Name: Pułapkowanie genów za pomocą Gal4 u danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: Poznaj metodę pułapkowania genów w danio pręgowanym przy użyciu wektorów z reporterem Gal4-VP16. Technika ta umożliwia generowanie mutantów do analizy funkcji genów w biologii rozwoju.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Jennifer Emtage za krytyczne przeczytanie manuskryptu, Ryanowi Gillowi za pomoc techniczną i pomoc w opiece nad danio pręgowanym oraz dr Stephenowi C. Ekkerowi (Mayo Clinic, Rochster, Minnesota) za odczynniki. Nasza praca była wspierana przez Temple University College of Science and Technology oraz National Institutes of Health (R01-HD061749).

1. Produkcja pokolenia F0 przez mikrointrykcję pułapki genowej.
Odkryliśmy, że zarodki o różnym pochodzeniu genetycznym wykazują różną tolerancję na tę procedurę, przy czym najbardziej tolerancyjne są szczepy dzikie ze sklepów zoologicznych i Tuebingen - Long Fin (TLF), podczas gdy szczepy AB i Tuebingen mają gorszą przeżywalność.
<ol>
	<li>Przygotowanie transpozonu DNA. Przygotuj plazmidowe DNA GBT-B1 (pDB783, Balciuniene i wsp. w przygotowaniu) za pomocą standardowego zestawu miniprep QIAprep (Qiagen 27106). Konieczne jest uwzględnienie etapu płukania PB (który jest opcjonalny w procedurze QIAprep), w przeciwnym razie DNA miniprep zostanie zanieczyszczone przez RNazę, co doprowadzi do degradacji mRNA transpozazy. Przed wstrzyknięciem należy rozcieńczyć DNA w wodzie wolnej od RNaz (Ambion AM9937) do 10 ng/μl.</li>
	<li>Przygotowanie mRNA transpozazy. Linearyzuj pT3TS/Tol2 (pDB600) 13 za pomocą XbaI i transkrybuj zlinearyzowane DNA za pomocą zestawu do transkrypcji in vitro mMessage Machine T3 (Ambion AM1348). Zmodyfikowaliśmy reakcję transkrypcji in vitro, dodając 0,5 μl inhibitora RNazy RiboLock (ThermoFisher Fermentas EO0381). Po etapie leczenia DNazą oczyść mRNA za pomocą zestawu RNeasy MinElute (Qiagen 74204). Oceń jakość transkrybowanego mRNA in vitro za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Rozcieńczyć mRNA w wodzie wolnej od RNaz do 40 ng/μl i przechowywać jako 2 μl podwielokrotności w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Przygotowanie mieszanki do mikroiniekcji. Przed wstrzyknięciem dodać 8 μl rozcieńczonego transpozonu DNA do 2 μl podwielokrotności mRNA transpozazy.</li>
	<li>Mikroiniekcja. Wstrzyknąć 3 nl mieszaniny DNA/RNA do żółtka 1-komórkowego zarodka danio pręgowanego przy użyciu standardowych technik mikroiniekcji, dążąc do granicy żółtka/blastomeru. Pobieraj zarodki co 20 minut, aby zapewnić wstrzyknięcie w fazie 1 komórki. Z naszego doświadczenia wynika, że wprawna osoba może z łatwością wstrzyknąć 1000 zarodków w ciągu 1-1,5 godziny.</li>
	<li>Po wstrzyknięciu przelej 5 μl pozostałego roztworu do wstrzykiwań na 1% żelu agarozowym w celu kontroli jakości, aby upewnić się, że mRNA transpozazy nie uległo degradacji.</li>
	<li>Pielęgnacja zarodków iniekcyjnych. Późnym popołudniem należy usunąć niezapłodnione i nieprawidłowe zarodki i rozprowadzić je do 60-80 na 100 mm szalki Petriego. Nieprawidłowe i martwe zarodki są usuwane po 1 dniu od zapłodnienia (dpf), 2 dpf i 3 dpf.</li>
	<li>Badania przesiewowe w kierunku ekspresji GFP. Badania przesiewowe zarodków bez jawnych wad pod kątem fluorescencji GFP przy 3 dpf (ryc. 3). Badania przesiewowe można wykonać zarówno na mikroskopie stereoskopowym wyposażonym w fluorescencję (używamy SMZ1500 Nikona), jak i na mikroskopie pionowym (używamy Zeiss AxioImager z obiektywem 5X Fluar). Niska ekspresja GFP wskazuje na nieudane wstrzyknięcie lub degradację transpozazy RNA z powodu zanieczyszczenia RNazą (Figura 3A). Wybierz około 30% najjaśniejszych zarodków, które mają ekspresję GFP w wielu tkankach lub w dużym odsetku komórek określonej tkanki (porównaj ryciny 3B i 3C). Z wstrzyknięcia 1000 zarodków zwykle otrzymujemy do 100 normalnych rozwojowo zarodków o wysokiej ekspresji GFP.</li>
	<li>Hoduj wybrane zarodki F0 przy użyciu standardowych procedur hodowli danio pręgowanego. Rozsądne jest oczekiwanie, że 20-30% wstrzykniętych zarodków wybranych do hodowli przetrwa do dorosłości.</li>
</ol>
2. Konserwacja linii testera UAS:mRFP.
Wygenerowano linię 14xUAS:mRFP oznaczoną specyficznym dla obiektywu γCry:GFP. Ponieważ UAS jest wyciszany poprzez metylację DNA, ważne jest, aby wybierać ryby o niskim poziomie wyciszenia do rozmnażania stada.
<ol>
	<li>Skonfiguruj indywidualne homozygoty UAS:mRFP do kojarzenia z jedną z naszych najbardziej niezawodnych linii pułapek genowych Gal4, nsftpl6 (Balciuniene i wsp. w przygotowaniu).</li>
	<li>Następnego dnia przenieś rybę UAS:mRFP, która oddała zarodki, do poszczególnych zbiorników statycznych, podczas gdy zarodki są zbierane i czyszczone.</li>
	<li>Badania przesiewowe zarodków pod kątem fluorescencji GFP i RFP przy 1 dpf i 3 dpf.</li>
	<li>Krzyżowanie ryb, które dały zarodki o wysokiej ekspresji mRFP, aby ustanowić następną generację linii UAS: mRFP.</li>
</ol>
3. Badanie przesiewowe ryb F0.
<ol>
	<li>Skrzyżuj osobnik F0 z homozygotyczną rybą UAS:mRFP (ryc. 4). Zwykle wstrzykujemy nasze GBT do linii z wzorami pigmentacji typu dzikiego lub lamparta, a nasza homozygotyczna linia UAS:mRFP jest na mosiężnym tle. W związku z tym ryby F0 z wstrzyknięciem GBT można łatwo odróżnić od ryb UAS:mRFP, eliminując potrzebę rejestrowania, czy badany F0 był samcem czy samicą, a także potencjalne błędy wynikające z błędów w rejestrowaniu i/lub określaniu płci każdej ryby. Personel o bardzo ograniczonym doświadczeniu, taki jak studenci studiów licencjackich, jest więc w stanie ustawić i rozłożyć krycia ryb. Podejście to ma tę wadę, że wykorzystuje się dwa różne tła genetyczne, co potencjalnie komplikuje interpretację fenotypów utraty funkcji.</li>
	<li>Następnego dnia zwróć mosiężne ryby UAS:mRFP do ich zbiornika. Umieść rybę F0, która dała zarodki, w indywidualnych zbiornikach statycznych (używamy Hagen Exo Terra Faunarium Small, ale do tego celu można użyć dowolnego małego zbiornika), podczas gdy zarodki są zbierane i badane.</li>
	<li>Oczyść i przenieś pobrane zarodki na nowe szalki Petriego (<100 na szalkę) po południu dnia 0.</li>
	<li>Badania przesiewowe zarodków pod kątem fluorescencji GFP i RFP przy 1 dpf, 2 dpf i 3 dpf. Wyciągnij zarodki dodatnie zarówno dla GFP, jak i RFP, posortuj je według wzorca ekspresji GFP/RFP (jeśli w lęgu obserwuje się więcej niż jeden wzorzec) i podnieś je, aby ustalić pokolenie F1.</li>
	<li>Poddaj eutanazji ryby F0, które wydały tylko ujemne zarodki (z całkowitej liczby 50-100 zarodków).</li>
	<li>Ponownie skrzyżuj ryby F0, które wyprodukowały potomstwo z dodatnim wynikiem GFP/RFP, aby uzyskać drugą partię dodatnich.</li>
</ol>
4. Badanie przesiewowe ryb F1.
Ryby F1 są badane w celu ustalenia rodzin F2, udokumentowania wzorca ekspresji pułapki genowej i zamrożenia partii zarodków w celu molekularnej identyfikacji loci pułapki genowej za pomocą 5' RACE i odwrotnego PCR.
<ol>
	<li>Skrzyżowanie poszczególnych ryb F1 z homozygotyczną rybą UAS:mRFP (ryc. 4).</li>
	<li>Następnego dnia umieść ryby F1, które dały zarodki, w indywidualnych zbiornikach statycznych, podczas gdy zarodki są zbierane i poddawane badaniom przesiewowym.</li>
	<li>Badania przesiewowe zarodków pod kątem fluorescencji GFP i RFP przy 1 dpf, 2 dpf i 3 dpf. Oddziel i sfotografuj zarodki z pozytywnym wynikiem zarówno dla GFP, jak i RFP 24.</li>
	<li>W 5 dpf zamrozić partie 20 zarodków GFP/RFP-dodatnich i 20 GFP/RFP-ujemnych w celu identyfikacji genów zmutowanych insercyjnie metodą odwrotnego PCR i 5' RACE 9,10. Hodować pozostałe zarodki z dodatnim wynikiem GFP/RFP, aby ustanowić pokolenie F2.</li>
</ol>

<ol><li>Balciunas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+trapping+in+zebrafish+using+the+Sleeping+Beauty+transposon%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Enhancer trapping in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon.</a> BMC Genomics. 5 (1), 62(2004).</li>
<li>Trinh le, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+gene+trap+to+visualize+and+interrogate+the+function+of+the+vertebrate+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A versatile gene trap to visualize and interrogate the function of the vertebrate proteome.</a> Genes Dev. 25 (21), 2306-2320 (2011).</li>
<li>Kawakami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transposon-mediated+gene+trap+approach+identifies+developmentally+regulated+genes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish.</a> Dev Cell. 7 (1), 133-144 (2004).</li>
<li>Emelyanov, A., Parinov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mifepristone-inducible+LexPR+system+to+drive+and+control+gene+expression+in+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mifepristone-inducible LexPR system to drive and control gene expression in transgenic zebrafish.</a> Dev Biol. 320 (1), 113-121 (2008).</li>
<li>Ellingsen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+enhancer+detection+in+the+zebrafish+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Large-scale enhancer detection in the zebrafish genome.</a> Development. 132 (17), 3799-3811 (2005).</li>
<li>Distel, M., Wullimann, M. F., Koster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+Gal4+genetics+for+permanent+gene+expression+mapping+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13365-13370 (2009).</li>
<li>Davison, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transactivation+from+Gal4-VP16+transgenic+insertions+for+tissue-specific+cell+labeling+and+ablation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Transactivation from Gal4-VP16 transgenic insertions for tissue-specific cell labeling and ablation in zebrafish.</a> Dev Biol. 304 (2), 811-824 (2007).</li>
<li>Sivasubbu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-breaking+transposon+mutagenesis+reveals+an+essential+role+for+histone+H2afza+in+zebrafish+larval+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Gene-breaking transposon mutagenesis reveals an essential role for histone H2afza in zebrafish larval development.</a> Mech Dev. 123 (7), 513-529 (2006).</li>
<li>Clark, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+protein+trapping+produces+a+functional+expression+codex+of+the+vertebrate+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo protein trapping produces a functional expression codex of the vertebrate proteome.</a> Nat Methods. 8 (6), 506-512 (2011).</li>
<li>Petzold, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+response+genetics+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Nicotine response genetics in the zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18662-18667 (2009).</li>
<li>Gaiano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+mutagenesis+and+rapid+cloning+of+essential+genes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish.</a> Nature. 383 (6603), 829-832 (1996).</li>
<li>Amsterdam, A., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+strategies+in+zebrafish+for+identifying+genes+involved+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis strategies in zebrafish for identifying genes involved in development and disease.</a> Trends Genet. 22 (9), 473-478 (2006).</li>
<li>Balciunas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+a+high+cargo-capacity+transposon+for+genetic+applications+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates.</a> PLoS Genet. 2 (11), e169(2006).</li>
<li>Urasaki, A., Morvan, G., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+dissection+of+the+Tol2+transposable+element+identified+the+minimal+cis-sequence+and+a+highly+repetitive+sequence+in+the+subterminal+region+essential+for+transposition%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Functional dissection of the Tol2 transposable element identified the minimal cis-sequence and a highly repetitive sequence in the subterminal region essential for transposition.</a> Genetics. 174 (2), 639-649 (2006).</li>
<li>Haffter, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+identification+of+genes+with+unique+and+essential+functions+in+the+development+of+the+zebrafish%2C+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio.</a> Development. 123, 1-36 (1996).</li>
<li>Amsterdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+315+genes+essential+for+early+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of 315 genes essential for early zebrafish development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12792-12797 (2004).</li>
<li>Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+Gal4-UAS+technique+for+targeted+gene+expression+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish.</a> Mech Dev. 80 (2), 153-158 (1999).</li>
<li>Koster, R. W., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+transgene+expression+in+living+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Tracing transgene expression in living zebrafish embryos.</a> Dev Biol. 233 (2), 329-346 (2001).</li>
<li>Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+double-strand+breaks+into+the+genome+of+mouse+cells+by+expression+of+a+rare-cutting+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease.</a> Mol Cell Biol. 14 (12), 8096-8106 (1994).</li>
<li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li>
<li>Lisby, M., Mortensen, U. H., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+of+multiple+DNA+double-strand+breaks+at+a+single+Rad52+repair+centre%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Colocalization of multiple DNA double-strand breaks at a single Rad52 repair centre.</a> Nat Cell Biol. 5 (6), 572-577 (2003).</li>
<li>Bennardo, N., Cheng, A., Huang, N., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative-NHEJ+is+a+mechanistically+distinct+pathway+of+mammalian+chromosome+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Alternative-NHEJ is a mechanistically distinct pathway of mammalian chromosome break repair.</a> PLoS Genet. 4 (6), e1000110(2008).</li>
<li>Rehn, K., Wong, K. S., Balciunas, D., Sumanas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+enhancer+trap+line+recapitulates+embryonic+aquaporin+1a+expression+pattern+in+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish enhancer trap line recapitulates embryonic aquaporin 1a expression pattern in vascular endothelial cells.</a> Int J Dev Biol. 55 (6), 613-618 (2011).</li>
<li>Petzold, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCORE+imaging%3A+specimen+in+a+corrected+optical+rotational+enclosure%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">SCORE imaging: specimen in a corrected optical rotational enclosure.</a> Zebrafish. 7 (2), 149-154 (2010).</li>
<li>Akitake, C. M., Macurak, M., Halpern, M. E., Goll, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenerational+analysis+of+transcriptional+silencing+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Transgenerational analysis of transcriptional silencing in zebrafish.</a> Dev Biol. 352 (2), 191-201 (2011).</li>
<li>Boniface, E. J., Lu, J., Victoroff, T., Zhu, M., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FlEx-based+transgenic+reporter+lines+for+visualization+of+Cre+and+Flp+activity+in+live+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">FlEx-based transgenic reporter lines for visualization of Cre and Flp activity in live zebrafish.</a> Genesis. 47 (7), 484-491 (2009).</li>
<li>Skarnes, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+public+gene+trap+resource+for+mouse+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">A public gene trap resource for mouse functional genomics.</a> Nat Genet. 36 (6), 543-544 (2004).</li>
<li>Davidson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+delivery+and+gene+expression+in+zebrafish+using+the+Sleeping+Beauty+transposon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene delivery and gene expression in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon.</a> Dev Biol. 263 (2), 191-202 (2003).</li>
</ol>

Autorzy ci nie mają nic do ujawnienia.

Opisane tutaj wektory pułapek genowych i metodologia są już wykorzystywane w kilku niezależnych laboratoriach. Z naszego doświadczenia wynika, że proces ten składa się z dwóch kluczowych etapów. Pierwszym krytycznym krokiem jest osiągnięcie wysokich wskaźników integracji pułapek genowych w zarodkach, którym wstrzyknięto F0. Niepowodzenie na tym etapie można często przypisać zanieczyszczeniu odczynników do wstrzykiwań RNazą, zwłaszcza DNA miniprepu. Bardzo ważne jest również wstrzykiwanie zarodków w stadium 1 komórki do eksperymentów z pułapkami genowymi. Z naszego doświadczenia wynika, że transgeneza za pośrednictwem Tol2 jest bardzo wydajna, co umożliwia uzyskanie linii transgenicznych nawet przy wstrzyknięciu później niż w stadium 1 komórki lub z DNA o niższej jakości. Iniekcje niespełniające norm są znacznie bardziej problematyczne podczas przeprowadzania mutagenezy pułapek genowych, ponieważ tylko niewielka część integracji wektorów prowadzi do skutecznych zdarzeń pułapek genowych. Drugim krytycznym krokiem jest ustalenie zdarzeń pułapki genowej poprzez przekroczenie naszej linii UAS:mRFP. Brak wyrażenia mRFP prawie zawsze wskazuje na zdarzenie pułapki wzmacniacza. Czasami jednak brak wyrażenia mRFP może wskazywać na wyciszenie 14x UAS. Dlatego ważne jest, aby utrzymać linię UAS:mRFP w stanie niewyciszonym poprzez propagację następnego pokolenia przy użyciu osobników o wysokiej ekspresji RFP po skrzyżowaniu z nsftpl6.
Możemy przewidzieć wprowadzenie kilku ulepszeń do naszych wektorów pułapek genowych i protokołu. Pierwszym z nich jest użycie mniej powtarzalnego UAS w konstrukcji pułapki genowej. Wykazano, że 5-krotny UAS jest wystarczający do osiągnięcia pełnej aktywacji w eksperymentach z hodowlami komórkowymi, a mniej powtarzalne sekwencje UAS są mniej podatne na metylację i wyciszenie 6,25. Możliwe jest również zaprojektowanie wektorów pułapek genowych dla w pełni warunkowej mutagenezy, analogicznie do wektorów stosowanych przez międzynarodowe konsorcjum pułapek genowych na myszy i ostatnio zaadaptowanych dla danio pręgowanego 2,26,27. Kolejnym ulepszeniem byłoby użycie innego systemu transpozonów, na przykład Sleeping Beauty 28, do wygenerowania linii reportera UAS:mRFP. Umożliwiłoby to wstrzyknięcie pułapek genowych opartych na Tol2 bezpośrednio do linii reporterowej i badanie przesiewowe F0 poprzez krzyżowanie. Co więcej, wyeliminowałoby to stosowanie dwóch różnych środowisk genetycznych, co ułatwiłoby interpretację fenotypów utraty funkcji. Nawet przy tych ulepszeniach, ogólny protokół pułapki genowej Gal4 przedstawiony tutaj nadal będzie w pełni możliwy do zastosowania.

Mutageneza insercyjna okazała się skutecznym podejściem do analizowania funkcji genów w różnych systemach modelowych, od organizmów jednokomórkowych, takich jak bakterie i drożdże, po organizmy wielokomórkowe, takie jak myszy i rośliny. Każde egzogenne DNA (wirus, transpozon lub plazmid) może służyć jako mutagen poprzez przerywanie istotnych elementów genów, takich jak eksony lub promotory. Efektywny cel takich prostych podejść jest niezwykle mały w przypadku dużych złożonych genomów, ponieważ eksony stanowią tylko 1-3% typowego genomu kręgowców. Mały efektywny rozmiar celu można przezwyciężyć dzięki bardzo wysokim wskaźnikom integracji wektorów, czego przykładem jest ogromny sukces retrowirusowej mutagenezy insercyjnej u danio pręgowanego 11,12. Natomiast introny stanowią około 20-30% genomów kręgowców. U danio pręgowanego wektory mutagenezy insercyjnej oparte na transpozonach, które skutecznie wprowadzają zerowe lub ciężkie mutacje hipomorficzne po integracji z intronami, zostały nazwane "transpozonami łamiącymi geny" (GBT) 8-10. Aby zapewnić efektywną integrację pułapek genowych, używają minimalnego transpozonu Tol2 13,14. Mutagenność GBT opiera się na pochodzącym z ryb akceptorze splicingu i sekwencjach terminacji/poliadenylacji transkrypcji. Elementy odpowiedzialne za mutagenność GBT są otoczone bezpośrednimi miejscami loxP do wycięcia przez rekombinazę Cre. Tak więc wstrzyknięcie mRNA Cre prowadzi do skutecznego odwrócenia mutacji indukowanych przez GBT, mimo że niektóre sekwencje transpozonów pozostają w locus integracji 9,10.
Ostatnio opublikowane wektory GBT używają mRFP jako reportera pułapek genowych 9,10, co prowadzi do dwóch potencjalnych niedociągnięć. Po pierwsze, nie wiadomo, jaka część genów danio pręgowanego ulega ekspresji na wystarczająco wysokim poziomie, aby można ją było wykryć za pomocą bezpośrednich fluorescencyjnych białek reporterowych. Po drugie, oczekuje się, że tylko niewielki podzbiór genów będzie pełnił podstawowe funkcje. Szacuje się, że do rozwoju danio pręgowanego potrzebnych jest tylko 1400-2400 genów. Oczekuje się, że większość mutantów pułapek genowych nie będzie wykazywać jawnych fenotypów i dlatego będzie miała ograniczoną użyteczność. Aby przezwyciężyć te dwa ograniczenia, zmodyfikowaliśmy GBT-R15 9,10 do stosowania z Gal4-VP16 jako głównym reporterem pułapki genowej (Balciuniene i wsp. w przygotowaniu). Podobnie jak w przypadku mRFP bez AUG w GBT-R15, strona startowa tłumaczenia została usunięta z Gal4-VP16. W celu bezpośredniego wykrywania zdarzeń pułapek genowych, nasze wektory zawierają reporter eGFP pod kontrolą 14x Gal4 UAS 17,18.
Kilka dodatkowych funkcji zostało zaprojektowanych w naszym dwudzielnym wektorze pułapki genowej. Kaseta UAS:eGFP jest otoczona bezpośrednimi miejscami FRT (szare szewrony na rysunku 1). Wstrzyknięcie mRNA rekombinazy Flp prowadzi do wycięcia kasety UAS:eGFP, pozostawiając mutację pułapki genowej nieoznaczoną fluorescencją eGFP. Następnie może być stosowany w liniach transgenicznych, które oznaczają określone tkanki lub zdarzenia rozwojowe za pomocą fluorescencji GFP. Podobnie jak w innych GBT, cała kaseta pułapki genowej jest otoczona bezpośrednimi miejscami loxP (otwarte pięciokąty na rysunku 1). To sprawia, że zdarzenia pułapki genowej są odwracalne przez ekspresję rekombinazy Cre, co łatwo ustanawia dowód związku przyczynowego między określoną integracją pułapki genowej a obserwowanym fenotypem (Figura 2). Wreszcie, kaseta pułapki genowej jest otoczona odwróconymi miejscami meganukleazy I-SceI (czarne trójkąty na rycinie 1). U Drosophila integracje transpozonów są często przekształcane w delecje (niedobory) przez nieprecyzyjne wycięcie elementu P. Nie ma dowodów na to, że wycięcie transpozonu Tol2 (lub jakiegokolwiek innego transpozonu aktywnego u kręgowców, takiego jak Sleeping Beauty, PiggyBac lub Ac/Ds) może prowadzić do delecji. W związku z tym włączyliśmy miejsca I-SceI jako potencjalną zastępczą metodę indukcji delecji, mimo że nie ma dowodów na to, że I-SceI może indukować delecje u danio pręgowanego. Należy zauważyć, że podczas gdy meganukleaza I-SceI może być stosowana do ułatwiania transgenezy u danio pręgowanego, rozszczepianie DNA przez meganukleazę I-SceI służy do badania mechanizmów naprawy DNA, w tym podatnego na błędy niehomologicznego łączenia końców, w komórkach drożdży i ssaków 19-22.
Integracja naszego wektora pułapki genowej może prowadzić do ekspresji eGFP za pomocą dwóch różnych mechanizmów. Pierwszym z nich jest prawdziwa pułapka genowa (ryc. 1C): wektor integruje się z genem (IMG dla genu zmutowanego insercyjnie), transkrypt fuzyjny między 5' endogennego transkryptu IMG a Gal4-VP16 jest wytwarzany i translowany do białka fuzyjnego zawierającego N-koniec białka kodowanego przez IMG i Gal4-VP16. To białko fuzyjne wiąże się z 14x UAS i aktywuje transkrypcję eGFP. Drugim, mniej pożądanym zdarzeniem jest pułapka wzmacniacza (ryc. 1D): minimalny promotor przed eGFP wpada pod kontrolę wzmacniacza w pobliżu miejsca integracji, co prowadzi do produkcji eGFP przy braku produkcji Gal4-VP16. W naszych szacunkach 30-50% zdarzeń związanych z ekspresją eGFP jest spowodowanych pułapką wzmacniającą, a 50-70% jest spowodowanych pułapką genową 23 (Balciuniene i wsp. w przygotowaniu). Aby rozróżnić te dwie klasy zdarzeń, stworzyliśmy linię transgeniczną 14xUAS:mRFP (Rysunek 1B), dla wygody oznaczoną specyficznym dla soczewki γCry:GFP (Balciuniene i in. w przygotowaniu). Zdarzenia pułapki genowej są weryfikowane przez koekspresję GFP i RFP (porównaj C i D na rysunku 2).
Na naszym ekranie pilotażowym odzyskaliśmy ponad 40 przypadków pułapek genowych po przebadaniu 270 ryb F0, którym wstrzyknięto mieszaninę transpozonu DNA i transpozazy mRNA. Dwie z naszych integracji pułapek genowych nastąpiły w genach z wcześniej opublikowanymi mutantami indukowanymi chemicznie: nsf i flr. Fenotypy naszych mutantów insercyjnych nsftpl6 i flrtpl24 są powierzchownie nie do odróżnienia od fenotypów odpowiednich mutantów indukowanych chemicznie. Zauważyliśmy również, że zdarzenia pułapki genowej wydają się być stronnicze w kierunku intronów w pobliżu końca 5' genów, zwiększając w ten sposób prawdopodobieństwo wystąpienia alleli zerowych. Obserwujemy pewien stopień wyciszenia (zmienności) UAS we wszystkich naszych liniach pułapek genowych, a niektóre loci są wyraźnie bardziej podatne na różnorodność niż inne. Nie uważamy, że wyciszanie UAS stanowi istotny problem dla rozmnażania linii pułapek genowych, ponieważ byliśmy w stanie łatwo rozmnażać wszystkie nasze linie pułapek genowych przez co najmniej pięć pokoleń, selekcjonując je wyłącznie pod kątem ekspresji GFP.

<table><tbody><tr><td>Zestaw Miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>Opcjonalny etap mycia PB jest koniecznością</td></tr><tr><td>Enzym ograniczający XbaI</td><td>ThermoFisher</td><td>ER0681</td><td></td></tr><tr><td>mMessage Machine T3</td><td>Ambion</td><td>AM1348</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor RNazy RiboLock</td><td>ThermoFisher</td><td>EO0381</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MinElute</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>Może być zastąpiony przez ekstrakcję fenolu i opad atmosferyczny. Kiedy nie stosować LiCl!</td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td>Musi być niepoddana obróbce DEPC</td></tr><tr><td>Kapilarki ze szkła borokrzemianowego do igieł do mikroiniekcji</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokapilarze do kalibracji</td><td>Drummond Scientific</td><td>1-000-0010</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do mikroładowarek</td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz igieł *</td><td>Sutter Instrumenty</td><td>P-87</td><td></td></tr><tr><td>Stereoskop do mikroiniekcji * </td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td>Używamy również Wild 5M i Olympus SZ61 ze statywem do światła przechodzącego</td></tr><tr><td>Picoinjector *</td><td>Harvard Instruments</td><td>Pli-90</td><td>Używamy również Pli-100</td></tr><tr><td>Mikroskop przesiewowy z fluorescencją GFP/RFP *</td><td>Obiektyw Zeiss</td><td>Zeiss AxioImager</td><td>5X Fluar ma wystarczającą odległość roboczą</td></tr><tr><td>Mikroskop przesiewowy z fluorescencją GFP/RFP *</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">* Sugerujemy ten sprzęt tylko dlatego, że z powodzeniem używamy go w naszym laboratorium. W każdej kategorii dostępnych jest kilka porównywalnych opcji od wielu producentów.</td></tr></tbody></table>

pułapkowanie genów za pomocą gal4 u danio pręgowanego

Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

Duży rozmiar lęgu i zewnętrzny rozwój optycznie przezroczystych zarodków sprawiają, że danio pręgowany jest wyjątkowym modelem kręgowców do mutagenezy insercyjnej in vivo, wykorzystującej fluorescencyjne reportery do oznaczania ekspresji zmutowanych genów. Kilka laboratoriów skonstruowało i przetestowało wektory pułapek wzmacniających i genowych u zebry pręgowanego, wykorzystując białka fluorescencyjne, aktywatory transkrypcji oparte na Gal4 i lexA jako reportery 1-7. Wektory te miały dwie potencjalne wady: nieoptymalną rygorystyczność (np. brak zdolności do różnicowania zdarzeń wzmacniających i pułapek genowych) oraz niską mutagenność (np. integracje z genami rzadko wytwarzały allele zerowe). Transpozon łamiący geny (GBT) został opracowany w celu wyeliminowania tych wad 8-10. Zmodyfikowaliśmy jeden z pierwszych wektorów GBT, GBT-R15, do użytku z Gal4-VP16 jako główny reporter pułapki genowej i dodaliśmy UAS:eGFP jako drugorzędny reporter do bezpośredniego wykrywania zdarzeń pułapki genowej. Zastosowanie Gal4-VP16 jako głównego reportera pułapki genowej ma dwie główne zalety. Po pierwsze, zwiększa wrażliwość na geny ulegające ekspresji przy niskich poziomach ekspresji. Po drugie, umożliwia naukowcom wykorzystanie linii pułapek genowych jako czynników napędzających Gal4 do kierowania ekspresją innych transgenów w bardzo specyficznych tkankach. Jest to szczególnie istotne w przypadku genów o nieistotnych lub nadmiarowych funkcjach, w przypadku których integracja pułapki genowej może nie prowadzić do jawnych fenotypów. Wadą stosowania Gal4-VP16 jako głównego reportera pułapki genowej jest to, że geny kodujące białka z N-końcowymi sekwencjami sygnałowymi nie są podatne na pułapkowanie, ponieważ powstałe białka fuzyjne Gal4-VP16 prawdopodobnie nie będą w stanie dostać się do jądra i aktywować transkrypcji. Co ważne, zastosowanie Gal4-VP16 nie powoduje wstępnej selekcji białek jądrowych: odzyskaliśmy mutacje pułapek genowych w genach kodujących białka, które funkcjonują w jądrze, cytoplazmie i błonie komórkowej.

W przypadku udanej iniekcji co najmniej 80% embrionów wstrzykniętych mieszaniną DNA pułapki genowej i mRNA transpozazy Tol2 wykazuje pewien stopień fluorescencji GFP (Rysunek 3). Po wybraniu najjaśniejszych embrionów GFP-dodatnich (Rysunek 3C) w celu utworzenia puli F0, około jedna na 10 przebadanych ryb F0 daje potomstwo z pułapką genową. Wśród ryb F0, u których odzyskano zdarzenia pułapki genowej, większość przekazuje jedno zdarzenie pułapki genowej oprócz kilku nieekspresyjnych integracji transpozonów. Udało nam się jednak ustanowić do czterech linii pułapki genowej z jednego osobnika F0. Wzorce ekspresji GFP/RFP w liniach pułapki genowej różnią się od ekstremalnie tkankowo specyficznych (na przykład w cebulkach węchowych) do dość powszechnych.
<img alt="Schemat edycji genów przedstawiający integrację eGFP i mRFP z miejscami loxP i FRT; genetyka molekularna." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Zawierający Gal4 dwuczęściowy wektor pułapki genowej GBT-B1 i jego zastosowania. A. Komponenty wektora pułapki genowej zawierającego Gal4: Tol2 5' i Tol2 3', minimalne końce transpozonu Tol2 13; cSA, akceptor splicingu β-aktyny Carp 8; ^Gal4-VP16, Gal4-VP16 pozbawiony kodonu AUG; zp(A), elementy 3' UTR β-aktyny ryby danio pręgowanej i poly(A) z GBT-R15 9,10. 14XUAS, eGFP oraz SV40 p(A) są komponentami kasety ekspresyjnej UAS:eGFP 17,18. Strzałka wskazuje aktywację UAS:eGFP przez Gal4-VP16 wytwarzany przez pułapkę genową. B. Transgen 14XUAS:mRFP znakowany soczewka-specyficzną kasetą γCry:GFP. Strzałka wskazuje aktywację UAS:mRFP przez Gal4-VP16 in trans. C. Zdarzenie pułapki genowej. Niebieskie pola to eksony. Splicing jest zaznaczony linią przerywaną. D. Zdarzenie pułapki enhansera. Integracja wektora w pobliżu enhansera (brązowe pole) może sprawić, że minimalny promotor eGFP znajdzie się pod kontrolą tego enhansera (brązowa strzałka). Doprowadziłoby to do tkankowo-specyficznej ekspresji eGFP, ale ponieważ Gal4-VP16 nie jest wytwarzany, ekspresja mRFP nie zostałaby aktywowana.
<img alt="Proces edycji genów; schemat modyfikacji DNA, analiza fluorescencji zarodka transgenicznej danio pręgowanej." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Odwrócenie zdarzeń pułapki genowej przy użyciu rekombinazy Cre. A, B. Schemat mutacji pułapki genowej (A) oraz allelu pułapki genowej odwróconej przez Cre (B). C, D. Koekspresja GFP (C) i RFP (D) w układzie nerwowym linii pułapki genowej nsftpl6. E, F. Iniekcja RNA Cre do zarodków nsftpl6 prowadzi do utraty ekspresji GFP (E) i RFP (F). Należy zauważyć, że w soczewce nie występuje spadek ekspresji GFP, zgodnie z oczekiwaniami.
<img alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej ukazujące ekspresję białka w komórkach roślinnych; widoczna zielona fluorescencja." src="/files/ftp_upload/50113/50113fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Zarodki wstrzyknięte pułapką genową GBT-B1 (pDB783). A. Zarodki wstrzyknięte samym pGBT-B1 (pDB783) wykazują słabą fluorescencję GFP w ciele. B, C. Zarodki wstrzyknięte pGBT-B1 oraz mRNA transpozazy Tol2: losowa grupa zarodków (B) oraz osobniki o wysokiej ekspresji wybrane do hodowli (C).
<img alt="Schemat procesu edycji genów; selekcja genetyczna ryb z tagowaniem GFP/RFP; metoda krzyżowania." fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Schemat eksperymentalny tworzenia linii z pułapką genową Gal4. Częściowo nakładające się struktury czerwone/zielone wskazują na koekspresję GFP i RFP, natomiast sam kolor zielony wskazuje na mozaikowość w przypadku zdarzeń pułapki genowej lub pułapki enhancera.

Ten protokół opisuje metodę mutagenezy insercyjnej pułapki genowej przy użyciu Gal4-VP16 jako głównego reportera i GFP/RFP jako wtórnego reportera u danio pręgowanego. Około jedna na dziesięć ryb o wysokiej ekspresji F0 daje potomstwo pułapki genowej koeksprymujące GFP i RFP. Procedurę przesiewową można łatwo przeskalować, aby dostosować ją do wielkości laboratorium wykonującego badanie przesiewowe mutagenezy insercyjnej.

Pułapkowanie genów za pomocą Gal4 u danio pręgowanego

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie mutantów ryb z wykorzystaniem transpozasji rozbijającej geny na wektorach z GAL4 i VP16 jako głównym reporterem pułapki genowej. Osiąga się to poprzez wstępną ko-iniekcję wektora pułapki genowej wraz z transpozasą Tol2 do embrionów zebrafish. W trzeciej dobie po zapłodnieniu embriony poddaje się przesiewowi pod kątem fluorescencji GFP, a następnie wybiera około 30% najsilniej fluorescujących embrionów w celu utworzenia puli F0.Następnie ryby z pokolenia F zero krzyżuje się z linią testerową U-A-S-M-R-F-P, aby sprawdzić transmisję linii zarodkowej zdarzeń pułapkowania genów. Ostatnim etapem jest krzyżowanie wsteczne pokolenia F1 w celu utworzenia pokolenia F two oraz uzyskania embrionów do charakterystyki molekularnej zdarzeń pułapkowania genów za pomocą odwróconej PCR oraz 5' RACE. Ostatecznie około jedna na 10 przebadanych ryb F zero powinna dać potomstwo z pułapką genową.Transpozony z przerywaniem genu (gene breaking transposons) zostały zaprojektowane tak, aby nie wywoływać mutacji podczas integracji w obrębie sekwencji kodujących białka. Nasze wektory GBT wykorzystują G4P16 jako główny reporter pułapki genowej. Modyfikacja ta zwiększa czułość w wykrywaniu genów o niskim poziomie ekspresji i umożliwia nam wykorzystanie mutantów pułapki genowej bez fenotypów nadmiarowych jako driverów G4 do tkankowo specyficznej ekspresji innych transgenów.Uważamy, że głównym wąskim gardłem naszej metody jest osiągnięcie wystarczająco wysokiego stopnia integracji pułapki genowej w linii zarodkowej ryb generacji F0. W niniejszym pokazie omówimy kilka krytycznych etapów: przygotowanie DNA, mikroiniekcję oraz przesiewanie osobników F0. Wektor pułapki genowej GBTB1 wykorzystuje GAL4-VP16 jako główny reporter pułapki genowej.Do integracji pułapki genowej wykorzystuje się minimalne elementy transpozycyjne z końcowymi sekwencjami transpose. Zdarzenia pułapkowania genów są bezpośrednio wykrywane przez reporter EGFP pod kontrolą 14 X GAL four UAS. Cała kaseta pułapki genowej jest flankowana przez bezpośrednie miejsca rozpoznawania P.Dzięki temu zdarzenia pułapki genowej stają się odwracalne poprzez ekspresję rekombinaz Cre, co pozwala na ustalenie dowodu związku przyczynowo-skutkowego między specyficzną integracją pułapki genowej a obserwowanym fenotypem. Dodatkowo kaseta U-A-S-E-G-F-P jest flankowana przez bezpośrednie miejsca FRT. Wstrzyknięcie mRNA rekombinaz flip doprowadzi do wycięcia kasety U-A-S-E-G-F-P, w wyniku czego mutacja pułapki genowej nie będzie oznakowana fluorescencją EGFP, co umożliwi jej zastosowanie w liniach transgenicznych, które przed mikroiniekcją znakują specyficzne tkanki lub zdarzenia rozwojowe za pomocą fluorescencji GFP.Przygotuj transpozon DNA oraz transkrypcyjny mRNA. Przygotuj DNA wektora pułapki genowej GBTB dla jednego genu. Podczas przygotowywania DNA, przy użyciu standardowego zestawu do mini-preparatyki i zgodnie z protokołem producenta, niezbędne jest uwzględnienie etapu płukania PB.W przeciwnym razie DNA z mini-prep będzie zanieczyszczone RNA, co prowadzi do degradacji mRNA transpozazy. Rozcieńcz DNA w wodzie wolnej od RNA do stężenia 10 nanograms per microliter. Aby przygotować mRNA dwóch transpozaz, najpierw zlinearyzuj PT three TS T two za pomocą xbo one. Następnie przeprowadź transkrypcję zlinearyzowanego DNA, używając zestawu do transkrypcji in vitro M message machine T three z jedną modyfikacją.Po etapie obróbki DNA dodać 0,5 µL inhibitora RibLock RNA, oczyścić mRNA za pomocą standardowego zestawu i ocenić jakość mRNA transkrybowanego in vitro za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Rozcieńczyć mRNA w wodzie wolnej od RNaz do stężenia 40 ng/µL i przechowywać w alikwotach po 2 µL w temperaturze -80 °C do momentu mikroiniekcji. Przygotować mieszaninę do iniekcji, dodając 8 µL rozcieńczonego DNA transpozazy do 2 µL alikwotu mRNA transpozazy.Wstrzyknij 3 nanolitrów mieszaniny DNA/RNA do żółtka zarodków danio przebróżkowanego w stadium jednego komórki, stosując standardowe techniki mikroiniekcji i celując w interfejs żółtka i blastodermu. Po iniekcji nanieś 5 mikrolitrów pozostałego roztworu wtryskowego na żel agarozowy 1% w celu kontroli jakości, aby upewnić się, że mRNA transpozazy nie uległo degradacji, około 6 do 8 godzin po iniekcji. Usuń niezapłodnione i martwe zarodki, a następnie rozdziel zarodki tak, aby w każdej 100 milimetrowej płytce Petriego znajdowało się od 60 do 80 sztuk. Nieprawidłowo rozwinięte i martwe zarodki usuwa się w pierwszym, drugim i trzecim dniu po zapłodnieniu; w trzecim dniu po zapłodnieniu oceny dokonuje się pod mikroskopem stereoskopowym wyposażonym w fluorescencję lub pod mikroskopem odwróconym.Przeprowadź przesiew zarodków i usuń wszystkie zarodki nieprawidłowe. Wyselekcjonuj pozostałe zarodki pozbawione wyraźnych wad. Pod kątem fluorescencji GFP wybierz najjaśniejsze zarodki F zero i hoduj je zgodnie ze standardowymi procedurami hodowli zebrafish stosowanymi w tym laboratorium.GBT są zazwyczaj wstrzykiwane do linii o pigmentacji typu dzikiego lub leopardziej. Można oczekiwać, że od 20 do 30% wstrzykniętych embrionów wybranych do hodowli przeżyje do wieku dorosłego. Integracja wektora pułapki genowej GBTB może prowadzić do ekspresji EGFP za pomocą dwóch różnych mechanizmów.Pierwszym przypadkiem jest właściwe zdarzenie pułapki genowej. Wektor integruje się z genem, tworząc transkrypty fuzyjne pomiędzy końcem 5' transkryptu tego genu endogennego a GAL4-VP16, który jest tłumaczony na białko fuzyjne zawierające koniec N-terminalny białka zakodowanego przez zmutowany gen wstawiony oraz GAL4-VP16. Białko fuzyjne to wiąże się z sekwencją 14xUAS i aktywuje transkrypcję EGFP.Drugim, mniej pożądanym zdarzeniem jest pułapka enhansera. Minimalny promotor przed EGFP wpada pod kontrolę enhansera znajdującego się w pobliżu miejsca integracji, co prowadzi do produkcji EGFP wobec braku GAL four, VP 16. Aby rozróżnić te dwie klasy zdarzeń, stworzono transgeniczną linię 14 X-U-A-S-M-R-F-P znakowaną lens-specyficzną gamma crystalline GFP.Zdarzenia pułapkowania genów są weryfikowane poprzez krzyżowanie ryb po iniekcji GBT z homozygotycznymi rybami U-A-S-M-R-F-P oraz przesiewanie w kierunku koekspresji GFP i RFP, co jest możliwe tylko wtedy, gdy powstanie GAL four, VP 16 i aktywuje U-A-S-M-R-F-P w trans. Aby rozpocząć procedurę przesiewania ryb F zero, należy skrzyżować poszczególne osobniki F zero z homozygotycznymi rybami U-A-S-M-R-F-P. Ponieważ ryby po iniekcji GBT posiadają pigmentację typu dzikiego lub leopardziego, a linia homozygotyczna U-A-S-M-R-F-P znajduje się w tle miedzianym, ryby F zero można łatwo odróżnić od ryb U-A-S-M-R-F-P, co eliminuje potrzebę zapisywania, czy przesiewany osobnik F zero był samcem czy samicą, a także potencjalne błędy wynikające z pomyłek w zapisywaniu i/lub określaniu płci każdej ryby. Następnego dnia.Przenieś mosiężne ryby U-A-S-M-R-F-P z powrotem do ich zbiornika. Umieść ryby F zero, które złożyły embriony, w osobnych zbiornikach statycznych podczas zbierania embrionów do przesiewania, a zebrane embriony przenieś do nowych naczyń Petriego w popołudnie dnia zero. Przesiewaj embriony pod kątem fluorescencji GFP i RFP w pierwszym oraz trzecim dniu po zapłodnieniu.Wyizoluj embriony wykazujące dodatni wynik dla GFP i RFP, a następnie posortuj je według wzorca ekspresji G-F-P-R-F-P. Jeśli w jednym miocie zaobserwowano więcej niż jeden wzorzec, wyhoduj je w celu ustanowienia generacji F1. Należy pamiętać, że embriony 3D PF wykazujące dodatni wynik dla GFP, ale nie dla RFP, nie są izolowane, ponieważ reprezentują one zdarzenia pułapki enhancera.Ponownie skrzyżuj ryby F0, które wydały potomstwo dodatnie pod kątem G-F-P-R-F-P, aby uzyskać drugą partię osobników dodatnich. Ryby F1 są przesiewane w celu utworzenia rodzin F2 dla udokumentowania wzorca ekspresji pułapki genowej oraz zamrożenia partii embrionów do molekularnej identyfikacji loci pułapki genowej. W pierwszej kolejności, następnego dnia, skrzyżuj poszczególne ryby F1 z homozygotycznymi rybami U-A-S-M-R-F-P. Umieść ryby F1, które wydały embriony, w oddzielnych zbiornikach statycznych, podczas gdy embriony są zbierane do przesiewania w pierwszym dniu po zapłodnieniu.Oznakowanie RFP mogło jeszcze nie wystąpić, dlatego należy przesiewowo zbadać embriony pod kątem fluorescencji GFP i wyłowić embriony GFP-dodatnie w trzecim dniu po zapłodnieniu; następnie przeprowadzić przesiew pod kątem fluorescencji zarówno GFP, jak i RFP i wyłowić osobniki podwójnie dodatnie. Następnie w piątym dniu po zapłodnieniu należy sfotografować embriony dodatnie zarówno dla GFP, jak i RFP, a następnie zamrozić grupy po 20 embrionów GFP-RFP-dodatnich oraz 20 embrionów GFP-RFP-ujemnych w celu identyfikacji zmutowanych genów wkładki za pomocą odwrotnej PCR i 5' RACE. Pozostałe embriony GFP-RFP-dodatnie należy hodować, aby w przypadku udanej iniekcji ustanowić pokolenie F2.Przynajmniej 80% embrionów wstrzykniętych mieszanką DNA pułapki genowej i mRNA transpozazy wykaże pewien stopień fluorescencji GFP. Niska ekspresja GFP wskazuje na nieudaną iniekcję lub degradację RNA transpozazy spowodowaną kontaminacją RNazami. Gdy do utworzenia puli F zero wybierane są embriony z najsilniejszą fluorescencją GFP, około jedna na 10 przebadanych ryb F zero dostarczy potomstwa z pułapką genową spośród ryb F zero, z których odzyskano zdarzenia pułapki genowej.Większość z nich przekazuje pojedyncze zdarzenie pułapki genowej (gene trap) oprócz kilku nieekspresyjnych integracji transpozonów. Ponieważ cała kaseta pułapki genowej jest flankowana przez bezpośrednie miejsca rozpoznawania LoxP, wszelkie mutacje pułapki genowej przedstawione na tym schemacie (gdzie niebieskie pola reprezentują eksony zmutowanego genu) są odwracalne poprzez ekspresję rekombinazy Cre. Obrazy te pokazują koekspresję GFP i RFP w układzie nerwowym linii pułapki genowej NSF TP 6. Iniekcja mRNA Cre do embrionów NSF TP 6 prowadzi do utraty ekspresji GFP i RFP.Należy zauważyć, że zgodnie z oczekiwaniami nie występuje redukcja ekspresji GFP w soczewce. Większość opisanych tutaj procedur ma zastosowanie również do innych przesiewów pułapek genowych, jak i do standardowych eksperymentów transgenicznych z użyciem TOL two i innych transpozonów. Stosując opisaną tutaj procedurę pułapki genowej, wykonanie od 20 do 30 krzyżówek wstecznych F zero tygodniowo powinno pozwolić na uzyskanie jednej pułapki genowej na tydzień.Procedurę tę można jednak łatwo przeskalować.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Pułapka genów z użyciem Gal4 w rybie zebra

Mikroiniekcja jest uznaną i skuteczną metodą wprowadzania obcych substancji do zapłodnionych embrionów danio pręgowanego. W niniejszej pracy prezentujemy niezawodną technikę mikroiniekcji służącą do przeprowadzania badań nad nadekspresją mRNA oraz wyciszaniem genów za pomocą morfolino oligonukleotydów u danio pręgowanego.

Mikroiniekcja mRNA i morfolinoowych oligonukleotydów antysensownych w embriony ryb danio pręgowanych.

Obumierające komórki są usuwane z tkanek nabłonkowych poprzez skoordynowany skurcz komórek sąsiednich, bez naruszania funkcji barierowej. Przejrzystość optyczna rozwijających się rybek danio przymrużonych stanowi doskonały system do wizualizacji procesu ekstruzji w żywych nabłonkach. W niniejszej pracy opisujemy metody indukcji i obrazowania ekstruzji w naskórku larw rybek danio przymrużonych z rozdzielczością komórkową.

Obrazowanie na żywo ekstruzji komórek z naskórka rozwijającego się danio pręgowanego

Rozdzielczość czasowa i przestrzenna manipulacji genetycznych determinuje spektrum zjawisk biologicznych, na które mogą one oddziaływać. W niniejszej pracy wykorzystujemy dyskretną czasowo i przestrzennie elektroporację in vivo, w połączeniu z transgenicznymi liniami danio pręgowanego, aby indukować ekspresję transgenu GFP specyficznie w neuronach rozwijającej się opolśnij węchowej.

Targetowanie neuronów opłaty węchowej z wykorzystaniem połączonej elektroporacji in vivo oraz linii ryb danio-ostroskrzelnych typu enhancer trap opartych na Gal4

Badanie najwcześniejszych zdarzeń progresji komórek przednowotworowych i interakcji wrodzonych komórek odpornościowych jest kluczowe dla zrozumienia i leczenia raka. W tym miejscu opisujemy metodę warunkowego wywoływania przemian komórek nabłonkowych i późniejszego obrazowania na żywo interakcji wrodzonych komórek odpornościowych z komórkami skóry wyrażającymi HRASG12V u larw danio pręgowanego.

Obrazowanie na żywo interakcji między komórkami immunologicznymi i przednowotworowymi przy użyciu indukowalnego systemu ekspresji Gal4/UAS w skórze larw danio pręgowanego

Obrazowanie dynamicznego zachowania organelli i innych struktur subkomórkowych in vivo może rzucić światło na ich funkcję w warunkach fizjologicznych i chorobowych. W tym artykule przedstawiono metody genetycznego znakowania dwóch organelli, centrosomów i mitochondriów oraz obrazowania ich dynamiki w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii szerokokątnej i konfokalnej.

Obrazowanie struktur subkomórkowych w żywym zarodku danio pręgowanego

Tutaj pokazujemy proces tworzenia linii reportera napięcia elektrycznego komórkowego do wizualizacji rozwoju embrionalnego, ruchu i komórek nowotworowych ryb in vivo.

Wizualizacja komórkowej aktywności elektrycznej we wczesnych zarodkach i nowotworach danio pręgowanego

Danio pręgowany był używany jako wiarygodne modele genetyczne w badaniach biomedycznych, zwłaszcza wraz z pojawieniem się technologii edycji genów. Gdy spodziewane są fenotypy larw, ekstrakcja DNA i identyfikacja genotypu może być trudna. W tym miejscu opisujemy skuteczną procedurę genotypowania larw danio pręgowanego, poprzez obcinanie ogonów, już po 72 godzinach od zapłodnienia.

Wysokoprzepustowa ekstrakcja DNA i genotypowanie larw danio pręgowanego 3dpf poprzez obcinanie płetw

Opisujemy podejścia do manipulacji genami w systemie modelu ewolucyjnego Astyanax mexicanus. Opisano trzy różne techniki: transgenezę za pośrednictwem Tol2, ukierunkowaną manipulację genomem za pomocą CRISPR/Cas9 oraz knockdown ekspresji za pomocą morpholinos. Narzędzia te powinny ułatwić bezpośrednie badanie genów leżących u podstaw zmienności między formami zamieszkującymi powierzchnię i jaskinie.

Manipulacja funkcją genów u meksykańskich ryb jaskiniowych

Ta praca opisuje protokół dla modułowego systemu transgenezy Tol2, metody klonowania opartej na bramie, służącej do tworzenia i wstrzykiwania transgenicznych konstruktów do embrionów zebranego.

System Danio pręgowanego Tol2: modułowe i elastyczne podejście do transgenezy oparte na bramce

Tutaj prezentujemy protokół oznaczania białek znacznikiem białka fluorescencyjnego u larw danio pręgowanego, nowo opracowany i zmodyfikowany system in vivo, szczególnie przydatny do wizualizacji białek o niskiej obfitości u danio pręgowanego.

Znakowanie fluorescencyjne w celu wizualizacji białek o niskiej ekspresji u danio pręgowanego

W tym miejscu opisujemy protokół generowania matczynego mutanta, który łączy stabilną linię knock-in zpc: cas9 z dostarczaniem kaset ekspresyjnych sgRNA za pośrednictwem Tol2.

Generowanie matczynych mutantów przy użyciu zpc:cas9 Knock-in Danio pręgowanego

Poznaj metodę pułapkowania genów w danio pręgowanym przy użyciu wektorów z reporterem Gal4-VP16. Technika ta umożliwia generowanie mutantów do analizy funkcji genów w biologii rozwoju.

Pułapkowanie genów za pomocą Gal4 u danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów