Obrazowanie na żywo apoptotycznego usuwania komórek podczas embriogenezy Drosophila

Ogólnym celem tej procedury jest śledzenie dynamiki apoptotycznego klirensu komórek w zarodku Drosophila. Osiąga się to za pomocą transgenicznych much zawierających cytoplazmatyczny marker GFP, który oznacza populacje komórek fagocytarnych zarodki markerem Simio GFP, są zbierane, myte i powlekane. Następnie zarodki są umieszczane do wstrzyknięcia, a następnie monitorowane jest ośrodkowy układ nerwowy.

Trzecim krokiem jest znakowanie komórek apoptotycznych poprzez wstrzyknięcie zarodkom specyficznych markerów fagocytozy apoptozy, takich jak X na pięć, ostatnim krokiem jest wykonanie poklatkowych zapisów zarodkowego OUN za pomocą mikroskopii konfokalnej. Ostatecznie wyniki mogą pokazać lokalizację i zachowanie komórek apoptotycznych i fagocytów podczas różnych etapów apoptotycznego usuwania komórek za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak immunohistochemia na utrwalonych zarodkach, jest to, że możemy śledzić dynamikę apoptotycznego usuwania komórek.

Apoptotyczny klirens komórek jest wysoce dynamicznym procesem składającym się z różnych etapów. Ta technika pozwala nam śledzić różne kroki przy użyciu specyficznych markerów dla komórek apoptozy i fagocytów. Protokół rozpoczyna się od wykonania kleju z konwencjonalnych odczynników, rozwinięcia taśmy dwustronnej, a następnie zwinięcia jej z powrotem, aby zmieściła się w fiolce scyntylacyjnej.

Napełnij fiolkę heptanem i zamknij ją paramem. Następnie przymocuj fiolkę do tarki orzechowej i delikatnie kołysz nią przez 24 godziny. W temperaturze pokojowej następnego dnia przygotowany klej przenosi się do nowej fiolki.

Użyj szklanej pipety PE, aby przenieść przygotowany klej do nowego pliku. Po przygotowaniu użyj końcówki pipety, aby nałożyć klej na szkiełka nakrywkowe. Rozprowadź kroplę kleju heptanowego w linii biegnącej pośrodku szkiełka nakrywkowego.

Pozwól klejowi spróbować przez kilka sekund. Szkiełka nakrywkowe można następnie przechowywać w temperaturze pokojowej w zamkniętym pudełku do miesiąca po znieczuleniu much dwutlenkiem węgla Zbierz około 400 much w pojemniku zbiorczym z podgrzanym sokiem winogronowym, talerzem do układania wymienionym w 25 stopniach Celsjusza na dwie godziny. Zbierz talerz do układania soku winogronowego i przykryj pojemnik nowym talerzem, aby muchy były szczęśliwe.

Pobrana płytka zawiera zarodki w wieku od zera do dwóch godzin. Umieść zebraną płytkę do układania soku winogronowego z zarodkami do inkubatora o temperaturze 25 stopni Celsjusza, aż osiągną pożądany punkt czasowy rozwoju. W tym przykładzie zarodki są inkubowane od 10 do 12 godzin, więc rozwijają się do stadium 15 lub 16 po rozwinięciu.

Użyj wody z kranu i czystego pędzla, aby przenieść zarodki z płytki do komórki. Sitko. Sitko należy przechowywać nad pojemnikiem, aby można było odzyskać wszelkie rozlane zarodki. Opłucz zebrane zarodki, aż cała pasta drożdżowa zostanie usunięta.

Następnie wysusz nadmiar wody, wycierając zewnętrzną część sitka. Umieść sitko na czystej szalce Petriego, aby usunąć pestkę w wystarczającym stopniu. 50% wybielacza, aby przykryć zarodki w sitku do komórek i odczekaj dwie minuty, mieszając je dwa do trzech razy.

Następnie spłucz zarodki, aż przestaną pachnieć jak wybielacz. Umieść zarodki w pojemniku na komórki na czystej szalce Petriego i zalej je wodą, aby zapobiec ich wyschnięciu. Do wstrzykiwania zarodków.

Igły do wstrzykiwań należy przygotować z wyprzedzeniem za pomocą ściągacza igieł i cienkościennych włókien szklanych. Załaduj jeden mikrolitr żądanego odczynnika do dwóch igieł, z których jedna służy jako kopia zapasowa. Stabilny marker, który nie wybiela się łatwo, taki jak X na pięć, jest dobrym odczynnikiem.

Teraz umieść prostokątny kawałek agaru z sokiem winogronowym pod mikroskopem. Przesuń i przenieś zarodki z sitka do agaru. Używając czystego pędzla pod fluorescencyjnym mikroskopem preparacyjnym, wybierz odpowiednio zarodki do wstrzyknięcia za pomocą markera GFP.

Za pomocą mokrego pędzla przenieś wybrane zarodki do rzędu 10 brzuszną stroną do góry. Ustaw rząd na krawędzi bloku agro. GFP można zaobserwować w ośrodkowym układzie nerwowym zarodka.

Teraz przymocuj zarodki do szkiełka nakrywkowego za pomocą paska kleju heptanowego. Właściwa pozycja zarodków jest bardzo ważna dla powodzenia wstrzyknięcia. Nie spiesz się i upewnij się, że zarodki są dokładnie ustawione we właściwej orientacji.

Następnie umieść szkiełko nakrywkowe w komorze odwadniania na około pięć minut. Po wysuszeniu zarodków przykryj je olejem węglowym Hello 700, aby uniknąć dalszego odwodnienia. Na koniec umieść kroplę wody na szkiełku mikroskopowym.

Następnie umieść wargę zakrywającą z zarodkami na mokrym szkiełku mikroskopowym. Zarodki są teraz gotowe do wstrzyknięcia. Zacznij od przymocowania igły do manipulatora mikrom i pompy pico.

Pompa kontroluje ilość wstrzykiwanej cieczy poprzez wtłaczanie azotu do igły. Pedał nożny steruje bramkowanym wyrzutem azotu pod mikroskopem. Ustawić ostrość na końcówce igły i ustawić ją w pobliżu krawędzi szkiełka nakrywkowego, tak aby końcówka igły i szkiełko nakrywkowe były bardzo ostrożnie.

Przesuwać szkiełko nakrywkowe, aż dotknie końcówki igły i ją złamie. Średnica otworu powinna wynosić od pół do dwóch mikrometrów. Teraz skup się na zarodkach.

Wprowadzić igłę do oleju. Jeśli końcówka igły została prawidłowo złamana, do oleju powinna przedostać się kropla płynu. Po naciśnięciu pedału bez dotykania uchwytu igły, należy przesunąć stolik tak, aby boczna krawędź zarodka została przebita igłą.

Szybko wstrzyknąć kroplę roztworu do zarodka. Odsuń zarodek i przejdź do następnego, aż wszystkie 10 zarodków zostanie wstrzykniętych. Zobrazuj zarodki na odwróconym mikroskopie konfokalnym z obiektywem 40 x lub 100 x.

Szukaj ładnie ustawionego zarodka z OUN pośrodku, wykazującym silną ekspresję GFP i znakowanie komórek apoptotycznych. Aby wykonać nagrania poklatkowe, wybierz pięć lub sześć konfokalnych plasterków, które mają być przyklejone w tych miejscach. Wykonuj skan co 60 sekund w odstępie czasu, w którym wybielanie GFP nie powinno stanowić problemu.

Następnie wykonaj rzut trzech plasterków o grubości sześciu mikronów, aby obserwować całe komórki. W niektórych przypadkach zarodek może zacząć się toczyć w czasie nagrywania wideo. Dlatego monitoruj nagranie, aby nie tracić czasu na poruszanie się zarodków.

Zarodek w stadium 15 prawidłowo umieszczony pokazuje embrionalny OUN pośrodku z dobrze oznaczonym glejem oznaczonym przez g makrofagi M, które w większości znajdują się poza pokazem OUN. Silna cytoplazmatyczna ekspresja GFP. Komórki ektodermalne E są również znakowane cytoplazmatycznym GFP.

Ramki te pokazują komórki apoptotyczne oznaczone ex w pięciu i ektodermie clea oraz makrofagach znakowanych cytuj GFP. Każda klatka jest projekcją trzech plasterków, a każdy plasterek ma grubość dwóch mikronów. Wiele ex na pięć dodatnich komórek znajduje się wewnątrz i na zewnątrz OUN.

Zdarzenie w pudełku pokazuje komórkę glejową pochłaniającą cząstkę apoptozy. Zwróć uwagę na sondujące zachowanie komórki glejowej. Dotyka cząsteczki apoptotycznej kilka razy, zanim zobowiąże się do pochłonięcia komórki apoptotycznej po jej rozwoju.

Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się usuwaniem komórek apoptotycznych w celu zbadania fagocytozy komórek apoptotycznych podczas ich rozwoju. Korzystając z tej techniki, możemy zbadać wysoce dynamiczne zachowanie apoptotycznego klirensu komórek.