Name: Nienaruszona charakterystyka histologiczna mikrourządzeń z implantami do mózgu i otaczających tkanek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Poznaj metodę histologiczną do obrazowania nienaruszonej tkanki mózgu wokół wszczepionych mikrourządzeń u gryzoni. Technika zachowuje integralność tkanek i umożliwia szczegółową analizę odpowiedzi biologicznej przy użyciu mikroskopii konfokalnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone pod nadzorem Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami Purdue oraz Programu Zwierząt Laboratoryjnych na Uniwersytecie Purdue.
Ta praca była sponsorowana przez Biuro Technologii Mikrosystemów (MTO) Agencji Zaawansowanych Projektów Badawczych Obrony (DARPA), pod auspicjami Dr. Jacka W. Judy (jack.judy@darpa.mil) w ramach Programu Niezawodnej Technologii Neuronowej, za pośrednictwem Space and Naval Warfare Systems Command (SPAWAR) Systems Center (SSC) Pacific Grant No. N66001-11-1-4013.
Autorzy chcieliby podziękować Mikhailowi Slipchenko, Donowi Ready'emu, Gregowi Richterowi, Aaronowi Taylorowi i Kevinowi Eliceiri za podzielenie się swoją wiedzą na temat mikroskopii.

Rozwiązania

Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) - w g/l; 9 g NaCl, 0,144 g KH2PO4, 0,795 g Na2HPO4, przy pH 7,4
4% Formaldehyd - w ml/l; 202 ml dwuzasadowego roztworu fosforanu sodu (0,4 M Na2HPO4), 48 ml roztworu jednozasadowego fosforanu sodu (0,4 M NaH2PO4), 500 ml 8% roztworu formaldehydu, 250 ml wody Milli-Q DDi, o pH 7,4
HEPES Buforowana sól fizjologiczna Hanka z azydkiem sodu (HBHS) - w g/l; 7,5 g NaCl, 0,3 g KCl, 0,06 g KH2PO4, 0,13 g Na2HPO4, 2 g glukozy, 2,4 g HEPES, 0,05 g MgCl2 6 części H2O, 0,05 g MgSO4 7 części H2O, 0,165 g CaCl2, 0,09 g NaN3 przy pH 7,4
Roztwór do mycia (WS) - 1% obj./obj., normalna surowica kozia, 0,3% Triton X-100, w HBHS z azydkiem sodu (NaN3). Wstaw WS do lodówki w temperaturze 4 °C przed użyciem w kolejnych etapach.
U2 Roztwór Scale - 4 M mocznik, 30% glicerol i 0,1% Triton X-100 17
PROCEDURA
Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone pod nadzorem Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami Purdue oraz Programu Zwierząt Laboratoryjnych na Uniwersytecie Purdue.

1. Chirurgia
<ol>
 <li>Różne aseptyczne metody chirurgiczne są zgodne z prezentowaną metodą histologiczną. Zaleca się stosowanie ramy stereotaktycznej i automatycznych podajników w celu poprawy odtwarzalności i kontroli kąta implantacji matryc mikroelektrod (MEA) w odniesieniu do płaszczyzn stereotaktycznych.</li>
</ol>
Uwaga: W tej demonstracji nasza metoda chirurgiczna jest następująca: trzymaj gryzonia w stereotaktycznych nausznikach podczas znieczulenia izofluranem (między 1-3%) przenoszonym przez tlen medyczny. Przetestuj na brak odbicia przytrzaśnięcia palca u szczura lub brak odruchu szczypania ogona u myszy, aby potwierdzić, że zwierzę jest w pełni znieczulone. Nałóż maść do oczu i oczyść miejsce operowane trzema naprzemiennymi płukaniami betadiny i etanolu. Umyj ręce, rękawiczki chirurgiczne o świcie, siatkę na włosy, maskę na twarz i fartuch. Wstrzyknij bolus lidokainy, aby znieczulić obszar chirurgiczny, wykonaj nacięcie za pomocą nożyczek lub skalpela, oczyść okostną za pomocą skrobaka do kości i bawełnianych aplikatorów oraz wykonaj kraniotomię za pomocą rękojeści wiertła dentystycznego i wiertła. Wbij jednozębowy MEA do kory mózgowej za pomocą mikromanipulatora. Skorzystaj z pomocy asystenta chirurgicznego w utrzymaniu aseptycznych warunków chirurgicznych i dokumentuj postępy operacji.
<ol start="2">
 <li>Po wszczepieniu MEA do mózgu należy zebrać obrazy za pomocą mikroskopu chirurgicznego, aby poinformować o ewentualnym usunięciu czaszki z okolic mózgu. Wszczepione części urządzeń zostaną zakonserwowane in situ.</li>
</ol>
Uwaga: Ostateczne pobranie tkanki za pomocą urządzeń in situ polega na ścisłym dopasowaniu płaszczyzny włożenia urządzenia do płaszczyzny cięcia tkanki. Szczegółowe notatki na temat płaszczyzny wprowadzania urządzenia względem mózgu są więc bardzo ważne.
<ol start="3">
 <li>Po wszczepieniu urządzenia nałóż elastomer silikonowy Kwik-Sil (WPI) na odsłonięte trzpienie MEA lub okablowanie i pozostaw do utwardzenia. Wysterylizowany kawałek plastiku, taki jak wycięta końcówka pipety, może być użyty do utrzymania elastomeru silikonowego w małym dołku wokół kraniotomii podczas utwardzania.</li>
 <li>Nałóż warstwę dwuskładnikowego akrylu dentystycznego ("Jet Liquid" i "Jet Powder" firmy Lang Dental) na Kwik-Sil i odsłoniętą czaszkę.</li>
</ol>
Uwaga: W późniejszym kroku, głowica zostanie stopiona, aby umożliwić oddzielenie implantu od czaszki. Należy unikać utwardzania promieniami UV akrylu przed Kwik-Sil i kraniotomią, ponieważ ten bardzo twardy akryl jest trudny do późniejszego usunięcia. Należy również unikać wizualnie nieprzezroczystych materiałów wokół implantu; clear Kwik-Sil zapewnia wgląd w implant podczas kolejnych etapów tego protokołu.
<ol start="5">
 <li>Wykonywanie zabiegów opieki pooperacyjnej zgodnie z lokalnym protokołem przepisów dotyczących dobrostanu zwierząt i powrót pacjentów ambulatoryjnych do jednorodzinnych boksów.</li>
</ol>
2. Perfuzja i pobieranie tkanek
Uwaga: Zobacz Gage et al. Aby zapoznać się ze szczegółowym przewodnikiem po procedurze perfuzji w modelu szczurazwierzęcego 19.
<ol>
 <li>Stosuj protokół znieczulenia i perfuzji zatwierdzony przez komitet ds. opieki nad zwierzętami i użytkowania instytucji. Po głębokim znieczuleniu gryzonia (potwierdzonym brakiem odruchu szczypania palców u szczurów lub odruchem szczypania ogona u myszy) i odsłonięciu serca należy wykonać płytkie nacięcia nożycowe w lewej komorze i prawym przedsionku. Włóż igłę do lewej komory i podaj PBS w temperaturze pokojowej. Dostarczyć łącznie ~10 ml PBS przy ~5 ml/min u myszy i ~200 ml PBS przy ~100 ml/min u szczurów. Poszukaj klirenu krwi z wątroby podczas.</li>
 <li>W razie potrzeby wstrzyknąć histologicznie istotne etykiety chemiczne przezsercowo, podając strzykawkę, zachowując ostrożność, aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyków.</li>
</ol>
Uwaga: Etykiety naczyniowe (np. DiI) i barwniki przeciwbarwiące kwasy nukleinowe (np. Hoechst 33342) są przykładami etykiet chemicznych, które można dostarczyć podczas perfuzji. Przy prawidłowym podawaniu, te markery histologiczne powinny oznaczać całe zwierzę20.
<ol start="3">
 <li>Dostarczyć buforowany 4% formaldehyd o temperaturze pokojowej przezskórnie, aby utrwalić zwierzę. Należy unikać perforacji przegrody w poprzek serca, o czym może świadczyć drenaż płuc i nosa podczas perfuzji. Poszukaj drżenia fiksacyjnego w dużych mięśniach, aby wskazać na całkowitą perfuzję. Dostarczyć łącznie ~10 ml utrwalacza przy ~5 ml/min u myszy i ~200 ml utrwalacza przy ~100 ml/min u szczurów.</li>
 <li>Po perfuzji odciąć zwierzęciu głowę, odsłonić część pnia mózgu lub móżdżku za pomocą rongeurs lub nożyczek i umieścić głowę w 4% roztworze formaldehydu na noc w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Umyj głowę w trzech zmianach PBS w odstępach od jednej do czterech godzin między praniami.</li>
 <li>Stałe głowice należy przechowywać w HBHS zawierającym azydek sodu w temperaturze 4 °C przez kilka dni lub miesięcy.</li>
</ol>
3. Usuwanie mózgu za pomocą urządzeń in situ
Uwaga: Wykonaj tę sekcję pod wyciągiem wyciągowym, nosząc odpowiedni sprzęt ochrony osobistej. Unikaj wysuszania tkanek, okresowo wkładając stałą głowicę do roztworu HBHS.
<ol>
 <li>Ostrożnie wypreparuj skórę i inne tkanki z okolic akrylowej czapki czaszki za pomocą kleszczy i małych nożyczek.</li>
 <li>Nosząc rękawice niewrażliwe na ciepło, użyj lutownicy, aby usunąć akryl dentystyczny i odsłonić obszar leżącego pod spodem przezroczystego Kwik-Sil (Rysunek 2a).</li>
</ol>
Uwaga: Celem tego kroku jest umożliwienie mikronożyczkom odpowiedniego kąta dostępu do pozycji, w których wszczepione urządzenia wchodzą do mózgu, tak aby elementy wszczepione do mózgu mogły być oddzielone od elementów przymocowanych do czaszki.
<ol start="3">
 <li>Pod mikroskopem chirurgicznym pokrój elastomer silikonowy za pomocą zakrzywionych mikronożyczek, usuwając małe kawałki Kwik-Sil za pomocą pęsety aż do miejsca, w którym urządzenia wchodzą do mózgu. </li>
 <li>Kontynuuj cięcie wzdłuż powierzchni kraniotomii za pomocą zakrzywionych mikronożyczek, aby oddzielić elementy urządzenia przyczepione do polikrzemu i czaszki od elementów wszczepionych do mózgu. Ponownie należy używać powiększenia mikroskopu i zachować szczególną ostrożność podczas przecinania odsłoniętych elementów urządzenia, uważając, aby nie wciskać lub nie przeciągać implantów w utrwalonej tkance.</li>
 <li>Ostrożnie usuń kość wokół główki za pomocą rongeurs. Użyj szpatułki, aby oddzielić mózg z wszczepionymi urządzeniami od czaszki. Przechowuj mózg w roztworze HBHS, aż będzie gotowy do krojenia.</li>
 <li>Umieść mózg na szklanej szalce Petriego wypełnionej HBHS i użyj żyletki, aby usunąć obce tkanki, takie jak rdzeń kręgowy, móżdżek lub opuszka węchowa, w zależności od tego, czy są one istotne dla lokalizacji implantacji urządzenia. Użyj bloku mózgowego (Ted Pella) i żyletek, aby podzielić mózg na sekcje i stworzyć płaską płaszczyznę ściśle dopasowaną do kąta wszczepionych urządzeń; Osiąga się to poprzez umieszczenie mózgu w bloku mózgowym o odpowiedniej wielkości, zorientowanie mózgu w taki sposób, aby każda widoczna część implantu była równoległa do prowadnicy żyletki, oraz umieszczenie żyletki w prowadnicy ostrza w odległości co najmniej 2 mm od implantu. Wciśnij żyletkę przez tkankę. Zamontuj tę powierzchnię na platformie wibratomowej. Alternatywnie, żyletka zamontowana na mikromanipulatorze może być używana w podobnie kontrolowany sposób jak blok mózgowy, aby stworzyć płaszczyznę ściśle dopasowaną do kierunku implantu.</li>
 <li>Umieść lód pod platformą wibratomu, a po pozostawieniu powierzchni tkanki do krótkiego wyschnięcia na ręczniku papierowym, przyklej mózg do wibratomu za pomocą Super Glue. Przyklej płaską płaszczyznę tkanki utworzoną w poprzednim kroku do etapu. W przypadku asymetrycznych wymiarów tkanki należy ustawić próbkę w taki sposób, aby najszerszy wymiar był przyklejony równolegle do kierunku ruchu ostrza wibratomu, aby uniknąć potencjalnego przewrócenia tkanki przez ostrze. Po związaniu kleju (~1-2 min) dodaj schłodzony (~4 °C) PBS do naczynia wibratomu wokół tkanki.</li>
 <li>Zbieraj grube plastry tkanek o wielkości od 200 do 400 μm, w tym tkankę kontrolną, używając maksymalnej szybkości wibracji (~100 Hz) i powolnej szybkości postępu ostrza (< 0,2 mm na sekundę), przy kącie ostrza 10 ° od poziomu. Ostrożnie zebrać plastry za pomocą pędzla lub szpatułki i przechowywać w HBHS na 24-dołkowej płytce w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Gdy urządzenie in situ jest widoczne gołym okiem lub pod mikroskopem chirurgicznym, należy pobrać cieńsze fragmenty, aby zbliżyć się do urządzenia w odstępach co 100 μm lub mniejszych.</li>
</ol>
Uwaga: Typowe mikroimplanty silikonowe są widoczne gołym okiem w tkance kory mózgowej gryzoni utrwalonej formaldehydem w odległości od 300 do 500 μm od powierzchni urządzenia.
<ol start="10">
 <li>Gdy urządzenie in situ znajduje się teraz blisko powierzchni tkanki, zbierz wycinek tkanki o wielkości >250 μm zawierający znajdujące się w nim urządzenie. Oszacowanie potrzebnej grubości może być wspomagane przez odniesienie do wcześniej zebranych plastrów.</li>
</ol>
>Uwaga: Większe urządzenia, urządzenia wielozębowe i urządzenia kątowe mogą wymagać grubszych warstw tkanki (>500 μm), aby uchwycić urządzenie w jednym kawałku tkanki; pamiętaj, że zarówno penetracja nałożonych etykiet, jak i głębokość obrazowania mikroskopowego będą ograniczone w ostatecznym zbieraniu danych z tych bardzo grubych warstw. Jeśli to możliwe, unikaj uderzania urządzenia ostrzem wibratomowym, ponieważ może to spowodować przeciąganie urządzenia przez tkankę i deformację morfologiczną.
4. Przetwarzanie i oczyszczanie tkanek
<ol>
 <li>Pierz plastry 3x po 5 minut na pranie w HBHS</li>
 <li>Inkubować w borowodorku sodu (5 mg NaBH4/ 1 ml HBHS) łącznie przez 30 minut (15 minut z każdej strony plastra). Odwróć plastry za pomocą mikro łyżki ze stali nierdzewnej lub pokrytej teflonem i małego pędzelka (Ted Pella). Powolne i przemyślane ruchy poprawiają sukces każdego przewrócenia plasterka. Unikaj dotykania szczoteczką jakichkolwiek obszarów wokół wszczepionego urządzenia. Jeśli to możliwe, dodanie znacznie większej ilości roztworu niż wymagane (>2 ml) pozwala na łatwiejsze manipulowanie i odwracanie plasterków tkanki.</li>
</ol>
Uwaga: Ten krok zmniejsza endogeniczną autofluorescencję; Pomiń ten krok, jeśli etykiety fluorescencyjne zostały nałożone podczas perfuzji lub obecne są markery transgeniczne xFP.
<ol start="3">
 <li>Plastry myć 3x po 5 minut na pranie w roztworze myjącym o temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
Uwaga: Mieszanie podczas etapów mycia i inkubacji jest opcjonalne. Autorzy spekulują, że subtelne wstrząsy sztywnego implantu w stosunku do otaczającej tkanki mózgowej mogą wystąpić wraz z pobudzeniem. Jednak mieszalnik orbitalny poruszający się z łagodną prędkością (< 60 obr./min) może tego uniknąć, jednocześnie zwiększając ruch roztworów.
<ol start="4">
 <li>Blokuj przez 2 godziny w roztworze do mycia w temperaturze pokojowej (odwróć plasterki po godzinie).</li>
 <li>Inkubować w przeciwciałach pierwszorzędowych (rozcieńczonych w roztworze do mycia) przez około 48 godzin (24 godziny z każdej strony plastru) w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Wykonaj 6 szybkich, 3-minutowych myć roztworem do mycia.</li>
 <li>Wykonaj 6, 1 godzinne pranie (3 prania z każdej strony plastra chusteczki) w roztworze do mycia (przechowywać w temperaturze 4 °C w przypadku prania przez noc).</li>
 <li>Inkubować w przeciwciałach drugorzędowych (rozcieńczonych roztworem do mycia) przez około 48 godzin (24 godziny z każdej strony) w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Wykonaj 6 szybkich, 3-minutowych myć roztworem do mycia.</li>
 <li>Wykonaj 6, 1 godzinne pranie (3 prania z każdej strony) w roztworze myjącym; przechowywać w temperaturze 4 °C w przypadku prania przez noc.</li>
 <li>Usuń roztwór myjący i dodaj roztwór oczyszczający "U2 - Scale" na bazie glicerolu. Pozostawić do oczyszczenia około 1 tygodnia w przypadku grubych plastrów (250-500 μm) lub 2-3 tygodni w przypadku bardzo grubych skrawków tkanek (>500 μm) w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Przykryć płytę folią i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Zamontuj w szkiełkach mieszczących grube skrawki tkanki (ryc. 2b, 2c) za pomocą roztworu czyszczącego jako nośnika montażowego i uszczelnij przezroczystym lakierem do paznokci. Przechowywać w temperaturze 4 °C z dala od światła.</li>
</ol>
5. Obrazowanie panoramiczne pełnego interfejsu tkanek i urządzeń
<ol>
 <li>Używając obiektywów mikroskopu o większej odległości roboczej (> 2 mm), rozpocznij obrazowanie za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego lub mikroskopu 2-fotonowego. Zademonstrujemy to za pomocą Zeiss LSM 710, oprogramowania "Zen" Carl Zeiss (2010) i sterowanego komputerowo stolika translacyjnego XY, aby zobrazować panoramę 3D wokół implantu.</li>
</ol>
Uwaga: Popraw współczynnik załamania światła roztworu czyszczącego albo w oprogramowaniu, poprzez kołnierz korekcyjny na obiektywie, albo w przetwarzaniu danych po zebraniu. W tej demonstracji wprowadzamy wartość współczynnika załamania światła dla roztworu czyszczącego "U2" wynoszącą 1,4 do oprogramowania mikroskopu Leica Zen; To ustawienie subtelnie dostosowuje odstępy kroku Z, aby uwzględnić niedopasowanie współczynnika załamania światła.
<ol start="2">
 <li>W tkance w pobliżu urządzenia z grubsza oceń odpowiednie okno osi z i ustawienia zbierania danych w wymiarze z dla każdego kanału fluorescencyjnego przy użyciu niskiej mocy lasera (~0,5 do 5%) i dużych rozmiarów kroku z (>25 μm).</li>
</ol>
Uwaga: Uwzględnij dodatkowe miejsce powyżej i poniżej podczas ustawiania osi z podczas ustawiania do zbierania danych panoramicznych, ponieważ tkanka może nie leżeć całkowicie płasko na szkle szkiełkowym (~20 μm w każdym kierunku).
<ol start="3">
 <li>Ustaw cel w centrum x-y swojej ostatecznej panoramy; korzystając z oprogramowania Zen panorama, określ liczbę pozycji zbierania wymaganych dla każdej osi (x i y), aby pokryć obszar zainteresowania.</li>
 <li>Ponownie oceń i sfinalizuj okno zbierania danych na osi z.</li>
 <li>Ręcznie ustaw czułość detektora i moc lasera tak, aby odpowiednio narastały wraz ze wzrostem głębokości; celem jest zazwyczaj utrzymanie w przybliżeniu tej samej intensywności obrazu niezależnie od głębokości obrazowania w wycinku tkanki, ale także uniknięcie wysokiego szumu tła.</li>
 <li>Zbierz każdą serię danych obrazu fluorescencyjnego. Jeśli to konieczne, aby uniknąć nakładania się sygnałów, należy sekwencyjnie uruchamiać linie laserowe.</li>
</ol>
Uwaga: Jeśli to możliwe, ustaw oprogramowanie tak, aby automatycznie zapisywało dane na dysku twardym podczas zbierania.
<ol start="7">
 <li>Zmień ustawienia oprogramowania, aby zbierać dane o "odbiciu" i "transmitancji", a następnie użyj dłuższego, bardziej penetrującego lasera o długości fali (np. 633 nm) do uchwycenia tych kanałów. Określ odpowiednią moc lasera i czułość detektora dla zbierania "odbicia" i "transmitancji", a następnie powtórz tę samą serię zbierania wokół wszczepionego urządzenia.</li>
 <li>Eksportuj dane do późniejszego przetwarzania, kwantyfikacji i analizy.</li>
</ol>

<ol><li>Schwartz, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+Neural+Prosthetics%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cortical Neural Prosthetics.</a> Annual Review of Neuroscience. 27, 487-507 (2004).</li>
<li>Normann, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technology+Insight%3A+future+neuroprosthetic+therapies+for+disorders+of+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Clinical+Practice+Neurology%22%5BJournal%5D)">Technology Insight: future neuroprosthetic therapies for disorders of the nervous system.</a> Nature Clinical Practice Neurology. 3, 444-452 (2007).</li>
<li>Rousche, P., Normann, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+recording+capability+of+the+Utah+Intracortical+Electrode+Array+in+cat+sensory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Chronic recording capability of the Utah Intracortical Electrode Array in cat sensory cortex.</a> Journal of Neuroscience Methods. 82, 1-15 (1998).</li>
<li>Koivuniemi, A., Wilks, S. J., Woolley, A. J., Otto, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal%2C+longitudinal+assessment+of+intracortical+microstimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Multimodal, longitudinal assessment of intracortical microstimulation.</a> Prog. Brain Res. 194, 131-144 (2011).</li>
<li>Otto, K. J., Rousche, P. J., Kipke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microstimulation+in+auditory+cortex+provides+a+substrate+for+detailed+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Microstimulation in auditory cortex provides a substrate for detailed behaviors.</a> Hearing Research. 210, 112-117 (2005).</li>
<li>Drake, K., Wise, K., Farraye, J., Anderson, D., BeMent, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+planar+multisite+microprobes+in+recordingextracellular+single-unit+intracortical+activity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Performance of planar multisite microprobes in recordingextracellular single-unit intracortical activity.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 35, 719-732 (1988).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+the+interface+between+neural+tissue+and+chronically+implanted+intracortical+microelectrodes%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Rehab.+Eng%22%5BJournal%5D)">Stability of the interface between neural tissue and chronically implanted intracortical microelectrodes.</a> IEEE Trans. Rehab. Eng. 7, 315-326 (1999).</li>
<li>Williams, J. C., Hippensteel, J. A., Dilgen, J., Shain, W., Kipke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+impedance+spectroscopy+for+monitoring+tissue+responses+to+inserted+neural+implants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Complex impedance spectroscopy for monitoring tissue responses to inserted neural implants.</a> J. Neural Eng. 4, 410-423 (2007).</li>
<li>Polikov, V., Tresco, P., Reichert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+brain+tissue+to+chronically+implanted+neural+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes.</a> Journal of Neuroscience Methods. 148, 1-18 (2005).</li>
<li>Szarowski, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+responses+to+micro-machined+silicon+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Brain responses to micro-machined silicon devices.</a> Brain Research. 983, 23-35 (2003).</li>
<li>McConnell, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implanted+neural+electrodes+cause+chronic%2C+local+inflammation+that+is+correlated+with+local+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Implanted neural electrodes cause chronic, local inflammation that is correlated with local neurodegeneration.</a> J. Neural Eng. 6, 056003(2009).</li>
<li>Holecko, M. M., Williams, J. C., Massia, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+intact+interface+between+neural+tissue+and+implanted+microelectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Visualization of the intact interface between neural tissue and implanted microelectrode arrays.</a> J. Neural Eng. 2, 97-102 (2005).</li>
<li>Pierce, A. L., Sommakia, S., Rickus, J. L., Otto, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin-film+silica+sol-gel+coatings+for+neural+microelectrodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Thin-film silica sol-gel coatings for neural microelectrodes.</a> J. Neurosci. Methods. 180, 106-110 (2009).</li>
<li>Wilks, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%283%2C4-ethylene+dioxythiophene%29+%28PEDOT%29+as+a+micro-neural+interface+material+for+electrostimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroengineering%22%5BJournal%5D)">Poly(3,4-ethylene dioxythiophene) (PEDOT) as a micro-neural interface material for electrostimulation.</a> Frontiers in Neuroengineering. 2, (2009).</li>
<li>Johnson, M. D., Otto, K. J., Kipke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeated+voltage+biasing+improves+unit+recordings+by+reducing+resistive+tissue+impedances%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Neural+Syst.+Rehabil.+Eng%22%5BJournal%5D)">Repeated voltage biasing improves unit recordings by reducing resistive tissue impedances.</a> IEEE Trans Neural Syst. Rehabil. Eng. 13, 160-165 (2005).</li>
<li>Otto, K. J., Johnson, M. D., Kipke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage+pulses+change+neural+interface+properties+and+improve+unit+recordings+with+chronically+implanted+microelectrodes%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Voltage pulses change neural interface properties and improve unit recordings with chronically implanted microelectrodes.</a> IEEE Trans. Biomed. Eng. 53, 333-340 (2006).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale%3A+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 14, 1481-1488 (2011).</li>
<li>Woolley, A. J., Desai, H. A., Steckbeck, M. A., Patel, N. K., Otto, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+characterization+of+the+brain-microdevice+interface+using+Device+Capture+Histology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">In situ characterization of the brain-microdevice interface using Device Capture Histology.</a> Journal of Neuroscience Methods. 201, 67-77 (2011).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> J. Vis. Exp. (65), e3564(2012).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+labeling+and+visualization+of+blood+vessels+with+lipophilic+carbocyanine+dye+DiI%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI.</a> Nature Protocols. 3, 1703-1708 (2008).</li>
<li>Clendenon, S. G., Young, P. A., Ferkowicz, M., Phillips, C., Dunn, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+Tissue+Fluorescent+Imaging+in+Scattering+Specimens+Using+Confocal+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Deep Tissue Fluorescent Imaging in Scattering Specimens Using Confocal Microscopy.</a> Microscopy and Microanalysis. 17, 614-617 (2011).</li>
<li>Wilks, S. J., Richner, T. J., Brodnick, S. K., Kipke, D. R., Williams, J. C., Otto, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage+Biasing%2C+Cyclic+Voltammetry%2C+%26+Electrical+Impedance+Spectroscopy+for+Neural+Interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Voltage Biasing, Cyclic Voltammetry, & Electrical Impedance Spectroscopy for Neural Interfaces.</a> J. Vis. Exp. (60), e3566(2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych istotnych ujawnień do deklaracji, finansowych lub innych.

Zademonstrowana tutaj metoda "Device-Capture Histology" (DCHist) umożliwia dokładną ocenę histologiczną morfologicznie zachowanych interakcji między tkanką mózgową a implantami tkankowymi. Pobranie tkanek DCHist wymaga starannego oddzielenia elementów urządzenia montowanego na czaszce od elementów wszczepionych do mózgu. DCHist wymaga również pobrania grubego wycinka tkanki histologicznej (>250 μm). Te skrawki tkanek, po oznaczeniu, oczyszczeniu, zamontowaniu i zobrazowaniu, mogą dostarczyć nowych informacji na temat urazu implantacyjnego lub późniejszej przewlekłej reakcji na urządzenia zainstalowane na stałe. Korzystając z zaawansowanych narzędzi mikroskopowych, interfejs między tkanką a urządzeniem może być obrazowany i analizowany z dużą szczegółowością, jak pokazano na rysunkach 3-5.
Prezentowane techniki w swojej obecnej formie polegają na możliwości powolnego wydobywania nasadki wykonanej z dwuskładnikowego cementu dentystycznego i Kwik-Sil aż do momentu wszczepienia urządzenia. Wykorzystanie cementu dentystycznego, który można spalić lub w inny sposób usunąć, oraz przezroczystego elastomeru silikonowego, przez który można wizualnie prowadzić małe nożyczki, znacznie pomaga w skutecznym oddzieleniu wszczepionego urządzenia od jego elementów zamontowanych na czaszce. Nie zaleca się prób przecięcia urządzenia pod czaszką i nad mózgiem w celu zebrania go in situ , ponieważ implant montowany na czaszce zostanie znacznie wyciągnięty z mózgu.
Chociaż cieńsze, mniejsze implanty, takie jak jednozębowe MEA firmy NeuroNexus Technologies, są najbardziej podatne na DCHist, zasady nie ograniczają się do pojedynczych trzonków urządzeń lub układów mikroelektrod. Strategie pobierania i obrazowania mają szerokie zastosowanie w przypadku wyrobów wielotrzpieniowych i większych implantów, takich jak kaniule, przy czym wymagania są takie, że muszą one być oddzielone od dowolnego mocowania czaszki i pobrane w grubym wycinku tkanki. Chociaż autorzy koncentrują się na analizie tkanki otaczającej implanty korowe, urządzenia wbite głębiej w mózg mogą być również zbierane i obrazowane. Głębokość wprowadzenia implantu nie powinna mieć wpływu na uchwycenie implantu w plastrze, pod warunkiem, że urządzenie nie odchyla się gwałtownie od znanego kąta wprowadzenia.
Istnieją ograniczenia w użytecznym zastosowaniu metody DCHist. Skrawki tkanki mózgowej są trudne do zobrazowania za pomocą setek mikrometrów, zwłaszcza w obszarach istoty białej, chociaż rozwiązania w zakresie oczyszczania optycznego mogą znacznie poprawić głębokość obrazowania w różnych tkankach21. Aby jeszcze bardziej poprawić głębię obrazowania, można zastosować mikroskopię wzbudzenia dwufotonowego wraz z opisanym oczyszczaniem optycznym.
Kolejnym potencjalnym ograniczeniem opisywanej metody mogą być specyficzne metody immunohistochemiczne fluorescencyjne oraz stosowane przez badaczy przeciwciała. Dyfuzja bierna zazwyczaj napędza inkorporację tych markerów przez utrwaloną tkankę i do miejsc wiązania antygenu. Końcowe stężenia robocze przeciwciał muszą być określane przez badaczy indywidualnie dla każdego przypadku, aby zmaksymalizować penetrację znacznika przy jednoczesnym uniknięciu wysokich poziomów znakowania tła. Znakowanie przeciwciał nie powinno być zmienne między warstwami, które są przetwarzane identycznie, ale różne przeciwciała mogą się znacznie różnić pod względem zdolności do przenikania i znakowania antygenu, przy czym niektóre przeciwciała łatwo znakują antygeny na głębokość wielu setek mikrometrów, a inne znakują antygeny tylko na głębokość kilkudziesięciu mikrometrów. Opisujemy poprawę tej dyfuzji poprzez stosowanie etykiet przeciwciał w stężeniach wyższych niż typowe, przez wiele dni stosowania oraz w roztworze zawierającym rozcieńczony detergent i surowicę blokującą. Okresowe przewracanie plasterków sprzyja również równomiernemu etykietowaniu. Etapy pobierania antygenu i alternatywne procesy wiązania (np. aldehyd glutarowy, mikrofale itp.) mogą być odpowiednie dla określonych antygenów. Drugorzędowe koniugaty przeciwciało-fluorochrom mogą również różnić się wydajnością znakowania grubych odcinków, chociaż nie zostało to zaobserwowane przez autorów używających znaczników Alexa Fluor firmy Invitrogen. Alternatywnie, transgeniczne zwierzęta wykazujące ekspresję białek fluorescencyjnych w typach komórek będących przedmiotem zainteresowania mogą być wykorzystane w celu uniknięcia problemów z penetracją znacznika przeciwciała, ponieważ wiele białek fluorescencyjnych, takich jak eGFP, zachowuje swoją fluorescencję po traktowaniu formaldehydem i może być natychmiast uwidocznione w skrawkach tkanki.
DCHist to potężny zestaw technik do przechwytywania i analizowania wpływu wszczepionych mikrourządzeń na tkankę mózgową. Połączenie tego protokołu histologicznego z oceną in vivo jakości elektrofizjologii i danych dotyczących impedancji elektrod22 może znacznie poprawić naszą wiedzę na temat biologicznych źródeł zmienności i degradacji fizjologii. W szczególności dziedzina wszczepianych protez nerwowych może skorzystać ze szczegółowego obrazowania DCHist nienaruszonego interfejsu urządzenie/tkanka w celu informowania o dalszym rozwoju biologicznie neutralnych urządzeń MEA.

Dziedzina badań neuroprotetycznych ma na celu pomoc osobom cierpiącym na różne niepełnosprawności i zaburzenia poprzez omijanie chorych lub uszkodzonych struktur w ciele za pomocą urządzeń łączących OUN1,2. Mikrourządzenia z implantami do mózgu, takie jak matryce mikroelektrod (MEA), mogą być wykorzystywane do rejestrowania lub stymulowania struktur mózgu, a tym samym umożliwiają ustanowienie długoterminowych interfejsów między elektroniką a tkanką OUN3-5. Penetrujące MEA, urządzenia, które są wprowadzane do tkanki mózgowej, są szczególnie obiecujące jako dwukierunkowe interfejsy ze względu na bliską bliskość, w której prezentują elektrody do stosunkowo niewielkiego zestawu pobliskich neuronów6.
Jednak złożone reakcje tkanek wynikają z długotrwałej implantacji penetrujących MEA, co często skutkuje zmiennymi i stopniowo pogarszającymi się elektrofizjologicznymi stosunkami sygnału do szumu w ciągu dni do miesięcy oraz wzrostem impedancji elektrycznej między miejscami elektrod a ziemią7,8. Przypuszczalne pochodzenie tych zmian obejmuje aktywację mikrogleju, reaktywną astrocytozę wzdłuż mikrourządzeń oraz utratę lub migrację neuronów z tkanki otaczającej do wszczepionych urządzeń9-11. Głównym wyzwaniem dla zrozumienia tych zmian tkankowych wokół przewlekłych, penetrujących MEA jest trudność w uchwyceniu danych histologicznych nienaruszonego interfejsu tkankowego otaczającego przewlekle wszczepione urządzenia12. Analiza histologiczna tkanki z nadal obecnym interfejsem wyrób/tkanka poprawiłaby obecne protokoły histologiczne usuwania urządzenia. Gdy niezakłócone urządzenie pozostaje w tkance, biologiczny wpływ stosunkowo subtelnych interakcji, takich jak zastosowanie biokompatybilnych powłok13,14 lub elektryczne oczyszczanie powierzchni elektrody15,16, może być obrazowany i analizowany w odniesieniu do implantu.
Tutaj demonstrujemy metodę zbierania, przetwarzania i obrazowania nienaruszonego interfejsu mikrourządzenia do szczegółowej analizy otaczającej tkanki mózgowej opartej na mikroskopii. W tej metodzie urządzenie i otaczająca tkanka mózgowa są zbierane w grubym (>250 μm) skrawku tkanki za pomocą wibratomu. Aby poprawić penetrację znacznika histologicznego do tych grubych plastrów, fluorescencyjne znaczniki histochemiczne i immunohistochemiczne są nakładane w wysokich stężeniach w roztworach zawierających surowicę blokującą i detergent przez wiele dni. W celu poprawy głębokości obrazowania mikroskopowego zastosowano rozwiązanie do czyszczenia optycznego, a tkanka jest umieszczana w 2-stronnych komorach w celu późniejszej laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej17. Aby uchwycić pełny interfejs histologiczny, podczas obrazowania stosuje się sterowany komputerowo etap translacyjny w celu zebrania panoram stosu z wzdłuż implantów. Oprócz obrazowania nałożonych etykiet tkankowych, zbieranie odbicia laserowego z powrotem z implantów i przepuszczanie światła przez tkankę pomaga zlokalizować interfejs urządzenia w stosunku do otaczającej tkanki. Tkanka przygotowana przy użyciu tego protokołu "Device-Capture Histology" (DCHist) zapewnia dostęp do obrazowania morfologicznie zachowanych interakcji tkanka/urządzenie, a tym samym poprawia się w stosunku do poprzednich protokołów histologicznych usuwania urządzenia18.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Odczynniki</td></tr><tr><td>H&#8211; chst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>14533</td><td>Marker DNA</td></tr><tr><td>Królik anty-Iba1</td><td>Wako (Japonia)</td><td>019-19741</td><td>Przeciwciało monocytowe</td></tr><tr><td>Akryl</td><td>dentystyczny Lang Dental (różni dystrybutorzy)</td> <td>Proszek do naprawy protez zębowych i Płynna</td><td>konstrukcja nasadki</td></tr><tr><td>Kwik-Sil</td><td>World Precision Instruments</td><td>KWIK-SIL</td><td>Pokrywanie odsłoniętych implantów czaszki</td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>005-000-121</td><td>Przetwarzanie tkanek</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ml</td><td>Przetwarzanie tkanek</td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U4883</td><td>Roztwór</td></tr> <tr>czyszczący<td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G20225</td><td>Roztwór</td></tr><tr> czyszczący<td colspan="4"><silny>Sprzęt</mocny></td></tr><tr><td>Zakrzywione mikronożyczki</td><td>World Precision Instruments</td><td>14208</td><td>Cięcie implantu przed usunięciem mózgu</td></tr><tr><td>Żyletki</td><td>Ted Pella</td> <td>(różne rozmiary)</td><td>Do użytku z Brain Block</td></tr><tr><td>Acrylic Brain Matrice</td><td>Ted Pella</td><td>15054</td><td>Blok mózgu do tworzenia początkowej płaszczyzny w tkance</td></tr><tr><td>Szkiełka plastikowe</td><td>Ted Pella</td><td>260225</td><td>Montaż chusteczki</td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe</td><td>Ted Pella</td> <td>(różne rozmiary)</td> <td>Montaż tkanki</td></tr><tr><td>Matryce elektrod</td><td>NeuroNexus Technologies</td> <td>(różne projekty)</td><td>Przykład MEA</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td>Specyficzny system zastosowany w prezentowanej metodzie</td></tr><tr><td>Ostrza wibratomu</td> <td>(różni dostawcy)</td><td></td><td>Zbieranie plastrów</td></tr><tr><td>Płytki 24-dołkowe</td> <td>(różni dostawcy)</td><td></td> <td>Przechowywanie i przetwarzanie plastrów tkanek</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny z zmotoryzowanym stolikiem skanowania XY</td><td>Mikroskopia Carl Zeiss Zeiss</td><td>LSM 710 i &#8217; Zen 2010&#8217; oprogramowanie</td><td>Specyficzny system zastosowany w prezentowanej metodzie</td></tr><tr><td>Lutownica</td> <td>(różni dostawcy)</td><td></td> <td>Nasadka do kopania</td></tr></tbody></table>

nienaruszona charakterystyka histologiczna mikrourządzeń z implantami do mózgu i otaczających tkanek

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Badania nad projektowaniem i wykorzystaniem mikrourządzeń z implantami do mózgu, takich jak układy mikroelektrod, mają na celu wyprodukowanie klinicznie istotnych urządzeń, które chronicznie łączą się z otaczającą tkanką mózgową. Uważa się, że tkanka otaczająca te implanty reaguje na obecność urządzeń w miarę upływu czasu, co obejmuje tworzenie izolującej "blizny glejowej" wokół urządzeń. Jednak analiza histologiczna tych zmian tkankowych jest zwykle wykonywana po eksplantacji urządzenia, w procesie, który może zakłócić morfologię tkanki będącej przedmiotem zainteresowania.
Tutaj demonstrujemy protokół, w którym urządzenia z wszczepioną korą są zbierane w stanie nienaruszonym w otaczającej tkance mózgowej gryzoni. Opisujemy, w jaki sposób, po perfuzji utrwalaczem, mózgi są usuwane i krojone w taki sposób, aby uniknąć eksplantacji urządzeń. Przedstawiamy metody znakowania przeciwciałami fluorescencyjnymi i optycznego usuwania przydatne do wytwarzania pouczającego, ale grubego wycinka tkanki. Na koniec demonstrujemy montaż i obrazowanie tych skrawków tkanek w celu zbadania interfejsu biologicznego wokół urządzeń z implantami mózgu.

Implantowane w mózgu MEA można odzyskać z plastrów tkankowych, najpierw oddzielając komponenty zamocowane na czaszce od komponentów osadzonych w mózgu. Rycina 2a przedstawia wyniki usunięcia jednej strony nakładki czaszkowej z cementu dentystycznego oraz części Kwik-Sil otaczającego kabel MEA na czaszce szczura. Do usunięcia cementu dentystycznego i Kwik-Sil w dygestorium użyto lutownicy. Następnie okablowanie oraz wszelkie nieimplantowane struktury MEA przecięto mikronożyczkami, powoli wydrążając Kwik-Sil aż do powierzchni utrwalonego mózgu.
Po pocięciu, znakowaniu i klarowaniu tkanki, proste szkiełka wykonane na zamówienie są przydatne do montażu grubych skrawków tkanki (Rysunek 2b). Na Rysunku 2c przedstawiono zamontowany skrawka mózgu z implantowanym mikro urządzeniem. Obrazowanie z obu stron szkiełka pozwala ocenić interfejs wokół urządzenia, co zaprezentowano na Rysunku 3, gdzie z jednej strony widoczna jest mikroglej wzdłuż silikonowego podłoża MEA (Rysunek 3a), a z drugiej strony widoczna jest mikroglej wzdłuż miejsc elektrod i ścieżek (Rysunek 3b).
Po zamocowaniu tkanka może być obrazowana przy użyciu stolika translacyjnego XY. Przeglądowe obrazy znaczników fluorescencyjnych w obrębie całych przekrojów tkanki mogą być generowane z pożądaną rozdzielczością (Rysunek 4). Szczegółowa analiza morfologicznie zachowanego interfejsu tkankowego wokół implantowanych mikrourządzeń może być przeprowadzona przy dużym powiększeniu w celu oceny lokalnej odpowiedzi tkankowej (Rysunek 5).
<img src="/files/ftp_upload/50126/50126fig1.jpg" alt="Schemat procesu implantacji do mózgu gryzonia; etapy obróbki tkanek po śmierci, krojenia i montażu." fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50126/50126fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Przegląd procedury. (a-c) Operacje mikroimplantacji mózgu kończy się nałożeniem warstwy polimeru Kwik-Sil bezpośrednio wokół urządzenia, a następnie pokryciem go cementem akrylowym. (d, e) Po eutanazji warstwa akrylowa zostaje wypalona, a komponenty urządzenia zamocowane do czaszki zostają oddzielone od komponentów implantowanych poprzez przecięcie elastomeru silikonowego. (f, g) Mózg zostaje następnie usunięty z czaszki, przecięty i zamontowany na stole wibratomu. (h-k) Pobierane są plastry tkanek, w tym plaster zawierający urządzenie. (l) Tkankę można następnie przetworzyć i zamontować w specjalnych komorach do szczegółowej mikroskopii. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50126/50126fig1large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy rysunek</a>.
<img src="/files/ftp_upload/50126/50126fig2.jpg" alt="Proces przygotowania próbek do analizy skamieniałego drewna; przygotowanie preparatu mikroskopowego; inspekcja wizualna." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. (a) Przezroczysty elastomer silikonowy Kwik-Sil otaczający kabel macierzy elektrod (strzałka) został odsłonięty poprzez wypalenie otworu w cementowej zakładce stomatologicznej na perfundowanej głowie gryzonia przy użyciu lutownicy. (b) Aby umożliwić obrazowanie obu stron grubego przekroju tkanki, proste „komory szkiełka” można wykonać poprzez docięcie szkiełka plastikowego i przyklejenie szkiełka nakrywkowego po obu stronach wokół tkanki i roztworu montującego. (c) Przedstawiono przekrój tkanki mózgu szczura z nienaruszonym implantem (czerwona strzałka) po montażu. Dzięki takiemu ustawieniu obie strony tkanki są szybko dostępne do obrazowania mikroskopowego. Dla skali: panel (a) ma 25 mm szerokości u dołu, natomiast panele (b, c) mają 80 mm szerokości u dołu.
<img src="/files/ftp_upload/50126/50126fig3.jpg" alt="Przekroje tkanki mózgowej; mikroskopia fluorescencyjna; barwienie Hoe342 i Iba1; analiza szczegółów komórkowych." fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50126/50126fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Z-projekcje maksymalnej intensywności stosów obrazów o grubości 40 μm, zebranych z tyłu (a) i z przodu (b) wszczepionej macierzy mikroelektrod. Mikroglej (oznaczony przeciwciałem anty-Iba1 i Alexa Fluor 633, kolor biały) oraz odblask światła laserowego (kolor czerwony), zebrane z powierzchni urządzenia, obrazowano sekwencyjnie z obu stron skrawka tkanki o grubości 400 μm. Ponieważ implanty mózgowe są często nieprzezroczyste, montaż z dostępem optycznym do obu stron zapewnia wyraźny widok oznakowanych struktur tkankowych znajdujących się „za” implantem względem obiektywu mikroskopu. Pasek skali 50 μm.
<img src="/files/ftp_upload/50126/50126fig4.jpg" alt="Porównanie obrazów mikroskopowych; włókno mięśniowe, struktura komórkowa; analiza mikroskopii fluorescencyjnej." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Oznaczony przekrój DCHist obrazowany przy użyciu sterowanego komputerowo stolika w konfokalnym mikroskopie skaningowym. (a) Jądra komórkowe (barwione Hoechst 33342) oraz (b) monocyty/mikroglej (oznaczone przeciwciałem anty-Iba1) były obrazowane jednocześnie na osobnych kanałach. (c) Zebrano również światło transmisyjne i odbite, co pokazuje położenie 4-tygodniowego implantu w odniesieniu do danych Hoechst i Iba1. (d) Przedstawiono również nałożenie wszystkich kanałów z wyjątkiem transmisyjnego. Obszar białego prostokąta został powiększony na obrazach widocznych po prawej stronie. Pasek skali 1 mm.
<img src="/files/ftp_upload/50126/50126fig5.jpg" alt="Wyniki elektroforezy; prążki białkowe; obrazowanie fluorescencyjne; rozdział molekularny; analiza żelu." fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50126/50126fig5highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Przy użyciu sterowanego komputerowo stolika mikroskopowego i odpowiedniego oprogramowania można zebrać panoramiczne dane obrazowe wokół implantu. Reflektancja (a) i transmitancja (b) pozwalają na lokalizację urządzenia, natomiast fluorescencyjne przeciwciała lub znaczniki chemiczne (c, znakowanie mikrogleju i makrofagów przeciwciałami anty-Iba1) umożliwiają szczegółowe obrazowanie składników tkanki wzdłuż nienaruszonego interfejsu tkankowego. Pasek skali 200 μm.

Tutaj prezentujemy histologiczną metodę przechwytywania, znakowania, optycznego oczyszczania i obrazowania nienaruszonego interfejsu tkanki mózgowej wokół przewlekle wszczepionych mikrourządzeń w tkance mózgowej gryzoni. Wyniki technik obejmujących tę metodę są przydatne do zrozumienia wpływu różnych penetrujących implantów mózgowych na otaczające je tkanki.

Nienaruszona charakterystyka histologiczna mikrourządzeń z implantami do mózgu i otaczających tkanek

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Celem tej procedury jest zobrazowanie nienaruszonego interfejsu tkanki mózgowej wokół przewlekle wszczepionych mikrourządzeń w tkance mózgowej gryzoni. Osiąga się to poprzez użycie najpierw elastomeru silikonowego o szybkich komórkach i dwuczęściowego akrylu dentystycznego, aby pokryć kraniotomię i utworzyć czapeczkę czaszki wokół wszczepionego urządzenia. Po perfuzji zwierzęcia za pomocą utrwalacza i pośmiertnego przetwarzania tkankowego, część urządzenia z implantacją mózgu jest oddzielana od nasadki głowy poprzez wypalenie akrylu dentystycznego i przecięcie szybkiej komórki.Następnie mózg jest usuwany i cięty za pomocą viome, aby uchwycić implant w wycinku tkanki. Ostatnim krokiem jest przygotowanie tkanki do obrazowania fluorescencyjnego poprzez mycie, znakowanie, a następnie oczyszczenie wycinka tkanki w optycznym roztworze czyszczącym. Ostatecznie mikroskopia konfokalna służy do pokazania nienaruszonej odpowiedzi biologicznej, jaką wytwarza penetrujący implant mózgowy w otaczającej tkance w skali subkomórkowej.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak explaning, urządzenie, jest to, że technika ta pozwala uniknąć zakłócenia tkanki otaczającej i przylegającej do wszczepionego urządzenia, dzięki czemu tkanka współpracująca może być badana w stanie nienaruszonym. Metoda ta opiera się na zaawansowanych technikach immunohistochemicznych i mikroskopowych, a jej wynikiem są dane z mikroskopii konfokalnej, które szczegółowo opisują obszar otaczający urządzenie z implantem mózgu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuroprotetyki, takie jak stopień, w jakim miejscowa śmierć komórki, tworzenie blizn glejowych i reorganizacja naczyń krwionośnych naprawdę wpływają na żywotność mikroelektrod wszczepionych w mózg.Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w przewlekły interfejs neuronowy wszczepionych w mózg układów mikroelektrod. Techniki związane z tą metodą można również zastosować w innych obszarach badań neurobiologicznych, w tym w wszczepionych kaniulach lub światłowodach W okapie oparowym rozpocznij procedurę od ostrożnego usunięcia skóry i innych tkanek wokół akrylowej czapki czaszki, używając kleszczy i małych nożyczek, nosząc rękawice niewrażliwe na ciepło. Użyj żołnierskiego żelazka, aby zrobić okno w akrylu wgniecenia i odsłonić obszar pod spodem szybkiego uszczelnienia.Urządzenie powinno być widoczne zamknięte w przezroczystej szybkozłączce. Następnie, pod mikroskopem chirurgicznym, wytnij elastomer silikonowy za pomocą zakrzywionych mikronożyczek. Następnie usuń małe kawałki szybkiej uszczelki za pomocą pęsety i mikronożyczek aż do miejsca, w którym urządzenie wchodzi do mózgu.Kontynuuj cięcie wzdłuż powierzchni kraniotomii, aby oddzielić elementy urządzenia przyczepiające się do polikrzemu i czaszki od elementów wszczepionych do mózgu. Zachowaj ostrożność podczas przecinania odsłoniętych elementów urządzenia. Unikaj wciskania lub przeciągania implantów w utrwalonej tkance.Następnie ostrożnie usuń kość wokół nasadki głowy, używając następnie surowych shes. Użyj szpatułki, aby oddzielić mózg z wszczepionym urządzeniem od czaszki. Teraz umieść mózg na szklanej szalce Petriego wypełnionej HBHS.Użyj bloku mózgowego i żyletek, aby podzielić mózg na sekcje i stworzyć płaską płaszczyznę ściśle dopasowaną do kąta wszczepionych urządzeń. Następnie wciśnij dwie żyletki przez tkankę mózgową, odsłaniając płaską powierzchnię, która zostanie zamontowana na Vibram. Następnie umieść trochę lodu pod platformą Vibram.Następnie krótko osusz powierzchnię chusteczki na ręczniku papierowym. Następnie zorientuj próbkę tak, aby najszerszy wymiar był równoległy do kierunku ruchu wibrującego ostrza tonu, aby uniknąć potencjalnego przewrócenia tkanki przez ostrze, natychmiast przyklej płaską płaszczyznę do stolika za pomocą super kleju. Po nałożeniu kleju umieść schłodzony PBS na naczyniu vibrato wokół tkanki.Teraz pokrój plastry tkanki o grubości od 250 do 500 mikronów, używając maksymalnej szybkości wibracji i powolnego tempa postępu ostrza przy kącie ostrza 10 stopni od poziomu. Następnie ostrożnie zbierz plastry za pomocą pędzla i szpatułki i przechowuj HBHS w 24-dołkowej płytce w temperaturze czterech stopni Celsjusza, zbierając plastry, zapisuj grubość i położenie każdego plasterka, gdy są one wyjmowane na płytkę 24-dołkową. Gdy urządzenie Insitu będzie widoczne, zbierz plasterek tkanki o grubości około 500 mikronów.W celu uchwycenia wyrobu w pojedynczym wycinku tkanki w celu zebrania cieńszego fragmentu tkanki, można ostrożnie pobrać wycinki o grubości 100 mikronów, aby zbliżyć się do urządzenia. W tym momencie można zebrać plasterek o grubości mniejszej niż 500 mikronów z urządzeniem w środku. Przetwarzanie tkanek należy rozpocząć od trzykrotnego umycia plastrów po pięć minut na pranie w HBHS.Następnie inkubuj je w wodorku boru sodu przez 15 minut. Z każdej strony plastra powoli obracaj plasterek za pomocą małego pędzla i unikaj dotykania jakichkolwiek obszarów wokół wszczepionego urządzenia. Wraz z małym pędzlem można również użyć mikro łyżki ze stali nierdzewnej lub teflonu.Teraz umyj plastry trzy razy po pięć minut na pranie w roztworze myjącym o temperaturze pokojowej. Zablokuj je w roztworze myjącym na dwie godziny w temperaturze pokojowej, przewracając plastry. Po jednej godzinie, po dwóch godzinach, inkubuj plastry w przeciwciałie pierwszorzędowym przez około 48 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie wykonaj sześć szybkich, trzyminutowych myć roztworem myjącym. Następnie wykonaj sześć godzinnych płukań w roztworze do mycia. Następnie inkubuj je w przeciwciałie drugorzędowym przez około 48 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Ponownie wykonaj sześć szybkich, trzyminutowych myć, a następnie sześć jednogodzinnych płukań w roztworze myjącym. Następnie usuń roztwór myjący i dodaj roztwór czyszczący U2 na bazie glicerolu. Przykryj talerz folią i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Pozostaw grube plastry do usunięcia około tygodnia lub bardzo grube skrawki tkanki przez dwa do trzech tygodni w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po usunięciu zamontuj skrawki tkanek na szkiełkach, używając roztworu czyszczącego jako nośnika montażowego. Uszczelnij wszystkie szkiełka przezroczystym lakierem do paznokci i przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza z dala od światła, używając obiektywów mikroskopowych o większej odległości roboczej.Rozpocznij obrazowanie za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego lub mikroskopu dwufotonowego. Zademonstrujemy za pomocą oprogramowania XS L SM seven 10 Carl Xi send i sterowanego komputerowo stolika translującego XY na obraz Panorama 3D wokół implantu w celu skorygowania współczynnika załamania światła roztworu czyszczącego. W tej demonstracji wprowadzamy wartość współczynnika załamania światła wynoszącą 1,4 w oprogramowaniu mikroskopu Leica Zen dla rozwiązania do czyszczenia U2.To ustawienie subtelnie dostosowuje odstępy kroku Z, aby uwzględnić niedopasowanie współczynnika załamania światła w tkance w pobliżu urządzenia. Z grubsza oceń odpowiednie okno osi Z i ustawienia zbierania danych w wymiarze zdi dla każdego kanału fluorescencyjnego przy użyciu niskiej mocy lasera, około 0,5 do 5% i dużych rozmiarów kroku Z. Następnie użyj oprogramowania Zen panorama, aby ustawić obiektyw w środku XY ostatecznej panoramy i określić liczbę pozycji zbierania wymaganych dla osi x i y.Aby objąć obszar zainteresowania, ponownie oceń i sfinalizuj okno zbierania osi Z, szybko sprawdzając pierwszą i ostatnią klatkę stosu. Następnie ręcznie ustaw czułość detektora i moc lasera, aby odpowiednio narastały wraz ze zwiększoną głębokością. Celem jest zazwyczaj utrzymanie w przybliżeniu tej samej intensywności obrazu niezależnie od głębokości obrazowania w wycinku tkanki, a także uniknięcie wysokiego szumu tła.W razie potrzeby zbierz każdą serię danych obrazu fluorescencyjnego, aby uniknąć nakładania się sygnałów, sekwencyjnie uruchamiaj linie laserowe. Zmień ustawienia oprogramowania, aby zbierać dane lub dane dotyczące transmitancji i użyj dłuższego, bardziej penetrującego lasera o większej długości fali, takiego jak 6 33 nanometrów, aby uchwycić te kanały. Następnie określ odpowiednią moc lasera i wykryj czułość na odbicie i odbiór sygnału oraz transmitancję, a następnie powtórz tę samą serię zbierania wokół wszczepionego urządzenia.Na koniec wyeksportuj dane do późniejszego przetwarzania, kwantyfikacji i analizy. Obrazowanie po obu stronach szkiełka może pozwolić na ocenę granicy faz wokół urządzenia, jak pokazano tutaj, gdzie mikroglej wzdłuż krzemowego podłoża MEA jest widoczny z jednej strony, a mikroglej wzdłuż miejsc elektrod i śladów jest widoczny po drugiej stronie. Po zobrazowaniu zamontowanej tkanki za pomocą etapu translacji XY, można uzyskać przegląd etykiet fluorescencyjnych na całym wycinku tkanki w żądanej rozdzielczości.Tutaj jądra komórkowe barwione haczykami 3, 3, 3 4 2 i monocyty mikrogleju znakowane 3 2 9. Jeden z nich był jednocześnie wyświetlany na różnych kanałach. Zebrano również światło transmisyjne i współczynnik odbicia, pokazując lokalizację czterotygodniowego implantu w odniesieniu do haczyków i danych IVA one, nakładki wszystkich kanałów, ale transmisja jest pokazana tutaj.Szczegółowe badanie morfologicznie zachowanej granicy faz tkankowych wokół wszczepionych mikrourządzeń można pobrać w dużym powiększeniu w celu analizy lokalnej odpowiedzi tkankowej, odbicie i przepuszczalność pozwalają na lokalizację urządzenia, podczas gdy fluorescencyjne przeciwciała lub znaczniki chemiczne umożliwiają szczegółowe obrazowanie składników tkanki wzdłuż nienaruszonego interfejsu tkankowego. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby naprawdę poświęcić trochę czasu na staranne oddzielenie wszczepionych urządzeń przez nasadkę na głowę i zaplanować, że ten krok zajmie ponad 30 minut. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zbierać i przetwarzać wycinki mózgu zawierające wszczepione urządzenia.Powinieneś również być w stanie oznaczyć i zebrać dane histologiczne opisujące neurobiologię otaczającą te urządzenia.

intact-histological-characterization-brain-implanted-microdevices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Nienaruszony histologiczny charakter mikroukładów implantowanych w mózgu i otaczających tkanek

Opisano metodę wszczepiania elektrod do jądra podwzgórzowego (STN) szczurów. Lepsza lokalizacja STN została osiągnięta dzięki zastosowaniu systemu mikrozapisu. Ponadto przedstawiono konfigurację stymulacji, która charakteryzuje się długotrwałymi połączeniami między głową zwierzęcia a stymulatorem.

Implantacja elektrod pod kontrolą mikroelektrod do jądra podwzgórzowego szczurów w celu długotrwałej głębokiej stymulacji mózgu

Wykazaliśmy, że wszczepienie mikroelektrody w korze ruchowej szczurów powoduje natychmiastowe i trwałe deficyty motoryczne. Proponowane tutaj metody obejmują operację wszczepienia mikroelektrod i trzy zadania behawioralne gryzoni w celu wyjaśnienia potencjalnych zmian w funkcji motorycznej małej lub dużej spowodowanej uszkodzeniem kory ruchowej spowodowanym implantacją.

Testy behawioralne gryzoni w celu oceny deficytów funkcjonalnych spowodowanych implantacją mikroelektrod w korze ruchowej szczura

Sondy elektroniczne Mesh bezproblemowo integrują się i zapewniają stabilny, długoterminowy zapis na poziomie pojedynczego neuronu w mózgu. Protokół ten wykorzystuje elektronikę siatkową do eksperymentów in vivo, obejmujących wytwarzanie elektroniki siatkowej, ładowanie do igieł, wstrzykiwanie stereotaktyczne, łączenie wejść / wyjść, eksperymenty rejestracyjne i histologię tkanki zawierającej sondy siatkowe.

Elektronika siatkowa do wstrzykiwania strzykawki dla stabilnej elektrofizjologii przewlekłych gryzoni

Ten artykuł opisuje prostą metodę przygotowania mózgów małych zwierząt do obrazowania mikro-CT, w którym zmiany chorobowe mogą być określane ilościowo, a elektrody lokalizowane z dużą precyzją w kontekście całego mózgu.

Metoda oparta na mikrotomografii komputerowej do charakteryzowania zmian chorobowych i lokalizacji elektrod w mózgach małych zwierząt

Ten protokół demonstruje metodologie dla mysiego modelu urazowego mózgu z otwartą czaszką i przeszczepu hodowanych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do miejsca urazu. W skrócie opisano również testy behawioralne i histologiczne wyników tych procedur.

Kontrolowany model wpływu kory mózgowej uszkodzenia mózgu myszy z terapeutycznym przeszczepem ludzkich pluripotencjalnych komórek nerwowych pochodzących z komórek macierzystych

Wykazaliśmy, że wytrawianie nano-architektury w wewnątrzkorowych urządzeniach mikroelektrodowych może zmniejszyć reakcję zapalną i ma potencjał do poprawy zapisów elektrofizjologicznych. Opisane w niniejszym dokumencie metody nakreślają podejście do wytrawiania nanoarchitektur na powierzchni niefunkcjonalnych i funkcjonalnych mikroelektrod krzemowych z pojedynczym trzpieniem wewnątrzkorowym.

Litografia z użyciem skupionej wiązki jonów do wytrawiania nanoarchitektur w mikroelektrodach

Obecny protokół opisuje narzędzia do obsługi mikroelektrod wewnętrznych z krzemu podczas zabiegów modyfikacji powierzchni poprzez osadzanie gazu i reakcje roztworu wodnego. Szczegółowo wyjaśniono montaż komponentów używanych do obsługi urządzeń podczas całej procedury.

Narzędzia do obróbki powierzchniowej krzemowych płaskich mikroelektrod wewnątrzkorowych

Ta praca opisuje rozwój elastycznych elektrod międzypalcowych do implementacji w modelach 3D guzów mózgu, a mianowicie w hodowli in vitro, modelu in ovo i modelu mysim in vivo. Proponowana metoda może być wykorzystana do oceny wpływu pulsacyjnych pól elektrycznych na nowotwory na różnych poziomach złożoności.

Elastyczne organiczne urządzenia elektroniczne do terapii pulsacyjnym polem elektrycznym glejaka

Ten artykuł opisuje metodę przewlekłej obserwacji in vivo spoczynkowego mikrogleju w mysim hipokampie CA1 przy użyciu precyzyjnie kontrolowanej chirurgii i mikroskopii dwufotonowej.

In vivo (in vivo) Przewlekłe dwufotonowe obrazowanie mikrogleju w hipokampie myszy

Tutaj prezentujemy metodę długoterminowej oceny wydajności i bezpieczeństwa miękkich matryc elektrod podtwardówkowych w modelu minipig, opisując metodę i narzędzia chirurgiczne, pooperacyjny rezonans magnetyczny, elektrofizjologię kory słuchowej, właściwości elektrochemiczne implantu oraz immunochemię pośmiertną.

Implantacja matrycy podtwardówkowej miękkiej elektrokortykografii (ECoG) i długotrwała rejestracja kory mózgowej u świnek miniaturowych

Tutaj przedstawiamy lekki, opłacalny system implantacji sond dla przewlekłej elektrofizjologii u gryzoni, zoptymalizowany pod kątem łatwości użycia, odzyskiwania sondy, wszechstronności eksperymentalnej oraz zgodności z zachowaniem.

Implant DREAM: lekki, modułowy i opłacalny system implantów do przewlekłej elektrofizjologii u myszy zamocowanych na głowie i swobodnie zachowujących się

Poznaj metodę histologiczną do obrazowania nienaruszonej tkanki mózgu wokół wszczepionych mikrourządzeń u gryzoni. Technika zachowuje integralność tkanek i umożliwia szczegółową analizę odpowiedzi biologicznej przy użyciu mikroskopii konfokalnej.

Nienaruszona charakterystyka histologiczna mikrourządzeń z implantami do mózgu i otaczających tkanek

Przeglądaj więcej filmów