Znakowanie pojedynczych komórek w ośrodkowym układzie nerwowym Drosophila melanogaster

Ogólnym celem tej procedury jest znakowanie pojedynczych neuronów w ośrodkowym układzie nerwowym zarodków drosophila we wczesnym stadium 17. Osiąga się to poprzez zbieranie jaj i pozwalanie im rozwijać się do odpowiedniego etapu. Drugim krokiem procedury jest ręczne chlorowanie i wyrównanie jaj.

Po tej divie kolonizacja i filetowanie zarodków sprawia, że rdzeń nerwowy staje się dostępny. Ostatnim krokiem jest znakowanie pojedynczych komórek za pomocą Iono retic aplikacji lipofilowego oka matrycowego. Ostatecznie wyniki pozwalają na wizualizację morfologii pojedynczego neuronu, jeśli jest to pożądane w kontekście znanych wzorców ekspresji GFP i/lub na tle zmutowanych.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami znakowania pojedynczych komórek, takimi jak markum, jest to, że działa ona w zarodku i pozwala na celową wizualizację zidentyfikowanych komórek. Wizualna demonstracja tej metody jest niezwykle pomocna, ponieważ wiele kroków jest delikatnych, a przez to trudnych do nauczenia. Pozwól zdrowym muchom złożyć zarodki na płytkach agarowych.

Wymieniaj płytkę co półtorej godziny w temperaturze 25 stopni Celsjusza i zachowaj zarodki. Inkubuj zarodki na ich płytkach w temperaturze 25 lub 18 stopni Celsjusza, aż osiągną wymagany etap rozwoju. Gdy będą gotowe, przenieś zarodki na szkiełko pokryte dwustronną taśmą klejącą.

Unikaj przenoszenia agaru z zarodkami, ponieważ zakłóci to ich przyleganie do taśmy. Na taśmie. Poczekaj, aby zarodki wyschły przez pięć do 10 minut.

Pokryj szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 milimetry na 60 milimetrów klejem heptanowym. Umieść małą kroplę kleju na środku szkiełka i rozprowadź ją na bardzo cienkiej folii za pomocą 18-milimetrowego kwadratowego szkiełka nakrywkowego. Po wyschnięciu zarodków delikatnie dotknij ich igłą.

Żyłka pęknie, a zarodek przyklei się do igły. Natychmiast przenieś odchlorowane zarodki do bloku agarowego, aby zapobiec ich wysuszeniu. Ustaw je tam 10 w rzędzie, brzuszną stroną do góry.

Odetnij nadmiar agaru z bloku skalpelem. Następnie delikatnie dotknij zarodków szkiełkiem nakrywkowym pokrytym klejem heptanowym. Powinny przylegać do szkiełka nakrywkowego brzuszną stroną do dołu.

Nałóż ramkę taśmy samoprzylepnej na szkiełko nakrywkowe i przymocuj je do szkiełka mikroskopowego. Utrzymywanie zarodków na wierzchu szkiełka nakrywkowego. Przykryj zarodki dużą ilością PBS po grzbietowej stronie każdego zarodka w pobliżu jego tylnego końca.

Przeniknij przez błonę witelową szklaną igłą, rozerwij błonę wzdłuż grzbietowej linii środkowej i wyciągnij zarodek z błony. Teraz zmień orientację zarodka brzuszną stroną w dół w innym miejscu na podłożu kleju heptanu. Wypełnij zarodek szklaną igłą, delikatnie perforując ścianę ciała i rozrywając wzdłuż grzbietowej linii środkowej.

Za pomocą igły dociśnij ściankę korpusu tak, aby przykleiła się do szkiełka. Rozerwij jelito na jego przednim i tylnym końcu i podnieś jelito. Ponieważ kilka zarodków zostanie zsegregowanych na tym samym szkiełku, pomocne jest albo bardzo dokładne określenie ich orientacji, albo wykonanie rysunku ich orientacji.

Następnie zarodki można lekko utrwalić przez 10 do 15 minut w 7,4% formaldehydzie w PBS, a następnie cztery płukania w PBS, należy zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć dotykania zarodków powierzchnią roztworu. Siły napięcia powierzchniowego zniszczą je pod obiektywem 10x. Wyśrodkuj pole widzenia na przygotowanym zarodku, zwiększ powiększenie i zlokalizuj interesującą nas komórkę pod optyką DIC lub pod fluorescencją.

Jeśli komórka docelowa wykazuje ekspresję GFP, należy upewnić się, że membrana polowa mikroskopu jest otwarta tylko do krawędzi pola widzenia, nie poza wąskie oświetlenie. Wiązka pomoże w ustawieniu mikropipety, zmień ją z powrotem na obiektyw 10 x i umieść elektrodę kąpielową wzmacniacza prądu stałego w roztworze z dala od zarodka i ścieżki mikropipety. Zamontuj mikropipetę iniekcyjną wypełnioną roztworem chlorku litu do uchwytu i przymocuj ją do mikromanipulatora.

Korzystając z kontrolek kursu, umieść mikropipetę poniżej obiektywu i znacznie powyżej zarodka. Jeśli kąt mikro peppe jest zbyt stromy, końcówka nie będzie ostra. Jeśli jest zbyt płytki, trzon będzie przylegał do ściany wanny, wyśrodkować końcówkę w polu view.

Teraz opuść mikropipetę i skup się naprzemiennie, aż pipeta znajdzie się w PBS i nie za daleko nad zarodkiem. Teraz zmień na obiektyw o dużej mocy i wyśrodkuj pipetę w polu view. Gdy trzon jest w ostrości, przesuń mikropipetę w osi X, aż jej końcówka znajdzie się w środku pola widzenia.

Końcówka mikropipety powinna znajdować się znacznie powyżej poziomu zarodka. Przełącz się na oświetlenie fluorescencyjne i sprawdź końcówkę. Sprawdź, czy nie ma wycieku z oka barwnika.

Dostosuj prąd DC tak, aby kryształ barwnika nie gromadził się na końcówce. Teraz opuść mikropipetę w osi Z w kierunku zarodka. Stopniowe dostosowywanie ostrości w miarę ustawiania ostrości na zarodku.

Przełącz się na korzystanie z precyzyjnej kontroli. Skoncentruj celę, która ma zostać wstrzyknięta, na środku pola, a następnie ponownie ustaw ostrość na końcówce mikropipety. Od tego momentu wygodniej może być korzystanie z kontroli stopnia mikroskopu w celu przesunięcia zarodka względem mikropipety.

Doprowadź końcówkę mikropipety do kontaktu z ogniwem i wykonaj wgłębienie na jego powierzchni. Przepuść kilka nanoamperów prądu depolaryzującego przez kilka sekund. Na komórce utworzy się mały kryształ oka barwnikowego, aby potwierdzić, że komórka została oznaczona.

Na krótko otwórz migawkę, aby oświetlić pole światłem fluorescencyjnym. Jeśli treść komórki wykazuje oznaki etykietowania, przyłóż prąd jeszcze przez kilka sekund. Następnie wyłącz prąd i szybko odciągnij zarodek od mikropipety za pomocą elementów sterujących stolikiem.

Jeśli nie było widocznego oznaczenia w kształcie litery D, mikropipeta mogła być zablokowana i wymagać wymiany. Jeśli końcówka pipety zaczepi się o inne tkanki u nasady komórki i zaplami, spróbuj nieznacznie wyjąć mikropipetę i ponownie podejść do komórki, zanim w razie potrzeby wymienisz mikropipetę. Kontynuuj znakowanie innych komórek w tym samym zarodku lub w innych zarodkach na tym samym szkiełku.

Przesuń końcówkę do krawędzi pola view i powtórz procedurę. Usunąć większą część roztworu z komory iniekcyjnej. Następnie utrwal zarodki, dodając 7,4% formaldehydu PBS przez 10 minut, a następnie cztery przepłuczenia PBS.

Preparat można teraz przekonwertować na zdjęcia lub zamontować w mikroskopii konfokalnej przy użyciu opisanego protokołu. Wypełniony dai inter neuron został bezbłędnie przekonwertowany na zdjęcia pod optyką DIC. Kontekst przestrzenny znakowanej komórki w obrębie nieznakowanej otaczającej tkanki był dobrze rozwiązany

Na przykład pozycje ciała komórki w korze mózgowej i projekcji włókien w pigułce neurologicznej można było zobaczyć w tym preparacie. Kropla barwnika była trochę za duża. Kilka sąsiednich komórek zostało oznaczonych jednocześnie, co utrudnia powiązanie poszczególnych projekcji z różnymi ciałami komórek.

Zauważ również, że pod mikroskopem fluorescencyjnym rozdzielczość tła jest znacznie niższa bez konwersji zdjęć. W tym preparacie można również wstrzyknąć wiele komórek w sąsiednich segmentach, przeciwciało przeciwko szybkim dwóm plamom fal w pigułce neurologicznej. Pomimo przezroczystych ciał komórkowych, preparat wykazuje możliwy efekt uboczny w postaci wydłużonych okresów fotokonwersji.

Bardziej intensywnie znakowane komórki mają tendencję do przebarwień i zaczynają pęcznieć w porównaniu do znakowania pojedynczej komórki za pomocą optyki konfokalnej. Znakowanie oczu barwnikowych w zarodkach, które zawierają konstrukty reporterowe GFP, może zapewnić kontekst przestrzenny i tożsamość komórki wypełnionej D w określonych populacjach typów komórek neuronalnych lub glejowych GFP dodatnich. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować i wykonać znakowanie pojedynczych neuronów w embrionalnym OUN po oph.

Ale próbując tej procedury, pamiętaj, że każdy krok jest wymagający, więc spodziewaj się kilku powtórzeń, aż cała procedura przebiegnie płynnie.