Obrazowanie na żywo apoptotycznego usuwania komórek podczas embriogenezy Drosophila
18 sierpnia 2013
Tutaj opisujemy skuteczną metodę badania dynamiki apoptotycznego oczyszczania komórek in vivo. Metoda ta wykorzystuje żywe zarodki Drosophila jako potężny model do monitorowania fagocytozy komórek apoptotycznych przy użyciu specyficznego znakowania komórek apoptotycznych i fagocytów.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest śledzenie dynamiki usuwania apoptotycznych komórek w zarodku drosofilem. Jest to realizowane przy użyciu much transgenicznych zawierających cytoplazmatyczny marker GFP, który znakuje populacje komórek fagocytarnych; zarodki z markerem Simio GFP są zbierane, płukane i powlekane. Następnie zarodki są ustawiane do iniekcji, po czym następuje monitorowanie OUN.
Trzecim krokiem jest znakowanie komórek apoptotycznych poprzez wstrzyknięcie do embrionów specyficznych markerów fagocytozy apoptozy, takich jak X in five; ostatnim krokiem jest wykonanie nagrań time-lapse ośrodkowego układu nerwowego embrionu przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Ostatecznie wyniki mogą wykazać lokalizację i zachowanie komórek apoptotycznych oraz fagocytów podczas różnych etapów usuwania komórek apoptotycznych za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak immunohistochemia na utrwalonych embrionach, jest możliwość śledzenia dynamiki usuwania komórek apoptotycznych.
Usuwanie komórek apoptotycznych jest wysoce dynamicznym procesem obejmującym różnorodne etapy. Technika ta pozwala na śledzenie poszczególnych kroków przy użyciu specyficznych markerów dla komórek apoptotycznych i fagocytów. Protokół rozpoczyna się od przygotowania kleju z konwencjonalnych odczynników – należy rozwinąć dwustronną taśmę klejącą, a następnie zwinąć ją ponownie tak, aby zmieściła się w fiolce scyntylacyjnej.
Napełnij fiolkę heptanem i zamknij ją za pomocą param. Następnie przymocuj fiolkę do rotatora i delikatnie kołysz przez 24 godziny. Następnego dnia, w temperaturze pokojowej, przygotowany klej przenosi się do nowej fiolki.
Za pomocą szklanej pipety przenieś przygotowany klej do nowej probówki. Po przygotowaniu użyj końcówki do pipety, aby nanieść klej na szkiełka nakrywkowe. Rozprowadź kroplę kleju heptanowego w linii wzdłuż środka szkiełka nakrywkowego.
Pozostaw klej do wyschnięcia przez kilka sekund. Przygotowane szkiełka przykrywowe można następnie przechowywać w temperaturze pokojowej w zamkniętym pudełku do jednego miesiąca. Po znieczuleniu much dwutlenkiem węgla, zgromadź około 400 much w pojemniku kolekcjonerskim z podgrzaną płytką do składania jaj z sokiem winogronowym, pozostawionym w temperaturze 25 °C przez dwie godziny. Wyjmij płytkę z sokiem winogronowym i przykryj pojemnik nową płytką, aby zapewnić odpowiednie warunki bytowania much.
Zebrana płytka zawiera embriony w wieku od zero do dwóch godzin. Należy przenieść zebraną płytkę z sokiem z winogron z embrionami do inkubatora w temperaturze 25 stopni Celsius, aż osiągną one pożądany punkt czasowy rozwoju. W tym przykładzie embriony są inkubowane przez okres od 10 do 12 godzin, tak aby po tym czasie osiągnęły stadium 15 lub 16.
Użyj wody z kranu i czystego pędzla, aby przenieść zarodki z płytki do sitka komórkowego. Trzymaj sitko nad pojemnikiem, aby można było odzyskać zarodki, które mogą przez nie wypaść. Płucz zebrane zarodki, aż do całkowitego usunięcia pasty drożdżowej.
Następnie osusz nadmiar wody, wycierając zewnętrzną stronę sitka. Umieść sitko komórkowe w czystej szalce Petriego, aby usunąć chorion. Dolej 50% bleach w ilości wystarczającej do przykrycia embrionów w sitku komórkowym i odczekaj dwie minuty, mieszając je dwa do trzech razy.
Następnie płucz zarodki, aż przestaną pachnieć wybielaczem. Przenieś zarodki z pojemnika na komórki do czystej szalki Petriego i przykryj je wodą, aby zapobiec ich wysychaniu. Do iniekcji zarodków.
Przygotuj wcześniej igły do iniekcji, korzystając z wyciągacza igieł i cienkościennych włókien szklanych. Napełnij dwa igły jednym mikrolitrem pożądanego odczynnika, przy czym jedna igła powinna służyć jako zapasowa. Dobrym odczynnikiem jest stabilny marker, który nie ulega łatwo wymyciu, np. X w five.
Następnie umieść prostokątny fragment agaru z sokiem z winogron na mikroskopie. Przesuń i przenieś embriony z sitka na agar. Używając czystego pędzla pod fluorescencyjnym mikroskopem sekcyjnym, wybierz embriony na odpowiednim etapie rozwoju do iniekcji, posługując się markerem GFP.
Za pomocą wilgotnego pędzla przenieś wybrane embriony, układając je w rzędzie po 10 sztuk, stroną brzuszną do góry. Umieść rząd na krawędzi bloku agarowego. GFP można zaobserwować w ośrodkowym układzie nerwowym embrionu.
Teraz przymocuj zarodki do szkiełka nakrywkowe za pomocą paska kleju heptanowego. Prawidłowe ułożenie zarodków jest kluczowe dla powodzenia iniekcji. Działaj powoli i upewnij się, że zarodki są precyzyjnie wyrównane w odpowiedniej orientacji.
Następnie umieść szkiełko podstawowe w komorze odwadniającej na około pięć minut. Po osuszeniu embrionów pokryj je olejem węglowym Hello carbon oil 700, aby zapobiec dalszemu odwodnieniu. Na koniec nanieś kroplę wody na przedmiotowe szkiełko mikroskopowe.
Następnie połóż krawędź przykrywki z zarodkami skierowaną do góry na wilgotnym szkiełku mikroskopowym. Zarodki są teraz gotowe do iniekcji. Rozpocznij od przymocowania igły do mikromanipulatora i pikopompy.
Pompa kontroluje ilość wstrzykiwanego płynu poprzez tłoczenie azotu do igły. Pedał steruje dozowaniem azotu pod mikroskopem. Należy skupić się na czubku igły i bardzo ostrożnie ustawić go w pobliżu krawędzi szkiełka nakrywki, dbając o to, aby zarówno czubek igły, jak i szkiełko nakrywki znajdowały się w ostrości.
Przesuwaj szkiełko nakrywkowe, aż uderzy ono w końcówkę igły i ją przełamie. Średnica otworu powinna wynosić od 0,5 do 2 µm. Teraz ustaw ostrość na embriony.
Zanurz igłę w oleju. Jeśli końcówka igły została prawidłowo złamana, do oleju powinna wyciekać kropla cieczy. Naciskając pedał bez dotykania uchwytu igły, przesuń stolik tak, aby igła przebiła boczny brzeg embrionu.
Szybko wstrzyknij kroplę roztworu do zarodka. Odsuń zarodek i przejdź do następnego, aż wszystkie 10 zarodków zostanie poddanych iniekcji. Wykonaj obrazowanie zarodków przy użyciu odwróconego mikroskopu konfokalnego z obiektywem 40 x lub 100 x.
Należy wyszukać odpowiednio ustawiony embrion z OUN w centrum, wykazujący silną ekspresję GFP oraz oznakowanie komórek apoptotycznych. Aby wykonać nagrania time-lapse, należy wybrać pięć lub sześć przekrojów konfokalnych w tych lokalizacjach i ustawić dla nich tzw. micron sticks. Skanowanie powinno odbywać się co 60 sekund – przy takim odstępie czasu blaknięcie GFP nie powinno stanowić problemu.
Następnie wykonaj projekcję trzech przekrojów o grubości 6 µm, aby zaobserwować całe komórki. W niektórych przypadkach zarodek może zacząć się obracać w czasie nagrywania wideo. Należy zatem monitorować nagranie, aby nie tracić czasu na poruszające się zarodki.
Prawidłowo ustawiony embrion w stadium 15 wykazuje obecność embrionalnego OUN w środku z wyraźnie znakowaną gleją oznaczoną jako g; makrofagi M, znajdujące się głównie poza OUN, wykazują silną cytoplazmatyczną ekspresję GFP. Komórki ektodermalne E są również znakowane cytoplazmatycznym GFP.
Klatki te przedstawiają komórki apoptotyczne znakowane an ex in five oraz ektodermę i makrofagi znakowane cite GFP. Każda klatka jest projekcją trzech warstw, a każda warstwa ma grubość dwóch mikronów. Wiele komórek wykazujących pozytywny wynik dla an ex in five znajduje się wewnątrz i na zewnątrz OUN.
W ramce przedstawiono zdarzenie, w którym komórka glejowa pochłania cząsteczkę apoptotyczną. Należy zwrócić uwagę na zachowanie badawcze komórki glejowej. Dotyka ona cząsteczki apoptotycznej kilka razy, zanim przystąpi do pochłonięcia komórki apoptotycznej po jej rozwoju.
Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny usuwania komórek apoptotycznych do badania fagocytozy komórek apoptotycznych podczas rozwoju. Dzięki zastosowaniu tej metody możemy badać wysoce dynamiczny przebieg procesu usuwania komórek apoptotycznych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje metodę badania dynamiki usuwania apoptotycznych komórek in vivo z wykorzystaniem embrionów Drosophila. Technika ta umożliwia monitorowanie w czasie rzeczywistym fagocytozy komórek apoptotycznych dzięki specyficznemu znakowaniu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Biologia rozwoju
Wstęp
- Usuwanie apoptotycznych komórek jest kluczowe dla homeostazy tkanek.
- Zarodki Drosophila stanowią efektywny model do badania tego procesu.
- Tradycyjne metody, takie jak immunohistochemia, nie pozwalają na dynamiczną obserwację.
- Techniki obrazowania na żywo mogą dostarczyć informacji na temat oddziaływań komórkowych podczas procesu usuwania.
Cel badania
- Śledzenie dynamiki usuwania komórek apoptotycznych w embrionach Drosophila.
- Wizualizacja zachowania fagocytów i komórek apoptotycznych.
- Pogłębienie zrozumienia mechanizmów uczestniczących w fagocytozie.
Zastosowane metody
- Wykorzystuje się transgeniczne muchówki Drosophila z cytoplazmatycznymi markerami GFP.
- Zarodki są zbierane, płukane i przygotowywane do iniekcji.
- Do zarodków wstrzykuje się specyficzne markery komórek apoptotycznych.
- Przy użyciu mikroskopii konfokalnej wykonuje się nagrania time-lapse ośrodkowego układu nerwowego (CNS) zarodka.
Główne wyniki
- Obrazowanie w czasie rzeczywistym pozwala na ujawnienie lokalizacji komórek apoptotycznych.
- Zachowanie fagocytów może być monitorowane podczas różnych etapów usuwania komórek.
- Metoda ta wykazuje przewagi nad analizą utrwalonych tkanek.
- Wyniki przyczyniają się do lepszego zrozumienia procesów apoptotycznych.
Wnioski
- Opisana metoda umożliwia dynamiczną obserwację usuwania apoptotycznych komórek.
- Obrazowanie na żywo dostarcza informacji, których nie mogą zapewnić metody utrwalania.
- To podejście może usprawnić badania w zakresie biologii komórki i procesów rozwojowych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Obrazowanie na żywo usuwania apoptotycznych komórek w embrionach Drosophila stanowi dynamiczny model do badania mechanizmów fagocytozy istotnych dla walidacji celów w immunologii i onkologii. Metoda ta umożliwia mechanistyczne ograniczanie ryzyka poprzez wizualizację interakcji w czasie rzeczywistym między komórkami apoptotycznymi a fagocytami, co zwiększa wiarygodność przewidywań we wczesnej fazie odkryć. Podejście to pomaga w identyfikacji i priorytetyzacji celów zaangażowanych w szlaki śmierci i usuwania komórek.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie hipotez terapeutycznych związanych z sygnalizacją fagocytarną oraz szlakami śmierci komórkowej.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez wizualizację interakcji fagocytów z komórkami apoptotycznymi w żywym systemie.
- Wartość prognostyczna: Zmniejsza ryzyko mechanistyczne dzięki bezpośredniej obserwacji dynamiki usuwania komórek, co pozwala na lepszy dobór celu terapeutycznego.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Zapewnia ilościowy odczyt oparty na obrazowaniu w zakresie pochłaniania cząsteczek apoptotycznych, co umożliwia standaryzację analizy.
- Wartość operacyjna: Ułatwia przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych (zarodki Drosophila) do powtarzalnego przesiewania związków.
- Skalowalność: Wspiera ponowne wykorzystanie platformy dzięki konfokalnemu obrazowaniu time-lapse aktywności fagocytarnej w OUN i tkankach obwodowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy mechanistyczne spostrzeżenia z fazy odkryć z przedklinicznymi modelami stanu zapalnego i neurodegeneracji.
- Dostosowanie biomarkerów: Umożliwia korelację aktywności fagocytarnej z potencjalnymi translacyjnymi biomarkerami wydajności oczyszczania.
- Postęp dostosowany do ryzyka: Wspiera decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez ujawnianie defektów w usuwaniu komórek apoptotycznych, które mogą przewidywać wyniki patologiczne.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w proces badawczy, obejmujący etapy od testowania hipotez dotyczących celów terapeutycznych po identyfikację związków wiodących, w szczególności w zakresie modulowania szlaków fagocytarnych w kontekstach chorobowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez wizualizację fagocytozy komórek apoptotycznych pośredniczonej przez glej i makrofagi w czasie rzeczywistym.
- Screening: Umożliwia przygotowanie analizy poprzez standaryzowane protokoły przygotowania i iniekcji zarodków w celu ekspozycji na związki chemiczne.
- Analityka: Generuje ilościowe dane z obrazowania konfokalnego dotyczące lokalizacji cząsteczek apoptotycznych oraz zachowania fagocytów w czasie.
- Badania translacyjne: Łączy obserwacje z obrazowania na żywo z ciągłością przedkliniczną w modelach, w których defekty usuwania komórek przyczyniają się do rozwoju choroby.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę obrazowania do badania konserwowanych mechanizmów śmierci komórkowej i ich usuwania w ramach różnych projektów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez ograniczenie niejednoznaczności w interpretacji mechanizmu fagocytozy.
- Wartość operacyjna: Sprzyja standaryzacji i powtarzalności dzięki zdefiniowaniu parametrów etapu rozwoju zarodka, iniekcji oraz obrazowania.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesne wykrycie nieskutecznych modulatorów usuwania komórek.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o funkcjonalną walidację aktywności fagocytycznej in vivo.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w pracy z muchami Drosophila, mikroiniekcjami zarodków oraz mikroskopią konfokalną.
- Zależne od dostępności transgenicznych linii much wykazujących ekspresję GFP w fagocytach oraz odczynników do znakowania komórek apoptotycznych.
- Wymaga standaryzacji pomiędzy zespołami w zakresie określania stadium rozwoju zarodków, powtarzalności iniekcji oraz ustawień akwizycji obrazu.
- W przypadku adaptacji należy uwzględnić markery specyficzne dla fagocytów i komórek apoptotycznych w innych systemach modelowych.
- Ograniczenia praktyczne obejmują przeżywalność zarodków po iniekcji oraz fotoblaknięcie podczas długotrwałego obrazowania time-lapse.
