Eksperymentalne metody testowania wpływu peptydu neurotroficznego, ADNF-9, przeciwko apoptozie wywołanej alkoholem podczas ciąży u myszy C57BL/6

Celem zabiegu jest ocena neuroprotekcyjnego działania peptydów troficznych w płodowym modelu ekspozycji na alkohol. Osiąga się to poprzez najpierw krycie zwierząt doświadczalnych, a następnie traktowanie ciężarnych samic peptydami troficznymi w drugim kroku, płody są preparowane w celu wyizolowania mózgów płodów do zastosowań eksperymentalnych. Następnie mózgi płodu są umieszczane w żelatynie w celu podziału, a następnie barwienia tunelowego w celu określenia wyników śmierci komórki.

To pokazuje, że prenatalne narażenie na alkohol zwiększa liczbę komórek tunelowo-dodatnich w wyniosłości zwojowej. W porównaniu z grupą kontrolną podawaną peptydowi troficznemu, dziewiątka D i F znacznie zmniejszyła indukowany alkoholem wzrost liczby komórek tunelowo-dodatnich w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi leczonymi alkoholem. Tak więc wizualna demonstracja tego metalu ma kluczowe znaczenie, ponieważ sekcja mózgu płodu i wbudowane kroki są trudne do nauczenia, ponieważ mózgi płodu są bardzo małe do wypreparowania i przetworzenia w celu sekcji Sześć czarnych myszy pierwszej rasy C 57 poprzez umieszczenie sześciotygodniowych samic myszy o wadze około 20 gramów w klatkach domowych dla samców na dwie godziny bezpośrednio po usunięciu.

Sprawdź każdą samicę pod kątem obecności czopa plemnikowego, aby potwierdzić, że doszło do krycia. Jeśli obecny jest czop nasienny, oznacz ten embrionalny dzień zerowy na E siedem wagowo dopasować ciężarne samice do czterech grup. Jedna grupa dietetyczna płynów alkoholowych zapewniała swobodny dostęp jako jedyne źródło składników odżywczych.

Dwie grupy kontrolne Perfed grupa leczenia peptydami trzy grupy, które powinny otrzymać dootrzewnowe wstrzyknięcie peptydu DNF nine wraz z ekspozycją na alkohol. Dieta płynna. Zapisz objętość płynnej diety spożytej przez zwierzęta w ciągu 24 godzin z 30-mililitrowych rurek z podziałką, aby określić dzienną ilość alkoholu, diety płynnej lub sparowanej diety płynnej, która może być dostarczana przez wolny nadmiar jako jedyne źródło składników odżywczych.

Upewnij się, że świeżo przygotowana płynna dieta jest dostarczana codziennie od E 7 do E 13 po poświęceniu ciężarnej Myer E 13 poprzez eutanazję dwutlenkiem węgla, a następnie zwichnięcie szyjki macicy. Połóż tuszę na desce sekcyjnej w pozycji leżącej na plecach i oczyść brzuch 70% etanolem. Użyj sterylnych nożyczek i kleszczy, aby wykonać nacięcie brzucha.

Gdy brzuch jest otwarty, przytrzymaj macicę kleszczami i użyj drugich kleszczy, aby powoli i delikatnie oderwać endometrium od macicy bez nakłuwania zarodków. Ostrożnie wyjmij zarodki z macicy i przenieś je do roztworu sortowania równowagi Hanka W naczyniu do hodowli komórek o wymiarach 60 milimetrów na 15 mililitrów na mokrym lodzie umieść naczynie i pojemnik na lód na stoliku mikroskopu stereoskopowego za pomocą ultracienkich kleszczy do mikrosekcji. Zdejmij skórę zarodków w górnej części głowy, aby odsłonić czaszkę.

Gdy czaszka jest odsłonięta i wyraźnie uwidoczniona pod mikroskopem stereoskopowym, chwyć podstawę czaszki na poziomie rdzenia kręgowego i pnia mózgu za pomocą kleszczy i zacznij odklejać czaszkę. Kontynuuj odklejanie czaszki kawałek po kawałku od tylnej do przedniej części głowy. Gdy mózg jest w pełni odsłonięty, użyj kleszczy, aby go wydobyć.

Następnie należy wypreparować mózg płodu od podstawy pierwotnej lub fabrycznej bańki do podstawy Met Postfix, wszystkie wypreparowane mózgi płodu w 4% paraldehydzie przez dwa do trzech dni. Mózgi płodów mogą być również zamrożone, jeśli testuje się je pod kątem western blot lub testów enzymatycznych. Po przygotowaniu 10% roztworu żelatyny klasy A przygotowanego w wodzie destylowanej, napełnij do połowy formę do zatapiania i poczekaj, aż żelatyna zastygnie.

Umieść kontrolne i prenatalne mózgi płodowe obok siebie na zestalonej żelatynie. Ma to na celu utrzymanie spójnych warunków zarówno między grupą kontrolną, jak i eksperymentalną. Upewnij się, że żelatyna nie jest zbyt gorąca i dodaj płynną żelatynę na wierzch mózgu płodu, aby uzyskać kompletną formę.

Ostateczna forma powinna przypominać ten obraz, wstaw do lodówki przygotowaną formę żelatynową, która utrzymuje mózg płodu przez 15 minut. Następnie odklej plastikową formę do zatapiania. Ostateczna forma powinna wyglądać tak, a następnie przenieść żelatynę zawierającą mózgi płodu do 4% paraldehydu na dwa dni.

Trzeciego dnia przymocuj blok żelatynowy zawierający nieruchome mózgi płodu do stadium viome. Następnie należy przeciąć mózgi za pomocą viome ustawionego na grubość od 25 do 50 mikronów w celu przekroju koronalnego. Zbierz sekcje mózgu płodu w PBS, a następnie zamontuj sekcje mózgu płodu na super frostach plus szkiełka w wodzie i pozwól im wyschnąć przez 15 minut.

Po upływie 15 minut. Umieść szkiełka w PBS do następnego dnia testowania reakcji tunelowej. Najpierw zanurz szkiełka w roztworze 20 mikrogramów na mililitr proteinazy K i PBS na pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie spłucz trzy razy w PBS przez pięć minut na wytrząsarce orbitalnej. Inkubować skrawki z 3% nadtlenkiem wodoru w metanolu przez 10 minut w temperaturze pokojowej bez wstrząsania. Następnie umyj szkiełka jak poprzednio.

Następnie inkubuj skrawki w przepuszczalnym roztworze przez dwie minuty na lodzie. Po inkubacji przemyć dwukrotnie w PBS. Tak jak poprzednio, użyj chusteczki laboratoryjnej, aby osuszyć obszar szkiełka wokół sekcji.

Następnie użyj pisaka, aby narysować sekcje na slajdzie. Zapobiega to wyciekom roztworu barwiącego, umożliwiając w ten sposób użycie niewielkiej objętości. Inkubować po jednej sekcji w każdej parze z tunelową mieszaniną reakcyjną przygotowaną zgodnie z instrukcjami producenta.

Dodać roztwór nośnika bez odczynnika tunelowego do sekcji kontroli ujemnej. Następnie inkubuj szkiełka przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po upływie czasu inkubacji umyć szkiełka trzykrotnie w PBS na wytrząsarce orbitalnej, tak jak poprzednio.

Następnie osusz obszar wokół tkanki chusteczką laboratoryjną. Następnie inkubować sekcje z roztworem konwertora POD przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza bez wstrząsania. Następnie spłucz skrawki trzy razy przez pięć minut każda za pomocą tris HCL.

Przenieś szkiełka do uchwytu i umieść je w słoiku z kopiną zawierającym 0,05% DAB i 0,003% nadtlenku wodoru. Przykryj słoik folią aluminiową i umieść go na wytrząsarce orbitalnej na lodzie na siedem minut po inkubacji, myjąc PBS jak poprzednio, jeśli jest to pożądane. Slajdy mogą być przechowywane w PBS przed przystąpieniem do barwienia przeciw pociskom, jak szczegółowo opisano w części tekstowej protokołu.

Poniższe obrazy pokazują wpływ neurotroficznego peptydu A DNF nine na apoptozę wywołaną alkoholem przy użyciu testu tunelowego w wyniosłości zwojowej, gdy prenatalne narażenie na alkohol w stadium E 13 indukowane wzrostem śmierci komórek, jak wskazują groty strzałek w grupie A LC w porównaniu z grupą PF. Podawanie D NF nine wraz z prenatalną ekspozycją na alkohol powodowało zmniejszenie liczby komórek tunelowo-dodatnich. Analiza statystyczna wykazała, że podawanie AD i F 9 zapobiegało indukowanemu alkoholem wzrostowi liczby komórek tunelowo-dodatnich.

Wartości są przedstawiane jako średnie plus minus błąd standardowy średniej. Pojedyncza gwiazdka oznacza wartość P mniejszą niż 0,052. Gwiazdka oznacza wartość P mniejszą niż 0,01 w teście post hoc Newmana Colesa.

Każda grupa zawierała N z czterech. Tak więc po jego opracowaniu, technika ta pozwala naukowcom i dziedzinie rozwoju mózgu badać wpływ leków lub związków i rozwój mózgu u myszy.