Wytwarzanie i odzyskiwanie sferoid β-komórkowych z hydrożeli peptydowych PEG o skokowym wzroście

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie technik kapsułkowania komórek w fotopolimeryzowanych hydrożelach, a także późniejsze odzyskanie naturalnie powstałego pH komórek beta z wrażliwych na enzymy hydrożeli z charakterystyki biologicznej. Osiąga się to poprzez najpierw zmieszanie sześciu komórek beta z kołkiem przedramienia, macerem norbertyny i wrażliwym na enzymy środkiem sieciującym peptydy. Komórki są następnie otaczane za pomocą polimeryzacji za pośrednictwem wolnych rodników, a następnie fotopolimeryzacji w celu utworzenia hydrożelu.

Drugim krokiem jest hodowla zamkniętych komórek w hydrożelach w inkubatorze dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po tym, jak komórki rozmnożą się w celu utworzenia agregatów, hydrożele obciążone komórkami są płukane roztworem buforowym, a następnie inkubowane w roztworze trypsyny chia. Pod delikatnym wstrząsaniem w celu erozji żelu, odzyskane kruszywa są starannie myte w celu usunięcia roztworu enzymatycznego i zerodowanego polimeru.

Ostatecznie te agregaty komórkowe można wykorzystać do analizy strukturalnej i funkcjonalnej. Tak więc główną zaletą przyrostu krokowego, a następnie fotochemii jest to, że jego warunki reakcji są łagodniejsze niż w przypadku tradycyjnego wzrostu łańcucha PEG dde. Dlatego te hydrożele zapewniają doskonałe mikrośrodowisko dla wielu typów komórek, w tym komórek beta trzustki.

Implikacje tej techniki rozciągają się na różne terapie komórkowe, ponieważ ten system DIN zapewnia doskonałe mikrośrodowisko do eksperymentów in vitro i doskonałą platformę do dostarczania komórek. Podczas gdy syntetyzujemy peptydy używane w tych eksperymentach w naszym laboratorium, istnieje wiele firm, od których można uzyskać opisane przez nas peptydowe środki sieciujące. Aby rozpocząć tę procedurę, przygotuj 20% roztwór PEG four NB w PBS i mieszaj mieszaninę, aż rimer całkowicie się rozpuści.

Następnie przepuścić roztwór Kermera przez filtr strzykawkowy w celu jego wysterylizowania i przechowywać Eloqua w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu, gdy będzie potrzebny. Następnie przygotuj 2% roztwór fosfonianu litu arolu w PBS z fotoinicjatora. Przepuść roztwór fotoinicjatora przez filtr strzykawkowy i przechowuj wysterylizowany roztwór w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.

Kolejnym krokiem przygotowawczym jest rozpuszczenie wrażliwego na chryzynę peptydu sieciującego w PBS i przefiltrowanie strzykawką roztworu do sterylizacji. Dodatkowe porcje są przechowywane w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Oznaczyć stężenie grupy wodnej siarków w przygotowanym roztworze peptydu za pomocą odczynnika Elmana zgodnie z protokołem producenta.

Następnie przygotuj foremki, odcinając górną jednocentymetrową porcję sterylnych jednorazowych strzykawek o pojemności jednego mililitra. Za pomocą żyletki ponownie wysterylizuj formy strzykawek. Za pomocą autoklawu przygotuj arkusz kalkulacyjny zawierający obliczenia pożądanej formulacji żelu, w tym objętość i stężenie materiałów wyjściowych, w tym peptydu polimerowego, środka sieciującego, fotoinicjatora i roztworów buforowych.

Pierwsza wstępnie podgrzana hodowla komórkowa, zbalansowany roztwór soli średniej masy i dwie x podróże w EDTA do 37 stopni Celsjusza. Następnie wyjąć z inkubatora kolby zawierające co najmniej sześć komórek beta i umieścić je w okapie z przepływem laminarnym. Po zassaniu pożywki do hodowli komórkowych z kolb, przepłukać komórki wstępnie ciepłymi zbiornikami, zrównoważyć roztwór soli.

Następnie spróbuj zamrozić komórki za pomocą trzech mililitrów wstępnego ciepła, dwa x razy w EDTA i inkubować kolby przez cztery minuty. Po inkubacji delikatnie postukaj kolbami o powierzchnię kaptura, aby całkowicie odłączyć komórki. Potwierdź odłączenie i dysocjację komórek pod mikroskopem.

Następnie dodaj równą objętość pożywki do hodowli komórkowych. Aby zneutralizować trypsynę, dobrze wymieszaj roztwór, delikatnie pipetując w górę iw dół. Następnie przenieść mieszaninę do sterylnej stożkowej probówki, odwirować zawiesinę komórek przez pięć minut przy 200 RCF po odwirowaniu, odessać supernatant i delikatnie ponownie zawiesić komórki w czterech do pięciu mililitrach wstępnie ogrzanej hodowli. Media.

Na koniec określ gęstość komórek, mieszając część zawiesiny komórkowej z 50% błękitem trianowym i licząc komórki za pomocą hemocytometru. Gdy komórki są gotowe, wymieszaj wymagane objętości fotoinicjatora sieciującego PEG four i peptydu B o końcowym stężeniu jednej komórki milimolowej i HBSS w mikroprobówce wirówkowej opartej na stosunku jeden do jednego TH do EEN i delikatnie wymieszaj przez pipetowanie. W tej demonstracji użyto 4% PEG, czterech i B.

Następnie odpipetować 25 mikrolitrów powstałego roztworu do każdej formy strzykawki. Wystaw formy strzykawek na działanie światła UV o długości 365 nanometrów o mocy pięciu miliwatów na centymetr kwadratowy przez dwie minuty. Aby spolimeryzować żel po fotopolimeryzacji, zanurz żele w sterylnej 24-dołkowej płytce zawierającej jeden mililitr pożywki do hodowli komórkowych i inkubuj hydrożele w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 30 minut, aby wypłukać luźno przyczepione komórki lub nieusieciowane makra.

Po 30 minutach wyjąć płytkę z inkubatora i przenieść żele do jednego mililitra świeżej pożywki. Odświeżaj nośnik co dwa do trzech dni. Przygotuj jeden miligram na mililitr roztworu enzymatycznego, dodając zrównoważony roztwór soli Hanksa do trypsyny alfa chimi bez trypsyny.

Następnie wysterylizuj mieszaninę za pomocą filtra strzykawkowego. Następnie wyjmij płytkę hodowlaną z inkubatora i przepłucz żele roztworem soli równoważącej Hanka. Następnie dodaj 500 mikrolitrów roztworu trypsyny gongu do każdej studzienki, następnie inkubuj w temperaturze pokojowej, delikatnie potrząsając na wytrząsarce przez około pięć do 10 minut, aby osiągnąć całkowitą erozję żelu.

Gdy żel zostanie całkowicie zdysocjowany, umieść płytkę na lodzie na kilka minut, aby zmniejszyć aktywność trypsyny CH. Następnym krokiem jest przeniesienie zawiesiny komórek do jednomililitrowej probówki i powolne wirowanie w temperaturze 45 RCF i czterech stopniach Celsjusza przez dwie minuty. Po odwirowaniu ostrożnie usunąć sklaraty sklarowanej nad osadem za pomocą pipety PEI i delikatnie zawiesić steroid w roztworze soli równoważącej Hanka.

Następnie przenieś odzyskany roztwór steroidowy na nową płytkę 24-dołkową i umieść płytkę na lodzie na pięć do 10 minut, aby umożliwić steroidowi osadzenie się i przyczepienie do powierzchni w celu analizy wielkości. Uzyskaj obrazy kontrastu fazowego osiadłych sferoid za pomocą mikroskopu świetlnego, zmierz odzyskane średnice sferoid za pomocą oprogramowania, takiego jak oprogramowanie do elementów firmy Nikon lub obraz J. Ta metoda enkapsulacji zapewnia wysoką początkową żywotność komórek, określoną ilościowo przez barwienie żywych żywych zmarłych. Z czasem w hodowli komórkowej, metabolizm komórkowy mierzony za pomocą alamaru, niebieskich odczynników wzrastał w ciągu 10 dni we wszystkich badanych stężeniach.

Po 10 dniach w hodowli komórkowej sterydy zwiększyły swój rozmiar i nadal utrzymywały wysoką żywotność komórek. W hydrożelach hydrożel peptydowy PEG wspierał przeżycie i proliferację zamkniętych w kapsułkach komórek beta, pokazanych tutaj po 10 dniach w hodowli, w odzyskiwaniu somatycznym za pomocą trypsyny alfa chim, która uwalnia steroidy z matrycy hydrożelowej, wytwarzając wąski rozkład rozmiarów steroidów, które są niezależne od stężenia w matrycy. Sterydy te mogą być następnie używane do dodatkowych charakterystyk i aplikacji Podczas próby tej procedury.

Ważne jest, aby zachować jednorodność w roztworze prepolimeru podczas enkapsulacji, aby zapewnić dobre rozmieszczenie komórek. Po tej procedurze odzyskane komórki można scharakteryzować za pomocą innych technik, takich jak barwienie immunologiczne całej góry i western blot w celu zbadania wpływu stanu macierzy hydrożelowej na ekspresję białek komórkowych i fenotyp. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak kapsułkować komórki w hydrożelach, a także jak odzyskać komórki z żeli w celu uzyskania dodatkowych charakterystyk biologicznych.