Name: Prosta i skuteczna technika przygotowania zawiesin komórek jąder (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 33 s
Description: Poznaj szybką metodę przygotowania zawiesin komórek jąder gryzoni bez użycia enzymów. Mechaniczna dezagregacja trwa tylko 15 minut, zachowując żywotność komórek i integralność makrocząsteczek do analiz cytometrycznych oraz badań ekspresji genów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez CSIC (I+D project C022) i PEDECIBA. Autorzy pragną podziękować Marieli Bollati i Valentinie Porro z Zakładu Biologii Komórki (Instytut Pasteura de Montevideo) za ich hojną współpracę przy sortowniku komórek MoFlo oraz firmie Merial-Montevideo za delikatne dostarczenie wszystkich próbek świnek morskich wykorzystanych w tym projekcie. Rysunek 1 został odtworzony za zgodą BioMed Central; Rysunki 2 i 3 oraz tabela 1 uzyskane za zgodą S. Karger AG, Bazylea; oraz rysunki 4 i 5 zostały powielone lub zaadaptowane za zgodą John Wiley & Sons, Inc (prawa autorskie należą do Wiley-Blackwell, 2011).

1. Przygotowanie zawiesin komórkowych
<ol>
 <li>Ofiarować próbkę do użycia zgodnie z zaleceniami wyspecjalizowanych komitetów, takich jak IACUC lub równoważny (w Urugwaju Narodowa Komisja ds. Doświadczeń na Zwierzętach [CNEA]). W naszym przypadku podano przedawkowanie pentobarbitalu. </li>
 <li>Wyciąć jądra zgodnie ze standardowymi zatwierdzonymi procedurami i umieścić je na szklanej szalce Petriego o średnicy 96 mm na lodzie, zawierającej 10 ml lodowatego DMEM uzupełnionego 10% płodową surowicą cielęcą. </li>
 <li>Usuń osłonkę białawą i pokrój zdekapsulowane jądra na kwadratowe kawałki o boku 2 - 3 mm. </li>
 <li>Kawałki te są następnie przetwarzane w Medimachine, zautomatyzowanym młynku mechanicznym, w którym tkanka jest dezagregowana wewnątrz jednorazowego urządzenia zawierającego perforowane sito ze stali nierdzewnej i metalowy wirnik. W tym celu umieść 1 ml DMEM uzupełnionego na zimno i 4 - 5 tych kawałków w jednorazowym urządzeniu o wielkości 50 μm, włącz deagregator i przetwarzaj przez 50 sekund, postępując zgodnie z prostymi instrukcjami producenta. </li>
 <li>Odzyskać powstałą zawiesinę komórek z jednostki dezagregacji za pomocą strzykawki o pojemności 3 - 5 ml bez igły. </li>
 <li>Przefiltrować przez nylonową siatkę o grubości 50 μm, uprzednio nasączoną 0,5 ml dodatku. </li>
 <li>Ponownie przefiltrować zawiesinę za pomocą nasączonej siatki nylonowej o grubości 25 μm i umieścić na lodzie. </li>
 <li>Policz w komorze Neubauera i dostosuj stężenie komórkowe do 1 - 2 x 107 komórek/ml z uzupełnionym DMEM. Zwykle uzyskuje się co najmniej 4 x 107 komórek/gram materiału jądra. </li>
 <li>Na koniec dodaj NDA (kwas 2-naftol-6,8-disulfonowy, sól dipotasowa) do końcowego stężenia 0,2%, aby zapobiec zlepianiu się komórek. </li>
 <li>Opcjonalnie: sprawdzić żywotność zawiesin komórek jądra za pomocą dostępnego w handlu zestawu do pomiaru żywotności komórek zwierzęcych, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. </li>
</ol>
2. Analiza cytometryczna przepływowa
 Użyliśmy cytometru przepływowego Becton-Dickinson FACSVantage wyposażonego w koherentny laser jonowy argonu dostrojony do emisji przy długości fali 488 nm do analizy komórek barwionych wysokimi stężeniami jodku propidyny (PI). (Kwestia wnikania PI do nieutrwalonych komórek pod wpływem stresu została poruszona w innym miejscu9,10).
<ol>
 <li>W przypadku barwienia PI dodać fluorochrom o końcowym stężeniu 50 μg/ml do zawiesiny komórek i inkubować przez 10 minut w temperaturze 0 °C w ciemności.</li>
 <li>Moc lasera jest ustawiona na 100 mW, a filtr pasmowo-przepustowy 575/26 służy do zbierania fluorescencji emitowanej przez PI w FL2. </li>
 <li>Pomiary FC wykonujemy dyszą o wielkości 70 μm. Aby posortować populacje spermatocytów, ustaw tryb sortowania na Normal-R lub Normal-C, używając 3 posortowanych kropli jako koperty. Przechowywać probówki do pobierania próbek i pobierania próbek w temperaturze 3–4 °C za pomocą agregatu chłodniczego. Dostosuj różnicę próbek, aby analizować komórki z szybkością od 500 do 1,500 na sekundę. </li>
 <li>Użyj oprogramowania CellQuest (BD) do analizy następujących parametrów: rozproszenie do przodu (FSC-H), rozproszenie boczne (SSC-H), całkowita emitowana fluorescencja lub obszar impulsu (FL2-A) oraz czas emisji fluorescencji lub szerokość impulsu (FL2-W). </li>
</ol>
Alternatywnie, użyliśmy kluczowego barwnika Hoechst 33342 do końcowego stężenia 5 μg/ml i inkubowaliśmy przez 10 minut w temperaturze 37 °C w ciemności. Analizę komórek przeprowadzono za pomocą cytometru MoFlo (DakoCytomation) wyposażonego w laser o długości fali wzbudzenia UV o mocy 25 mW i dyszy 70 μm. Manipulacja danymi została wykonana za pomocą oprogramowania Summit v4.3 (DakoCytomation).

<ol><li>Meistrich, M. L. Separation of spermatogenic cells and nuclei from rodent testes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMeistrich%2C+ML+%22Methods+of+Cell+Biology%22">Methods of Cell Biology</a>. Prescott, D. M. 15, Academic Press. New York. 15-54 (1977).</li>
<li>Lam, D. M. K., Furrer, R., Bruce, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+separation%2C+physical+characterization%2C+and+differentiation+kinetics+of+spermatogonial+cells+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">The separation, physical characterization, and differentiation kinetics of spermatogonial cells of the mouse.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 65, 192-199 (1970).</li>
<li>Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcet, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+sedimentation+velocity%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity.</a> Dev. Biol. 19, 119-131 (1976).</li>
<li>Geisinger, A., Rodríguez-Casuriaga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+for+gene+expression+studies+in+mammalian+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet.+Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry for gene expression studies in mammalian spermatogenesis.</a> Cytogenet. Genome Res. 128, 46-56 (2010).</li>
<li>Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+purification+of+mouse+meiotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry purification of mouse meiotic cells.</a> J. Vis. Exp. (50), e2602(2011).</li>
<li>Meistrich, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+velocity+sedimentation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Separation of mouse spermatogenic cells by velocity sedimentation.</a> J. Cell Physiol. 80, 299-312 (1972).</li>
<li>Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+composition+of+fractions+of+mouse+testis+cells+following+velocity+sedimentation+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation.</a> Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).</li>
<li>Malkov, M., Fisher, Y., Don, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+schedule+of+the+postnatal+rat+testis+determined+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Rep%22%5BJournal%5D)">Developmental schedule of the postnatal rat testis determined by flow cytometry.</a> Biol. Rep. 59, 84-92 (1998).</li>
<li>Rodríguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santiñaque, F., López, B., Folle, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-purity+flow+sorting+of+early+meiocytes+based+on+DNA+analysis+of+guinea+pig+spermatogenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells.</a> Cytometry A. 79, 625-634 (2011).</li>
<li>Davey, H. M., Hexley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+but+not+dead%3F+Membranes+of+stressed+Saccharomyces+cerevisiae+are+permeable+to+propidium+iodide%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Red but not dead? Membranes of stressed Saccharomyces cerevisiae are permeable to propidium iodide.</a> Environ. Microbiol. 13, 163-171 (2011).</li>
<li>Rodríguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., López-Carro, B., Porro, V., Wettstein, R., Folle, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-fast+and+optimized+method+for+the+preparation+of+rodent+testicular+cells+for+flow+cytometric+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Proced.+Online%22%5BJournal%5D)">Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis.</a> Biol. Proced. Online. 11, 184-195 (2009).</li>
<li>Spanò, M., Evenson, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+for+reproductive+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis for reproductive biology.</a> Biol Cell. 78, 53-62 (1993).</li>
</ol>

Opisana tutaj zoptymalizowana metoda umożliwia przygotowanie zawiesin komórkowych z tkanki jąder gryzoni w bardzo szybki i powtarzalny sposób, unikając obróbki enzymatycznej i detergentowej oraz zachowując dobrą integralność komórek i proporcje typów. Krótkotrwałość procedury (15-minutowy okres obejmuje rozwarstwienie jąder, cięcie tkanek i przetwarzanie), minimalna obsługa i brak zabiegów enzymatycznych to tylko niektóre z głównych zalet. Wszystko to przyczyniłoby się do dobrego zachowania makrocząsteczek o krótkim czas...

<table><tbody><tr><td>System Medimachine</td><td>BD</td><td>340587</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka Medicon (50 &mu; m)</td> <td>Jednostka BD</td><td>340591</td><td></td></tr><tr><td>Filcon (50 &mu; m)</td><td>BD</td><td>340603</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>430-2100</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu</td><td>PAA</td><td>A11-151</td><td></td></tr><tr><td>NDA</td><td>Chemos BmbH</td><td>277081</td><td></td></tr><tr><td>H&#8211; chst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14533</td><td>Roztwór podstawowy 5 mg/ml; stosowany w końcowym stężeniu 5 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Jodek propidyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>287075</td><td>roztwór podstawowy 1 mg/ml; stosowany w końcowym stężeniu 50 μn; g/ml</td></tr></tbody></table>

prosta i skuteczna technika przygotowania zawiesin komórek jąder

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

Jądra ssaków to bardzo złożone organy, które zawierają ponad 30 różnych typów komórek, w tym somatyczne komórki jąder i różne stadia rozwoju komórek linii rozrodczej. Ta heterogeniczność jest istotną wadą w badaniu podstaw spermatogenezy ssaków, ponieważ do większości analiz molekularnych potrzebne są czyste lub wzbogacone populacje komórek w określonych stadiach rozwoju plemników1.
 Różne strategie, takie jak Staput2,3, elutriacja odśrodkowa1 i cytometria przepływowa (FC)4,5 zostały zastosowane w celu uzyskania wzbogaconych lub oczyszczonych populacji komórek jąder, aby umożliwić badania różnicowej ekspresji genów. 
Wymagane jest, aby komórki były zawieszone dla większości podejść do wzbogacania/oczyszczania. Idealnie, zawiesina komórkowa będzie reprezentatywna dla pierwotnej tkanki, będzie miała wysoki odsetek żywotnych komórek i niewiele wielojądrowych - które mają tendencję do tworzenia się ze względu na syncytialny charakter nabłonka nasiennego6,7 - i nie będzie miała grudek komórkowych1 . Wcześniejsze doniesienia dowiodły, że zawiesiny komórek jąder przygotowane wyłącznie metodą mechaniczną łatwiej się zbrylały niż trypsynizowane1 . Z drugiej strony, leczenie enzymatyczne RNA i/lub enzymy dezagregujące, takie jak trypsyna i kolagenaza, prowadzi do degradacji określonych makrocząsteczek, co jest niepożądane w przypadku niektórych dalszych zastosowań. Idealny proces powinien być jak najkrótszy i obejmować minimalną manipulację, aby osiągnąć dobre zachowanie interesujących makrocząsteczek, takich jak mRNA. Obecne protokoły przygotowania zawiesin komórkowych z tkanek stałych są zwykle czasochłonne, w dużym stopniu zależne od operatora i mogą selektywnie uszkadzać niektóre typy komórek1,8 . 
 Przedstawiony tutaj protokół łączy zalety wysoce powtarzalnej i niezwykle krótkiej mechanicznej dezagregacji z brakiem leczenia enzymatycznego, co prowadzi do dobrej jakości zawiesin komórkowych, które mogą być używane do analizy cytometrycznej przepływowej i sortowania4 oraz dalszych badań ekspresji genów9 .

Przykład dobrze zdysaggregowanej zawiesiny komórek z jąder raty, przygotowanej zgodnie z opisanym tutaj protokołem, przedstawiono na Rysunku 1.
W porównaniu do traktowania enzymatycznego6,8 oraz wcześniej opisanych metod mechanicznej dysagregacji2, metoda tutaj przedstawiona jest znacznie szybsza, wiąże się z mniejszą liczbą czynności manipulacyjnych, jest łatwo powtarzalna (nie zależy od operatora) i generuje niewielką ilość debris komórkowych (zwłaszcza...

Opisano nowy protokół mechanicznego przygotowania zawiesin komórek jąder z materiału gryzoni, unikając enzymów i detergentów. Metoda jest bardzo prosta, szybka, powtarzalna i pozwala uzyskać dobrej jakości zawiesiny komórek, które nadają się do sortowania przepływowego i ekstrakcji RNA.

Prosta i skuteczna technika przygotowania zawiesin komórek jąder

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

W niniejszym filmie zostanie zaprezentowany bardzo prosty i wydajny protokół pozyskiwania zawiesiny komórkowej z materiału badawczego gryzoni w zaledwie 15 minut. Metoda ta została zastosowana do materiałów pochodzących od myszy, szczurów oraz świniGuińskich i wykorzystuje urządzenie typu meta machine do dysagregacji tkanki otoczkowej. Po filtracji i barwieniu zawiesina komórkowa jest gotowa do analizy metodą przepływową.Analiza cytometryczna lub sortowanie. Jednorodność populacji komórek jest warunkiem wstępnym analizy zdarzeń biochemicznych i molekularnych podczas różnicowania GA samca. Zatem heterogeniczność jąder z ponad 30 różnymi typami komórek stanowi jeden z głównych problemów dotyczących badania podstaw molekularnych spermatogenezy ssaków. Z tego powodu stosowano różne metody w celu uzyskania wzbogaconych lub oczyszczonych populacji komórek jądrowych, w tym PU oraz separację odwirowkową.Pierwszym krokiem w każdej metodzie separacji komórek jest przygotowanie zawiesiny komórkowej. Jednakże aktualne protokoły są zazwyczaj czasochłonne i mogą prowadzić do utraty krótkotrwałych cząsteczek, takich jak RNA, co jest niepożądane w przypadku późniejszych analiz ekspresji. Główną zaletą przedstawionego tutaj protokołu jest wyeliminowanie etapów pomiędzy uśmierceniem zwierzęcia a specyficznymi badaniami molekularnymi w stadium nasienia, przy jednoczesnym zapewnieniu dobrej jakości oraz doskonałej reprezentacji typów komórek w zawiesinach komórkowych.Procedury zaprezentuje dr Ana Rodriguez, badaczka z AL Laboratory, która opracowała tę metodę, oraz Federico San Lopez z zespołu cytometrii przepływowej, odpowiedzialny za analizę cytometryczną. Procedura wymaga zastosowania niewielkiego urządzenia – systemu meach wraz z akcesoriami medicon i fcon. Akcesoria fcon można jednak w pełni zastąpić membranami nylonowymi o tej samej wielkości porów.Jedynymi pozostałymi wymaganymi materiałami i odczynnikami są szklany rozcieracz, dwie szalki, nożyczki i pęseta, strzykawka o pojemności od 3 do 5 ml z komorą do inkubacji, pożywka DMEM uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą oraz NDA. Jeśli planowane są dalsze zastosowania obejmujące manipulacje z RNA, wszystkie materiały i roztwory powinny być traktowane zgodnie z wymogami dla tego protokołu. Umieść wypreparowany jądro w 96 mm szklanym naczyniu w temperaturze lodu, zawierającym 10 ml uzupełnionej, schłodzonej pożywki DMEM.Usunąć TAL Virginia, a odcięty jądro (testis) pokroić na kwadratowe kawałki o boku od dwóch do trzech milimetrów. Umieścić od czterech do pięciu takich kawałków w jednorazowej probówce desegregacyjnej medicon wraz z jednym mililitrem suplementowanego kodu D i przetworzyć w systemie maszyny meta przez 50 sekund. Każda jednostka medicon zawiera stałe sito ze stali nierdzewnej z około stu sześciokątnych otworów otoczonych przez sześć mikroostrzy.Tkanka jest doprowadzana do każdego otworu przez metalny rotor wewnątrz komory medicon i rozdzielana poprzez przejście nad zaostrzonymi otworami i przez metalowe sito, podczas gdy mikropompa pod sitem dostarcza ciecz i wypłukuje łupiny. Odzyskaj wynik w postaci zawiesiny komórkowej z mediconu, używając strzykawki o objętości od trzech do pięciu mililitrów bez igły. Następnie nasącz 50 µm sito nylonowe Falcon lub inne sito nylonowe o tym samym rozmiarze 0,5 mL pożywki i przefiltruj przez nie zawiesinę.Powtórz ten krok, lecz używając nylonowego sita o oczkach 25 µm lub równoważnej jednostki typu Falcon, a następnie umieść próbkę w lodzie, pobierz alikwot zawiesiny komórkowej do policzenia w komorze Noyera i dostosuj stężenie komórek do poziomu od 1 do 2 × 10⁷ komórek/mL w pożywce hodowlanej. Na koniec dodaj NDA do stężenia końcowego 0,2%, aby zapobiec agregacji komórek oraz zapchać urządzeniu podczas późniejszych badań przepływowych. Jeśli planowana jest ocena żywotności komórek, można ją przeprowadzić za pomocą zestawu do oceny żywotności komórek zwierzęcych (live/dead viability kit) zgodnie z instrukcjami producenta; przed analizą cytometryczną dodaj barwnik fluorescencyjny.Wybór fluorochromu zależy od dostępnych laserów. W niniejszej demonstracji zaprezentowane zostanie zastosowanie różnych barwników wiążących się z DNA. Chociaż jodek propidyny jest zazwyczaj stosowanym barwnikiem do komórek utrwalonych lub martwych w niskich stężeniach, stwierdzono, że w wysokich stężeniach barwnik ten wnika do nieutrwalonych komórek jąder w zawiesinach przygotowanych metodą przedstawioną w niniejszym opracowaniu.Jest to prawdopodobnie spowodowane wynikającym z tego stresem mechanicznym, który w połączeniu z wrażliwością nabłonka seminalnego może prowadzić do zerwania połączeń międzykomórkowych przy minimalnej manipulacji. W celu barwienia jodkiem propidyny, na 10 minut przed analizą próbki, do zawiesiny komórek należy dodać roztwór o stężeniu końcowym 50 µg/mL i inkubować w temperaturze 0 °C w ciemności. Do analizy barwienia jodkiem propidyny oraz dalszego sortowania wykorzystujemy cytometr przepływowy FACS Vantage wyposażony w laser argonowy emitujący światło o długości fali 488 nm. Moc lasera została ustawiona na 100 mW, a fluorescencję emitowaną przez jodek propidyny zbiera detektor FL2 przy użyciu filtra pasmowo-przepustowego 575/26.Do pomiarów cytometrii przepływowej należy użyć dyszy o średnicy 70 µm oraz oprogramowania squa do analizy następujących parametrów: rozpraszania światła w przód (Forward scatter), rozpraszania światła pod kątem (side scatter), całkowitej fluorescencji emitowanej lub pola impulsu (pulse area) oraz czasu trwania emisji fluorescencyjnych lub szerokości impulsu (pulse width). Wyniki przedstawiono w formie gramów reprezentujących liczbę zdarzeń na każdym poziomie fluorescencji oraz na wykresach punktowych (D plots) prezentujących rozpraszanie pod kątem w funkcji pola impulsu fluorescencyjnego oraz pola impulsu fluorescencyjnego w funkcji jego szerokości.Dublety są wykluczane z analizy przy użyciu wykresów DO, przedstawiających pole impulsu fluorescencyjnego w funkcji jego szerokości, w celu sortowania populacji monocytów SM przy ustawieniu trybu sortowania w systemie fax vantage na normal R lub normal C oraz zastosowaniu trzech sortowanych kropel jako obwiedni. Dostosuj różnicę próbek, aby analizować komórki z prędkością od 500 do 1500 na sekundę. Przechowuj probówki z próbkami i probówki do zbierania w temperaturze od trzech do czterech stopni celsius by użyć jednostki chłodzącej.Alternatywnie komórki w zawiesinie można barwić innymi fluorochromami. Na przykład barwnik witalny HER 3 3 3 4 2 może być stosowany w stężeniu końcowym 5 µg/mL i inkubowany przez co najmniej 10 minut w temperaturze 37 °C w ciemności dla Hirsch.Przygotowano 3, 3, 3, 4, 2 barwione próbki. Analizę komórek przeprowadzono za pomocą cytometru przepływowego MO wyposażonego w laser z długością fali wzbudzenia UV pracujący z mocą 25 milliwatts oraz dyszą o średnicy 70 micrometer. Należy użyć oprogramowania Summit 4.3 lub podobnego do analizy tych samych parametrów, które wskazano wcześniej, gdy zawiesiny komórek są analizowane pod kątem jakości zawiesin obserwowanych w optyce kontrastowej.Głównymi zaletami niniejszego protokołu są przede wszystkim zawiesiny komórek jąder przygotowane przy użyciu urządzenia oraz uzyskanie ich w czasie zaledwie 15 minut, obejmującym sekcję jądra, cięcie tkanek, homogenizację, obróbkę maszynową i filtrację; czas ten stanowi około jednej ósmej czasu zazwyczaj wymaganego przez inne protokoły. Zwięzłość tej procedury w połączeniu z minimalną manipulacją materiałem sprzyja dobremu zachowaniu krótkotrwałych makromolekuł, co jest kluczowe w przypadku konieczności uzyskania reprezentatywnej próbki związków obecnych w pierwotnej populacji komórek. Ponieważ metoda ta wiąże się z minimalną manipulacją, jest ona łatwo powtarzalna w tym układzie.Względne wartości procentowe różnych populacji komórek jąder dla siedmiu niezależnych eksperymentów przeprowadzonych na dorosłych szczurach i przeanalizowanych metodą cytometrii przepływowej zostały przedstawione jako przykład w celu wykazania powtarzalności metody. W przeciwieństwie do większości obecnie stosowanych metod przygotowania zawiesin komórek jądra, metoda przedstawiona w niniejszej pracy nie wykorzystuje działania enzymatycznego. Chociaż kroplowe podawanie kolagenazy w RNA, które są enzymami zazwyczaj stosowanymi w celu wspomagania dysocjacji tkanki, może być niewystarczające do prawidłowej segregacji, mogą one wpływać na zachowanie interesujących badacza makrocząsteczek.Brak obróbki enzymatycznej nie tylko sprzyja zachowaniu RNA i białek, ale także obniża koszty protokołu. Chociaż wcześniej zgłaszano, że mechanicznie przygotowane zawiesiny komórkowe ulegają agregacji łatwiej niż te poddane trypsynizacji, stwierdziliśmy, że niniejszy protokół pozwala na uzyskanie dobrze rozdzielonych zawiesin komórkowych bez zastosowania enzymów. Włączenie NDA okazało się bardzo pomocne w zapobieganiu zlepianiu się komórek.O dobrej jakości zawiesin świadczy również analiza cytometryczna próbek, w której zaobserwowano minimalną ilość debris komórkowego. Zgodnie z opublikowanymi informacjami, około 13% okrągłych plemników ma charakter wielojądrowy, zarówno w przypadku przygotowania zawiesin komórkowych wyłącznie metodą mechaniczną, jak i w obecności trypsyny. Jednakże wiele zawiesin przygotowanych maszynowo wykazuje bardzo niewielką liczbę komórek wielojądrowych, co prawdopodobnie wynika z ograniczenia splątania, ponieważ stwierdzono, że formy wielojądrowe powstają głównie w konsekwencji manipulacji tkanką.Na tym zdjęciu przedstawiono przykład zawiesiny komórek jądra nadjądłka szczura przygotowanej za pomocą urządzenia Many Machine. Jak widać, cytoplazma jest dobrze zachowana, a względne odsetki populacji komórek 2C i 4C w zawiesinach tkanki jądra przygotowanych za pomocą Many Machine dla różnych gryzoni odpowiadały tym obserwowanym w nienaruszonych PE.Potwierdza to założenie, że opisana tutaj metoda nie uszkadza selektywnie żadnego konkretnego typu komórek. Co zaskakujące, reprezentacja typów komórek w wielu zawiesinach przygotowanych maszynowo jest utrzymana znacznie lepiej niż w przypadku klasycznych metod przygotowania przez kropelkowanie. Jak widać, wykresy cytometryczne uzyskane dla przetworzonych zawiesin komórek jądr powiększone nie odbiegają znacząco od tych raportowanych wcześniej.W rzeczywistości uzyskane histogramy i wykresy kropkowe wykazują trzy charakterystyczne populacje komórek jądra o zawartości DNA odpowiadającej 4C, 2C oraz C, a także widoczną populację sub-haploidalną, która reprezentuje silnie skondensowane haploidalne spermatozoa. Profile te zaobserwowano odpowiednio dla zawiesin barwionych Hoechst 33342 lub jodkiem propidyny, zarówno w przypadku osobników dorosłych, jak i młodocianych. Sortowanie komórek spermatogennych przeprowadzono z sukcesem, osiągając czystość powyżej 98%, zarówno dla wybranych populacji jądra na podstawie zawartości DNA, jak i dla subpopulacji o tej samej zawartości DNA, lecz różnym stopniu kondensacji chromatyny, takich jak spermatocyty i spermatydy.Jak zaobserwowano w zawiesinach testowych z królika świnki morskiej, ponieważ protokół nie obejmuje obróbki RNA, posortowane populacje wykazują dobrą jakość RNA i umożliwiają badania różnicowej ekspresji genów nawet w przypadku populacji barwionych jodkiem propidium. W związku z tym warto przypomnieć, że w przeciwieństwie do innych barwników, jodek propidium barwi zarówno DNA, jak i dwuniciowy RNA; jednak na niniejszych grafikach z analizy zawiesiny jąder królika świnki morskiej podobne profile uzyskano przy użyciu jodku propidium równolegle z barwnikiem vibrant ized cycle orange. Ten żywotny barwnik specyficzny dla DNA wykazuje, że barwienie RNA nie wpływa znacząco na wzorce histogramów cytometrycznych.Poniższa lista podsumowuje główne zalety przedstawionego protokołu. Opisana tutaj zoptymalizowana metoda pozwala na przyspieszenie przygotowania odpowiednich zawiesin komórek jąder do analizy cytometrycznej różnych stadiów plemników gryzoni w zaledwie 15 minut, wliczając w to wycięcie jąder, krojenie tkanki oraz procesowanie w systemie ME machine. Krótki czas trwania, wyższa odtwarzalność oraz proporcje typów komórek w zawiesinach czynią tę metodę dobrą alternatywą dla innych, bardziej żmudnych i czasochłonnych technik samodzielnego przygotowania obecnie stosowanych w praktyce.Co więcej, ponieważ metoda ta wiąże się z minimalną manipulacją i nie wymaga użycia enzymów ani detergentów, stanowi ona idealny wybór dla delikatnych zastosowań analitycznych, takich jak badania ekspresji genów.

simple-efficient-technique-for-preparation-testicular-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Prosta i skuteczna technika przygotowywania zawiesin komórek jąder

Dysocjacja komórek z konkretnych typów tkanek wymaga zastosowania specyficznych parametrów agitacji tkanki, aby uzyskać wysoką liczbę żywych komórek zdolnych do hodowli. Urządzenie Miltenyi gentleMACS Dissociator optymalizuje to zadanie dzięki prostemu, praktycznemu protokołowi. W niniejszej publikacji wyjaśniono zastosowanie tego urządzenia w odniesieniu do tkanki nerwowej.

Przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek z tkanki nerwowej myszy

Ten film demonstruje procedurę izolacji komórek Sertoliego z kanalików nasiennych myszy, składnika jąder. Trawienie enzymatyczne i wielokrotne płukanie sprzyjają uwalnianiu komórek Sertoliego do roztworu, który może być dalej hodowany w celu proliferacji i wzrostu.

Izolacja immunologicznych regulatorowych komórek Sertoliego z mysich kanalików nasiennych

Prosta metoda pozyskiwania i utrzymywania linii komórek macierzystych i progenitorowych spermatogoniów od dorosłych myszy jest przedstawiona tutaj.  Metoda wykorzystuje komórki zasilające pochodzące z przedziału komórki somatycznej jądra dorosłej myszy. Ta technika ma zastosowanie do popularnych szczepów myszy, w tym myszy transgenicznych, nokautujących i knock-in.

Seryjne wzbogacanie spermatogonialnych komórek macierzystych i progenitorowych (SSC) w hodowli w celu uzyskania długoterminowych linii SSC dorosłych myszy

Metoda STA-PUT pozwala na rozdzielanie różnych populacji komórek spermatogennych na podstawie wielkości i gęstości.

Separacja typów komórek spermatogennych za pomocą sedymentacji prędkości STA-PUT

Materiał tutaj opisuje metodę opracowaną w celu zachowania trójwymiarowej struktury chromatyny komórek rozrodczych jąder. Zostało to nazwane metodą slajdów trójwymiarowych (3D). Metoda ta poprawia czułość wykrywania struktur subjądrowych i ma zastosowanie do immunofluorescencji, fluorescencji DNA i fluorescencji RNA hybrydyzacji in situ (FISH).

Metoda przygotowania szkiełek w celu zachowania trójwymiarowej architektury chromatyny komórek rozrodczych jąder

Podstawowe komórki Sertoliego są niezbędne do badania przywilejów immunologicznych jąder, transdukcji sygnału podczas stanu zapalnego lub infekcji oraz wykorzystania ich właściwości immunoprotekcyjnych. Tutaj opisujemy oparty na enzymach protokół izolacji wysoce oczyszczonych pierwotnych komórek Sertoliego i komórek okołokanalikowych z jąder szczurów.

Izolacja komórek Sertoliego i komórek okołokanalikowych z jąder szczura

Ta praca opisuje standaryzację metody uzyskiwania oczyszczonych populacji komórek rozrodczych z tkanki jąder różnych gatunków ssaków. Jest to prosty protokół, który łączy mechaniczną dysocjację jąder, barwienie za pomocą Hoechst-33342 i jodku propidyny oraz sortowanie FACS, z szerokim zastosowaniem w badaniach porównawczych biologii rozrodu mężczyzn.

Ustandaryzowane podejście do wielogatunkowego oczyszczania męskich komórek rozrodczych ssaków za pomocą mechanicznej dysocjacji tkanek i cytometrii przepływowej

Prezentowany tutaj jest protokół wzbogacania spermatocytów pachytenowych, okrągłych spermatyd i wydłużania spermatyd z jąder dorosłych myszy za pomocą nieciągłego gradientu gęstości albuminy surowicy bydlęcej za pomocą standardowego sprzętu laboratoryjnego.

Wzbogacanie spermatocytów pachytenowych i spermatydów z jąder myszy przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego

Tutaj prezentujemy protokół powtarzalnego generowania organoidów jąder świń z architekturą tkanek specyficzną dla jąder przy użyciu dostępnego na rynku systemu hodowli mikrostudzienek.

Generowanie organoidów jąder świń o architekturze specyficznej dla jąder przy użyciu hodowli mikrostudzienek

Tutaj opisane są cztery metody generowania organoidów jąder z pierwotnych komórek jąder myszy noworodków, tj. macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) oraz środowiska hodowli 2D i 3D wolne od ECM. Techniki te mają wiele zastosowań badawczych i są szczególnie przydatne do badania rozwoju jąder i fizjologii in vitro.

Pozakomórkowe i pozakomórkowe wolne od macierzy komórkowej wytwarzanie mysich organoidów jąder

Tutaj prezentujemy prostą i skuteczną metodę izolowania żywych mejotycznych i postmejotycznych komórek rozrodczych od jąder dorosłych myszy. Korzystając z barwnika wiążącego DNA o niskiej cytotoksyczności, wzbudzonego fioletem i sortowania komórek aktywowanego fluorescencją, można wyizolować wysoce wzbogacone populacje komórek spermatogennych do wielu dalszych zastosowań.

Izolacja mysich komórek spermatogennych za pomocą fioletowo-wzbudzonego, przepuszczalnego dla komórek barwnika wiążącego DNA

Poznaj szybką metodę przygotowania zawiesin komórek jąder gryzoni bez użycia enzymów. Mechaniczna dezagregacja trwa tylko 15 minut, zachowując żywotność komórek i integralność makrocząsteczek do analiz cytometrycznych oraz badań ekspresji genów.

Prosta i skuteczna technika przygotowania zawiesin komórek jąder

Przeglądaj więcej filmów