Pułapkowanie genów za pomocą Gal4 u danio pręgowanego
September 29th, 2013
Ten protokół opisuje metodę mutagenezy insercyjnej pułapki genowej przy użyciu Gal4-VP16 jako głównego reportera i GFP/RFP jako wtórnego reportera u danio pręgowanego. Około jedna na dziesięć ryb o wysokiej ekspresji F0 daje potomstwo pułapki genowej koeksprymujące GFP i RFP. Procedurę przesiewową można łatwo przeskalować, aby dostosować ją do wielkości laboratorium wykonującego badanie przesiewowe mutagenezy insercyjnej.
Ogólnym celem tej procedury jest wyprodukowanie zmutowanych ryb przy użyciu transpozycji łamania genów na wektory z GAL cztery, VP 16 jako głównym reporterem pułapki genowej. Osiąga się to poprzez pierwsze jednoczesne wstrzyknięcie wektora pułapki genowej wraz z dwoma wysokimi transpozycjami do zarodków danio pręgowanego. Zarodki, którym wstrzyknięto zarodki, są poddawane badaniom przesiewowym pod kątem fluorescencji GFP po trzech dniach od zapłodnienia, a około 30% najjaśniejszych zarodków jest wybieranych w celu ustalenia puli F zero.
Następnie ryby F zero są krzyżowane z linią testową U-A-S-M-R-F-P w celu przeprowadzenia badań przesiewowych pod kątem transmisji w linii zarodkowej zdarzeń pułapki genowej. Ostatnim krokiem jest skrzyżowanie F1 w celu ustanowienia pokolenia F dwa i wygenerowania zarodków do molekularnej charakterystyki zdarzeń pułapki genowej za pomocą odwrotnego PCR i pięciu pierwszych ras. Ostatecznie około jedna na 10 przebadanych ryb F zero powinna produkować potomstwo pułapki genowej.
Transpo łamiące geny zaprojektowano tak, aby nie powodowały mutacji po integracji z wejściami genów kodujących białka. Nasze wektory GBT wykorzystują G four P 16 jako główny reporter pułapki genowej. Ta modyfikacja zwiększa czułość na geny wyrażane na niskich poziomach i umożliwia nam stosowanie mutantów pułapek genowych bez nadmiernego unikania fenotypów jako czynników G 4 dla specyficznej tkankowo ekspresji innych transgenów.
Uważamy, że głównym wąskim gardłem naszej metody jest osiągnięcie wystarczająco wysokich wskaźników integracji pułapki genowej w linii zarodkowej ryb F zero. W tej demonstracji omówimy kilka krytycznych etapów, przygotowanie DNA, MIKROINIEKCJĘ i badanie przesiewowe F-zero. Wektor pułapki genowej GBTB wykorzystuje GAL four VP 16 jako główny reporter pułapki genowej.
Minimalna wysokość dwóch transpozycji na końcach jest używana do integracji pułapki genowej. Zdarzenia pułapki genowej są bezpośrednio wykrywane przez reportera EGFP pod kontrolą 14 X GAL four UAS. Cała kaseta pułapki genowej jest otoczona bezpośrednimi miejscami P zamków.
To sprawia, że zdarzenia pułapki genowej są odwracalne przez ekspresję grzebieni Cree w celu ustalenia dowodu związku przyczynowo-skutkowego między określoną integracją pułapki genowej a obserwowanym fenotypem. Ponadto kaseta U-A-S-E-G-F-P jest otoczona bezpośrednimi miejscami FRT. Wstrzyknięcie mRNA z odwróconymi grzebieniami doprowadzi do wycięcia kasety U-A-S-E-G-F-P, pozostawiając mutację pułapki genowej nieoznaczoną fluorescencją EGFP i umożliwiając jej zastosowanie w liniach transgenicznych, które oznaczają określone tkanki lub zdarzenia rozwojowe za pomocą fluorescencji GFP przed mikroiniekcją.
Przygotuj transpozycję na DNA i transponuje mRNA. Przygotuj DNA wektora pułapki genowej GBTB. Korzystając ze standardowego mini zestawu przygotowawczego i postępując zgodnie z protokołem producenta, konieczne jest uwzględnienie etapu mycia PB podczas przygotowywania DNA.
W przeciwnym razie mini prep DNA zostanie zanieczyszczony przez RNA, co prowadzi do degradacji transpozycji Mr.NA, rozcieńczyć DNA w wodzie wolnej od RNA do 10 nanogramów na mikrolitr. Aby przygotować dwie wysokie, transponuje mRNA, najpierw linearyzuje PT, trzy TS, T, dwa za pomocą xbo, jeden. Następnie dokonaj transkrypcji zlinearyzowanego DNA za pomocą maszyny do wysyłania wiadomości M T trzy zestaw do transkrypcji in vitro z jedną modyfikacją.
Dodaj 0,5 mikrolitra inhibitora RNA rib lock po etapie leczenia DNA, oczyść mRNA za pomocą standardowego zestawu i oceń jakość transkrybowanego mRNA in vitro za pomocą elektroforezy w żelu agros. Rozcieńczyć mRNA w wodzie wolnej od RNA do 40 nanogramów na mikrolitr i przechowywać jako dwie porcje mikrolitrów w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza tuż przed mikrowstrzyknięciem. Przygotować mieszaninę do wstrzykiwań, dodając osiem mikrolitrów rozcieńczonej transpozycji DNA do dwumikrolitrowej porcji transponowanego mRNA.
Wstrzyknij trzy nanolitry mieszaniny D-N-A-R-N-A do żółtka jednokomórkowego zarodków zebry zebry przy użyciu standardowych technik mikroiniekcji, dążąc do interfejsu bluźnierczego żółtka Po wstrzyknięciu uruchom pięć mikrolitrów pozostałego roztworu do wstrzykiwań na 1% żelu aros w celu kontroli jakości, aby upewnić się, że transponowane mRNA nie uległo degradacji około sześciu do ośmiu godzin po wstrzyknięciu. Usuń niezapłodnione i martwe zarodki i rozprowadź zarodki do 60 do 80 na 100 milimetrów szalki Petriego. Nieprawidłowe i martwe zarodki są usuwane jednego dnia po zapłodnieniu, dwa dni po zapłodnieniu i trzy dni po zapłodnieniu po trzech dniach od zapłodnienia pod mikroskopem stereoskopowym wyposażonym w fluorescencję lub mikroskopem pionowym.
Przebadaj zarodki i usuń wszelkie nieprawidłowe zarodki. Pozostałe zarodki należy przebadać bez widocznych wad. W przypadku fluorescencji GFP wybierz najjaśniejsze zarodki F zero i hoduj je przy użyciu standardowych procedur hodowli danio pręgowanego w tym laboratorium.
GBT są zwykle wstrzykiwane w linie z wzorami pigmentacji typu dzikiego lub lamparta. Uzasadnione jest oczekiwanie, że od 20 do 30% wstrzykniętych zarodków wybranych do hodowli przeżyje do dorosłości. Integracja jednego wektora pułapki genowej GBTB może prowadzić do ekspresji EGFP za pomocą dwóch różnych mechanizmów.
Pierwszym z nich jest prawdziwa pułapka genowa. Wektor integruje z genem transkrypt fuzyjny między pięcioma pierwszymi transkryptem tego endogennego genu a GAL cztery VP 16 jest wytwarzany i przekształcany w białko fuzyjne zawierające koniec białka i pokryte zmutowanym genem insertu i GAL cztery, VP 16. To białko fuzyjne wiąże się z 14 XUAS i aktywuje transkrypcję EGFP.
Drugim, mniej pożądanym zdarzeniem jest pułapka wzmacniająca. Minimalny promotor znajdujący się przed EGFP podlega kontroli wzmacniacza w pobliżu miejsca integracji, co prowadzi do produkcji EGFP w przypadku braku GAL cztery, VP 16. Aby rozróżnić te dwie klasy zdarzeń, wykonano 14 linii transgenicznych X-U-A-S-M-R-F-P oznaczonej specyficznym dla soczewek krystalicznym GFP gamma.
Zdarzenia pułapki genowej są weryfikowane poprzez krzyżowanie ryb, którym wstrzyknięto GBT z homozygotycznymi rybami U-A-S-M-R-F-P i badanie przesiewowe pod kątem koekspresji GFP i RFP, co jest możliwe tylko wtedy, gdy zostanie wykonany GAL cztery, VP 16 i aktywuje U-A-S-M-R-F-P in trans, aby rozpocząć procedurę badania przesiewowego ryb F zero, krzyżuj osobników F zero z homozygotycznymi rybami U-A-S-M-R-F-P. Ponieważ ryby, którym wstrzyknięto GBT, mają wzory pigmentacji typu dzikiego lub lamparta, a homozygotyczna linia U-A-S-M-R-F-P znajduje się na mosiężnym tle, ryby F zero można łatwo odróżnić od ryb U-A-S-M-R-F-P, eliminując potrzebę rejestrowania, czy badany F zero był samcem czy samicą, a także potencjalne błędy wynikające z błędów w rejestrowaniu i/lub określaniu płci każdej ryby. Następnego dnia.
Przywróć mosiężne ryby U-A-S-M-R-F-P do ich zbiornika. Rybki F zero, które dały zarodki, należy umieścić w indywidualnych zbiornikach statycznych, podczas gdy zarodki są zbierane do badań przesiewowych czyste i przenoszone są zebrane zarodki na nowe szalki Petriego po południu dnia zero. Badania przesiewowe zarodków pod kątem fluorescencji GFP i RFP po jednym dniu po zapłodnieniu i trzy dni po zapłodnieniu.
Wyciągnij zarodki z dodatnim wynikiem zarówno GFP, jak i RFP, sortuj je według wzorca ekspresji G-F-P-R-F-P. Jeśli w sprzęgle zaobserwuje się więcej niż jeden wzorzec i podnieś je, aby ustalić generację F1. Należy zauważyć, że zarodki 3D PF, które są dodatnie dla GFP, ale nie dla RFP, nie są usuwane, ponieważ reprezentują zdarzenia pułapki wzmacniającej.
Ponownie skrzyżuj rybę F zero, która wyprodukowała potomstwo z dodatnim wynikiem G-F-P-R-F-P, aby uzyskać drugą partię dodatnich. Ryby F1 są poddawane badaniom przesiewowym w celu ustalenia dwóch rodzin F, udokumentowania wzorca ekspresji pułapki genowej i zamrożenia partii zarodków w celu identyfikacji molekularnej loci pułapki genowej: Pierwszą krzyżówkę poszczególnych ryb F1 z homozygotycznymi rybami U-A-S-M-R-F-P następnego dnia. Umieść ryby F1, które dały zarodki, w indywidualnych zbiornikach statycznych, podczas gdy zarodki są zbierane do badań przesiewowych w ciągu jednego dnia po zapłodnieniu.
Etykietowanie RFP mogło jeszcze nie nastąpić, więc przeprowadź badania przesiewowe zarodków pod kątem fluorescencji GFP i wyciągnij zarodki GFP dodatnie trzy dni po zapłodnieniu pod kątem fluorescencji GFP i RFP i wyciągnij podwójnie dodatnie. Następnie sfotografuj zarodki z dodatnim wynikiem zarówno dla GFP, jak i RFP po pięciu dniach od zapłodnienia, zamroź partie 20 zarodków G-F-P-R-F-P dodatnich i 20 G-F-P-R-F-P ujemnych w celu identyfikacji zmutowanych genów za pomocą odwrotnej reakcji PCR i pięciu ras pierwotnych. Wyhodować pozostałe zarodki G-F-P-R-F-P dodatnie, aby ustalić pokolenie F dwa w udanym wstrzyknięciu.
Co najmniej 80% zarodków, którym wstrzyknięto DNA pułapki genowej o wysokości dwóch transponatów, mieszaniny mRNA, będzie wykazywać pewien stopień fluorescencji GFP. Niska ekspresja GFP wskazuje na nieudaną iniekcję lub degradację transpozycji RNA z powodu zanieczyszczenia RNA. Kiedy najjaśniejsze zarodki z dodatnim wynikiem GFP zostaną wybrane w celu ustanowienia puli F zero, około jedna na 10 przebadanych ryb F zero wyda potomstwo pułapki genowej wśród ryb F zero, od których odzyskuje się zdarzenia pułapki genowej.
Większość z nich przekazuje pojedyncze zdarzenie pułapki genowej oprócz kilku transpozycji bez ekspresji na integracje. Ponieważ cała kaseta pułapki genowej jest otoczona bezpośrednimi miejscami P zamków, wszelkie mutacje pułapki genowej zilustrowane na tym schemacie z niebieskimi polami reprezentującymi eksony zmutowanego genu są odwracalne przez ekspresję grzebieni CRE. Obrazy te pokazują koekspresję GFP i RFP w układzie nerwowym NSF TP wstrzyknięcie linii pułapki sześciogenowej Cree RNA do zarodków N SF TP sześć prowadzi do utraty ekspresji GFP i RFP.
Należy pamiętać, że nie ma zmniejszenia ekspresji GFP w soczewce zgodnie z oczekiwaniami. Większość opisanych tutaj procedur ma zastosowanie do innych badań przesiewowych pułapek genowych, a także do regularnych eksperymentów transgenezy z TOL dwa i innymi transpozonami Z procedurą pułapki genowej opisaną tutaj. Ustawienie od 20 do 30 krzyżówek F zero out tygodniowo powinno skutkować odzyskaniem jednej pułapki genowej tygodniowo.
Procedurę tę można jednak łatwo rozszerzyć.
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę mutagenezy przez wstawianie pułapki genowej u rybek Danio rerio z wykorzystaniem Gal4-VP16 jako podstawowego reportera oraz GFP/RFP jako reporterów wtórnych. Procedura umożliwia identyfikację potomstwa z pułapką genową koekspresującego GFP i RFP, z procesem przesiewowym, który można skalować zgodnie z wielkością laboratorium.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Genetyka
- Biologia rozwoju
- Modele transgeniczne
Tło
- Mutageneza przez wstawianie pułapki genowej to technika stosowana do tworzenia mutacji w określonych genach.
- Gal4-VP16 służy jako wrażliwy reporter ekspresji genów.
- GFP i RFP są wykorzystywane do wizualizowania zdarzeń pułapki genowej.
- Metoda ma na celu minimalizowanie niepożądanych mutacji podczas integracji.
Cel badania
- Wytworzenie rybek Danio rerio z mutacjami do analizy funkcji genów.
- Poprawa czułości wykrywania ekspresji genów.
- Ustanowienie niezawodnej metody przesiewowej dla zdarzeń pułapki genowej.
Zastosowane metody
- Współwstrzyknięcie wektorów pułapki genowej i mRNA transpoazy do zarodków ryb Danio rerio.
- Przesiewanie na fluorescencje GFP w trzecim dniu po zapłodnieniu.
- Krzyżowanie ryb F0 z liniami testerowymi U-A-S-M-R-F-P w celu zweryfikowania transmisji przez linię germinalną.
- Krzyżowanie F1 w celu ustanowienia generacji F2 dla charakteryzacji molekularnej.
Główne wyniki
- Około 30% najjaśniejszych zarodków zostało wybranych do dalszej analizy.
- Około jedna na dziesięć ryb F0 wyprodukowała potomstwo z pułapką genową.
- Zdarzenia pułapki genowej zostały potwierdzone poprzez koekspresję GFP i RFP.
- Zostały zidentyfikowane mechanizmy integracji, w tym prawdziwe zdarzenia pułapki genowej i pułapki enhancera.
Wnioski
- Metoda efektywnie generuje mutanty ryb Danio rerio do badań funkcji genów.
- Wysokie współczynniki integracji pułapki genowej są kluczowe dla sukcesu wyników.
- To podejście pozwala na odwracalne znakowanie zdarzeń pułapki genowej dla dalszych badań.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Gene trap insertional mutagenesis in zebrafish enables high-throughput functional annotation of genes in a vertebrate system, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The use of Gal4-VP16 as a primary reporter enhances sensitivity for low-abundance transcripts and allows converted trap lines to serve as tissue-specific drivers for transgene expression, facilitating pathway interrogation and phenotypic screening. This approach improves predictive confidence by linking genotype to tissue-specific phenotypes without relying on overt developmental defects, particularly valuable for genes with redundant or non-essential functions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through insertional mutagenesis that tags endogenous gene expression with Gal4-VP16 for sensitive detection.
- Operational Value: Generates reversible gene trap mutations via loxP-flanked cassettes, allowing causal validation of phenotype-genotype relationships through Cre-mediated excision.
- Scientific Value: Supports functional target validation by converting trapped loci into Gal4 drivers to direct expression of effector transgenes in specific tissues, clarifying gene function in disease-relevant contexts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces quantitative dual-reporter readouts (GFP/RFP co-expression) to distinguish true gene trap from enhancer trap events, improving assay specificity.
- Operational Value: Establishes a scalable germline transmission pipeline where ~10% of screened F0 founders yield transmissible gene trap alleles, supporting consistent mutant line generation.
- Scientific Value: Enables preparation of validated biological systems for downstream screening by freezing batches of double-positive embryos for molecular identification of trap loci via inverse PCR and 5' RACE.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Recovers trap mutations in genes encoding nuclear, cytoplasmic, and membrane proteins, ensuring broad target coverage without bias toward nuclear localization.
- Operational Value: Facilitates translational continuity by enabling F2 intercrosses to document expression patterns and freeze embryos for genotyping, supporting preclinical validation workflows.
- Scientific Value: Promotes mechanistic de-risking by allowing reversible marking of mutations, thus distinguishing causal gene trap integrations from positional effects in phenotypic screens.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early mutagenesis through lead identification, where gene trap lines serve as both mutant alleles and Gal4 drivers for pathway-specific transgene expression, supporting iterative target validation and assay refinement.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by tagging endogenous loci with Gal4-VP16 to monitor expression dynamics in vivo during chemical or genetic perturbation.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible quantitative outputs via GFP/RFP co-expression scoring, enabling standardized comparison of mutant and wild-type conditions across screening campaigns.
- Analytics: Generates molecular readouts (inverse PCR, 5' RACE) that enable precise identification of trapped genes, supporting data-driven target prioritization.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by preserving embryos for genotyping and expression analysis, ensuring phenotypic observations are linked to validated genetic lesions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reversible, scalable platform where founder fish can be repeatedly outcrossed to generate F2 families, supporting longitudinal studies and cross-project reagent sharing.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by enhancing detection of low-expression genes and enabling tissue-specific transgene expression without requiring phenotypic penetrance.
- Operational Value: Standardizes mutant generation through defined injection ratios, fluorescence-based sorting, and germline transmission screening, improving reproducibility across labs.
- Strategic Value: Reduces biological risk in lead identification by providing reversible, allele-specific models for target validation, minimizing false positives from insertional artifacts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through allelic series generation and phenotypic deconvolution, supporting go/no-go decisions based on mechanistic evidence rather than phenotypic severity alone.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish microinjection, fluorescence screening, and transgenic line maintenance.
- Dependent on functional transposase mRNA and high-purity DNA preparation, including PB wash steps to prevent RNA contamination.
- Necessitates standardized crossing schemes with UAS-mRFP reporter lines to distinguish gene trap from enhancer trap events via co-expression scoring.
- Involves adaptation considerations for genes encoding secreted or membrane proteins, as N-terminal fusions may impair Gal4-VP16 nuclear localization and transcriptional activity.
- Subject to practical limitations in germline transmission efficiency, where optimizing F0 screening and outcrossing frequency impacts mutant recovery rates.
