Name: Badania przesiewowe w kierunku modyfikatorów czerniaka przy użyciu autochtonicznego modelu guza danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Poznaj metodę przesiewową modyfikatorów czerniaka przy użyciu autochtonicznego modelu guza Danio rerio. Technika ta umożliwia szybką analizę genów wpływających na inicjację i progresję nowotworu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. Leonardowi I. Zonowi, w którego laboratorium te techniki zostały początkowo opracowane; Kristen Kwan i nieżyjącej już Chi-Bin Chien za dary w postaci plazmidów użytych w tej pracy; Jamesowi Listerowi i Davidowi Raible'owi za pomoc w barwieniu przeciwciał; oraz Jamesowi Neiswenderowi za film o mikroiniekcji. Ta praca została sfinansowana z grantu NIH R00AR056899-03 dla CJC.

1. Badania przesiewowe w kierunku modyfikatorów początku czerniaka
<ol>
	<li>Tworzenie klonów środkowego wejścia Gateway metodą PCR amplifikuje pełnowymiarową otwartą ramkę odczytu genów będących przedmiotem zainteresowania (GOI) i rekombinuje do pDONR 221 przy użyciu klonazy BP II (Invitrogen). Użyj technologii Multisite Gateway (Invitrogen) do rekombinacji p5E_mitfa, pME_GOI, Tol2kit #302 p3E_SV40polyA6 i miniCoopR5, aby umieścić interesujące geny pod promotorem mitfa w wektorze miniCoopR (Figura 1A).</li>
	<li>Wstrzyknij 25 pikogramów każdego klonu wraz z 25 pikogramami mRNA transpozazy Tol2 do jednokomórkowego Tg (mitfa: BRAFV600E); P53(LF); Mitfa(lf)potrójnie homozygotyczne zarodki danio pręgowanego, jak opisano wcześniej7. Inkubować wstrzyknięte zarodki w temperaturze 28,5 °C. Usunąć wszelkie martwe zarodki w temperaturze 24 hpf.</li>
	<li>Wybierz transgeniczne zwierzęta z uratowanymi melanocytami w temperaturze 72 hpf, umieszczając szalkę Petriego zawierającą wstrzyknięte zarodki na mikroskopie preparacyjnym pod padającym światłem na białym tle (ryc. 1A).</li>
	<li>Przenieść zwierzęta do zbiorników o pojemności 3 litrów w odchowalni danio pręgowanego przy 4 dpf, jak opisano wcześniej8.</li>
	<li>W wieku 2 miesięcy wybierz zwierzęta, u których co najmniej jeden obszar ratowania melanocytów jest większy niż 4mm2 (ryc. 1A). Istnieje silna korelacja między stopniem uratowania melanocytów przy 72 hpf a stopniem uratowania melanocytów po 2 miesiącach. Kiedy zarodki z uratowanymi melanocytami zostaną wybrane przy 72 hpf, większość z nich (~ 80%) będzie miała co najmniej jeden obszar ratowania melanocytów większy niż 4 mm2 po 2 miesiącach.</li>
	<li>Co tydzień badaj wybrane zwierzęta pod kątem obecności guzów (ryc. 1B). Istnieje silna korelacja między zmianami histopatologicznymi i morfologicznymi. Przejście od łagodnego do złośliwego jest rozpoznawane jako zmiana morfologiczna, gdy zmiany unoszą się nad powierzchnię zwierzęcia. Wyizoluj zwierzęta z nowotworem do badań.</li>
	<li>Narysuj krzywe przeżycia wolnego od czerniaka wraz z wiekiem w tygodniach na odciętej i procentem przeżycia wolnego od czerniaka na rzędnej. Zwierzęta z melanocytami, które wyrażają interesujący gen, są porównywane ze zwierzętami kontrolnymi, które wyrażają EGFP (wzmocnione białko zielonej fluorescencji) w melanocytach (ryc. 1C). Mediana początku występowania nowotworu u zwierząt, którym wstrzyknięto miniCoopR-EGFP, wynosi około 18 tygodni. Określ, czy te dwie krzywe różnią się statystycznie, korzystając z testu logarytmicznej.</li>
</ol>
2. Test inwazji nowotworu
<ol>
	<li>Wybierz izolowanego danio pręgowanego, u którego guzy rozwijają się grzbietowo, w regionie między tylną granicą tyłomózgowia a przednią granicą płetwy grzbietowej (ryc. 2A).</li>
	<li>Dwa tygodnie po wystąpieniu czerniaka należy poddać ryby eutanazji zgodnie z wytycznymi określonymi przez Panel ds. Eutanazji Amerykańskiego Towarzystwa Lekarzy Weterynaryjnych i zatwierdzonymi przez University of Massachusetts Medical School, Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). W szczególności rybę umieszcza się w naczyniu z 0,6 mg/ml tricainy, aż do ustania ruchu skrzeli.</li>
	<li>Wykonać nacięcie w jamie otrzewnej ryby za pomocą skalpela, a następnie umieścić rybę w 4% paraformaldehydzie (PFA) na noc w temperaturze 4 °C w celu utrwalenia.</li>
	<li>Traktować 0,5 M EDTA przez noc w temperaturze 4 °C w celu odwapnienia.</li>
	<li>Utrwalić formaliną w kasecie przez noc, odwodnić przez 1 godzinę, oczyścić ksylenem 3 razy przez 1 godzinę, a następnie potraktować parafiną 2 razy przez 2 godziny w temperaturze 60 °C.</li>
	<li>Zanurz tkankę w parafinie w formie i pozwól jej zastygnąć przez 30 minut do 1 godziny.</li>
	<li>Wykonaj 5 μm sekcji, po jednej co 50 μm. Odcinki powinny być poprzeczne i przechodzące przez całą zmianę, aby można było zidentyfikować punkt najgłębszej inwazji. Następnie wykonaj barwienie hematoksyliną i eozyną.</li>
	<li>Oceń inwazję guza, mierząc, czy komórki nowotworowe pozostają poza warstwą zbitą kolagenu, atakują mięśnie grzbietowe, czy też atakują dalej w kręgosłupie (ryc. 2B, C). Określ różnicę statystyczną między dwoma zestawami próbek.</li>
</ol>
3. Barwienie przeciwciałami melanocytów łuskowych
<ol>
	<li>Uzupełnić bufor PO4 80 ml 0,1 M Na2HPO4 i 20 ml 0,1 M NaH2PO4. Upewnij się, że pH wynosi 7,3. Uzupełnić 2 razy utrwalony bufor zawierający 8,0 g sacharozy, 0,15 ml 0,2 M CaCl2 i 90 ml 0,2 M buforu PO4 o pH 7,3. W razie potrzeby dostosować pH do 7,3 za pomocą NaOH lub HCl, a następnie uzupełnić do 100 ml buforem PO4</li>.
	<li>Odważyć do 300 mg stałego PFA i dodać do probówki do mikrowirówki. Dodać 5 mM NaOH do objętości równej 4,5 x masie PFA w mg (np. 450 ul 5 mM NaOH do 100 mg PFA). Ogrzewać w temperaturze 60-70 °C, od czasu do czasu wstrząsając, aż do rozpuszczenia PFA. Odkręć pozostałe cząstki i odzyskaj 20% supernatantu PFA. Zrób świeże za każdym razem.</li>
	<li>Przygotować roztwór utrwalający zawierający 1x bufor utrwalający i 4% PFA.</li>
	<li>Znieczulić ryby w 0,17 mg/ml tricainy.</li>
	<li>Używając padającego światła pod mikroskopem preparacyjnym, wyrwij łuski grzbietowe za pomocą ostrych kleszczy z cienką końcówką, uważając, aby nie uszkodzić połowy skali zawierającej melanocyty (ryc. 3A). Umieść łuski bezpośrednio z kleszczyków w 1 ml roztworu utrwalającego i inkubuj w temperaturze pokojowej, obracając przez ≥ 2 godziny. Przenieś rybę do wody dla ryb i monitoruj ryby, aby potwierdzić pomyślne wyzdrowienie.</li>
	<li>Aby wybielić pigmentowane melanocyty, umyj ustalone łuski w PBST (1x PBS pH 7,4, 0,1% Triton X-100) 2 razy przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Dodać 1 ml świeżo przygotowanego roztworu wybielacza zawierającego 0,4 ml 10% KOH i 0,15 ml 30% H2O2 w 5 ml z dH2O. Załóż parafilm lub zamki nasadkowe, aby zapobiec rozerwaniu probówek przez gaz. Kontynuuj wybielanie, aż pigment zniknie (zazwyczaj 10 minut) (ryc. 3B,C). Prać w PBST cztery razy przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Blokować przez co najmniej 30 minut w roztworze blokowym składającym się z 1x PBS pH 7,4, 0,2% Triton X-100, 2 mg/ml BSA, 1% DMSO, 0,02% NaN3 i 2% surowicy jagnięcej. Pomiń NaN3, jeśli rozwija się z reakcją HRP.</li>
	<li>Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym w roztworze blokowym przez noc w temperaturze pokojowej. Musisz mieć co najmniej 400 μl roztworu na próbkach, aby były zanurzone.</li>
	<li>Umyj wagę 3 razy przez 30 minut w PBST w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi przez 2 godziny do nocy w roztworze blokowym w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Barwienie przez 10 minut za pomocą PBST+ 0,1 μM DAPI.</li>
	<li>Umyć 3 razy przez 5 minut za pomocą PBST.</li>
	<li>Zamontuj wagę na szkiełku podstawowym w kropli vectashield tak, aby wklęsła strona wagi była skierowana w dół w kierunku szkiełka i umieść na nich szkiełko zakrywające. Uszczelnij krawędzie szkiełka przezroczystym lakierem do paznokci i obserwuj szkiełka pod mikroskopem fluorescencyjnym (rysunek 3D, E, F, G).</li>
</ol>
4. Test transplantacyjny
<ol>
	<li>Przygotować biorcę 2-3 miesięcznej rybki casper9 poprzez napromieniowanie promieniowaniem gamma 25 Gy na dzień przed przeszczepem10. Pozwól rybie zregenerować się w wodzie dla ryb.</li>
	<li>Poddaj eutanazji rybę z nowotworem, jak opisano wcześniej (sekcja 2.2).</li>
	<li>Odetnij guz i umieść go na szalce Petriego z około 5 ml filtrem wysterylizowanym 0,9x PBS z 5% FBS. Pokrój guz w kostkę brzytwą w roztworze.</li>
	<li>Pracując w temperaturze pokojowej, rozcieraj pipetą P1000, aby uzyskać pojedyncze komórki. Uzupełnić objętość do 25 ml za pomocą filtra wysterylizowanego 0,9x PBS z 5% FBS.</li>
	<li>Przefiltruj przez filtr siatkowy 40 μM.</li>
	<li>Wirować w wirówce stołowej Eppendorf 5810R z prędkością 1 500 obr./min (453 obr./min) przez 10 minut.</li>
	<li>Usunąć supernatant i wykonać zawiesinę komórek do mniej więcej pożądanego stężenia (załóżmy, że 10 7 komórek na guz o średnicy 100 mm3).</li>
	<li>Obliczyć dokładną liczbę komórek za pomocą hemocytometru i rozcieńczyć zawiesinę komórek tak, aby końcowa objętość wstrzyknięcia wynosiła około 5 μl. Na przykład, jeśli ma zostać wstrzykniętych 50 000 komórek, zawiesinę komórek należy rozcieńczyć do końcowego stężenia 10 000 komórek/μl. Przesuwaj probówkę zawierającą zawiesinę komórek co kilka minut, aby zapobiec zlepianiu się komórek.</li>
	<li>Umyj strzykawkę Hamilton 26s gauge (końcówka skośna) 701 N 10 μl 2-3 razy 100% etanolem i 0,9x PBS. Umieścić w strzykawce 5 μl zawiesiny komórek.</li>
	<li>Napromieniowaną rybę biorcę znieczulić 0,17 mg/ml trikainy. Umieść rybę na boku na wilgotnej chusteczce Kimwipe (Rysunek 4A).</li>
	<li>Ustabilizować rybę jedną ręką i wprowadzić igłę skosem skierowanym do góry pod kątem 45° w bok ryby powyżej jamy otrzewnej, mniej więcej w połowie odległości między tylną granicą tyłomózgowia a przednią granicą płetwy grzbietowej. Delikatnie wciśnij tłok (Rysunek 4B).</li>
	<li>Pozwól rybom zregenerować się w słodkiej wodzie dla ryb i codziennie obserwuj ryby pod kątem wszczepienia guza (ryc. 4C). Jeśli doszło do wszczepienia, można również zaobserwować ciągły wzrost i rozwój choroby.</li>
</ol>

<ol><li>Beroukhim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+of+somatic+copy-number+alteration+across+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The landscape of somatic copy-number alteration across human cancers.</a> Nature. 463, 899-905 (2010).</li>
<li>Curtin, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+sets+of+genetic+alterations+in+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Distinct sets of genetic alterations in melanoma.</a> N. Engl. J. Med. 353, 2135-2147 (2005).</li>
<li>Lin, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+genomic+diversity+and+tumor+dependency+in+malignant+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Modeling genomic diversity and tumor dependency in malignant melanoma.</a> Cancer Res. 68, 664-673 (2008).</li>
<li>Patton, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRAF+mutations+are+sufficient+to+promote+nevi+formation+and+cooperate+with+p53+in+the+genesis+of+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma.</a> Curr. Biol. 15, 249-254 (2005).</li>
<li>Ceol, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+methyltransferase+SETDB1+is+recurrently+amplified+in+melanoma+and+accelerates+its+onset%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The histone methyltransferase SETDB1 is recurrently amplified in melanoma and accelerates its onset.</a> Nature. 471, 513-517 (2011).</li>
<li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tol2kit%3A+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Dev. Dyn. 236, 3088-3099 (2007).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115(2009).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+of+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide of the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4, University of Oregon Press. (2000).</li>
<li>White, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).</li>
<li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nat. Immunol. 4, 1238-1246 (2003).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Metoda miniCoopR umożliwia ekspresję interesujących genów w melanocytach danio pręgowanego. Takie podejście wykorzystuje fakt, że gen mitfa danio pręgowanego działa autonomicznie komórkowo. Z tego powodu melanocyty uratowane przez wektor miniCoopR z pewnością zawierają minigen i każdy gen będący przedmiotem zainteresowania, z którym jest on fizycznie sprzężony. Uratowane melanocyty są wyraźnie widoczne i można je uzyskać u zwierząt, którym wstrzyknięto zarodki jednokomórkowe. Wybierany jest określony stopień chi...

<table><tbody><tr><td>Odczynniki do rekombinacji bramy</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>miniCoopR</td><td></td><td></td><td>Nr referencyjny5</td></tr><tr><td>Mitfa przeciwciało</td><td></td><td></td><td>referencyjne5FITC</td></tr> <tr><td>kozie przeciwciało anty-królicze IgG</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td> casper Danio pręgowany</td><td></td><td></td><td>Referencje9</td></tr><tr><td>701N 10 &mu; l Strzykawka</td><td>Hamilton/Fisher</td><td>14-824</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; M filtr</td><td>BD Falcon/Fisher</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>26140079</td><td></td></tr></tbody></table>

badania przesiewowe w kierunku modyfikatorów czerniaka przy użyciu autochtonicznego modelu guza danio pręgowanego

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Badania genomiczne ludzkich nowotworów dostarczyły wielu informacji na temat genów, które są zmienione w nowotworach1,2,3. Wyzwaniem wynikającym z tych badań jest to, że wiele genów jest zmienionych i może być trudno odróżnić zmiany genetyczne, które napędzały nowotworzenie od tych, które powstały przypadkowo podczas transformacji. Aby dokonać tego rozróżnienia, korzystne jest posiadanie testu, który może ilościowo zmierzyć wpływ zmienionego genu na inicjację guza i inne procesy, które umożliwiają przetrwanie i rozprzestrzenianie się guzów. W tym miejscu przedstawiamy szybki sposób badania przesiewowego dużej liczby potencjalnych modyfikatorów czerniaka u danio pręgowanego przy użyciu autochtonicznego modeluguza 4, który obejmuje etapy wymagane do inicjacji i utrzymania czerniaka. Kluczowym odczynnikiem w tym teście jest wektor miniCoopR, który łączy dziką kopię czynnika specyfikacji melanocytów mitfa z kasetą rekombinacji Gateway, do której można rekombinować geny kandydujące na czerniaka5. Wektor miniCoopR ma minigen ratujący mitfa, który zawiera promotor, otwartą ramkę odczytu i nieulegający translacji region 3' genu mitfa typu dzikiego. Pozwala nam to na tworzenie konstruktów przy użyciu pełnowymiarowych otwartych ramek odczytu potencjalnych modyfikatorów czerniaka. Te indywidualne klony można następnie wstrzyknąć do pojedynczej komórki Tg (mitfa: BRAFV600E); P53(LF); Mitfa(LF)Zarodki danio pręgowanego. Wektor miniCoopR zostaje zintegrowany przez transgenezęza pośrednictwem Tol2 6 i ratuje melanocyty. Ponieważ są one fizycznie sprzężone z minigenem ratującym mitfa, geny kandydujące ulegają ekspresji w uratowanych melanocytach, z których niektóre przekształcą się i rozwiną w guzy. Wpływ genu kandydującego na inicjację czerniaka i właściwości komórek czerniaka można zmierzyć za pomocą krzywych przeżycia wolnych od czerniaka, testów inwazji, barwienia przeciwciałami i testów transplantacyjnych.

Jednokomórkowe embriony zebrafish Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf) zostały wstrzyknięte wektorem miniCoopR zawierającym onkogen czerniaka SETDB15 lub EGFP, każdy pod kontrolą promotora mitfa. Wyselekcjonowano embriony z uratowaniem melanocytów i pozostawiono je do dojrzewania. W wieku 2 miesięcy wybrano zwierzęta z uratowaniem melanocytów o powierzchni większej niż 4 mm2. Zwierzęta były badane co tydzień pod kątem występowania czerniaków. Krzywe zapa...

Przedstawiono szybki sposób na badanie modyfikatorów czerniaka za pomocą autochtonicznego modelu guza danio pręgowanego. Wykorzystuje wektor miniCoopR, który pozwala na ekspresję genów kandydujących na czerniaka w melanocytach. Opisano metodę uzyskiwania krzywych przeżycia wolnych od czerniaka, test inwazji, protokół barwienia przeciwciałami melanocytów łuskowych oraz test przeszczepiania czerniaka.

Badania przesiewowe w kierunku modyfikatorów czerniaka przy użyciu autochtonicznego modelu guza danio pręgowanego

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest badanie przesiewowe pod kątem modyfikatorów czerniaka przy użyciu modelu autogennego guza danio pręgowanego. Osiąga się to poprzez tworzenie transgenicznych zwierząt, u których melanocyty wyrażają interesujący gen, a ryby są predysponowane do czerniaka. Następnie ocenia się początek czerniaka, aby ocenić, czy gen będący przedmiotem zainteresowania zmienia inicjację guza.Następnie przeprowadza się inwazję guza i testy specyficzne dla komórek w celu określenia dodatkowego wpływu interesującego genu na czerniaki i melanocyty przednowotworowe. Na koniec przeszczepia się komórki czerniaka w celu zmierzenia, w jaki sposób interesujący nas gen wpływa na częstotliwość komórek inicjujących czerniaka w ustalonych nowotworach. Wyniki pokazują, w jaki sposób gen kandydujący wpływa na różne właściwości melanocytów i czerniaka, w tym na początek inwazji i zdolność do przeszczepu.Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak transgeneza linii zarodkowej do badania potencjalnych genów raka, jest oszczędność czasu, wysiłku i kosztów, a wydajność jest zwiększona dzięki testowi. Różne aspekty nowotworu u zwierząt transgenicznych gongu Demonstrując tę procedurę, będzie to agar sherania, doktorant w moim laboratorium Aby wygenerować konstrukty do wstrzykiwania. Zacznij od stworzenia klonów środkowego wejścia bramy za pomocą PCR, amplifikując pełną długość otwartej ramki odczytu interesujących genów i rekombinując do P don R 2 21.Następnie użyj technologii bramy wielomiejscowej, aby ponownie zrekombinować specyficzny dla melanocytów gen promotora mifa i sygnał poliadenylacji do wektora mini Coopera, aby umieścić interesujące geny pod kontrolą promotora mifa, wstrzyknąć 25 pikogramów każdego klonu, wraz z 25 pikogramami TOL dwa transponują mRNA do jednej komórki transgenicznych potrójnych homozygotycznych zarodków danio pręgowanego. Mifa BRAF FP 53. Zmutowane zwierzęta mają niedobór melanocytów i są podatne na transformację i tworzenie czerniaka.Wraz z genem zainteresowania. Wektor mini Coopera zawiera ratujący mini gen MVA. Tak dobrze wstrzyknięte zwierzęta rozwiną uratowane melanocyty, które wyrażają interesujący nas gen.Inkubować wstrzyknięte zarodki w temperaturze 28,5 stopni Celsjusza po 24 godzinach od zapłodnienia lub HPF. Usuń martwe zarodki po 72 godzinach od zapłodnienia za pomocą mikroskopu preparacyjnego w świetle padającym na białym tle. Wybierz transgeniczne zwierzęta z uratowanymi melanocytami.Gdy zwierzęta osiągną cztery dni po zapłodnieniu, przenieś je do trzylitrowych zbiorników w odchowalni danio pręgowanego. W wieku dwóch miesięcy wybierz zwierzęta, których co najmniej jeden obszar ratowania melanocytów jest większy niż cztery milimetry kwadratowe. Co tydzień badaj wybrane zwierzęta pod kątem obecności guzów.Wyizoluj zwierzęta z nowotworem do badań. Narysuj krzywe przeżycia wolnego od czerniaka z wiekiem w tygodniach na absa i procentowym przeżyciem wolnym od czerniaka na rzędnej. Porównaj zwierzęta z melanocytami, które wyrażają interesujący gen, ze zwierzętami kontrolnymi, które wyrażają EGFP i melanocyty.Użyj testu logarytmicznej, aby określić, czy te dwie krzywe różnią się statystycznie. Aby wykonać test inwazji guza. Zacznij od wybrania izolowanych ryb danio pręgowanego, u których guzy rozwijają się grzbietowo w obszarze między tylną granicą tylnego mózgu a przednią granicą płetwy grzbietowej.Dwa tygodnie po wystąpieniu czerniaka użyj trica do eutanazji ryby po utrwaleniu i zanurzeniu ryby w parafinie. Wykonaj pięć mikrometrowych przekrojów poprzecznych przez zmiany. Jeden. Co 50 mikrometrów przecina całą zmianę, aby można było zidentyfikować punkt najgłębszej inwazji.Użyj hematyny i eoiny do zabarwienia sekcji. Oceń inwazję guza, mierząc, czy komórki nowotworowe pozostają poza warstwą kolagenową, zaatakują mięśnie grzbietowe, czy też wkroczą dalej w kręgosłup. Określ różnicę statystyczną między dwoma zestawami próbek, aby przeprowadzić barwienie immunologiczne.Znieczulij rybę w 0,17 miligrama na mililitr trica ze światłem padającym pod mikroskopem preparacyjnym. Użyj ostrych, drobno zakończonych kleszczy, aby wyrwać łuski grzbietowe. Uważając, aby nie uszkodzić melanocytu zawierającego połowę łuski.Umieść łuski bezpośrednio z kleszczy w jednym mililitrze utrwalacza i inkubuj w temperaturze pokojowej, obracając się przez co najmniej dwie godziny. Przenieś rybę do wody dla ryb i monitoruj ryby, aby potwierdzić pomyślne odzyskanie do wybielających pigmentowanych melanocytów. Najpierw umyj ustaloną wagę w PBST dwa razy przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Następnie dodaj jeden mililitr świeżo przygotowanego roztworu wybielacza i przykryj perfumami lub zakrętkami, aby zapobiec pękaniu rurek przez gaz. Kontynuuj wybielanie, aż pigment zniknie. Następnie umyj w PBST cztery razy na pięć minut w temperaturze pokojowej.Inkubować przez co najmniej 30 minut w roztworze blokowym, a następnie inkubować z około 400 mikrolitrami przeciwciała pierwszorzędowego i roztworu blokowego przez noc W temperaturze pokojowej następnego dnia umyć łuski trzy razy przez 30 minut w PBS w temperaturze pokojowej, inkubować z przeciwciałem drugorzędowym przez dwie godziny do nocy w temperaturze pokojowej. Po staniu z dpi nałóż kroplę osłony wektorowej na szklane szkiełko i zamontuj skale tak, aby wklęsła strona łusek była skierowana w dół w stosunku do szkiełka. Na próbki nałożyć szklaną szkiełko nakrywkowe.Użyj przezroczystego lakieru do paznokci, aby uszczelnić krawędzie i obserwuj szkiełka pod mikroskopem fluorescencyjnym. Po napromieniowaniu biorcy, dwu- lub trzymiesięczna ryba Casper z 25 szarymi promieniami gamma na jeden dzień przed przeszczepem. Pozwól rybie zregenerować się w wodzie dla ryb.Użyj trica do eutanazji ryby zawierającej guz, odetnij guz i umieść go na szalce Petriego z około pięcioma mililitrami filtra wysterylizowanego 0,9 XPBS z 5% FBS za pomocą żyletki kostką guz w roztworze działającym w temperaturze pokojowej i za pomocą pipety P 1000 iteruj w celu wytworzenia pojedynczych komórek. Zwiększ objętość do 25 mililitrów. Przefiltrować roztwór przez filtr siatkowy o wielkości 40 mikrometrów i wirować w wirówce stołowej przy 453 RCF przez 10 minut.Ponownie zawiesić osad w 0,9%PBS 5%FBS do pożądanego stężenia. Za pomocą cytometru hemologicznego oblicz dokładną liczbę komórek i rozcieńcz zawiesinę komórek tak, aby końcowa objętość wstrzyknięcia wynosiła około pięciu mikrolitrów. Na przykład, jeśli ma zostać wstrzykniętych 50 000 komórek, zawiesinę komórek należy rozcieńczyć do końcowego stężenia 10 000 komórek na mikrolitr.Przesuwaj probówkę zawierającą zawiesinę komórek co kilka minut, aby zapobiec zlepianiu się komórek ze 100% etanolem i 0,9 XPBS. Umyj końcówkę skośną 26 s 7, 0, 1 i 10 mikrolitrów strzykawki Hamiltona dwa do trzech razy przed załadowaniem strzykawki pięcioma mikrolitrami zawiesiny komórek. Po znieczuleniu napromieniowanej ryby biorcy in trica, połóż ją na boku na wilgotnej chusteczce Kim.Ustabilizuj rybę jedną ręką i włóż igłę skosem skierowanym do góry pod kątem 45 stopni w bok ryby powyżej jamy otrzewnej. Mniej więcej w połowie odległości między tylną granicą tylnego mózgu a przednią granicą płetwy grzbietowej. Delikatnie wcisnąć tłok.Pozwól rybom zregenerować się w słodkiej wodzie rybnej i codziennie obserwuj ryby pod kątem wszczepienia guza. Jeśli doszło do wszczepienia, można również zaobserwować ciągły wzrost i rozwój choroby. Jednokomórkowym zarodkom zebryka zebry BRAF FP 53 MIFA wstrzyknięto mini wektor Coopera zawierający zestaw onkogenów czerniaka DB one lub EGFP każdy pod kontrolą promotora MFA, jak pokazano tutaj.Krzywe zapadalności na nowotwory u dorosłych wykazały, że SET DB one znacznie przyspieszył początek czerniaka w porównaniu z kontrolą EGFP, jak widać tutaj, barwienie hematyną i EOSIN pokazuje, że czerniaki z ekspresją SET DB one były bardziej inwazyjne miejscowo niż czerniaki kontrolne EGFP. Rysunek ten przedstawia wybielone lub niebielone łuski grzbietowe danio pręgowanego, które zostały wybarwione przeciwciałem rozpoznającym jądrowy zlokalizowany czynnik transkrypcyjny mifa w celu oceny zdolności guza do przeszczepu. Komórki czerniaka wyizolowano z ryby mifa BRAF FP 53, której wstrzyknięto mini bańkę R-E-G-F-P, 50 000 komórek wstrzyknięto podskórnie do biorcy mutanta Caspera, który został napromieniowany dzień wcześniej 25 grejami, jak widać tutaj w wieku dwóch tygodni.Pigmentowane komórki pochodzące od dawcy były łatwe do rozpoznania. Tak więc po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią nowotworów do badania funkcjonalnych konsekwencji zmian genetycznych związanych z czerniakiem przy użyciu danio pręgowanego. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak badać modyfikatory czerniaka za pomocą testu, różnic w inwazji guza, ekspresji genów i zdolności do przeszczepu przy użyciu automatycznego modelu guza danio pręgowanego.

screening-for-melanoma-modifiers-using-zebrafish-autochthonous-tumor

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Badanie modyfikatorów czerniaka przy użyciu modelu guzów autochtonicznych u danio prążkowanego

Ten film opisuje metodę badań przesiewowych genów modyfikujących czerniaka za pomocą transgenicznego modelu guza danio pręgowanego. Po wstrzyknięciu indukującego czerniaka wektora miniCoopR danio pręgowany rozwija czerniaka i dlatego może być wykorzystany do badania czynników genetycznych wpływających na rozwój guza u danio pręgowanego.

Transgeneza wektorowa miniCoopR: technika badań przesiewowych genów indukujących czerniaka w modelu guza danio pręgowanego

Ten film opisuje metodę barwienia przeciwciał w celu wykrycia ekspresji czynników transkrypcyjnych w melanocytach związanych z łuską grzbietową modeli danio pręgowanego. Ta technika barwienia immunologicznego pomaga w specyficznej identyfikacji czynnika transfekcji A indukującego melanocyty u transgenicznego danio pręgowanego.

Barwienie przeciwciałami melanocytów łuskowych: technika wykrywania czynników transkrypcyjnych wyrażanych w melanocytach związanych z łuską grzbietową modeli danio pręgowanego

Ten film opisuje metodę przeszczepu komórek nowotworowych z modelu dawcy czerniaka do biorcy z obniżoną odpornością, zebry Casper. Pomaga uwidocznić wszczepienie i proliferację guza u ryb biorcy.

Test przeszczepu podskórnego: metoda przeszczepiania komórek czerniaka od dawcy do biorcy modelu danio pręgowanego

Celem tego badania jest pokazanie, jak strategia transgenezy mozaiki może być wykorzystana u danio pręgowanego, aby szybko i skutecznie ocenić względny wkład wielu onkogenów w inicjację i progresję guza in vivo.

Mozaikowa transgeneza danio pręgowanego do funkcjonalnej analizy genomowej kandydujących genów kooperacyjnych w patogenezie nowotworu

Przeszczepianie komórek nowotworowych jest ważnym narzędziem do identyfikacji mechanizmów nowotworowych i odpowiedzi terapeutycznych. Obecne techniki opierają się na zwierzętach niekompetentnych immunologicznie. W tym miejscu opisujemy metodę przeszczepiania komórek nowotworowych danio pręgowanego do zarodków kompetentnych immunologicznie w celu długoterminowej analizy zachowania komórek nowotworowych i odpowiedzi na leki in vivo.

Przeszczepianie pediatrycznych guzów mózgu danio pręgowanego do gospodarzy kompetentnych immunologicznie w celu długoterminowego badania zachowania komórek nowotworowych i odpowiedzi na leki

Modele ksenoprzeszczepów danio pręgowanego pozwalają na wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków i obrazowanie fluorescencyjne ludzkich komórek nowotworowych w mikrośrodowisku in vivo. Opracowaliśmy przepływ pracy do zautomatyzowanych badań przesiewowych leków na dużą skalę na próbkach białaczki pobranych od pacjentów u danio pręgowanego przy użyciu zautomatyzowanego urządzenia do obrazowania wyposażonego w mikroskop fluorescencyjny.

Badania przesiewowe leków w ksenoprzeszczepach nowotworowych pochodzących od pacjenta pręgowanego

Tutaj udostępniamy protokół krok po kroku, z poradami dotyczącymi generowania ksenoprzeszczepów i wytycznymi do analizy zachowania guza, immunofluorescencji całego montażu i kwantyfikacji obrazowania konfokalnego.

Generowanie ksenoprzeszczepów larw danio pręgowanego i analiza zachowania guza

Ten artykuł przedstawia metodę opracowywania, charakteryzowania i śledzenia w czasie rzeczywistym przerzutów nowotworowych w modelu nerwiaka zarodkowego danio pręgowanego, szczególnie w transgenicznej linii danio pręgowanego z nadekspresją MYCN i LMO1, która rozwija przerzuty spontanicznie.

Model danio pręgowanego z przerzutami nerwiaka zarodkowego

Opisujemy protokół ksenotransplantacji do żółtka przezroczystych zarodków danio pręgowanego, który jest zoptymalizowany za pomocą prostej, szybkiej metody oceny poziomu. Analizy po wstrzyknięciu obejmują przeżycie i ocenę obciążenia chorobowego ksenoprzeszczepionymi komórkami za pomocą cytometrii przepływowej.

Prosta, szybka i skuteczna metoda analizy ksenotransplantacji guza w przezroczystych zarodkach danio pręgowanego

Przedstawiono kompleksowy przegląd technik wykorzystywanych w tworzeniu mysiego modelu raka jamy ustnej oraz ilościowego monitorowania inwazji nowotworowej w obrębie języka za pomocą mikroskopii wielofotonowej komórek znakowanych. System ten może służyć jako użyteczna platforma do oceny molekularnej oraz skuteczności leków w przypadku związków przeciwinwazyjnych.

Obrazowanie wielofotonowe inwazji komórek nowotworowych w ortotopowym modelu mysim dla raka płaskonabłonkowego jamy ustnej

Poznaj metodę przesiewową modyfikatorów czerniaka przy użyciu autochtonicznego modelu guza Danio rerio. Technika ta umożliwia szybką analizę genów wpływających na inicjację i progresję nowotworu.

Badania przesiewowe w kierunku modyfikatorów czerniaka przy użyciu autochtonicznego modelu guza danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów