional red blood cells.</a> Biomaterials. 33 (10), 3047-3057 (2012).</li>
<li>Chapanian, R., Constantinescu, I., Rossi, N. A. A., Medvedev, N., Brooks, D. E., Scott, M. D., Kizhakkedathu, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+polymer+architecture+on+antigens+Camouflage%2C+CD47+protection+and+complement+mediated+lysis+of+surface+grafted+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Influence of polymer architecture on antigens Camouflage, CD47 protection and complement mediated lysis of surface grafted red blood cells.</a> Biomaterials. 33 (31), 7871-7883 (2012).</li>
<li>Rossi, N. A. A., Constantinescu, I., Brooks, D. E., Scott, M. D., Kizhakkedathu, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+cell+surface+polymer+grafting+in+concentrated+and+nonreactive+aqueous+polymer+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Enhanced cell surface polymer grafting in concentrated and nonreactive aqueous polymer solutions.</a> J. Am. Chem. Soc. 132 (10), 3423-3430 (2010).</li>
<li>Rossi, N. A. A., Constantinescu, I., Kainthan, R. K., Brooks, D. E., Scott, M. D., Kizhakkedathu, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+blood+cell+membrane+grafting+of+multi-functional+hyperbranched+polyglycerols%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Red blood cell membrane grafting of multi-functional hyperbranched polyglycerols.</a> Biomaterials. 31 (14), 4167-4178 (2010).</li>
<li>Muzykantov, V. R., Smirnov, M. D., Domogatsky, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemolytic+complement+activity+assay+in+microtitration+plates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+App.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Hemolytic complement activity assay in microtitration plates.</a> J. App. Biochem. 7 (3), 223-227 (1985).</li>
<li>Walter, H., Brooks, D. E., Fisher, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalter%2C+H+%22Partitioning+in+aqueous+two-phase+systems%3A+theory%2C+methods%2C+uses%2C+and+applications+to+biotechnology%22">Partitioning in aqueous two-phase systems: theory, methods, uses, and applications to biotechnology</a>. , Academic Press Inc. London. (1985).</li>
<li>Rossi, L., Serafini, S., Pierige, F., Antonelli, A., Cerasi, A., Franternale, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythrocyte-based+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Erythrocyte-based drug delivery.</a> Expert Opin. Drug Deliv. 2 (2), 311-322 (2005).</li>
<li>Walter, H., Krob, E. J., Brooks, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+surface+properties+other+than+charge+involved+in+cell+separation+by+partition+in+polymer%2C+aqueous+2-phase+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Membrane surface properties other than charge involved in cell separation by partition in polymer, aqueous 2-phase systems.</a> Biochemistry. 15 (14), 2959-2964 (1976).</li>
<li>Muzykantov, V. R., Murciano, J. C., Taylor, R. P., Atochina, E. N., Herraez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+complement-mediated+elimination+of+red+blood+cells+modified+with+biotin+and+streptavidin%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Regulation of the complement-mediated elimination of red blood cells modified with biotin and streptavidin.</a> Anal Biochem. 241 (1), 109-119 (1996).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Erytrocyty od dawców uniwersalnych mają ogromny potencjał w zwiększaniu dostępności krwi i bezpieczeństwa w terapii transfuzjologicznej. Erytrocyty są również uważane za obiecujące nośniki leków ze względu na ich długie krążenie i nieodłączną biokompatybilność 14, 15. Eksperymenty przedstawione w niniejszej pracy oceniają charakterystykę in vitro krwinek czerwonych modyfikowanych HPG. Właściwości in vitro i krążenie in vivo krwinek czerwonych modyfikowanych HPG były badane w naszej ...

<table><tbody><tr><td>Glycidol </td><td>Sigma Aldrich</td><td></td> <td>(ON, Kanada) </td></tr><tr><td>Trimethylolpropan </td><td>Fluka</td><td></td> <td>(ON, Kanada) </td></tr><tr><td>Metylan potasu</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td> <td>(ON, Kanada)</td></tr> <tr><td>Bezwodna pirydyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td> <td>(ON, Kanada)</td></tr> <tr><td>4-dimetyloaminopirydyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td> <td>(ON, Kanada)</td></tr> <tr><td>Bursztyn bezwodnik</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td> <td>(ON, Kanada)</td></tr> <tr><td>Aceton</td><td>Fisher Scientific</td><td></td> <td>(ON, Kanada)</td></tr> <tr><td>Bezwodny dimetyloformamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td> <td>(ON, Kanada)</td></tr> <tr><td>N-hydroksysukcynimid </td><td>Sigma Aldrich</td><td></td> <td>(ON, Kanada) </td></tr><tr><td>N,N'-diizopropylokarbodimid </td><td>Sigma Aldrich</td><td></td> <td>(ON, Kanada) </td></tr><tr><td>Karty MTS</td><td></td><td></td><td>Karty Micro Typing System (MTS) (FL, USA)</td></tr><tr><td>Dekstran 500 kDa</td><td>Pharmacia Fine Chemicals</td><td></td> <td>(Szwecja)</td></tr><tr><td>PEG 8 kDa</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td> <td>(ON, Kanada)</td></tr><tr><td>FITC monoklonalny anty-Rh D (RhD)</td><td>Biodiagnostyka</td><td></td> ilorazowa <td>(PA, USA)</td>PE</tr> <tr><td>monoklonalny anty-CD47 </td><td>BD Biosciences</td><td></td> <td>(NJ, USA) </td></tr><tr><td>Drabkin's odczynnik </td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>(ON, Kanada)</td></tr><tr><td colspan="4">Table. Chemikalia i odczynniki stosowane do szczepienia polimerów HPG na membranę RBC i ich analiza.</td></tr></tbody></table>

antygeny chroniły funkcjonalne czerwone krwinki przez szczepienie błonowe zwartych, hiperrozgałęzionych poligliceroli

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Transfuzja czerwonych krwinek (RBC) jest niezbędna w leczeniu wielu ostrych i przewlekłych problemów medycznych, takich jak talasemia większa i niedokrwistość sierpowatokrwinkowa 1-3. Ze względu na obecność wielu antygenów na powierzchni erytrocytów (~308 znanych antygenów 4), pacjenci w przewlekłej terapii transfuzji krwi wytwarzają alloprzeciwciała z powodu braku dopasowania mniejszych antygenów na przetoczonych krwinkach czerwonych 4, 5. Szczepienie hydrofilowych polimerów, takich jak glikol polietylenowy (PEG) i hiperrozgałęziony poliglicerol (HPG), tworzy warstwę wykluczającą na błonie RBC, która zapobiega interakcji przeciwciał z antygenami powierzchniowymi bez wpływu na przechodzenie małych cząsteczek, takich jak tlen, glukoza i jony3. Obecnie nie jest dostępna żadna metoda wytwarzania uniwersalnych czerwonych komórek dawcy krwi, częściowo ze względu na zniechęcające wyzwanie, jakim jest obecność dużej liczby antygenów (opartych na białkach i węglowodanach) na powierzchni krwinek czerwonych, a opracowanie takich metod znacznie poprawi bezpieczeństwo transfuzji oraz radykalnie poprawi dostępność i wykorzystanie krwinek czerwonych. W niniejszym raporcie przedstawiono eksperymenty, które są wykorzystywane do opracowania funkcjonalnych erytrocytów chronionych antygenem poprzez szczepienie błony HPG i ich charakterystykę. HPG są wysoce biokompatybilnymi zwartymi polimerami 6, 7 i oczekuje się, że będą zlokalizowane w glikokaliksie komórkowym otaczającym błonę lipidową 8, 9 i maskują antygeny powierzchniowe RBC10, 11.

Zamaskowanie antygenu Rhesus D oraz białka powierzchniowego RBC CD47 określono ilościowo metodą cytometrii przepływowej z użyciem znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał monoklonalnych, a reprezentatywny wynik przedstawiono na Rysunku 1. W przypadku RBC przeszczepionych HPG (kolor szary) natężenie sygnału zmalało (pik przesunął się w lewo) w porównaniu do kontrolnych RBC (kolor czerwony i zielony), co wskazuje na zmniejszenie wiązania przeciwciał z powierzchnią komórki, świadczące o maskowaniu białek po...

Przedstawiono modyfikację błony komórkowej czerwonych krwinek (RBC) za pomocą hiperrozgałęzionego poliglicerolu (HPG). Zmodyfikowane erytrocyty charakteryzowały się wodnym dwufazowym podziałem, kruchością osmotyczną i lizą za pośrednictwem dopełniacza. Kamuflaż białek powierzchniowych i antygenów oceniano za pomocą kart do fenotypowania krwi za pomocą cytometrii przepływowej i systemu mikrotypowania (MTS).

Antygeny chroniły funkcjonalne czerwone krwinki przez szczepienie błonowe zwartych, hiperrozgałęzionych poligliceroli

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Celem tej procedury jest przygotowanie funkcjonalnych krwinek czerwonych chronionych przed antygenem. Osiąga się to poprzez przygotowanie polimeru HPG w drugim etapie. HPG jest funkcjonalizowany poprzez dodanie grup bursztynianu sukcynylu.Następnie krew pełną od zdrowych dawców przepłukuje się solą fizjologiczną w celu oddzielenia czerwonych krwinek. W ostatnim etapie wyizolowane krwinki czerwone są traktowane funkcjonalizowanym HPG. Ostatecznie ochrona antygenów powierzchniowych na zmodyfikowanych komórkach przez funkcjonalizowany HPG jest oznaczana za pomocą cytometrii przepływowej.Główną zaletą naszej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że koniugacje HPG dają funkcjonalne czerwone krwinki, które krążą normalnie. Implikacje tej techniki rozciągają się na przewlekłą transfuzję krwi. Po modyfikacji HPG czerwone krwinki mają zmniejszoną antygenowość i normalne krążenie in vivo.Procedurę zademonstruje dr Ian, doktor habilitowany, kolega i stały nauczyciel, technik w moim laboratorium Trzy dni przed pobraniem pełnej krwi od zdrowych dawców, którzy wyrazili zgodę, suche liofilizowane HPG w kolbie z okrągłym dnem przez noc i próżnia w temperaturze 90 stopni Celsjusza. Następnego ranka wyjąć kolbę z łaźni olejowej i pozostawić do osiągnięcia temperatury pokojowej, a następnie rozpuścić wysuszony HPG w dwóch mililitrach bezwodnej pirydyny. Następnie dodaj katalityczną ilość dimetyloaminoparydyny do roztworu HPG, aby sfunkcjonalizować około ośmiu grup hydroksylowych na HPG z grupami karboksylowymi.W ciągu następnych 10 minut dodać wodorek Sica rozpuszczony w 0,5 mililitra, perynę kroplami do roztworu, a następnie mieszać mieszaninę przez noc w temperaturze pokojowej pod Argonne następnego dnia wytrącić mieszaninę HPG w 40 mililitrach w czterech stopniach Celsjusza. Aceton w 50 mililitrach do probówki wirówkowej przez 15 minut w temperaturze 27 000 razy G w czterech stopniach Celsjusza. Następnie zdekantować supinat i przepłukać osad argonnem w temperaturze pokojowej, aby usunąć wszelkie pozostałości acetonu.Aktywacja grup karboksylowych za pomocą grup bursztynianowych Saxon i Mial. Grupy rozpuszczają funkcjonalizowany karboksylem HPG w dwóch mililitrach bezwodnego DMF. Następnie dodać NHS i Diop profile CARBIMIDE do roztworu HPG i mieszać mieszaninę przez noc w temperaturze pokojowej pod Argonne.Następnego ranka przystąp do oczyszczania S-S-H-P-G przez wytrącanie w zimnym acetonie. Następnie przepłukanie argonnem w celu usunięcia resztek acetonu. Następnie określić czystość zmodyfikowanego HPG oraz stopień funkcjonalizacji bursztynianu karboksylu i sukcynylu za pomocą analizy protonowego NMR.Po uzyskaniu świadomej zgody należy pobrać krew od zdrowego dawcy podczas oceny czystości S-S-H-P-G. Odwirować krew pełną dawcy przez cztery minuty w temperaturze 1000 razy G i temperaturze pokojowej. Użyj pipety do pasty, aby usunąć supinat i kożuch, a następnie przenieś upakowane czerwone krwinki do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 mililitrów.Dodaj PBS do komórek, a następnie wymieszaj przez odwrócenie, aby uzyskać równomierny rozkład komórek. Następnie odwirować komórki w PB S3 razy, usuwając natant SUP. Po każdym praniu przenieś granulat RBC pact do 1,6 mililitrowej probówki eend orph i dodaj 300 mikrolitrów PBS, aby zwiększyć objętość do 400 mikrolitrów natychmiast po potwierdzeniu czystości zmodyfikowanego HPG przenieś 150 miligramów S-S-H-P-G do jednej fiolki Dr.Glass.Po zważeniu polimeru dodaj 300 mikrolitrów PBS do S-S-H-P-G i zwiruj go, aby rozpuścić polimer. Następnie dodaj roztwór polimeru S-S-H-P-G do 20% krwinek czerwonych przemytych hemidem. Następnie delikatnie zwirować zawiesinę, a następnie umieścić mieszaninę HPG czerwonych krwinek na wytrząsarce orbitalnej o temperaturze pokojowej.Po godzinie przepłukać roztwór czterokrotnie PBS i solą fizjologiczną, za każdym razem usuwając supinat. Następnie dodaj 300 mikrolitrów soli fizjologicznej do końcowego 100 mikrolitra palt upakowanych czerwonych krwinek do końcowego stężenia 20% hematokrytu. Teraz pozwól, aby osiem mililitrów pełnych krwinek dawcy krzepło przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Następnie po odwirowaniu komórek zbierz około trzech mililitrów surowicy, przenieś jeden mililitr surowicy do łaźni wodnej o temperaturze 60 stopni Celsjusza. Aby przygotować surowicę inaktywowaną na ciepło. Po 30 minutach dodaj 60 mikrolitrów świeżej surowicy i 60 mikrolitrów surowicy inaktywowanej termicznie do oddzielnych probówek eph.Każdy zawiera 60 mikrolitrów 20% hematokrytu zmodyfikowanych HPG czerwonych krwinek. Następnie dodaj 60 mikrolitrów tego samego do probówek zawierających taką samą objętość niezmodyfikowanych czerwonych krwinek i inkubuj wszystkie próbki czerwonej krwi przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby określić ilościowo ilość hemoglobiny w zawiesinach komórek, najpierw umieść 5,9 mikrolitra każdej z próbek w trzech egzemplarzach na 96-dołkowej płytce.Następnie wymieszaj każdą próbkę z 294 mikrolitrami odczynnika Drab Kins i odczytaj absorbancję pochodnej hemoglobiny sano za pomocą spektrofotometru na 540 nanometrach, aby określić ilościowo ilość hemoglobiny w wirówce supinacyjnej, resztę próbek komórek, a następnie płytkę 50 mikrolitrów każdego z supinianów w trzech egzemplarzach na 96-dołkowej płytce. Po wymieszaniu komórek z 250 mikrolitrami odczynnika Drab Kins, zmierz absorbancję pochodnej hemoglobiny ano, jak właśnie pokazano na tym etapie. Zacznij od odwirowania 50 mikrolitrów krwinek czerwonych modyfikowanych HPG z 10% hematokrytem w probówce eend orph.Po odrzuceniu supernatantu S w 110 mikrolitrach rozcieńczalnika MTS do osadu komórkowego i odpipetowania roztworu kilka razy w górę iw dół w celu homogenizacji zawiesiny komórek. Teraz załaduj 11 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdej kolumny mini żelu. Następnie umieść karty MTS w uchwycie na karty wirówki i obracaj karty przez sześć minut z prędkością 156 razy G. Ochronę antygenów powierzchniowych można następnie określić na podstawie lokalizacji czerwonych krwinek w mini kolumnach żelowych zgodnie z opisem producenta.Na tym etapie, po skonfigurowaniu dwufazowego systemu separacji dekstranu PEG, należy odwirować roztwór dekstranu PEG, aby uzyskać system dwufazowy. Następnie ostrożnie przesyp jeden mililitr górnej fazy PEG do oznakowanej probówki z wklęsłym dnem. Dodaj 20 mikrolitrów 20 do 30% hemożnych krypt HPG zmodyfikowanych RBC do probówki, mieszając zawiesinę komórkową przez delikatne trzepanie.Następnie dodaj 0,5 mililitra komórki zawierającej górną fazę do 0,5 mililitra dolnej powierzchni dekstranu, a następnie ponownie wymieszaj system z delikatniejszym trzepaniem. Teraz połóż rurkę na ławce, aby system oddzielił się po dwóch minutach. Czerwone krwinki powinny lokalizować się w górnej fazie PEG, w dolnej fazie dextra lub w obu czerwonych krwinkach.Derywatyzowane z wysokimi poziomami HPG znajdują się w górnej fazie PEG w celu oceny ochrony antygenów powierzchniowych krwinek czerwonych za pomocą analizy cytometrii przepływowej. Najpierw dodaj 20 mikrolitrów soli fizjologicznej do trzech probówek z faktami dla każdej próbki. Następnie dodać do probówek po pięć mikrolitrów kontrolnych niezmodyfikowanych i zmodyfikowanych HPG czerwonych krwinek w trzech egzemplarzach.Następnie dodaj 25 mikrolitrów monoklonalnego anty reus D fit C do każdej probówki i inkubuj próbki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w łaźni wodnej. Po 30 minutach umyj próbki w 1,5 mililitra soli fizjologicznej, dwukrotnie usuwając supinat za każdym razem po drugim myciu, Reese zgina czerwone krwinki w jednym mililitrze soli fizjologicznej. Na koniec uzyskaj co najmniej 5 000 zdarzeń na bramce kontrolnej czerwonych krwinek, aby przeanalizować ochronę antygenów powierzchniowych.Na tym histogramie normalna ekspresja e-antygenu Resus reprezentowanego przez zielony pik na niezmodyfikowanych czerwonych krwinkach od zdrowych ludzkich dawców jest pokazana, gdy czerwone krwinki są przeszczepiane do HPG, intensywność sygnału e-antygenu Reese'a maleje, o czym świadczy przesunięcie ekspresji w lewo oznaczone szarym szczytem. Modyfikacja czerwonych krwinek przez HPG również kamufluje ekspresję CD 47, jak wykazano przez przesunięcie w lewo szarego piku obserwowane również na tym histogramie, co wskazuje, że maskowanie białek powierzchniowych następuje w obecności HPG. Po tej procedurze, modyfikator HPG, komórki krwi mogą mieć zastosowanie w transfuzji krwi i dostarczaniu leków za pośrednictwem komórek.Po obejrzeniu tego filmu lepiej zrozumiesz, w jaki sposób polimery mogą być sprzężone z czerwonymi krwinkami w celu modyfikacji antygenowości i skonstruowania bazy do dostarczania leków.

antigens-protected-functional-red-blood-cells-membrane-grafting

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Antygeny chroniące funkcjonalne czerwone krwinki poprzez wszczepienie membrany z użyciem zwartych, hiperrozgałęzionych poligliceroli

Niniejsza praca opisuje prostą technikę indukowania anergii specyficznej dla alloantygenów w ludzkich mononuklearnych komórkach krwi obwodowej. Technikę tę można zastosować klinicznie w celu generowania niealloreaktywnych komórek dawcy. Infuzja tych komórek mogłaby poprawić rekonstrukcję immunologiczną i zmniejszyć toksyczność po allogenicznej transplantacji hematopoetycznych komórek macierzystych.

Indukcja anergii specyficznej dla alloantygenu w ludzkich mononuklearnych komórkach krwi obwodowej poprzez stymulację alloantygenem z blokadą sygnału kostymulującego

Opisano nową metodę indukcji i ekspansji antygenowo swoistych limfocytów T, niezależną od komórek dendrytycznych (DC). Sztuczne komórki prezentujące antygen (aAPC) oparte na HLA A2-Ig są ładowane peptydami ograniczonymi przez HLA-A2 w celu efektywnej ekspansji CTL o różnej swoistości antygenowej. Technologia ta wykazuje duży potencjał w zastosowaniu w immunoterapii adoptywnej opartej na CTL.

Sztuczne komórki prezentujące antygen oparte na HLA-Ig dla efektywnej ekspansji ludzkich CTL ex vivo

Konstrukcje typu Function-Spacer-Lipid (FSL) pozwalają na modyfikację charakterystyki powierzchni żywych komórek i wirionów bez utraty ich żywotności. Metoda ta wymaga jedynie prostego kontaktu roztworu konstrukcji FSL z komórką lub wirionem, co prowadzi do spontanicznej i stabilnej inkorporacji w powierzchnię.

Konstrukcje FSL: prosta metoda modyfikowania powierzchni komórek/wirionów za pomocą szeregu markerów biologicznych bez wpływu na ich żywotność

Kontakt krwi z polimerowymi kanałami krwionośnymi inicjuje reakcję ciała obcego, która jest związana z klinicznymi powikłaniami. Tutaj opisano Aparat Pętli Chandlera, eksperymentalne narzędzie naśladujące perfuzję krwi przez te przewody. Wyrostek rekombinowanego CD47 powoduje zmniejszenie dowodów reakcji ciała obcego na tych przewodach.

Zastosowanie aparatury pętlowej Chandlera ex vivo do oceny biokompatybilności zmodyfikowanych polimerowych przewodów krwiopochodnych

Ten artykuł opisuje metodę generowania i rozmnażania klonów ludzkich limfocytów T, które specyficznie reagują na zdefiniowany alloantygen. Protokół ten można dostosować do klonowania ludzkich limfocytów T specyficznych dla różnych ligandów peptyd-MHC.

Wytwarzanie ludzkich limfocytów T specyficznych dla alloantygenu z krwi obwodowej

Makrofagi to plastyczne komórki układu krwiotwórczego, które odgrywają kluczową rolę w ochronnej odporności i homeostazie. W tym raporcie opisujemy zoptymalizowane techniki in vitro do fenotypowego i funkcjonalnego charakteryzowania makrofagów regulatorowych naciekających przeszczepy, które gromadzą się w przeszczepionym narządzie w warunkach tolerogennych.

Charakterystyka funkcjonalna makrofagów regulatorowych, które hamują odporność reaktywną przeszczepu

Tutaj prezentujemy protokół indukcji tolerancji w transplantacji i oceniamy in vitro i in vivo zdolność tłumienia różnych podzbiorów komórek od biorcy oraz status immunologiczny biorcy wobec dawcy lub egzogennych antygenów.

Ocena in vitro i in vivo aktywności supresyjnej komórek T, B i mieloidalnych oraz odpowiedzi humoralnych u biorców przeszczepów

Kwantyfikacja komórek pochodzących od dawcy jest wymagana do monitorowania wszczepienia po przeszczepie komórek macierzystych u pacjentów z hemoglobinopatiami. Połączenie sortowania komórek opartego na cytometrii przepływowej, testu tworzenia kolonii i późniejszej analizy krótkich powtórzeń tandemowych można zastosować do oceny proliferacji i różnicowania komórek progenitorowych w przedziale erytroidalnym.

Wykrywanie resztkowych erytroidalnych komórek progenitorowych dawcy po przeszczepieniu krwiotwórczych komórek macierzystych u pacjentów z hemoglobinopatiami

Ten protokół opisuje usuwanie i oczyszczanie komórek śródbłonka tętnicy płucnej (PAEC), które przylegają do końcówek balonów cewników Swan-Ganz, podczas gdy są zaklinowane w tętnicy płucnej podczas cewnikowania prawego serca i pozostają przylegające do opróżnionego balonu po usunięciu z ciała pacjenta.

Pobieranie komórek śródbłonka z końcówek balonów cewników Swan-Ganz po cewnikowaniu prawego serca

Choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi jest poważnym powikłaniem po allogenicznym przeszczepie szpiku kostnego. Komórki dendrytyczne odgrywają kluczową rolę w patogenezie choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi. W niniejszym artykule opisano nowatorską platformę przeszczepu szpiku kostnego w celu zbadania roli komórek dendrytycznych w rozwoju choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi i efektowi przeszczep przeciwko białaczce.

Platforma do przeszczepiania szpiku kostnego w celu zbadania roli komórek dendrytycznych w chorobie przeszczep przeciwko gospodarzowi

Opisujemy model heterotopowego przeszczepu serca w jamie brzusznej u szczurów, sugerując modyfikacje obecnych strategii, które prowadzą do uproszczonego podejścia chirurgicznego. Dodatkowo opisujemy nowatorski model odrzucania przeszczepu poprzez wstrzyknięcie do ucha ważnych komórek mięśnia sercowego, co pozwala na dalsze analizy immunologiczne przeszczepu u szczurów.

Model immunologiczny do heterotopowego przeszczepu komórek serca i mięśnia sercowego u szczurów

Poznaj modyfikację erytrocytów hiperrozgałęzionym poliglicerolem w celu ochrony antygenów powierzchniowych. Metoda obejmuje szczepienie błonowe i analizę cytometrią przepływową.

Antygeny chroniły funkcjonalne czerwone krwinki przez szczepienie błonowe zwartych, hiperrozgałęzionych poligliceroli

Przeglądaj więcej filmów