Name: Znakowanie pojedynczych komórek w ośrodkowym układzie nerwowym Drosophila melanogaster (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Poznaj technikę znakowania pojedynczych neuronów w ośrodkowym układzie nerwowym embriogenetycznych Drosophila melanogaster. Metoda umożliwia analizę morfologii komórek nerwowych przy użyciu mikroskopii konfokalnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez dotację z DFG dla G.M.T.

<ol><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Broadie, K., Sink, H., Van Vactor, D., Fambrough, D., Whitington, P. M., Bate, M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+growth+cone+to+synapse%3A+the+life+history+of+the+RP3+motor+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Suppl%22%5BJournal%5D)">From growth cone to synapse: the life history of the RP3 motor neuron.</a> Dev. Suppl. , 227-238 (1993).</li>
<li>Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCampos-Ortega%2C+J+%22The+Embryonic+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Embryonic Development of Drosophila melanogaster</a>. , Springer. Berlin. (1985).</li>
<li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harvesting+and+Preparing+Drosophila+Embryos+for+Electrophysiological+Recording+and+Other+Procedures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures.</a> J. Vis. Exp. (27), e1347(2009).</li>
<li>Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+growth+cone+guidance+in+Drosophila%3A+fasciclin+II+functions+as+a+neuronal+recognition+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule.</a> Cell. 67, 45-57 (1991).</li>
<li>Kunz, T., Kraft, K. F., Technau, G. M., Urbach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+of+Drosophila+mushroom+body+neuroblasts+and+generation+of+divergent+embryonic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Origin of Drosophila mushroom body neuroblasts and generation of divergent embryonic lineages.</a> Development. 139, 2510-2522 (2012).</li>
<li>Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+half+century+of+experimental+neuroanatomical+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">A half century of experimental neuroanatomical tracing.</a> J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li>
<li>Levick, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Another+tungsten+microelectrode%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Biol.+Eng%22%5BJournal%5D)">Another tungsten microelectrode.</a> Med. Biol. Eng. 10, 510-515 (1972).</li>
<li>Matthes, D. J., Sink, H., Kolodkin, A. L., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semaphorin+II+can+function+as+a+selective+inhibitor+of+specific+synaptic+arborizations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Semaphorin II can function as a selective inhibitor of specific synaptic arborizations.</a> Cell. 81, 631-639 (1995).</li>
<li>Murray, M. J., Whitington, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+roundabout+on+growth+cone+dynamics%2C+filopodial+length%2C+and+growth+cone+morphology+at+the+midline+and+throughout+the+neuropile%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Effects of roundabout on growth cone dynamics, filopodial length, and growth cone morphology at the midline and throughout the neuropile.</a> Journal of Neuroscience. 19, 7901-7912 (1999).</li>
<li>Murray, M. J., Merritt, D. J., Brand, A. H., Whitington, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dynamics+of+axon+pathfinding+in+the+Drosophilia+CNS%3A+a+time-lapse+study+of+an+identified+motorneuron%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">In vivo dynamics of axon pathfinding in the Drosophilia CNS: a time-lapse study of an identified motorneuron.</a> J. Neurobiol. 37, 607-621 (1998).</li>
<li>Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+and+other+cell+types+in+whole-mount+Drosophila+embryos+and+larvae+using+antibody+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes.</a> Methods Cell Biol. 44, 445-487 (1994).</li>
<li>Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -L., Whitington, P. M., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+characterization+of+the+entire+interneuron+population+reveals+principles+of+neuromere+organization+in+the+ventral+nerve+cord+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Morphological characterization of the entire interneuron population reveals principles of neuromere organization in the ventral nerve cord of Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 31, 15870-15883 (2011).</li>
<li>Thomas, J. B., Bastiani, M. J., Bate, M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+grasshopper+to+Drosophila%3A+a+common+plan+for+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">From grasshopper to Drosophila: a common plan for neuronal development.</a> Nature. 310, 203-207 (1984).</li>
<li>Whitington, P., Harris, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+axonogenesis+in+the+embryo+of+a+primitive+insect%2C+the+silverfish+Ctenolepisma+longicaudata%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Genes+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Early axonogenesis in the embryo of a primitive insect, the silverfish Ctenolepisma longicaudata.</a> Development Genes and Evolution. 205 (5-6), 272-281 (1996).</li>
<li>Whitington, P., Meier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmentation%2C+neurogenesis+and+formation+of+early+axonal+pathways+in+the+centipede%2C+Ethmostigmus+rubripes+%28Brandt%29%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Genes+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Segmentation, neurogenesis and formation of early axonal pathways in the centipede, Ethmostigmus rubripes (Brandt).</a> Development Genes and Evolution. 199, 349-363 (1991).</li>
<li>Whitington, P. M., Seifert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+growth+from+limb+motorneurons+in+the+locust+embryo%3A+the+effect+of+target+limb+removal+on+the+pattern+of+axon+branching+in+the+periphery%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Axon growth from limb motorneurons in the locust embryo: the effect of target limb removal on the pattern of axon branching in the periphery.</a> Developmental Biology. 106, 438-449 (1984).</li>
<li>Whitington, P. M., Leach, D., Sandeman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+change+in+neural+development+within+the+arthropods%3A+axonogenesis+in+the+embryos+of+two+crustaceans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Evolutionary change in neural development within the arthropods: axonogenesis in the embryos of two crustaceans.</a> Development. 118, 449-461 (1993).</li>
<li>Williams, D. W., Tyrer, M., Shepherd, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+and+tau+reporters+disrupt+central+projections+of+sensory+neurons+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Tau and tau reporters disrupt central projections of sensory neurons in Drosophila.</a> J. Comp. Neurol. 428, 630-640 (2000).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Jedną z głównych zalet Drosophila jako systemu modelowego jest to, że umożliwia analizę rozwoju i funkcji na poziomie pojedynczych komórek. Jest to szczególnie pomocne w przypadku układu nerwowego, w którym różnorodność typów komórek jest wyjątkowo duża, a funkcja i morfologia sąsiednich komórek może być zupełnie inna.
Metoda, którą tutaj prezentujemy, pozwala na znakowanie pojedynczych neuronów barwnikiem, który może być albo przekształcony w trwałe barwnik, albo badany bezpośrednio ...

Znajomość morfologii neuronów na poziomie pojedynczych komórek jest kluczowym warunkiem wstępnym do zrozumienia połączeń neuronalnych i funkcji OUN. Tak więc od najwcześniejszych dni neuronauki naukowcy starali się opracować techniki znakowania pojedynczych komórek (patrz 7, aby zapoznać się z historycznym omówieniem tego problemu). Klasyczne metody, takie jak barwienie Golgiego, zapewniają doskonałą rozdzielczość morfologii neuronów, ale nie są odpowiednie, jeśli ktoś stara się oznaczyć określony typ neuronu w ukierunkowany sposób, ponieważ barwienie zachodzi w sposób losowy. Opracowanie metod barwienia pojedynczych komórek poprzez wewnątrzkomórkowe lub zbliżeniowokomórkowe wstrzykiwanie barwników z mikroelektrody było odpowiedzią na wymóg specyficznego znakowania.
Zastosowanie iniekcji barwnika z pojedynczym neuronem do Drosophila stanowiło duże wyzwanie, ze względu na mały rozmiar zarówno organizmu, jak i jego neuronów. Niemniej jednak, barwienie pojedynczych neuronów embrionalnych Drosophila zostało osiągnięte w połowie lat 80. w laboratorium Coreya Goodmana. Chociaż metoda ta okazała się niezwykle przydatna i dostarczyła kilku kluczowych informacji na temat mechanizmów rozwoju neuronów u Drosophila w ciągu ostatnich 20-30 lat (np. 2, 10), wielu pracowników unikało jej, głównie ze względu na jej wymagania techniczne.
Dostępność w ostatnich latach technik genetycznych do znakowania neuronów u Drosophila również przyczyniła się do niepopularności iniekcji barwnika z pojedynczym neuronem. Ukierunkowana na GAL4 ekspresja konstruktów GFP ukierunkowanych na błonę może zapewnić doskonałą rozdzielczość morfologii neuronalnej 1, 20. Jednak ta metoda ma pewne ograniczenia: często nieunikniona ekspresja GFP w wielu komórkach może przesłaniać strukturę poszczególnych neuronów, a linia sterująca GAL4 może nie być dostępna, aby sterować ekspresją w konkretnym neuronie będącym przedmiotem zainteresowania. Metoda MARCM (Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker) 8 może zapewnić znakowanie zasadniczo każdego neuronu na poziomie pojedynczej komórki, ale nie może być z powodzeniem stosowana w zarodku i wczesnej larwie ze względu na powolny obrót białka GAL80.
Biorąc pod uwagę te ograniczenia genetycznego znakowania, uważamy, że wstrzyknięcie pojedynczego barwnika z neuronu do zarodka Drosophila pozostaje wartościową techniką i zasługuje na szersze zastosowanie. Aby promować ten cel, podajemy tutaj szczegółowy opis metody. Ilustracją jego mocy jest nasze niedawne badanie morfologii kompletnego zestawu interneuronów w neuromerach brzusznych późnego zarodka Drosophila 14. To badanie, które ujawniło zarówno zmienność morfologiczną poszczególnych typów komórek nerwowych, jak i zasady organizacji neuromerów w OUN zarodka, nie byłoby możliwe przy użyciu żadnej innej obecnie dostępnej metody znakowania.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;ODCZNIKI&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>DAB</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5905" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>&lt;a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5905" target="_blank"&gt;D-5905&lt;/a&gt;</td><td>2-3 mg/ml w 100 mM TRIS-Hcl, pH 7.4</td></tr><tr><td>DiI</td><td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/D282" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Invitrogen/Molecular Probes</a></td><td>&lt;a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/D282" target="_blank"&gt;D-282&lt;/a&gt;</td><td>1 mg/ml w etanolu</td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.merckmillipore.com/germany/chemicals/formaldehydl&amp;#8211;sung-min-37-prozent/MDA_CHEM-104002/p_Wt6b.s1L6pAAAAEWp&amp;#8211;fVhTl" target="_blank"&gt;Formaldehyd&lt;/a&gt;</td><td>Merck Millipore</td><td></td><td>7,4 % w PBS</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td><a href="http://www.carlroth.com/catalogue/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> &lt;a href="http://www.carlroth.com/catalogue/" target="_blank"&gt;Roth&lt;/a&gt;</a></td><td>3783</td><td>70% w PBS</td></tr><tr><td>Klej heptanowy</td><td>Beiersdorf AG</td><td>Cello 31-39-30 *</td><td>rozcieńczyć ok. 1:1 n-Heptanem</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>1x</td></tr><tr><td>TRIS</td><td><a href="http://www.carlroth.com/catalogue/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> &lt;a href="http://www.carlroth.com/catalogue/" target="_blank"&gt;Roth&lt;/a&gt;</a></td><td>4855</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td><a href="http://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=427" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Vector Laboratories</a></td><td>&lt;a href="http://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=427" target="_blank"&gt;H1000&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;SPRZĘT&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Leica</td><td>TCS SP2</td><td>do obserwacji i dokumentowania znakowań w fluorescencji</td></tr><tr><td>Wzmacniacz DC</td><td>Dragan Corporation</td><td>Cornerstone ION-100</td><td>do przeprowadzania znakowań</td></tr><tr><td>Kryszalki</td><td><a href="http://www.menzel.de/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> &lt;a href="http://www.menzel.de/" target="_blank"&gt;Menzel&lt;/a&gt;</a></td><td>BB018018A1</td><td>18 x 18 mm</td></tr><tr><td>Kryszalki</td><td><a href="http://www.menzel.de/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> &lt;a href="http://www.menzel.de/" target="_blank"&gt;Menzel&lt;/a&gt;</a></td><td>BB024060A1</td><td>24 x 60 mm</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica</td><td>MZ8</td><td>do przygotowania i sekcji embrionów</td></tr><tr><td>Kapilary płaskie</td><td><a href="http://www.hilgenberg-gmbh.de/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> &lt;a href="http://www.hilgenberg-gmbh.de/" target="_blank"&gt;Hilgenberg&lt;/a&gt;</a></td><td></td><td>średnica zewnętrzna 1 mm; grubość szkła 0.1 mm</td></tr><tr><td>Kapilary do iniekcji</td><td>Science Products</td><td>GB 100 TF 8P</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator R</td><td>Leica</td><td></td><td>do przeprowadzania znakowań</td></tr><tr><td>Model P-97</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td>do wyciągania kapilar</td></tr><tr><td>Szkiełka przedmiotowe</td><td><a href="http://www.marienfeld-superior.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> &lt;a href="http://www.marienfeld-superior.com/" target="_blank"&gt;Marienfeld Superior&lt;/a&gt;</a></td><td>1000000</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop naukowy</td><td>Zeiss</td><td>Axioskop 2 mot</td><td>do obserwacji znakowań po fotokonwersji</td></tr><tr><td>Mikroskop naukowy</td><td>Olympus</td><td>BX50</td><td>do przeprowadzania znakowań</td></tr><tr><td>Kamera wideo Sony MC3255</td><td>Sony/AVT Horn</td><td>Sony MC3255</td><td>do rejestrowania znakowań po fotokonwersji</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class="jove_content"&gt;&lt;strong&gt;Tabela 1.&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

znakowanie pojedynczych komórek w ośrodkowym układzie nerwowym drosophila melanogaster

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

W tym artykule opisujemy, jak indywidualnie oznaczyć neurony w embrionalnym OUN Drosophila melanogaster poprzez zestawienie komórkowe lipofilowego markera fluorescencyjnego DiI. Metoda ta pozwala na bardzo szczegółową wizualizację morfologii komórek neuronalnych. Możliwe jest oznaczenie dowolnej komórki w OUN: ciała komórkowe docelowych neuronów są wizualizowane pod optyką DIC lub przez ekspresję fluorescencyjnego markera genetycznego, takiego jak GFP. Po znakowaniu DiI można przekształcić w trwałą brązową plamę przez fotokonwersję, aby umożliwić wizualizację morfologii komórki za pomocą światła przechodzącego i optyki DIC. Alternatywnie, komórki znakowane DiI można obserwować bezpośrednio za pomocą mikroskopii konfokalnej, co umożliwia kolokalizację genetycznie wprowadzonych fluorescencyjnych białek reporterowych. Technika ta może być stosowana u każdego zwierzęcia, niezależnie od genotypu, umożliwiając analizę zmutowanych fenotypów w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Rycina 4 przedstawia typowe wyniki opisanej tutaj techniki. Rycina 4A pokazuje przykład pojedynczego interneuronu wypełnionego barwnikiem DiI, który został prawidłowo poddany fotokonwersji. Doskonale obrazuje to poziom szczegółowości, jaki oferują takie preparaty. Podczas obserwacji w optyce DIC widoczny staje się kontekst przestrzenny znakowanej komórki w obrębie nieznakowanej tkanki otaczającej, np. położenie ciała komórki w korze oraz projekcji włókien w neuropilu.
<p cla...

Prezentujemy technikę oznaczania pojedynczych neuronów w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) zarodków Drosophila, która pozwala na analizę morfologii neuronów za pomocą światła przechodzącego lub mikroskopii konfokalnej.

Znakowanie pojedynczych komórek w ośrodkowym układzie nerwowym Drosophila melanogaster

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Ogólnym celem tej procedury jest znakowanie pojedynczych neuronów w ośrodkowym układzie nerwowym zarodków drosophila we wczesnym stadium 17. Osiąga się to poprzez zbieranie jaj i pozwalanie im rozwijać się do odpowiedniego etapu. Drugim krokiem procedury jest ręczne chlorowanie i wyrównanie jaj.Po tej divie kolonizacja i filetowanie zarodków sprawia, że rdzeń nerwowy staje się dostępny. Ostatnim krokiem jest znakowanie pojedynczych komórek za pomocą Iono retic aplikacji lipofilowego oka matrycowego. Ostatecznie wyniki pozwalają na wizualizację morfologii pojedynczego neuronu, jeśli jest to pożądane w kontekście znanych wzorców ekspresji GFP i/lub na tle zmutowanych.Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami znakowania pojedynczych komórek, takimi jak markum, jest to, że działa ona w zarodku i pozwala na celową wizualizację zidentyfikowanych komórek. Wizualna demonstracja tej metody jest niezwykle pomocna, ponieważ wiele kroków jest delikatnych, a przez to trudnych do nauczenia. Pozwól zdrowym muchom złożyć zarodki na płytkach agarowych.Wymieniaj płytkę co półtorej godziny w temperaturze 25 stopni Celsjusza i zachowaj zarodki. Inkubuj zarodki na ich płytkach w temperaturze 25 lub 18 stopni Celsjusza, aż osiągną wymagany etap rozwoju. Gdy będą gotowe, przenieś zarodki na szkiełko pokryte dwustronną taśmą klejącą.Unikaj przenoszenia agaru z zarodkami, ponieważ zakłóci to ich przyleganie do taśmy. Na taśmie. Poczekaj, aby zarodki wyschły przez pięć do 10 minut.Pokryj szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 milimetry na 60 milimetrów klejem heptanowym. Umieść małą kroplę kleju na środku szkiełka i rozprowadź ją na bardzo cienkiej folii za pomocą 18-milimetrowego kwadratowego szkiełka nakrywkowego. Po wyschnięciu zarodków delikatnie dotknij ich igłą.Żyłka pęknie, a zarodek przyklei się do igły. Natychmiast przenieś odchlorowane zarodki do bloku agarowego, aby zapobiec ich wysuszeniu. Ustaw je tam 10 w rzędzie, brzuszną stroną do góry.Odetnij nadmiar agaru z bloku skalpelem. Następnie delikatnie dotknij zarodków szkiełkiem nakrywkowym pokrytym klejem heptanowym. Powinny przylegać do szkiełka nakrywkowego brzuszną stroną do dołu.Nałóż ramkę taśmy samoprzylepnej na szkiełko nakrywkowe i przymocuj je do szkiełka mikroskopowego. Utrzymywanie zarodków na wierzchu szkiełka nakrywkowego. Przykryj zarodki dużą ilością PBS po grzbietowej stronie każdego zarodka w pobliżu jego tylnego końca.Przeniknij przez błonę witelową szklaną igłą, rozerwij błonę wzdłuż grzbietowej linii środkowej i wyciągnij zarodek z błony. Teraz zmień orientację zarodka brzuszną stroną w dół w innym miejscu na podłożu kleju heptanu. Wypełnij zarodek szklaną igłą, delikatnie perforując ścianę ciała i rozrywając wzdłuż grzbietowej linii środkowej.Za pomocą igły dociśnij ściankę korpusu tak, aby przykleiła się do szkiełka. Rozerwij jelito na jego przednim i tylnym końcu i podnieś jelito. Ponieważ kilka zarodków zostanie zsegregowanych na tym samym szkiełku, pomocne jest albo bardzo dokładne określenie ich orientacji, albo wykonanie rysunku ich orientacji.Następnie zarodki można lekko utrwalić przez 10 do 15 minut w 7,4% formaldehydzie w PBS, a następnie cztery płukania w PBS, należy zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć dotykania zarodków powierzchnią roztworu. Siły napięcia powierzchniowego zniszczą je pod obiektywem 10x. Wyśrodkuj pole widzenia na przygotowanym zarodku, zwiększ powiększenie i zlokalizuj interesującą nas komórkę pod optyką DIC lub pod fluorescencją.Jeśli komórka docelowa wykazuje ekspresję GFP, należy upewnić się, że membrana polowa mikroskopu jest otwarta tylko do krawędzi pola widzenia, nie poza wąskie oświetlenie. Wiązka pomoże w ustawieniu mikropipety, zmień ją z powrotem na obiektyw 10 x i umieść elektrodę kąpielową wzmacniacza prądu stałego w roztworze z dala od zarodka i ścieżki mikropipety. Zamontuj mikropipetę iniekcyjną wypełnioną roztworem chlorku litu do uchwytu i przymocuj ją do mikromanipulatora.Korzystając z kontrolek kursu, umieść mikropipetę poniżej obiektywu i znacznie powyżej zarodka. Jeśli kąt mikro peppe jest zbyt stromy, końcówka nie będzie ostra. Jeśli jest zbyt płytki, trzon będzie przylegał do ściany wanny, wyśrodkować końcówkę w polu view.Teraz opuść mikropipetę i skup się naprzemiennie, aż pipeta znajdzie się w PBS i nie za daleko nad zarodkiem. Teraz zmień na obiektyw o dużej mocy i wyśrodkuj pipetę w polu view. Gdy trzon jest w ostrości, przesuń mikropipetę w osi X, aż jej końcówka znajdzie się w środku pola widzenia.Końcówka mikropipety powinna znajdować się znacznie powyżej poziomu zarodka. Przełącz się na oświetlenie fluorescencyjne i sprawdź końcówkę. Sprawdź, czy nie ma wycieku z oka barwnika.Dostosuj prąd DC tak, aby kryształ barwnika nie gromadził się na końcówce. Teraz opuść mikropipetę w osi Z w kierunku zarodka. Stopniowe dostosowywanie ostrości w miarę ustawiania ostrości na zarodku.Przełącz się na korzystanie z precyzyjnej kontroli. Skoncentruj celę, która ma zostać wstrzyknięta, na środku pola, a następnie ponownie ustaw ostrość na końcówce mikropipety. Od tego momentu wygodniej może być korzystanie z kontroli stopnia mikroskopu w celu przesunięcia zarodka względem mikropipety.Doprowadź końcówkę mikropipety do kontaktu z ogniwem i wykonaj wgłębienie na jego powierzchni. Przepuść kilka nanoamperów prądu depolaryzującego przez kilka sekund. Na komórce utworzy się mały kryształ oka barwnikowego, aby potwierdzić, że komórka została oznaczona.Na krótko otwórz migawkę, aby oświetlić pole światłem fluorescencyjnym. Jeśli treść komórki wykazuje oznaki etykietowania, przyłóż prąd jeszcze przez kilka sekund. Następnie wyłącz prąd i szybko odciągnij zarodek od mikropipety za pomocą elementów sterujących stolikiem.Jeśli nie było widocznego oznaczenia w kształcie litery D, mikropipeta mogła być zablokowana i wymagać wymiany. Jeśli końcówka pipety zaczepi się o inne tkanki u nasady komórki i zaplami, spróbuj nieznacznie wyjąć mikropipetę i ponownie podejść do komórki, zanim w razie potrzeby wymienisz mikropipetę. Kontynuuj znakowanie innych komórek w tym samym zarodku lub w innych zarodkach na tym samym szkiełku.Przesuń końcówkę do krawędzi pola view i powtórz procedurę. Usunąć większą część roztworu z komory iniekcyjnej. Następnie utrwal zarodki, dodając 7,4% formaldehydu PBS przez 10 minut, a następnie cztery przepłuczenia PBS.Preparat można teraz przekonwertować na zdjęcia lub zamontować w mikroskopii konfokalnej przy użyciu opisanego protokołu. Wypełniony dai inter neuron został bezbłędnie przekonwertowany na zdjęcia pod optyką DIC. Kontekst przestrzenny znakowanej komórki w obrębie nieznakowanej otaczającej tkanki był dobrze rozwiązany.Na przykład pozycje ciała komórki w korze mózgowej i projekcji włókien w pigułce neurologicznej można było zobaczyć w tym preparacie. Kropla barwnika była trochę za duża. Kilka sąsiednich komórek zostało oznaczonych jednocześnie, co utrudnia powiązanie poszczególnych projekcji z różnymi ciałami komórek.Zauważ również, że pod mikroskopem fluorescencyjnym rozdzielczość tła jest znacznie niższa bez konwersji zdjęć. W tym preparacie można również wstrzyknąć wiele komórek w sąsiednich segmentach, przeciwciało przeciwko szybkim dwóm plamom fal w pigułce neurologicznej. Pomimo przezroczystych ciał komórkowych, preparat wykazuje możliwy efekt uboczny w postaci wydłużonych okresów fotokonwersji.Bardziej intensywnie znakowane komórki mają tendencję do przebarwień i zaczynają pęcznieć w porównaniu do znakowania pojedynczej komórki za pomocą optyki konfokalnej. Znakowanie oczu barwnikowych w zarodkach, które zawierają konstrukty reporterowe GFP, może zapewnić kontekst przestrzenny i tożsamość komórki wypełnionej D w określonych populacjach typów komórek neuronalnych lub glejowych GFP dodatnich. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować i wykonać znakowanie pojedynczych neuronów w embrionalnym OUN po oph.Ale próbując tej procedury, pamiętaj, że każdy krok jest wymagający, więc spodziewaj się kilku powtórzeń, aż cała procedura przebiegnie płynnie.

labeling-single-cells-central-nervous-system-drosophila

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Oznaczanie pojedynczych komórek w ośrodkowym układzie nerwowym Drosophila melanogaster

W tym artykule pokazujemy, jak wnikliwie ośrodkowego układu nerwowego z państw larw Drosophila stadium.

Dissection z larw CNS na Drosophila melanogaster

Opisujemy procedurę przygotowania zarodków Drosophila na różnych etapach rozwoju w celu wizualizacji embrionalnego układu nerwowego podczas embriogenezy.

Wizualizacja embrionalnego układu nerwowego w całych zarodkach Drosophila

Aby zrozumieć, w jaki sposób podczas rozwoju kształtowane są złożone formy komórek, takie jak dendryty neuronalne, kluczowa jest możliwość dokładnego badania organizacji mikrotubul. W niniejszej pracy opisujemy niezawodną metodę znakowania immunohistologicznego służącą do badania organizacji mikrotubul w dendrytach neuronów czuciowych o rozgałęzionym drzewku dendrytycznym, w tchawce, mięśniach oraz innych tkankach ściany ciała larwy Drosophila.

Immunohistochemiczne znakowanie mikrotubul w dendrytach neuronów sensorycznych, tchawkach i mięśniach ściany ciała larwy Drosophila

Ten film demonstruje barwienie immunofluorescencyjne transgenicznego mózgu Drosophila do obrazowania pojedynczych komórek glejowych. Mózg wykazuje ekspresję białek ukierunkowanych na błonę, połączonych z różnymi kombinacjami epitopów antygenowych pod kontrolą specyficznego dla gleju systemu rekombinazy. Wyizolowane i utrwalone mózgi są barwione pierwszorzędowymi przeciwciałami specyficznymi dla epitopów antygenowych, a następnie przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem.

Barwienie immunofluorescencyjne mózgów Drosophila do obrazowania pojedynczych komórek glejowych

Źródło: Inal, M. A. et. al., wsteczne śledzenie embrionalnych neuronów ruchowych Drosophila przy użyciu lipofilowych barwników fluorescencyjnych. J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje metodę wstecznego znakowania neuronów ruchowych Drosophila za pomocą barwników lipofilowych. Barwnik dostaje się do aksonu, przemieszcza się wstecz i oznacza neurony na zielono, umożliwiając szczegółową wizualizację ich morfologii i projekcji pod mikroskopem konfokalnym.

Wsteczne znakowanie neuronów ruchowych Drosophila za pomocą fluorescencyjnych barwników lipofilowych

Ten protokół szczegółowo opisuje uproszczoną metodę używaną do przeprowadzania obrazowania żywych komórek w kontekście nienaruszonego mózgu larwy. Metody obrazowania żywych komórek są nieocenione w badaniu asymetrycznych podziałów nerwowych komórek macierzystych, a także innych procesów neurogennych i rozwojowych, konsekwentnie odkrywając mechanizmy, które wcześniej były pomijane.

Obrazowanie na żywo neuroblastów larw Drosophila

Ten protokół opisuje sekcję i barwienie immunologiczne tkanek mózgowych dorosłych Drosophila melanogaster. W szczególności protokół ten podkreśla wykorzystanie ciała grzyba Drosophila i neuronów fotoreceptorowych jako przykładowych podzbiorów neuronów, które można dokładnie wykorzystać do odkrycia ogólnych zasad leżących u podstaw wielu aspektów rozwoju neuronów.

Rozwarstwienie i barwienie immunofluorescencyjne neuronów ciała grzyba i fotoreceptorów w mózgach dorosłych Drosophila melanogaster

Komórki mają różne morfologie i nawiązują różnorodne interakcje ze swoimi sąsiadami. Protokół ten opisuje, w jaki sposób ujawnić morfologię pojedynczych komórek i zbadać interakcję komórka-komórka przy użyciu dobrze znanego systemu ekspresji Gal4 / UAS.

Zastosowanie techniki MultiColor FlpOut do badania wysokorozdzielczych morfologii pojedynczych komórek i interakcji komórkowych gleju u Drosophila

Ten protokół opisuje metodę rejestrowania malejącej aktywności elektrycznej ośrodkowego układu nerwowego Drosophila melanogaster, aby umożliwić ekonomiczne i wygodne testowanie środków farmakologicznych, mutacji genetycznych białek nerwowych i/lub roli niezbadanych ścieżek fizjologicznych.

Elektrofizjologiczny zapis aktywności ośrodkowego układu nerwowego Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym

Analiza cyklu komórkowego za pomocą znakowania 5-etynylo-2'-deoksyurydyny (EdU) i fosfohistonu H3 (pH3) jest wieloetapową procedurą, która może wymagać rozległej optymalizacji. Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół, który opisuje wszystkie etapy tej procedury, w tym analizę obrazu i kwantyfikację w celu rozróżnienia komórek w różnych fazach cyklu komórkowego.

Protokół podwójnego znakowania 5-etynylo-2'-deoksyurydyny/fosfohistonu H3 do analizy progresji cyklu komórkowego w nerwowych komórkach macierzystych Drosophila

Artykuł opisuje efektywny protokół rozwarstwiania dysku wyobrażalnego i barwienia przeciwciał, który jest ekonomiczny pod względem odczynników i ułatwia obsługę dysków wyobrażających w małych ilościach.

Małoskalowe rozwarstwienie i barwienie przeciwciał na dyskach wyimaginowanych oczno-czułowych i skrzydłowych Drosophila melanogaster

Poznaj technikę znakowania pojedynczych neuronów w ośrodkowym układzie nerwowym embriogenetycznych Drosophila melanogaster. Metoda umożliwia analizę morfologii komórek nerwowych przy użyciu mikroskopii konfokalnej.

Znakowanie pojedynczych komórek w ośrodkowym układzie nerwowym Drosophila melanogaster

Przeglądaj więcej filmów