Badania przesiewowe w kierunku modyfikatorów czerniaka przy użyciu autochtonicznego modelu guza danio pręgowanego

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest badanie przesiewowe pod kątem modyfikatorów czerniaka przy użyciu modelu autogennego guza danio pręgowanego. Osiąga się to poprzez tworzenie transgenicznych zwierząt, u których melanocyty wyrażają interesujący gen, a ryby są predysponowane do czerniaka. Następnie ocenia się początek czerniaka, aby ocenić, czy gen będący przedmiotem zainteresowania zmienia inicjację guza.

Następnie przeprowadza się inwazję guza i testy specyficzne dla komórek w celu określenia dodatkowego wpływu interesującego genu na czerniaki i melanocyty przednowotworowe. Na koniec przeszczepia się komórki czerniaka w celu zmierzenia, w jaki sposób interesujący nas gen wpływa na częstotliwość komórek inicjujących czerniaka w ustalonych nowotworach. Wyniki pokazują, w jaki sposób gen kandydujący wpływa na różne właściwości melanocytów i czerniaka, w tym na początek inwazji i zdolność do przeszczepu.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak transgeneza linii zarodkowej do badania potencjalnych genów raka, jest oszczędność czasu, wysiłku i kosztów, a wydajność jest zwiększona dzięki testowi. Różne aspekty nowotworu u zwierząt transgenicznych gongu Demonstrując tę procedurę, będzie to agar sherania, doktorant w moim laboratorium Aby wygenerować konstrukty do wstrzykiwania. Zacznij od stworzenia klonów środkowego wejścia bramy za pomocą PCR, amplifikując pełną długość otwartej ramki odczytu interesujących genów i rekombinując do P don R 2 21.

Następnie użyj technologii bramy wielomiejscowej, aby ponownie zrekombinować specyficzny dla melanocytów gen promotora mifa i sygnał poliadenylacji do wektora mini Coopera, aby umieścić interesujące geny pod kontrolą promotora mifa, wstrzyknąć 25 pikogramów każdego klonu, wraz z 25 pikogramami TOL dwa transponują mRNA do jednej komórki transgenicznych potrójnych homozygotycznych zarodków danio pręgowanego. Mifa BRAF FP 53. Zmutowane zwierzęta mają niedobór melanocytów i są podatne na transformację i tworzenie czerniaka.

Wraz z genem zainteresowania. Wektor mini Coopera zawiera ratujący mini gen MVA. Tak dobrze wstrzyknięte zwierzęta rozwiną uratowane melanocyty, które wyrażają interesujący nas gen.

Inkubować wstrzyknięte zarodki w temperaturze 28,5 stopni Celsjusza po 24 godzinach od zapłodnienia lub HPF. Usuń martwe zarodki po 72 godzinach od zapłodnienia za pomocą mikroskopu preparacyjnego w świetle padającym na białym tle. Wybierz transgeniczne zwierzęta z uratowanymi melanocytami.

Gdy zwierzęta osiągną cztery dni po zapłodnieniu, przenieś je do trzylitrowych zbiorników w odchowalni danio pręgowanego. W wieku dwóch miesięcy wybierz zwierzęta, których co najmniej jeden obszar ratowania melanocytów jest większy niż cztery milimetry kwadratowe. Co tydzień badaj wybrane zwierzęta pod kątem obecności guzów.

Wyizoluj zwierzęta z nowotworem do badań. Narysuj krzywe przeżycia wolnego od czerniaka z wiekiem w tygodniach na absa i procentowym przeżyciem wolnym od czerniaka na rzędnej. Porównaj zwierzęta z melanocytami, które wyrażają interesujący gen, ze zwierzętami kontrolnymi, które wyrażają EGFP i melanocyty.

Użyj testu logarytmicznej, aby określić, czy te dwie krzywe różnią się statystycznie. Aby wykonać test inwazji guza. Zacznij od wybrania izolowanych ryb danio pręgowanego, u których guzy rozwijają się grzbietowo w obszarze między tylną granicą tylnego mózgu a przednią granicą płetwy grzbietowej.

Dwa tygodnie po wystąpieniu czerniaka użyj trica do eutanazji ryby po utrwaleniu i zanurzeniu ryby w parafinie. Wykonaj pięć mikrometrowych przekrojów poprzecznych przez zmiany. Jeden. Co 50 mikrometrów przecina całą zmianę, aby można było zidentyfikować punkt najgłębszej inwazji.

Użyj hematyny i eoiny do zabarwienia sekcji. Oceń inwazję guza, mierząc, czy komórki nowotworowe pozostają poza warstwą kolagenową, zaatakują mięśnie grzbietowe, czy też wkroczą dalej w kręgosłup. Określ różnicę statystyczną między dwoma zestawami próbek, aby przeprowadzić barwienie immunologiczne.

Znieczulij rybę w 0,17 miligrama na mililitr trica ze światłem padającym pod mikroskopem preparacyjnym. Użyj ostrych, drobno zakończonych kleszczy, aby wyrwać łuski grzbietowe. Uważając, aby nie uszkodzić melanocytu zawierającego połowę łuski.

Umieść łuski bezpośrednio z kleszczy w jednym mililitrze utrwalacza i inkubuj w temperaturze pokojowej, obracając się przez co najmniej dwie godziny. Przenieś rybę do wody dla ryb i monitoruj ryby, aby potwierdzić pomyślne odzyskanie do wybielających pigmentowanych melanocytów. Najpierw umyj ustaloną wagę w PBST dwa razy przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Następnie dodaj jeden mililitr świeżo przygotowanego roztworu wybielacza i przykryj perfumami lub zakrętkami, aby zapobiec pękaniu rurek przez gaz. Kontynuuj wybielanie, aż pigment zniknie. Następnie umyj w PBST cztery razy na pięć minut w temperaturze pokojowej.

Inkubować przez co najmniej 30 minut w roztworze blokowym, a następnie inkubować z około 400 mikrolitrami przeciwciała pierwszorzędowego i roztworu blokowego przez noc W temperaturze pokojowej następnego dnia umyć łuski trzy razy przez 30 minut w PBS w temperaturze pokojowej, inkubować z przeciwciałem drugorzędowym przez dwie godziny do nocy w temperaturze pokojowej. Po staniu z dpi nałóż kroplę osłony wektorowej na szklane szkiełko i zamontuj skale tak, aby wklęsła strona łusek była skierowana w dół w stosunku do szkiełka. Na próbki nałożyć szklaną szkiełko nakrywkowe.

Użyj przezroczystego lakieru do paznokci, aby uszczelnić krawędzie i obserwuj szkiełka pod mikroskopem fluorescencyjnym. Po napromieniowaniu biorcy, dwu- lub trzymiesięczna ryba Casper z 25 szarymi promieniami gamma na jeden dzień przed przeszczepem. Pozwól rybie zregenerować się w wodzie dla ryb.

Użyj trica do eutanazji ryby zawierającej guz, odetnij guz i umieść go na szalce Petriego z około pięcioma mililitrami filtra wysterylizowanego 0,9 XPBS z 5% FBS za pomocą żyletki kostką guz w roztworze działającym w temperaturze pokojowej i za pomocą pipety P 1000 iteruj w celu wytworzenia pojedynczych komórek. Zwiększ objętość do 25 mililitrów. Przefiltrować roztwór przez filtr siatkowy o wielkości 40 mikrometrów i wirować w wirówce stołowej przy 453 RCF przez 10 minut.

Ponownie zawiesić osad w 0,9%PBS 5%FBS do pożądanego stężenia. Za pomocą cytometru hemologicznego oblicz dokładną liczbę komórek i rozcieńcz zawiesinę komórek tak, aby końcowa objętość wstrzyknięcia wynosiła około pięciu mikrolitrów. Na przykład, jeśli ma zostać wstrzykniętych 50 000 komórek, zawiesinę komórek należy rozcieńczyć do końcowego stężenia 10 000 komórek na mikrolitr.

Przesuwaj probówkę zawierającą zawiesinę komórek co kilka minut, aby zapobiec zlepianiu się komórek ze 100% etanolem i 0,9 XPBS. Umyj końcówkę skośną 26 s 7, 0, 1 i 10 mikrolitrów strzykawki Hamiltona dwa do trzech razy przed załadowaniem strzykawki pięcioma mikrolitrami zawiesiny komórek. Po znieczuleniu napromieniowanej ryby biorcy in trica, połóż ją na boku na wilgotnej chusteczce Kim.

Ustabilizuj rybę jedną ręką i włóż igłę skosem skierowanym do góry pod kątem 45 stopni w bok ryby powyżej jamy otrzewnej. Mniej więcej w połowie odległości między tylną granicą tylnego mózgu a przednią granicą płetwy grzbietowej. Delikatnie wcisnąć tłok.

Pozwól rybom zregenerować się w słodkiej wodzie rybnej i codziennie obserwuj ryby pod kątem wszczepienia guza. Jeśli doszło do wszczepienia, można również zaobserwować ciągły wzrost i rozwój choroby. Jednokomórkowym zarodkom zebryka zebry BRAF FP 53 MIFA wstrzyknięto mini wektor Coopera zawierający zestaw onkogenów czerniaka DB one lub EGFP każdy pod kontrolą promotora MFA, jak pokazano tutaj.

Krzywe zapadalności na nowotwory u dorosłych wykazały, że SET DB one znacznie przyspieszył początek czerniaka w porównaniu z kontrolą EGFP, jak widać tutaj, barwienie hematyną i EOSIN pokazuje, że czerniaki z ekspresją SET DB one były bardziej inwazyjne miejscowo niż czerniaki kontrolne EGFP. Rysunek ten przedstawia wybielone lub niebielone łuski grzbietowe danio pręgowanego, które zostały wybarwione przeciwciałem rozpoznającym jądrowy zlokalizowany czynnik transkrypcyjny mifa w celu oceny zdolności guza do przeszczepu. Komórki czerniaka wyizolowano z ryby mifa BRAF FP 53, której wstrzyknięto mini bańkę R-E-G-F-P, 50 000 komórek wstrzyknięto podskórnie do biorcy mutanta Caspera, który został napromieniowany dzień wcześniej 25 grejami, jak widać tutaj w wieku dwóch tygodni.

Pigmentowane komórki pochodzące od dawcy były łatwe do rozpoznania. Tak więc po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią nowotworów do badania funkcjonalnych konsekwencji zmian genetycznych związanych z czerniakiem przy użyciu danio pręgowanego. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak badać modyfikatory czerniaka za pomocą testu, różnic w inwazji guza, ekspresji genów i zdolności do przeszczepu przy użyciu automatycznego modelu guza danio pręgowanego.