Nienaruszona charakterystyka histologiczna mikrourządzeń z implantami do mózgu i otaczających tkanek
11 lutego 2013
Tutaj prezentujemy histologiczną metodę przechwytywania, znakowania, optycznego oczyszczania i obrazowania nienaruszonego interfejsu tkanki mózgowej wokół przewlekle wszczepionych mikrourządzeń w tkance mózgowej gryzoni. Wyniki technik obejmujących tę metodę są przydatne do zrozumienia wpływu różnych penetrujących implantów mózgowych na otaczające je tkanki.
Celem tej procedury jest zobrazowanie nienaruszonego interfejsu tkanki mózgowej wokół przewlekle wszczepionych mikrourządzeń w tkance mózgowej gryzoni. Osiąga się to poprzez użycie najpierw elastomeru silikonowego o szybkich komórkach i dwuczęściowego akrylu dentystycznego, aby pokryć kraniotomię i utworzyć czapeczkę czaszki wokół wszczepionego urządzenia. Po perfuzji zwierzęcia za pomocą utrwalacza i pośmiertnego przetwarzania tkankowego, część urządzenia z implantacją mózgu jest oddzielana od nasadki głowy poprzez wypalenie akrylu dentystycznego i przecięcie szybkiej komórki.
Następnie mózg jest usuwany i cięty za pomocą viome, aby uchwycić implant w wycinku tkanki. Ostatnim krokiem jest przygotowanie tkanki do obrazowania fluorescencyjnego poprzez mycie, znakowanie, a następnie oczyszczenie wycinka tkanki w optycznym roztworze czyszczącym. Ostatecznie mikroskopia konfokalna służy do pokazania nienaruszonej odpowiedzi biologicznej, jaką wytwarza penetrujący implant mózgowy w otaczającej tkance w skali subkomórkowej.
Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak explaning, urządzenie, jest to, że technika ta pozwala uniknąć zakłócenia tkanki otaczającej i przylegającej do wszczepionego urządzenia, dzięki czemu tkanka współpracująca może być badana w stanie nienaruszonym. Metoda ta opiera się na zaawansowanych technikach immunohistochemicznych i mikroskopowych, a jej wynikiem są dane z mikroskopii konfokalnej, które szczegółowo opisują obszar otaczający urządzenie z implantem mózgu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuroprotetyki, takie jak stopień, w jakim miejscowa śmierć komórki, tworzenie blizn glejowych i reorganizacja naczyń krwionośnych naprawdę wpływają na żywotność mikroelektrod wszczepionych w mózg
.Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w przewlekły interfejs neuronowy wszczepionych w mózg układów mikroelektrod. Techniki związane z tą metodą można również zastosować w innych obszarach badań neurobiologicznych, w tym w wszczepionych kaniulach lub światłowodach W okapie oparowym rozpocznij procedurę od ostrożnego usunięcia skóry i innych tkanek wokół akrylowej czapki czaszki, używając kleszczy i małych nożyczek, nosząc rękawice niewrażliwe na ciepło. Użyj żołnierskiego żelazka, aby zrobić okno w akrylu wgniecenia i odsłonić obszar pod spodem szybkiego uszczelnienia.
Urządzenie powinno być widoczne zamknięte w przezroczystej szybkozłączce. Następnie, pod mikroskopem chirurgicznym, wytnij elastomer silikonowy za pomocą zakrzywionych mikronożyczek. Następnie usuń małe kawałki szybkiej uszczelki za pomocą pęsety i mikronożyczek aż do miejsca, w którym urządzenie wchodzi do mózgu.
Kontynuuj cięcie wzdłuż powierzchni kraniotomii, aby oddzielić elementy urządzenia przyczepiające się do polikrzemu i czaszki od elementów wszczepionych do mózgu. Zachowaj ostrożność podczas przecinania odsłoniętych elementów urządzenia. Unikaj wciskania lub przeciągania implantów w utrwalonej tkance.
Następnie ostrożnie usuń kość wokół nasadki głowy, używając następnie surowych shes. Użyj szpatułki, aby oddzielić mózg z wszczepionym urządzeniem od czaszki. Teraz umieść mózg na szklanej szalce Petriego wypełnionej HBHS.
Użyj bloku mózgowego i żyletek, aby podzielić mózg na sekcje i stworzyć płaską płaszczyznę ściśle dopasowaną do kąta wszczepionych urządzeń. Następnie wciśnij dwie żyletki przez tkankę mózgową, odsłaniając płaską powierzchnię, która zostanie zamontowana na Vibram. Następnie umieść trochę lodu pod platformą Vibram.
Następnie krótko osusz powierzchnię chusteczki na ręczniku papierowym. Następnie zorientuj próbkę tak, aby najszerszy wymiar był równoległy do kierunku ruchu wibrującego ostrza tonu, aby uniknąć potencjalnego przewrócenia tkanki przez ostrze, natychmiast przyklej płaską płaszczyznę do stolika za pomocą super kleju. Po nałożeniu kleju umieść schłodzony PBS na naczyniu vibrato wokół tkanki.
Teraz pokrój plastry tkanki o grubości od 250 do 500 mikronów, używając maksymalnej szybkości wibracji i powolnego tempa postępu ostrza przy kącie ostrza 10 stopni od poziomu. Następnie ostrożnie zbierz plastry za pomocą pędzla i szpatułki i przechowuj HBHS w 24-dołkowej płytce w temperaturze czterech stopni Celsjusza, zbierając plastry, zapisuj grubość i położenie każdego plasterka, gdy są one wyjmowane na płytkę 24-dołkową. Gdy urządzenie Insitu będzie widoczne, zbierz plasterek tkanki o grubości około 500 mikronów.
W celu uchwycenia wyrobu w pojedynczym wycinku tkanki w celu zebrania cieńszego fragmentu tkanki, można ostrożnie pobrać wycinki o grubości 100 mikronów, aby zbliżyć się do urządzenia. W tym momencie można zebrać plasterek o grubości mniejszej niż 500 mikronów z urządzeniem w środku. Przetwarzanie tkanek należy rozpocząć od trzykrotnego umycia plastrów po pięć minut na pranie w HBHS.
Następnie inkubuj je w wodorku boru sodu przez 15 minut. Z każdej strony plastra powoli obracaj plasterek za pomocą małego pędzla i unikaj dotykania jakichkolwiek obszarów wokół wszczepionego urządzenia. Wraz z małym pędzlem można również użyć mikro łyżki ze stali nierdzewnej lub teflonu.
Teraz umyj plastry trzy razy po pięć minut na pranie w roztworze myjącym o temperaturze pokojowej. Zablokuj je w roztworze myjącym na dwie godziny w temperaturze pokojowej, przewracając plastry. Po jednej godzinie, po dwóch godzinach, inkubuj plastry w przeciwciałie pierwszorzędowym przez około 48 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Następnie wykonaj sześć szybkich, trzyminutowych myć roztworem myjącym. Następnie wykonaj sześć godzinnych płukań w roztworze do mycia. Następnie inkubuj je w przeciwciałie drugorzędowym przez około 48 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Ponownie wykonaj sześć szybkich, trzyminutowych myć, a następnie sześć jednogodzinnych płukań w roztworze myjącym. Następnie usuń roztwór myjący i dodaj roztwór czyszczący U2 na bazie glicerolu. Przykryj talerz folią i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Pozostaw grube plastry do usunięcia około tygodnia lub bardzo grube skrawki tkanki przez dwa do trzech tygodni w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po usunięciu zamontuj skrawki tkanek na szkiełkach, używając roztworu czyszczącego jako nośnika montażowego. Uszczelnij wszystkie szkiełka przezroczystym lakierem do paznokci i przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza z dala od światła, używając obiektywów mikroskopowych o większej odległości roboczej.
Rozpocznij obrazowanie za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego lub mikroskopu dwufotonowego. Zademonstrujemy za pomocą oprogramowania XS L SM seven 10 Carl Xi send i sterowanego komputerowo stolika translującego XY na obraz Panorama 3D wokół implantu w celu skorygowania współczynnika załamania światła roztworu czyszczącego. W tej demonstracji wprowadzamy wartość współczynnika załamania światła wynoszącą 1,4 w oprogramowaniu mikroskopu Leica Zen dla rozwiązania do czyszczenia U2.
To ustawienie subtelnie dostosowuje odstępy kroku Z, aby uwzględnić niedopasowanie współczynnika załamania światła w tkance w pobliżu urządzenia. Z grubsza oceń odpowiednie okno osi Z i ustawienia zbierania danych w wymiarze zdi dla każdego kanału fluorescencyjnego przy użyciu niskiej mocy lasera, około 0,5 do 5% i dużych rozmiarów kroku Z. Następnie użyj oprogramowania Zen panorama, aby ustawić obiektyw w środku XY ostatecznej panoramy i określić liczbę pozycji zbierania wymaganych dla osi x i y.
Aby objąć obszar zainteresowania, ponownie oceń i sfinalizuj okno zbierania osi Z, szybko sprawdzając pierwszą i ostatnią klatkę stosu. Następnie ręcznie ustaw czułość detektora i moc lasera, aby odpowiednio narastały wraz ze zwiększoną głębokością. Celem jest zazwyczaj utrzymanie w przybliżeniu tej samej intensywności obrazu niezależnie od głębokości obrazowania w wycinku tkanki, a także uniknięcie wysokiego szumu tła.
W razie potrzeby zbierz każdą serię danych obrazu fluorescencyjnego, aby uniknąć nakładania się sygnałów, sekwencyjnie uruchamiaj linie laserowe. Zmień ustawienia oprogramowania, aby zbierać dane lub dane dotyczące transmitancji i użyj dłuższego, bardziej penetrującego lasera o większej długości fali, takiego jak 6 33 nanometrów, aby uchwycić te kanały. Następnie określ odpowiednią moc lasera i wykryj czułość na odbicie i odbiór sygnału oraz transmitancję, a następnie powtórz tę samą serię zbierania wokół wszczepionego urządzenia.
Na koniec wyeksportuj dane do późniejszego przetwarzania, kwantyfikacji i analizy. Obrazowanie po obu stronach szkiełka może pozwolić na ocenę granicy faz wokół urządzenia, jak pokazano tutaj, gdzie mikroglej wzdłuż krzemowego podłoża MEA jest widoczny z jednej strony, a mikroglej wzdłuż miejsc elektrod i śladów jest widoczny po drugiej stronie. Po zobrazowaniu zamontowanej tkanki za pomocą etapu translacji XY, można uzyskać przegląd etykiet fluorescencyjnych na całym wycinku tkanki w żądanej rozdzielczości.
Tutaj jądra komórkowe barwione haczykami 3, 3, 3 4 2 i monocyty mikrogleju znakowane 3 2 9. Jeden z nich był jednocześnie wyświetlany na różnych kanałach. Zebrano również światło transmisyjne i współczynnik odbicia, pokazując lokalizację czterotygodniowego implantu w odniesieniu do haczyków i danych IVA one, nakładki wszystkich kanałów, ale transmisja jest pokazana tutaj.
Szczegółowe badanie morfologicznie zachowanej granicy faz tkankowych wokół wszczepionych mikrourządzeń można pobrać w dużym powiększeniu w celu analizy lokalnej odpowiedzi tkankowej, odbicie i przepuszczalność pozwalają na lokalizację urządzenia, podczas gdy fluorescencyjne przeciwciała lub znaczniki chemiczne umożliwiają szczegółowe obrazowanie składników tkanki wzdłuż nienaruszonego interfejsu tkankowego. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby naprawdę poświęcić trochę czasu na staranne oddzielenie wszczepionych urządzeń przez nasadkę na głowę i zaplanować, że ten krok zajmie ponad 30 minut. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zbierać i przetwarzać wycinki mózgu zawierające wszczepione urządzenia.
Powinieneś również być w stanie oznaczyć i zebrać dane histologiczne opisujące neurobiologię otaczającą te urządzenia.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia metodę histologiczną do obrazowania nienaruszonego interfejsu tkanki mózgowej wokół przewlekle zaimplantowanych mikrourządzeń w tkance mózgowej gryzoni. Technika ta pozwala na badanie reakcji biologicznej na przenikające implanty mózgowe przy zachowaniu otoczenia tkanki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Histologia
- Mikroskopia
Tło
- Rozumienie interakcji między implantami mózgowymi a otaczającą tkanką jest kluczowe dla neuroprotetyki.
- Istniejące metody często niszczą tkankę otaczającą implanty.
- To badanie wprowadza technikę, która utrzymuje integralność tkanki dla lepszej analizy.
- Zaawansowane techniki immunohistochemiczne i mikroskopowe są stosowane.
Cel badania
- Rozwój metody obrazowania interfejsu tkanki mózgowej wokół zaimplantowanych urządzeń.
- Ocena reakcji biologicznej tkanki na przewlekłe implanty.
- Dostarczenie wglądu w czynniki wpływające na trwałość urządzeń zaimplantowanych w mózgu.
Zastosowane metody
- Pokrycie kraniotomie silikonowym elastomerem i akrylem dentystycznym.
- Perfuzja zwierzęcia utrwalaczem i przetwarzanie tkanki po śmierci.
- Zastosowanie mikroskopii konfokalnej do wizualizowania reakcji tkanki.
- Zastosowanie zaawansowanych technik immunohistochemicznych do znakowani.
Główne wyniki
- Metoda ta pozwala na nienaruszone badanie interfejsu tkanki wokół implantów.
- Mikroskopia konfokalna ujawnia szczegółowe reakcje biologiczne na poziomie subkomórkowym.
- Zdobyto wgląd w lokalną śmierć komórek, tworzenie blizny glejowa i reorganizację naczyń krwionośnych.
- Technika ta może być dostosowana do innych zastosowań w badaniach neuronauki.
Wnioski
- Ta metoda histologiczna jest skuteczna w badaniu urządzeń zaimplantowanych w mózgu.
- Zachowanie integralności otoczenia tkanki umożliwia szczegółową analizę.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia przewlekłego interfejsu nerwowego w neuroprotetykach.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Preserving the native tissue architecture around chronically implanted neural interfaces enables accurate assessment of biological responses that directly impact device longevity and functional performance. This capability supports mechanistic de-risking in neuroprosthetics development by providing subcellular resolution data on glial scarring, neuronal loss, and vascular reorganization without tissue disruption artifacts. Such insights inform early-stage target validation and predictive confidence in implant design iterations, reducing late-stage failure risk in preclinical pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of tissue-implant interfaces to validate hypotheses about chronic inflammatory responses and foreign body reactions.
- Operational Value: Provides reproducible histological readouts for assessing candidate biomaterials and surface modifications in rodent models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative multiplexed immunofluorescence data on microglia activation, neuronal density, and vascular markers surrounding implants.
- Operational Value: Standardizes tissue preparation and imaging workflows for comparative analysis across device geometries or coating conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains spatial relationships between implant sites and tissue responses, enabling correlation of histological endpoints with functional electrophysiology outcomes.
- Operational Value: Supports longitudinal studies by allowing serial sectioning from the same implanted cohort without explant-induced variability.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into discovery biology workflows by providing intact tissue readouts that bridge in vitro biocompatibility screening and in vivo functional validation, informing go/no-go decisions prior to GLP toxicology studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of material-tissue interactions through preserved subcellular architecture for detailed morphometric analysis.
- Screening: Enables assay readiness via standardized thick-section preparation compatible with high-content immunofluorescence screening of implant candidates.
- Analytics: Delivers multiplexed quantitative readouts (e.g., IBA1+ microglia coverage, NeuN+ neuronal density, CD31+ vascular density) to compare implant conditions.
- Translational Research: Connects discovery-phase histological responses to preclinical continuity by preserving tissue for correlative functional assessments.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable histology platform for evaluating diverse neural interfaces (MEAs, cannulas, fiber optics) across neuroscience discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in tissue response characterization by avoiding explant-induced artifacts.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized fixation, sectioning, clearing, and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early identification of non-viable implant designs before costly chronic studies.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of neuroprosthetic candidates based on quantitative histological risk scores.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgery, immunohistochemistry, and optical clearing techniques.
- Dependent on access to vibratory microtomes, confocal microscopes, and clearing solution handling infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization between surgery, histology, and imaging teams for consistent tissue orientation and sectioning.
- Adaptation considerations include optimizing clearing times and antibody penetration for different tissue thicknesses and implant materials.
- Practical limitations include extended clearing durations (1-3 weeks) and potential autofluorescence from clearing solutions requiring spectral unmixing.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:12
Brain Removal with In situ Devices
5:17
Tissue Processing and Clearing
7:05
Panorama Imaging of Full Tissue and Device Interface
9:26
Results: Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue
10:51
Conclusion
