Prosta i skuteczna technika przygotowania zawiesin komórek jąder

W tym filmie zostanie zaprezentowany bardzo prosty i skuteczny protokół uzyskiwania zawiesiny komórkowej badanego materiału od gryzoni w zaledwie 15 minut. Metoda została zastosowana do testu testowego na myszach, szczurach świnkach morskich i wykorzystuje urządzenie meta machine do dezagregacji zamkniętej tkanki. Po filtracji i zabarwieniu inion komórkowy jest gotowy do przepływu.

Analiza lub sortowanie cyto Jednorodność populacji komórek jest warunkiem wstępnym do analizy zdarzeń biochemicznych i molekularnych podczas różnicowania męskiego GA. Tak więc heterogeniczność jąder z ponad 30 różnymi typami komórek stanowi jeden z głównych problemów dotyczących badania molekularnych podstaw spermatogenezy ssaków. Z tego powodu zastosowano różne metody w celu uzyskania wzbogaconych do oczyszczonych populacji komórek jąder, w tym ilustracji PU i odśrodkowej.

Pierwszym krokiem każdej metody separacji komórek jest przygotowanie zawiesiny komórkowej. Jednak obecne protokoły są zwykle czasochłonne i mogą oznaczać utratę krótkotrwałych cząsteczek, takich jak RNA, co jest niepożądane w przypadku analizy dalszej ekspresji. Główną zaletą przedstawionego tutaj protokołu jest to, że eliminuje etapy między uśmiercaniem zwierząt a badaniami molekularnymi specyficznymi dla danego stadium nasienia, ale jednocześnie zapewnia dobrą jakość i doskonałą reprezentację typu komórki w zawiesinach komórkowych.

Procedurę zademonstruje dr Ana Rodriguez, badaczka z AL Laboratory, która opracowała metodę, oraz Federico San Lopez cytometria przepływowa, która była odpowiedzialna za analizę cytometryczną. Zabieg wymaga niewielkiego sprzętu, systemu meach, wraz z akcesoriami medicon i fcon. Jednak akcesoria fcon można doskonale zastąpić nylonowymi membranami o tej samej wielkości porów.

Jedynymi innymi wymaganymi materiałami i odczynnikami są szkło do smarowania, dwie naczynia, nożyczki i kleszcze, strzykawka o pojemności od trzech do pięciu mililitrów do wykrywania komory jelitowej, pożywka hodowlana DMM uzupełniona 10% płodową surowicą kaszlową i NDA. Jeśli planowane są dalsze zastosowania obejmujące manipulacje RNA, wszystkie materiały i roztwory powinny być odpowiednio traktowane w celu wykonania protokołu. Umieść wypreparowane jądro w 96-milimetrowej szklance zgodnie z danymi pokazanymi lodem zawierającym 10 mililitrów dodatkowego lodu zwanego dm.

Wyjmij TAL Virginia, pokrój jądro decap na kwadratowe kawałki po dwa do trzech milimetrów z każdej strony. Umieść cztery do pięciu tych kawałków w jednorazowym desegregowanym medykonie wraz z jednym mililitrem kodu uzupełnionego D i przetwarzanego w systemie meta machine przez 50 sekund. Każda jednostka medyczna zawiera stały ekran ze stali nierdzewnej z około setką sześciokątnych otworów otoczonych sześcioma mikroostrzami.

Tkanka jest dostarczana do każdego otworu przez metalowy wirnik wewnątrz komory medycznej i desegregowana poprzez przejście przez zaostrzone otwory i przez metalowy ekran, podczas gdy mikropompa pod sitkiem dostarcza płyn i wypłukuje łuski. Odzyskać wynik w zawiesinie komórek z leku za pomocą strzykawki o średnicy od trzech do pięciu milimetrów bez igły. Następnie namocz sokoła o średnicy 50 mikrometrów lub tę samą nylonową siatkę o rozmiarze czterech rozmiarów z pół mililitrowym podłożem i przefiltruj przez nie zawiesinę.

Powtórz krok, ale używając nylonowej siatki o grubości 25 mikrometrów lub równoważnej jednostki sokoła i umieść na lodzie, weź wycenę ALI zawiesiny komórek, aby policzyć w komorze noyer i dostosuj stężenie komórkowe do jednego do dwóch razy 10 do siedmiu komórek na mililitr w pożywce hodowlanej. Na koniec dodaj NDA do końcowego stężenia 0,2%, aby uniknąć pompowania komórek, a także uniknąć zatykania mięśni podczas kolejnych badań przepływu. Jeżeli ma być oceniana żywotność komórek, można to przeprowadzić za pomocą zestawu do pomiaru żywotności żywych trupów dla komórek zwierzęcych zgodnie z instrukcjami producenta przed analizą cytometryczną przepływową, dodać barwnik fluorescencyjny.

Wybór fluorochromu będzie zależał od dostępnych laserów. W tej demonstracji zostanie pokazane użycie różnych barwników, które wiążą dokument z DNA. Chociaż dieta propidium yo jest zwykłym barwnikiem dla utrwalonych lub martwych komórek w niskich stężeniach, odkryliśmy, że gdy jest stosowana w wysokich stężeniach, ROM dostaje się do nieutrwalonych komórek jąder w zawiesinach przygotowanych metodą przedstawioną tutaj.

Jest to prawdopodobnie spowodowane implikowanym naprężeniem mechanicznym, które w połączeniu z sensorycznym charakterem nabłonka półmiskowego może prowadzić do zerwania mostów łączących komórka do komórki przy minimalnej manipulacji Do barwienia jodkiem propidyny 10 minut przed analizą próbki w roztworze o końcowym stężeniu 50 mikrogramów na mililitr do zawiesiny komórek i inkubować w temperaturze zero stopni Celsjusza w ciemności Do analizy komórek barwiących propidium mu. Do dalszego sortowania używamy cytometru przepływowego Fax Vantage wyposażonego w koherentny laser jonowy Targon, dostrojony do emisji o długości 488 nanometrów. Moc lasera jest ustawiona na sto miliwatów, a fluorescencja emitowana przeze mnie propidium jest zbierana przez detektor FL dwa za pomocą filtra pasmowego 5, 7, 5, 5 ukośników, 26 pasm

Użyj dyszy 70 mikrometrów do pomiarów cytometrii przepływowej i oprogramowania squa do analizy następujących parametrów. Rozproszenie boczne rozproszenia do przodu, całkowita emitowana fluorescencja lub obszar impulsu oraz czas trwania emisji fluorescencyjnej lub szerokość impulsu. Wyniki są przedstawione w gramach reprezentujących liczbę zdarzeń na każdym poziomie fluorescencyjnym oraz na wykresach D przedstawiających rozproszenie boczne w stosunku do obszaru impulsu fluorescencyjnego oraz obszar impulsu fluorescencyjnego w stosunku do jego szerokości.

Dublety są wyłączane z analizy przy użyciu wykresów DO obszaru impulsu fluorescencyjnego w funkcji jego szerokości w celu sortowania populacji monocytów SM z trybem sortowania z funkcją faksu, ustawieniem trybu sortowania w normalnym R lub normalnym C i użyciem trzech posortowanych kropli jako koperty. Dostosuj różnicę próbek, aby analizować komórki z szybkością od 500 do 1500 na sekundę. Utrzymuj sample i probówki zbiorcze w temperaturze od trzech do czterech stopni Celsjusza za pomocą agregatu chłodniczego.

Alternatywnie, komórki w zawiesinie mogą być barwione innymi fluorochromami. Na przykład barwnik witalny. HER 3 3 3 4 2 może być stosowany do końcowego stężenia pięciu mikrogramów na mililitr i inkubowany przez co najmniej 10 minut w temperaturze 37 stopni chroniony przed światłem dla Hirscha.

3, 3, 3, 4, 2 próbki plam. Analizę komórek przeprowadzono za pomocą cytometru przepływowego MO wyposażonego w laser o długości fali wzbudzenia UV o mocy 25 miliwatów i dyszy o mocy 70 mikrometrów. Użyj oprogramowania Summit 4.3 lub podobnego, aby przeanalizować te same parametry, które wskazano wcześniej, gdy zawiesiny ogniw są analizowane pod powierzchnią kontrastową, obserwuje się zawiesiny o jakości cięcia.

Głównymi zaletami tego protokołu są przede wszystkim zawiesiny komórek jąder przygotowane przy użyciu wielu maszyn i uzyskujące tylko 15 minut, w tym testowe cesarskie cięcie, cięcie tkanek, ach, przetwarzanie maszynowe i filtracja, w tym czasie około jednej ósmej czasu zwykle zajmowanego przez inne protokoły. Krótkotrwałość tego protokołu wraz z minimalnym zaangażowaniem w przenoszenie pozwoliłaby na dobre zachowanie makrocząsteczek o krótkim czasie życia, co ma kluczowe znaczenie, gdy wymagana jest reprezentatywna próbka związków obecnych w pierwotnej populacji komórek. Ponieważ metan wymaga minimalnego obchodzenia się z metanem, można go łatwo odtworzyć w tej tabeli.

Względne wartości procentowe różnych populacji komórek jąder dla siedmiu niezależnych eksperymentów przeprowadzonych na dorosłych szczurach i analizowanych za pomocą cytometrii przepływowej przedstawiono jako przykład pokazujący odtwarzalność metody. W przeciwieństwie do większości obecnie stosowanych cząstek do przygotowania zawiesin komórek jąder, przedstawiona tutaj metoda nie obejmuje działania enzymatycznego. Chociaż kolagenaza wlewająca się w RNA, które są ogólnie zaliczanymi enzymami, przyczynia się do niewystarczającej segregacji tkanki, może wpływać na zachowanie interesujących makrocząsteczek.

Brak zabiegów enzymatycznych nie tylko sprzyja zachowaniu RNA i białka, ale także sprawia, że protokół jest tańszy. Chociaż wcześniej donoszono, że mechanicznie przygotowane zawiesiny komórkowe zbrylają się łatwiej niż te z trypsami, odkryliśmy, że ten protokół prowadzi do dobrze zdesegregowanych zawiesin komórkowych przy braku działania enzymatycznego. Włączenie NDA okazało się bardzo pomocne w zapobieganiu zlepianiu się komórek.

Dobra jakość zawiesin jest również potwierdzona, gdy próbki są poddawane analizie cytometrycznej, co ocenia się na podstawie zaobserwowanych minimalnych szczątków komórek. Zgodnie z opublikowanymi informacjami, około 13% okrągłych plemników znajduje się jako wielojądrowe, gdy zawiesiny komórkowe są przygotowywane wyłącznie metodą mechaniczną lub w obecności trypsyny. Jednak wiele zawiesin przygotowanych maszynowo sprawia, że wielojądrowe są bardzo rzadkie, najprawdopodobniej ze względu na zmniejszenie splątania, ponieważ stwierdzono, że wielojądrowe są wytwarzane głównie w wyniku manipulacji tkankami.

Na tym rysunku zaobserwowano przykład wielu przygotowanych maszynowo zawiesin komórkowych z jąder szczurów. Jak widać. Cytoplazmy są dobrze zachowane, względne procenty populacji komórek C, dwóch, C i czterech komórek C w wielu maszynowo przygotowanych zawiesinach jąder dla różnych gryzoni ponownie złożyły te z nienaruszonych PE.

Potwierdza to założenie, że opisana tutaj metoda nie uszkadza selektywnie żadnego konkretnego typu komórek. Co zaskakujące, reprezentacja typu komórek w wielu zawiesinach przygotowanych maszynowo jest znacznie lepiej zachowana niż w przypadku klasycznych metod przygotowania kroplówek. Jak widać, cytografika uzyskana dla zawiesin komórek jąder przetwarzanych meine nie różni się znacząco od wcześniej zgłoszonych.

W rzeczywistości uzyskane histogramy i wykresy kropkowe wykazują trzy charakterystyczne cztery populacje komórek jąder C do C i C w oparciu o zawartość DNA, a także populację pozornie subha, która reprezentuje wysoce skondensowane haploidalne plemniki. Profile te zaobserwowano odpowiednio dla zawiesin barwiących jodkiem propidyny lub propidy, co dotyczy również osobników dorosłych i młodocianych. Sortowanie komórek mitogennych sper udało się osiągnąć z ponad 98% czystością, zarówno dla wybranych populacji jąder na podstawie zawartości DNA, jak i nawet dla subpopulacji o tej samej zawartości DNA, ale różnym poziomie kondensacji chromatyny, takich jak zęby snu i miocyty zębów.

Jak mogliśmy zaobserwować w zawiesinach testowych świnek morskich, ponieważ protokół nie obejmuje posortowanych populacji poddanych działaniu RNA, zapewniają dobrą jakość RNA i umożliwiają zróżnicowane badania ekspresji genów nawet dla populacji barwionych jodkiem propidyny. W tym sensie warto przypomnieć, że w przeciwieństwie do innych barwników, barwienia jodkiem propidyny, DNA, a także dwuniciowym RNA, jednak w tej grafice analizy zawiesiny jąder świnki morskiej podobne profile uzyskano przy użyciu jodku propidyny równolegle z żywym cyklem pomarańczowym. Jest to niezbędny barwnik specyficzny dla DNA, który pokazuje, że barwienie RNA nie wpływa znacząco na cytometryczne wzorce histogramu.

Poniższa lista podsumowuje główne zalety protokołu percented. Opisana tutaj zoptymalizowana metoda pozwala na przyspieszenie przygotowania odpowiednich zawiesin komórek jąder do analizy cytometrycznej różnych etapów nasienia gryzoni w ciągu zaledwie 15 minut, w tym wypreparowania jąder, cięcia tkanek i przetwarzania przez system maszynowy ME. Zwięzłość, wyższa jakość odtwarzalności i proporcje typów komórek w zawiesinach komórek sprawiają, że jest to dobra alternatywa dla innych, bardziej żmudnych i czasochłonnych technik samodzielnego przygotowania, które są obecnie stosowane.

Co więcej, ponieważ metoda ta wiąże się z bardzo niewielką manipulacją i pozwala uniknąć enzymów i detergentów, jest idealnym wyborem do delikatnych zastosowań późniejszych, takich jak badania ekspresji genów.