Pułapkowanie genów za pomocą Gal4 u danio pręgowanego

Ogólnym celem tej procedury jest wyprodukowanie zmutowanych ryb przy użyciu transpozycji łamania genów na wektory z GAL cztery, VP 16 jako głównym reporterem pułapki genowej. Osiąga się to poprzez pierwsze jednoczesne wstrzyknięcie wektora pułapki genowej wraz z dwoma wysokimi transpozycjami do zarodków danio pręgowanego. Zarodki, którym wstrzyknięto zarodki, są poddawane badaniom przesiewowym pod kątem fluorescencji GFP po trzech dniach od zapłodnienia, a około 30% najjaśniejszych zarodków jest wybieranych w celu ustalenia puli F zero.

Następnie ryby F zero są krzyżowane z linią testową U-A-S-M-R-F-P w celu przeprowadzenia badań przesiewowych pod kątem transmisji w linii zarodkowej zdarzeń pułapki genowej. Ostatnim krokiem jest skrzyżowanie F1 w celu ustanowienia pokolenia F dwa i wygenerowania zarodków do molekularnej charakterystyki zdarzeń pułapki genowej za pomocą odwrotnego PCR i pięciu pierwszych ras. Ostatecznie około jedna na 10 przebadanych ryb F zero powinna produkować potomstwo pułapki genowej.

Transpo łamiące geny zaprojektowano tak, aby nie powodowały mutacji po integracji z wejściami genów kodujących białka. Nasze wektory GBT wykorzystują G four P 16 jako główny reporter pułapki genowej. Ta modyfikacja zwiększa czułość na geny wyrażane na niskich poziomach i umożliwia nam stosowanie mutantów pułapek genowych bez nadmiernego unikania fenotypów jako czynników G 4 dla specyficznej tkankowo ekspresji innych transgenów.

Uważamy, że głównym wąskim gardłem naszej metody jest osiągnięcie wystarczająco wysokich wskaźników integracji pułapki genowej w linii zarodkowej ryb F zero. W tej demonstracji omówimy kilka krytycznych etapów, przygotowanie DNA, MIKROINIEKCJĘ i badanie przesiewowe F-zero. Wektor pułapki genowej GBTB wykorzystuje GAL four VP 16 jako główny reporter pułapki genowej.

Minimalna wysokość dwóch transpozycji na końcach jest używana do integracji pułapki genowej. Zdarzenia pułapki genowej są bezpośrednio wykrywane przez reportera EGFP pod kontrolą 14 X GAL four UAS. Cała kaseta pułapki genowej jest otoczona bezpośrednimi miejscami P zamków.

To sprawia, że zdarzenia pułapki genowej są odwracalne przez ekspresję grzebieni Cree w celu ustalenia dowodu związku przyczynowo-skutkowego między określoną integracją pułapki genowej a obserwowanym fenotypem. Ponadto kaseta U-A-S-E-G-F-P jest otoczona bezpośrednimi miejscami FRT. Wstrzyknięcie mRNA z odwróconymi grzebieniami doprowadzi do wycięcia kasety U-A-S-E-G-F-P, pozostawiając mutację pułapki genowej nieoznaczoną fluorescencją EGFP i umożliwiając jej zastosowanie w liniach transgenicznych, które oznaczają określone tkanki lub zdarzenia rozwojowe za pomocą fluorescencji GFP przed mikroiniekcją.

Przygotuj transpozycję na DNA i transponuje mRNA. Przygotuj DNA wektora pułapki genowej GBTB. Korzystając ze standardowego mini zestawu przygotowawczego i postępując zgodnie z protokołem producenta, konieczne jest uwzględnienie etapu mycia PB podczas przygotowywania DNA.

W przeciwnym razie mini prep DNA zostanie zanieczyszczony przez RNA, co prowadzi do degradacji transpozycji Mr.NA, rozcieńczyć DNA w wodzie wolnej od RNA do 10 nanogramów na mikrolitr. Aby przygotować dwie wysokie, transponuje mRNA, najpierw linearyzuje PT, trzy TS, T, dwa za pomocą xbo, jeden. Następnie dokonaj transkrypcji zlinearyzowanego DNA za pomocą maszyny do wysyłania wiadomości M T trzy zestaw do transkrypcji in vitro z jedną modyfikacją.

Dodaj 0,5 mikrolitra inhibitora RNA rib lock po etapie leczenia DNA, oczyść mRNA za pomocą standardowego zestawu i oceń jakość transkrybowanego mRNA in vitro za pomocą elektroforezy w żelu agros. Rozcieńczyć mRNA w wodzie wolnej od RNA do 40 nanogramów na mikrolitr i przechowywać jako dwie porcje mikrolitrów w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza tuż przed mikrowstrzyknięciem. Przygotować mieszaninę do wstrzykiwań, dodając osiem mikrolitrów rozcieńczonej transpozycji DNA do dwumikrolitrowej porcji transponowanego mRNA.

Wstrzyknij trzy nanolitry mieszaniny D-N-A-R-N-A do żółtka jednokomórkowego zarodków zebry zebry przy użyciu standardowych technik mikroiniekcji, dążąc do interfejsu bluźnierczego żółtka Po wstrzyknięciu uruchom pięć mikrolitrów pozostałego roztworu do wstrzykiwań na 1% żelu aros w celu kontroli jakości, aby upewnić się, że transponowane mRNA nie uległo degradacji około sześciu do ośmiu godzin po wstrzyknięciu. Usuń niezapłodnione i martwe zarodki i rozprowadź zarodki do 60 do 80 na 100 milimetrów szalki Petriego. Nieprawidłowe i martwe zarodki są usuwane jednego dnia po zapłodnieniu, dwa dni po zapłodnieniu i trzy dni po zapłodnieniu po trzech dniach od zapłodnienia pod mikroskopem stereoskopowym wyposażonym w fluorescencję lub mikroskopem pionowym.

Przebadaj zarodki i usuń wszelkie nieprawidłowe zarodki. Pozostałe zarodki należy przebadać bez widocznych wad. W przypadku fluorescencji GFP wybierz najjaśniejsze zarodki F zero i hoduj je przy użyciu standardowych procedur hodowli danio pręgowanego w tym laboratorium.

GBT są zwykle wstrzykiwane w linie z wzorami pigmentacji typu dzikiego lub lamparta. Uzasadnione jest oczekiwanie, że od 20 do 30% wstrzykniętych zarodków wybranych do hodowli przeżyje do dorosłości. Integracja jednego wektora pułapki genowej GBTB może prowadzić do ekspresji EGFP za pomocą dwóch różnych mechanizmów.

Pierwszym z nich jest prawdziwa pułapka genowa. Wektor integruje z genem transkrypt fuzyjny między pięcioma pierwszymi transkryptem tego endogennego genu a GAL cztery VP 16 jest wytwarzany i przekształcany w białko fuzyjne zawierające koniec białka i pokryte zmutowanym genem insertu i GAL cztery, VP 16. To białko fuzyjne wiąże się z 14 XUAS i aktywuje transkrypcję EGFP.

Drugim, mniej pożądanym zdarzeniem jest pułapka wzmacniająca. Minimalny promotor znajdujący się przed EGFP podlega kontroli wzmacniacza w pobliżu miejsca integracji, co prowadzi do produkcji EGFP w przypadku braku GAL cztery, VP 16. Aby rozróżnić te dwie klasy zdarzeń, wykonano 14 linii transgenicznych X-U-A-S-M-R-F-P oznaczonej specyficznym dla soczewek krystalicznym GFP gamma.

Zdarzenia pułapki genowej są weryfikowane poprzez krzyżowanie ryb, którym wstrzyknięto GBT z homozygotycznymi rybami U-A-S-M-R-F-P i badanie przesiewowe pod kątem koekspresji GFP i RFP, co jest możliwe tylko wtedy, gdy zostanie wykonany GAL cztery, VP 16 i aktywuje U-A-S-M-R-F-P in trans, aby rozpocząć procedurę badania przesiewowego ryb F zero, krzyżuj osobników F zero z homozygotycznymi rybami U-A-S-M-R-F-P. Ponieważ ryby, którym wstrzyknięto GBT, mają wzory pigmentacji typu dzikiego lub lamparta, a homozygotyczna linia U-A-S-M-R-F-P znajduje się na mosiężnym tle, ryby F zero można łatwo odróżnić od ryb U-A-S-M-R-F-P, eliminując potrzebę rejestrowania, czy badany F zero był samcem czy samicą, a także potencjalne błędy wynikające z błędów w rejestrowaniu i/lub określaniu płci każdej ryby. Następnego dnia.

Przywróć mosiężne ryby U-A-S-M-R-F-P do ich zbiornika. Rybki F zero, które dały zarodki, należy umieścić w indywidualnych zbiornikach statycznych, podczas gdy zarodki są zbierane do badań przesiewowych czyste i przenoszone są zebrane zarodki na nowe szalki Petriego po południu dnia zero. Badania przesiewowe zarodków pod kątem fluorescencji GFP i RFP po jednym dniu po zapłodnieniu i trzy dni po zapłodnieniu.

Wyciągnij zarodki z dodatnim wynikiem zarówno GFP, jak i RFP, sortuj je według wzorca ekspresji G-F-P-R-F-P. Jeśli w sprzęgle zaobserwuje się więcej niż jeden wzorzec i podnieś je, aby ustalić generację F1. Należy zauważyć, że zarodki 3D PF, które są dodatnie dla GFP, ale nie dla RFP, nie są usuwane, ponieważ reprezentują zdarzenia pułapki wzmacniającej.

Ponownie skrzyżuj rybę F zero, która wyprodukowała potomstwo z dodatnim wynikiem G-F-P-R-F-P, aby uzyskać drugą partię dodatnich. Ryby F1 są poddawane badaniom przesiewowym w celu ustalenia dwóch rodzin F, udokumentowania wzorca ekspresji pułapki genowej i zamrożenia partii zarodków w celu identyfikacji molekularnej loci pułapki genowej: Pierwszą krzyżówkę poszczególnych ryb F1 z homozygotycznymi rybami U-A-S-M-R-F-P następnego dnia. Umieść ryby F1, które dały zarodki, w indywidualnych zbiornikach statycznych, podczas gdy zarodki są zbierane do badań przesiewowych w ciągu jednego dnia po zapłodnieniu.

Etykietowanie RFP mogło jeszcze nie nastąpić, więc przeprowadź badania przesiewowe zarodków pod kątem fluorescencji GFP i wyciągnij zarodki GFP dodatnie trzy dni po zapłodnieniu pod kątem fluorescencji GFP i RFP i wyciągnij podwójnie dodatnie. Następnie sfotografuj zarodki z dodatnim wynikiem zarówno dla GFP, jak i RFP po pięciu dniach od zapłodnienia, zamroź partie 20 zarodków G-F-P-R-F-P dodatnich i 20 G-F-P-R-F-P ujemnych w celu identyfikacji zmutowanych genów za pomocą odwrotnej reakcji PCR i pięciu ras pierwotnych. Wyhodować pozostałe zarodki G-F-P-R-F-P dodatnie, aby ustalić pokolenie F dwa w udanym wstrzyknięciu.

Co najmniej 80% zarodków, którym wstrzyknięto DNA pułapki genowej o wysokości dwóch transponatów, mieszaniny mRNA, będzie wykazywać pewien stopień fluorescencji GFP. Niska ekspresja GFP wskazuje na nieudaną iniekcję lub degradację transpozycji RNA z powodu zanieczyszczenia RNA. Kiedy najjaśniejsze zarodki z dodatnim wynikiem GFP zostaną wybrane w celu ustanowienia puli F zero, około jedna na 10 przebadanych ryb F zero wyda potomstwo pułapki genowej wśród ryb F zero, od których odzyskuje się zdarzenia pułapki genowej.

Większość z nich przekazuje pojedyncze zdarzenie pułapki genowej oprócz kilku transpozycji bez ekspresji na integracje. Ponieważ cała kaseta pułapki genowej jest otoczona bezpośrednimi miejscami P zamków, wszelkie mutacje pułapki genowej zilustrowane na tym schemacie z niebieskimi polami reprezentującymi eksony zmutowanego genu są odwracalne przez ekspresję grzebieni CRE. Obrazy te pokazują koekspresję GFP i RFP w układzie nerwowym NSF TP wstrzyknięcie linii pułapki sześciogenowej Cree RNA do zarodków N SF TP sześć prowadzi do utraty ekspresji GFP i RFP.

Należy pamiętać, że nie ma zmniejszenia ekspresji GFP w soczewce zgodnie z oczekiwaniami. Większość opisanych tutaj procedur ma zastosowanie do innych badań przesiewowych pułapek genowych, a także do regularnych eksperymentów transgenezy z TOL dwa i innymi transpozonami Z procedurą pułapki genowej opisaną tutaj. Ustawienie od 20 do 30 krzyżówek F zero out tygodniowo powinno skutkować odzyskaniem jednej pułapki genowej tygodniowo.

Procedurę tę można jednak łatwo rozszerzyć.