Name: Wytwarzanie i odzyskiwanie sferoid β-komórkowych z hydrożeli peptydowych PEG o skokowym wzroście (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Naucz się techniki enkapsulacji komórek β w fotopolimeryzowanych hydrożelach PEG-peptydowych z użyciem reakcji tiol-en. Metoda umożliwia kontrolowane odzyskiwanie sferoidów komórkowych do dalszej charakteryzacji biologicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt został sfinansowany przez NIH (R21EB013717) i IUPUI OVCR (RSFG). Autor dziękuje Pani Han Shih za jej pomoc techniczną.

A. Synteza makromerów i peptydów
<ol>
	<li>Zsyntetyzuj 4-ramienny PEG-norbornen (PEG4NB) i fotoinicjator Lithium arylphosphanate (LAP) przy użyciu ustalonych protokołów. Rozdział 18,19</li>
	<li>Zsyntetyzuj bis-cysteinę zawierającą peptyd wrażliwy na chymotrypsynę CGGY↓C (strzałka wskazuje miejsce cięcia chymotrypsyny) przy użyciu standardowej syntezy peptydów w fazie stałej w mikrofalowym syntezatorze peptydów (CEM Discover SPS).
	<ol class="lalpha">
		<li>Obliczyć potrzebną ilość żywicy (żywicy Rink-amide MBHA) na podstawie współczynnika substytucji żywicy i skali syntezy. Pęcznieć żywicę w dimetyloformamidzie (DMF) w naczyniu reakcyjnym (RV) przez 15 minut.</li>
		<li>Usuń grupę chroniącą Fmoc z żywicy za pomocą roztworu deprotekcyjnego zawierającego 20% piperydyny i 0,1 M HOBt w DMF. Użyj parametrów wymienionych w poniższej tabeli do deprotekcji Fmoc wspomaganej mikrofalami (dla wszystkich aminokwasów Fmoc):
		<obramowanie tabeli="1">
			<tbody>
				<tr>
					<td>Skala syntezy</td>
					<td>0,1 mln</td>
					<td>0,2 mln</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>moc</td>
					<td>20 W</td>
					<td>50 W</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>temperatura</td>
					<td>75 °C</td>
					<td>75 °C</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>Godzina</td>
					<td>Czas trwania: 3 min</td>
					<td>Czas trwania: 3 min</td>
				</tr>
			</tbody>
		</table>
		</li>
		<li>Po odbezpieczeniu przepłucz żywicę DMF i wykonaj test Ninhydryny, aby potwierdzić usunięcie Fmoc (ekspozycja N-końcowej aminy). Żywica powinna zmienić kolor na niebieski po 2 minutach w temperaturze 95 °C.</li>
		<li>Po udanej deprotekcji połącz pierwszy aminokwas Fmoc na końcu C (synteza przebiega od końca C do N) w roztworze zasady aktywatora (0,28 M Diizopropyloetyloamina (DIEA) w DMF) o parametrach wymienionych w poniższej tabeli.
		<obramowanie tabeli="1">
			<tbody>
				<tr>
					<td>Skala syntezy</td>
					<td>0,1 mln</td>
					<td>0,2 mln</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>moc</td>
					<td>20 W</td>
					<td>50 W</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>temperatura*</td>
					<td>75 °C</td>
					<td>75 °C</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>Godzina*</td>
					<td>Czas trwania: 5 min</td>
					<td>Czas trwania: 5 min</td>
				</tr>
			</tbody>
		</table>
		 
		* W przypadku torbieli i torbieli należy użyć 50 °C i 10 minut, aby zmniejszyć racemizację.</li>
		<li>Wypłucz żywicę i wykonaj test Ninhydryny, aby jakościowo potwierdzić zakończenie sprzęgania (zniknięcie N-końcowej aminy). Żywica powinna być przezroczysta po 5 minutach w temperaturze 95 °C. Powtórzyć etap sprzęgania (A.2.d), jeśli test ninhydryny da wynik pozytywny (kolor niebieski).</li>
		<li>Powtórzyć deprotekcję (krok A.2.b) i sprzęganie (krok A.2.d) dla dodatkowych aminokwasów w sekwencji kończącej się ostatnim etapem deprotekcji.</li>
		<li>Opróżnij RV, przepłucz żywicę 25 ml dichlorometanu (DCM). Ten krok polega na spłukaniu DMF, który jest bazą i utrudnia rozszczepianie peptydów.</li>
		<li>Przygotuj koktajl łupliwy, mieszając 250 mg fenolu w 4,75 ml kwasu trifluorooctowego (TFA), 0,125 ml triizopropylosilanu (TIS) i 0,125 mlddH2O.</li>
		<li>Dodaj roztwór rozszczepienia do RV i rozszczepiaj przez 30 minut w mikrofalowym syntezatorze peptydów (moc = 20 W; Temperatura = 38 °C).</li>
		<li>Zebrać roztwór peptydów do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml za pomocą kolektora próżniowego.</li>
		<li>Wytrącić rozszczepiony peptyd w 40 ml eteru, zawirować probówkę i odwirować z prędkością 3 000 obr./min przez 5 minut, aby zebrać peptyd.</li>
		<li>Odcedzić supernatant i powtórzyć krok A.2.k dwukrotnie.</li>
		<li>Zbierz i wysusz peptyd w próżni.</li>
		<li>Oczyść peptyd za pomocą HPLC i scharakteryzuj go za pomocą spektrometrii mas.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
B. Przygotowanie materiału i sterylizacja
<ol>
	<li>Przygotować 20% wagowy roztwór PEG4NB w PBS, mieszać mieszaninę do całkowitego rozpuszczenia makromeru i wysterylizować roztwór makromeru za pomocą filtra strzykawkowego. Wysterylizowany roztwór przechowywać w temperaturze -20 °C (przygotować porcje do długotrwałego przechowywania).</li>
	<li>Przygotować i wysterylizować 2% wagowy roztwór fotoinicjatora (LAP) w PBS. Wysterylizowany roztwór należy przechowywać w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem.</li>
	<li>Rozpuść peptyd (CGGYC) w PBS, zwiruj mieszaninę i strzykawką przefiltruj roztwór do sterylizacji. Roztwor peptydowy podzielić na porcje i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia (zapobiec cyklom zamrażania i rozmrażania).</li>
	<li>Oznaczyć stężenie tiolu (-SH) w przygotowanym roztworze peptydu za pomocą odczynnika Ellmana (postępuj zgodnie z protokołem producenta). Ten krok zapewni dokładne stężenie peptydu (tj. [SH]/2), które jest wymagane do obliczenia ilości peptydu, która ma być użyta w reakcjach fotoklikania tiol-en.</li>
	<li>Przygotować formy do żelowania, odcinając górną część sterylnych jednorazowych strzykawek o pojemności 1 ml za pomocą żyletki (otwarta końcówka do usuwania żelu). Wysterylizuj formy strzykawek w autoklawie.</li>
	<li>Na podstawie pożądanej formuły żelu (stosunek tiolu do enu = 1) i stężeń materiałów wyjściowych oblicz wymaganą objętość polimeru, peptydowego środka sieciującego, fotoinicjatora i roztworu buforowego.</li>
</ol>
C. Przygotowanie komórek
<ol>
	<li>Pożywka do hodowli komórkowych o wysokiej zawartości glukozy (DMEM o wysokiej zawartości glukozy zawierająca 10% płodowej surowicy bydlęcej; Antybiotyk-Antybiotyk z 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 250 ng/ml Fungizone; i 50 μM β-merkaptoetanolu), zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS, Ca2+, Mg2+ free) i trypsyna-EDTA do 37 °C.</li>
	<li>Wyjąć kolby zawierające komórki β MIN6 z inkubatora CO2 i umieścić kolby w okapie z przepływem laminarnym.</li>
	<li>Odessać pożywkę do hodowli komórkowych z kolb i przepłukać komórkę HBSS.</li>
	<li>Trypsynizować komórki za pomocą 3 ml 2X (0,1%) trypsyny-EDTA i inkubować kolby przez 4 minuty w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
	<ul>
		<li>Uwaga: Użycie 2X roztworu trypsyny umożliwia całkowitą dysocjację komórek β MIN6 w zawiesinę pojedynczej komórki.</li>
	</ul>
	</li>
	<li>Po inkubacji delikatnie postukaj kolbami o powierzchnię kaptura, aby całkowicie odłączyć komórki. Potwierdź odłączenie i dysocjację komórek za pomocą mikroskopu.</li>
	<li>Dodaj równą objętość pożywki do hodowli komórkowych, aby zneutralizować trypsynę. Dobrze wymieszaj roztwór, delikatnie pipetując, a następnie przenieś mieszaninę do kanonicznej probówki i odwiruj przez 5 minut z prędkością 1 000 obr./min.</li>
	<li>Odessać supernatant i delikatnie zawiesić komórki w 4 - 5 ml pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Określ gęstość komórek za pomocą 50% buforu błękitu trypanowego w hemocytometrze.</li>
</ol>
D. Wytwarzanie hydrożelu i enkapsulacja komórek
<ol>
	<li>Gdy komórki są gotowe, wymieszaj (w oparciu o stosunek tiolu do enu 1:1) wymagane objętości PEG4NB, CGGYC, LAP, roztworu komórkowego i HBSS w probówce do mikrowirówki.</li>
	<li>Delikatnie wymieszać roztwór za pomocą pipety, aby uzyskać jednorodną mieszaninę i dodać 25 μl powstałego roztworu do formy strzykawki. Wystawić strzykawkę na działanie promieniowania UV (365 nm, 5 mW/cm2) przez 2 minuty.</li>
	<li>Po fotopolimeryzacji zanurzyć żele w sterylnej 24-dołkowej płytce zawierającej pożywkę do hodowli komórkowych i inkubować hydrożele w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Umyj hydrożele z komórkami w pożywce do hodowli komórkowych przez 30 minut, aby spłukać luźno przyczepione komórki i nieusieciowane makromery. Przenieś żele do świeżego podłoża.</li>
	<li>Odświeżaj pożywkę do hodowli komórkowych co 2 do 3 dni.</li>
</ol>
E. Test żywotności komórek
Morfologię komórek w kapsułkach można obserwować za pomocą mikroskopu świetlnego (ponieważ zsyntetyzowane hydrożele są przezroczyste). Żywotność komórek można wizualizować i mierzyć jakościowo za pomocą barwienia Live/Dead oraz ilościowo za pomocą odczynnika AlamarBlue.
E.1. Żywe/martwe plamienie
<ol>
	<li>Rozmrażanie żywych/martwych odczynników barwiących w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>W probówce kanonicznej dodać PBS zgodnie z liczbą próbek (n) do barwienia: 
	Całkowita objętość PBS=n × 500 μl</li>
	<li>Odmierzyć pipetą 0,25 μl Calceiny AM i 2 μl EthD-1 na 1 ml PBS do probówki kanonicznej zawierającej PBS. Zwiruj roztwór, aby wymieszać składniki.</li>
	<li>Inkubować hydrożele zawierające komórki w żywym/martwym roztworze barwiącym (0,5 ml / próbkę) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej.</li>
	<li>Za pomocą pipety Pasteura usunąć roztwór barwnika i dwukrotnie przepłukać próbkę PBS.</li>
	<li>Umieścić próbkę na szkiełku nakrywkowym lub szkiełku podstawowym. Obserwuj i obrazuj komórki za pomocą mikroskopu konfokalnego.</li>
</ol>
E.2. Test AlamarBlue
<ol>
	<li>Przygotować 10 v/v% roztwór AlamarBlue w pożywce do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Wyjąć hydrożele z inkubatora i odessać pożywkę z każdej studzienki bez kontaktu z hydrożelem.</li>
	<li>Inkubować hydrożele komórkowe i pustą studzienkę (kontrola ujemna) w 500 μl 10% roztworu AlamarBlue przez 16 godzin.</li>
	<li>Po inkubacji pobrać pipetę z 200 μl roztworu AlamarBlue na 96-dołkową płytkę i zmierzyć fluorescencję za pomocą czytnika mikropłytek (wzbudzenie: 560 nm, emisja: 590 nm).
	<ul>
		<li>Wyższa komórkowa aktywność metaboliczna zmniejsza zawartość barwnika, aby zapewnić wyższy odczyt fluorescencji.</li>
		<li>Upewnij się, że jako ślepe próby zawierają co najmniej dwie studzienki z 10% roztworem Alamarblue. Analizując dane, odejmij uśrednioną wartość fluorescencji ślepej próby od odczytu fluorescencji próbek.</li>
	</ul>
	</li>
</ol>
F. Erozja żelu za pośrednictwem chymotrypsyny i regeneracja sferoidów
<ol>
	<li>Przygotować 1 mg/ml roztworu α-chymotrypsyny bez trypsyny w HBBS i sterylnie przefiltrować roztwór.</li>
	<li>Inkubować hydrożele w roztworze chymotrypsyny (500 μl na każdy żel) w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając, aż do uzyskania całkowitej erozji żelu.
	<ul>
		<li>W przypadku żelu o objętości 25 μl czas do całkowitej erozji wynosi około 5 minut.</li>
	</ul>
	</li>
	<li>Umieść talerz na lodzie na kilka minut, aby zmniejszyć aktywność chymotrypsyny.</li>
	<li>Przenieść roztwór komórkowy do probówki o pojemności 1 ml i odwirować przy prędkości 300 obr./min, 4 °C przez 2 min.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety pastwiskowej i delikatnie zawiesić sferoidy w HBSS.</li>
	<li>Przenieś odzyskany roztwór sferoidowy na 24-dołkową płytkę i umieść płytkę na lodzie, aby sferoidy mogły się uspokoić.</li>
	<li>W celu analizy wielkości należy uzyskać obrazy z kontrastem fazowym osadzonych sferoid za pomocą mikroskopu świetlnego. Zmierz odzyskane średnice sferoid za pomocą oprogramowania, takiego jak oprogramowanie Nikon Element lub ImageJ.</li>
</ol>
G. Test funkcjonalny odzyskanych sferoid
G.1. Glukoza stymulowała wydzielanie insuliny z odzyskanych sferoid komórkowych
<ol>
	<li>Na 24-dołkowej płytce inkubować żele w 500 μl 2 mM buforu Kerbs-Ringer (KRB) o niskiej zawartości glukozy przez 1 godzinę.</li>
	<li>Erodować żel i odzyskać sferoidy komórek, wykonując kroki od F.1 do F.6.</li>
	<li>Ostrożnie odessać supernatant, nie wchodząc w żaden kontakt ze sferoidami komórek, a następnie ponownie zawiesić sferoidy w 500 μl 2 mM KRB o niskiej stężeniu glukozy.</li>
	<li>Przenieść 100 μl roztworu sferoid komórkowych do probówki o pojemności 0,6 ml i umieścić na lodzie w celu wewnątrzkomórkowego oznaczania ilościowego ATP.</li>
	<li>Podzielić pozostały roztwór sferoidowy komórek na pół (na dwie probówki do mikrowirówek) i wirować przez 2 minuty przy 300 obr./min i 4 °C.</li>
	<li>Odessać supernatant (prawie do dna) i ponownie zawiesić pierwszą połowę sferoid komórkowych w 1 ml 25 mM KRB o wysokim poziomie glukozy, a drugą połowę w 1 ml 2 mM KRB o niskiej glikemii.</li>
	<li>Delikatnie odpipetować i przenieść roztwór zawierający sferoidy odzyskanych komórek na płytkę 24-dołkową. Inkubować płytkę przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Po inkubacji przenieść roztwór do probówki do mikrowirówki i wirować przez 2 minuty przy 1 000 obr./min i w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść 500 μl supernatantu z probówki wirówkowej do innej probówki do mikrowirówki i przechowywać w temperaturze 4 °C do testu ELISA insuliny.</li>
	<li>Wykonaj test ELISA insuliny zgodnie z protokołem producenta.</li>
</ol>
G.2. Test CellTiter Glo
<ol>
	<li>Wzorce ATP: Przygotuj roztwór ATP 10 μM i wykonaj seryjne rozcieńczenia, aby uzyskać serię 8 roztworów wzorcowych.</li>
	<li>Do białej płytki 96-dołkowej dodać 50 μl roztworu sferoidalnego komórek (z kroku G.1.6) i wzorce.</li>
	<li>Do każdej studzienki zawierającej próbki i wzorce dodać 50 μl odczynnika CellTiter Glo i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
	<li>Po inkubacji zmierz liczbę luminescencji próbek i wzorców za pomocą czytnika mikropłytek i skalibruj stężenia ATP próbki za pomocą krzywej regresji liniowej wygenerowanej przez wzorce ATP.</li>
	<li>Określić całkowite stężenie ATP w próbce i pomnożyć przez współczynnik rozcieńczenia próbki, aby uzyskać wewnątrzkomórkowe stężenie ATP w jednym hydrożelu obciążonym komórkami.</li>
</ol>
G.3. Określ wydzielanie insuliny
<ol>
	<li>Obliczyć ilość insuliny wydzielanej z odzyskanych sferoid, biorąc stosunek ilości insuliny wydzielanej w pożywce o wysokim poziomie glukozy do ilości insuliny wydzielanej w pożywce o niskiej zawartości glukozy.</li>
	<li>Normalizować ilościową zawartość insuliny w sferoidach komórkowych odpowiednią ilością wewnątrzkomórkowego ATP odzyskanych sferoid komórkowych.</li>
</ol>

<ol><li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+bioengineering%22%5BJournal%5D)">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnology and bioengineering. 103, 655-663 (2009).</li>
<li>Lin, C. C., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEG+hydrogels+for+the+controlled+release+of+biomolecules+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+research%22%5BJournal%5D)">PEG hydrogels for the controlled release of biomolecules in regenerative medicine.</a> Pharmaceutical research. 26, 631-643 (2009).</li>
<li>Lin, C. C., Metters, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+in+controlled+release+formulations%3A+network+design+and+mathematical+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+drug+delivery+reviews%22%5BJournal%5D)">Hydrogels in controlled release formulations: network design and mathematical modeling.</a> Advanced drug delivery reviews. 58, 1379-1408 (2006).</li>
<li>Khetan, S., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+hydrogels+in+three+dimensions+towards+controlling+cellular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Patterning hydrogels in three dimensions towards controlling cellular interactions.</a> Soft Matter. 7, 830-838 (2011).</li>
<li>Aimetti, A. A., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neutrophil+elastase+responsive+delivery+from+poly%28ethylene+glycol%29+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Human neutrophil elastase responsive delivery from poly(ethylene glycol) hydrogels.</a> Biomacromolecules. 10, 1484-1489 (2009).</li>
<li>Weber, L. M., He, J., Bradley, B., Haskins, K., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEG-based+hydrogels+as+an+in+vitro+encapsulation+platform+for+testing+controlled+beta-cell+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+biomaterialia%22%5BJournal%5D)">PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled beta-cell microenvironments.</a> Acta biomaterialia. 2, 1-8 (2006).</li>
<li>Lin, C. C., Raza, A., Shih, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEG+hydrogels+formed+by+thiol-ene+photo-click+chemistry+and+their+effect+on+the+formation+and+recovery+of+insulin-secreting+cell+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">PEG hydrogels formed by thiol-ene photo-click chemistry and their effect on the formation and recovery of insulin-secreting cell spheroids.</a> Biomaterials. 32, 9685-9695 (2011).</li>
<li>Lin, C. C., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucagon-like+peptide-1+functionalized+PEG+hydrogels+promote+survival+and+function+of+encapsulated+pancreatic+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Glucagon-like peptide-1 functionalized PEG hydrogels promote survival and function of encapsulated pancreatic beta-cells.</a> Biomacromolecules. 10, 2460-2467 (2009).</li>
<li>Lin, C. C., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+communication+mimicry+with+poly%28ethylene+glycol%29+hydrogels+for+enhancing+beta-cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cell-cell communication mimicry with poly(ethylene glycol) hydrogels for enhancing beta-cell function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 6380-6385 (2011).</li>
<li>Hui, H., Nourparvar, A., Zhao, X., Perfetti, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucagon-like+peptide-1+inhibits+apoptosis+of+insulin-secreting+cells+via+a+cyclic+5%27-adenosine+monophosphate-dependent+protein+kinase+A-+and+a+phosphatidylinositol+3-kinase-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Glucagon-like peptide-1 inhibits apoptosis of insulin-secreting cells via a cyclic 5'-adenosine monophosphate-dependent protein kinase A- and a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway.</a> Endocrinology. 144, 1444-1445 (2003).</li>
<li>Weber, L. M., Lopez, C. G., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+PEG+hydrogel+crosslinking+density+on+protein+diffusion+and+encapsulated+islet+survival+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomedical+materials+research.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Effects of PEG hydrogel crosslinking density on protein diffusion and encapsulated islet survival and function.</a> Journal of biomedical materials research. Part A. 90, 720-729 (2009).</li>
<li>Weber, L. M., Hayda, K. N., Haskins, K., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+cell-matrix+interactions+on+encapsulated+beta-cell+function+within+hydrogels+functionalized+with+matrix-derived+adhesive+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effects of cell-matrix interactions on encapsulated beta-cell function within hydrogels functionalized with matrix-derived adhesive peptides.</a> Biomaterials. 28, 3004-3011 (2007).</li>
<li>Hsu, C. W., Olabisi, R. M., Olmsted-Davis, E. A., Davis, A. R., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cathepsin+K-sensitive+poly%28ethylene+glycol%29+hydrogels+for+degradation+in+response+to+bone+resorption%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomedical+materials+research.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Cathepsin K-sensitive poly(ethylene glycol) hydrogels for degradation in response to bone resorption.</a> Journal of biomedical materials research. Part A. 98, 53-62 (2011).</li>
<li>Leslie-Barbick, J. E., Moon, J. J., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalently-immobilized+vascular+endothelial+growth+factor+promotes+endothelial+cell+tubulogenesis+in+poly%28ethylene+glycol%29+diacrylate+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomaterials+science.+Polymer%22%5BJournal%5D)">Covalently-immobilized vascular endothelial growth factor promotes endothelial cell tubulogenesis in poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels.</a> Journal of biomaterials science. Polymer. 20, 1763-1779 (2009).</li>
<li>Moon, J. J., Hahn, M. S., Kim, I., Nsiah, B. A., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+of+poly%28ethylene+glycol%29+diacrylate+hydrogels+with+biomolecules+to+regulate+and+guide+endothelial+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Micropatterning of poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels with biomolecules to regulate and guide endothelial morphogenesis.</a> Tissue engineering. Part A. 15, 579-585 (2009).</li>
<li>Hoyle, C. E., Bowman, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-ene+click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Thiol-ene click chemistry.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 49, 1540-1573 (2010).</li>
<li>Hoyle, C. E., Lowe, A. B., Bowman, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-click+chemistry%3A+a+multifaceted+toolbox+for+small+molecule+and+polymer+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+reviews%22%5BJournal%5D)">Thiol-click chemistry: a multifaceted toolbox for small molecule and polymer synthesis.</a> Chemical Society reviews. 39, 1355-1387 (2010).</li>
<li>Fairbanks, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Versatile+Synthetic+Extracellular+Matrix+Mimic+via+Thiol-Norbornene+Photopolymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">A Versatile Synthetic Extracellular Matrix Mimic via Thiol-Norbornene Photopolymerization.</a> Adv. Mater. 21, 5005(2009).</li>
<li>Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoinitiated+polymerization+of+PEG-diacrylate+with+lithium+phenyl-2%2C4%2C6-trimethylbenzoylphosphinate%3A+polymerization+rate+and+cytocompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility.</a> Biomaterials. 30, 6702-6707 (2009).</li>
<li>Zustiak, S. P., Leach, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+protein+release+from+hydrolytically+degradable+poly%28ethylene+glycol%29+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+bioengineering%22%5BJournal%5D)">Characterization of protein release from hydrolytically degradable poly(ethylene glycol) hydrogels.</a> Biotechnology and bioengineering. 108, 197-206 (2011).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Opisany protokół przedstawia szczegóły dotyczące łatwej enkapsulacji komórek w hydrożelach tiolowo-enowych powstałych w wyniku fotopolimeryzacji krokowej wzrostu. Chociaż w tym protokole zastosowano stosunek stechiometryczny 1:1 grup funkcyjnych norbornenu do tiolu, stosunek ten można dostosować w zależności od eksperymentów. Oprócz prawidłowej formuły ważne jest utrzymanie jednorodności w roztworze prepolimeru. W szczególności należy stosować delikatne pipetowanie, aby upewnić się, że komórki są dobrze rozmieszczone w r...

Hydrożele to hydrofilowe usieciowane polimery o wyjątkowym potencjale jako materiały rusztowania do naprawy i regeneracji tkanek. 1-3 Wysoka zawartość wody w hydrożelach umożliwia łatwą dyfuzję tlenu oraz wymianę składników odżywczych i komórkowych produktów przemiany materii, które mają kluczowe znaczenie dla utrzymania żywotności komórek. Ponadto hydrożele są doskonałymi nośnikami do kontrolowanego uwalniania i dostarczania komórek ze względu na ich wysoką przestrajalność. 2 Hydrożele syntetyczne, takie jak te przygotowane z poli(glikolu etylenowego) (PEG), są coraz częściej stosowane w inżynierii tkankowej, głównie ze względu na ich cytokompatybilność, elastyczność podobną do tkanki oraz wysoką dostrajalność właściwości fizycznych i mechanicznych materiałów. 4-6
Chociaż powszechnie używana platforma hydrożelowa, badania wykazały, że hydrożele diakrylanu PEG (PEGDA) powstałe w wyniku fotopolimeryzacji wzrostu łańcucha mają tendencję do uszkadzania zamkniętych komórek podczas sieciowania sieci i enkapsulacji komórek in situ. 7 Uszkodzenie komórek zostało w dużej mierze przypisane gatunkom rodnikowym generowanym przez cząsteczki fotoinicjatora, które rozprzestrzeniają się przez grupy winylowe na PEGDA, sieciując łańcuchy polimerowe w hydrożele. Niestety, te rodniki powodują również stres i uszkodzenia komórek podczas enkapsulacji komórek, szczególnie w przypadku komórek wrażliwych na rodniki, takich jak komórki β trzustki. 8-10 W celu uzyskania większego rozmiaru oczek dla lepszej dyfuzji i przeżycia komórek, PEGDA o wyższej masie cząsteczkowej są często używane do enkapsulacji komórek. Pogarsza to jednak kinetykę polimeryzacji i powoduje nieoptymalne właściwości biofizyczne żelu. 7,11,12 Oprócz wyżej wymienionych wad, bardzo trudno jest odzyskać struktury komórkowe z hydrożeli PEGDA ze względu na niejednorodność i niedegradowalny charakter sieci usieciowanych. Podczas gdy peptydy wrażliwe na proteazę mogą być włączone do szkieletu makromeru PEG, aby uczynić obojętne hydrożele PEGDA wrażliwymi na rozszczepienie enzymatyczne, koniugacja często wykorzystuje drogie odczynniki, a powstałe sieci nadal zawierają wysoki stopień niejednorodności ze względu na charakter polimeryzacji opartej na wzroście łańcucha. 13-15
Ostatnio wykazano, że hydrożele peptydowe PEG powstałe w wyniku stopniowej fotopolimeryzacji tiolowo-enowej wykazują preferencyjne właściwości do enkapsulacji komórek w porównaniu z hydrożelami powstałymi w wyniku fotopolimeryzacji łańcuchowej. 7 Lepsza kinetyka żelowania hydrożeli tiolowo-enowych przypisuje się "klikającemu" charakterowi reakcji między funkcjami tiolu i enu. W porównaniu z polimeryzacją łańcuchową PEGDA, reakcja tiol-en jest mniej hamowana tlenem, co skutkuje szybszym tempem żelowania. 16,17 Hydrożele tiolowo-enowe mają również wyższą wydajność polimeryzacji i lepsze właściwości biofizyczne żelu w porównaniu z hydrożelami PEGDA o wzroście łańcucha,7,18 co skutkuje ograniczonymi uszkodzeniami komórek spowodowanymi przez rodniki podczas fotopolimeryzacji.
Wcześniej, hydrożele tiolowo-europejskie utworzone przez 4-ramienny makromer PEG-norbornene (PEG4NB) i bi-cysteiny zawierające peptydowe środki sieciujące, takie jak peptydy wrażliwe na proteazę, były wykorzystywane do enkapsulacji komórek. 7,18 Wysoka przestrajalność sieci hydrożelowych PEG oferuje elastyczne i kontrolowane mikrośrodowisko 3D do badania przeżycia i aktywności komórek, podczas gdy zastosowanie wrażliwej na proteazę sekwencji peptydowej zapewnia łagodny sposób odzyskiwania konstruktów komórkowych powstałych naturalnie w hydrożelach. W tym protokole wykorzystujemy fotopolimeryzowane hydrożele tiolowo-enowe o skokowym wzroście, wytwarzane przy użyciu 4-ramiennego PEG-norbornenu (PEG4NB) i wrażliwego na chymotrypsynę peptydu sieciującego (CGGY↓C) do enkapsulacji komórek β MIN6. Protokół ten systematycznie opracowuje techniki badania przeżycia, proliferacji i sferoidalnego tworzenia komórek β MIN6 w hydrożelach tiolowo-enowych. Ponadto przedstawiamy metodę odzyskiwania sferoidów w komórkach β i charakterystykę biologiczną odzyskanych sferoid.

<table><tbody><tr><td>4-ramienny PEG (20kDa)</td><td>Jenkem Technology USA</td><td>4ARM-PEG-20K</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-aminokwasy</td><td>Anaspec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw żywotności żywych/martwych komórek</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td>Zawiera Calcein AM i Ethidium homodimer-1</td></tr><tr><td>Odczynnik AlamarBlue</td><td>AbD Serotec</td><td>BUF012</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik CellTiter Glo</td><td>Promega</td><td>G7570</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td>Bez Ca+2 i Mg+2</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Lonza</td><td>10547F</td><td>Bez Ca+2 i Mg+2</td></tr><tr><td>hyklon DMEM o wysokiej zawartości glukozy</td><td></td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td></td><td>FBS Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotykowo-przeciwgrzybiczy</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>&#946;-Mercapt&#8211; thanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Bez trypsyny &alfa;-chymotrypsyna</td><td>Worthington Biochemical Corp</td><td>LS001432</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw ELISA Mouse Inusin</td><td>Mercodia</td><td>10-1247-01</td><td></td></tr> 1 <tr><td>ml jednorazowa strzykawka</td><td>BD biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie i odzyskiwanie sferoid β-komórkowych z hydrożeli peptydowych peg o skokowym wzroście

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Hydrożele to hydrofilowe usieciowane polimery, które zapewniają trójwymiarowe mikrośrodowisko o elastyczności podobnej do tkanki i wysokiej przepuszczalności do hodowli komórek lub tkanek istotnych z terapeutycznego punktu widzenia. Hydrożele przygotowane z pochodnych poli(glikolu etylenowego) (PEG) są coraz częściej wykorzystywane do różnych zastosowań w inżynierii tkankowej, częściowo ze względu na ich właściwości przestrajalne i cytokompatybilne. W tym protokole wykorzystaliśmy fotopolimeryzacje etapowego wzrostu tiolu do wytwarzania hydrożeli peptydowych PEG do kapsułkowania komórek b MIN6 trzustki. Żele zostały utworzone przez 4-ramienny makromer PEG-norbornene (PEG4NB) i wrażliwy na chymotrypsynę peptyd sieciujący (CGGYC). Hydrofilowy i niezarastający charakter PEG zapewnia cytokompatybilne mikrośrodowisko dla przetrwania i proliferacji komórek w 3D, podczas gdy zastosowanie sekwencji peptydowej wrażliwej na chymotrypsynę (CGGY↓C, strzałka wskazuje miejsce cięcia enzymu, podczas gdy końcowe reszty cysteiny zostały dodane w celu sieciowania tiolowo-enowego) pozwala na szybkie odzyskanie konstruktów komórkowych tworzących się w hydrożelu. Poniższy protokół opracowuje techniki dotyczące: (1) enkapsulacji komórek β MIN6 w hydrożelach tiolowych; (2) Jakościowe i ilościowe testy żywotności komórek w celu określenia przeżywalności i proliferacji komórek; (3) Odzyskiwanie sferoid komórkowych za pomocą erozji żelu za pośrednictwem chymotrypsyny; oraz (4) analiza strukturalna i funkcjonalna odzyskanych sferoid.

Ryciny 1-4 przedstawiają reprezentatywne wyniki enkapsulacji, przeżywalności, proliferacji, tworzenia sferoidów oraz odzyskiwania sferoidów w hydrożelach tiol-en. Rycina 1 przedstawia schemat reakcji (1) fotopolimeryzacji tiol-en z etapowym wzrostem z użyciem PEG4NB i CGGYC oraz (2) erozji żelu indukowanej chymotrypsyną, która przebiega zgodnie z mechanizmem erozji powierzchniowej. Ryciny 2 i 3 prezentują wyniki żywotności uzyskane za pomocą barwienia Li...

Poniższy protokół dostarcza techniki kapsułkowania komórek β trzustki w hydrożelach peptydowych PEG powstałych w wyniku reakcji fotoklikania tiolowo-enowego. Ta platforma materiałowa nie tylko oferuje cytokompatybilne mikrośrodowisko do enkapsulacji komórek, ale także umożliwia kontrolowane przez użytkownika szybkie odzyskiwanie struktur komórkowych utworzonych w hydrożelach.

Wytwarzanie i odzyskiwanie sferoid β-komórkowych z hydrożeli peptydowych PEG o skokowym wzroście

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie technik kapsułkowania komórek w fotopolimeryzowanych hydrożelach, a także późniejsze odzyskanie naturalnie powstałego pH komórek beta z wrażliwych na enzymy hydrożeli z charakterystyki biologicznej. Osiąga się to poprzez najpierw zmieszanie sześciu komórek beta z kołkiem przedramienia, macerem norbertyny i wrażliwym na enzymy środkiem sieciującym peptydy. Komórki są następnie otaczane za pomocą polimeryzacji za pośrednictwem wolnych rodników, a następnie fotopolimeryzacji w celu utworzenia hydrożelu.Drugim krokiem jest hodowla zamkniętych komórek w hydrożelach w inkubatorze dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po tym, jak komórki rozmnożą się w celu utworzenia agregatów, hydrożele obciążone komórkami są płukane roztworem buforowym, a następnie inkubowane w roztworze trypsyny chia. Pod delikatnym wstrząsaniem w celu erozji żelu, odzyskane kruszywa są starannie myte w celu usunięcia roztworu enzymatycznego i zerodowanego polimeru.Ostatecznie te agregaty komórkowe można wykorzystać do analizy strukturalnej i funkcjonalnej. Tak więc główną zaletą przyrostu krokowego, a następnie fotochemii jest to, że jego warunki reakcji

generation-recovery-cell-spheroids-from-step-growth-peg-peptide

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Generowanie i odzyskiwanie sferycznych komórek β z żeli hydrofilowych PEG-peptydowych typu step-growth

W niniejszej pracy opisujemy zastosowanie samoorganizującego się rusztowania trójwymiarowego do hodowli ludzkich komórek progenitorowych neuronów. Przedstawiamy protokół uwalniania komórek z rusztowań w celu ich późniejszej analizy, np. za pomocą cytometrii przepływowej. Protokół ten może zostać dostosowany do innych typów komórek w celu przeprowadzenia szczegółowych badań mechanistycznych.

Hodowla ludzkich komórek progenitorowych neuronów w trójwymiarowym samoorganizującym się hydrożelu peptydowym

Metoda hodowli trójwymiarowej opisana w tym protokole podsumowuje rozwój trzustki z rozproszonych embrionalnych przodków trzustki myszy, włączając ich znaczną ekspansję, różnicowanie i morfogenezę do rozgałęzionego organu. Ta metoda jest podatna na obrazowanie, funkcjonalną ingerencję i manipulację niszą.

In vitro Organogeneza trzustki z rozproszonych przodków embrionalnych myszy

Tutaj prezentujemy metodologię generowania i podawania mikrosfer z poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego) (PLGA) do nienaruszonych mysich wysp trzustkowych w hodowli, a następnie analizy immunofluorescencyjnej proliferacji komórek β. Metoda ta jest odpowiednia do określania skuteczności kandydujących mitogenów β-komórkowych.

Trwałe podawanie mitogenów z komórek β do nienaruszonych wysepek myszy ex vivo przy użyciu biodegradowalnych mikrosfer poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego)

Tutaj prezentujemy protokół generowania ekspresji insuliny 3D mysich trzustek z swobodnie pływających e10.5 dysocjowanych komórek progenitorowych trzustki i związanych z nimi mezenchymów.

Wytwarzanie bezrusztowaniowych, trójwymiarowych trzustek eksprymujących insulinę z mysich progenitorów trzustki in vitro

Obecny protokół opisuje ulepszoną metodę zwiększania koekspresji czynników transkrypcyjnych PDX1 i NKX6.1 w progenitorach trzustki pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) w płaskich monowarstwach. Osiąga się to poprzez uzupełnienie świeżej macierzy, manipulowanie gęstością komórek i dysocjację komórek endodermalnych.

Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w prekursory komórek beta trzustki w systemie hodowli 2D

Obecny protokół opisuje technikę wytwarzania sferoidów tkankowych na dużą skalę przy użyciu wydrukowanego w 3D urządzenia przypominającego stempel.

Generowanie sferoid tkankowych za pomocą wydrukowanego w 3D urządzenia przypominającego stempel

Tutaj prezentujemy protokół, który umożliwia szybką, solidną i tanią produkcję sferoid nowotworowych, a następnie enkapsulację hydrożelową. Ma szerokie zastosowanie, ponieważ nie wymaga specjalistycznego sprzętu. Byłoby to szczególnie przydatne do badania interakcji sferoida-matryca oraz budowania modeli fizjologii lub patologii tkanek in vitro.

Wytwarzanie i enkapsulacja sferoidów nowotworowych w hydrożelach glikolu polietylenowego do badania oddziaływań sferoida-matryca

Ten artykuł przedstawia protokół ukierunkowanego różnicowania i analizy funkcjonalnej komórek podobnych do komórek β. Opisujemy optymalne warunki hodowli i pasażki dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przed wytworzeniem komórek trzustki produkujących insulinę. Sześcioetapowe różnicowanie postępuje od ostatecznego tworzenia endodermy do funkcjonalnych komórek podobnych do komórek β wydzielających insulinę w odpowiedzi na glukozę.

Zoptymalizowany protokół generowania funkcjonalnych komórek wydzielających insulinę trzustkową z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Rak trzustki pozostaje jednym z najtrudniejszych nowotworów do leczenia. Dlatego tak ważne jest, aby modele przedkliniczne oceniające skuteczność leczenia były powtarzalne i istotne klinicznie. Protokół ten opisuje prostą procedurę kohodowli w celu wygenerowania powtarzalnych, klinicznie istotnych sferoid desmoplastycznych.

Hodowla desmoplastycznych trójwymiarowych sferoid raka trzustki z kokultury

To badanie przedstawia opłacalną i efektywną metodologię generowania struktur komórkowych 3D za pomocą systemu opartego na stemplach do tworzenia mikrostudzienek w formach agarozowych. System sprzyja tworzeniu się jednolitych sferoidów/organoidów, poprawiając w ten sposób interakcje komórkowe. Takie podejście zmniejsza zmienność eksperymentalną i wspiera zastosowania w testowaniu leków i inżynierii tkankowej.

Generowanie trójwymiarowych sferoidów/organoidów z dwuwymiarowych kultur komórkowych przy użyciu nowatorskiego urządzenia do stemplowania

Naucz się techniki enkapsulacji komórek β w fotopolimeryzowanych hydrożelach PEG-peptydowych z użyciem reakcji tiol-en. Metoda umożliwia kontrolowane odzyskiwanie sferoidów komórkowych do dalszej charakteryzacji biologicznej.

Wytwarzanie i odzyskiwanie sferoid β-komórkowych z hydrożeli peptydowych PEG o skokowym wzroście

Przeglądaj więcej filmów