Name: Obrazowanie na żywo apoptotycznego usuwania komórek podczas embriogenezy Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Poznaj metodę obrazowania na żywo apoptotycznego usuwania komórek w embriogenetyce Drosophila. Technika umożliwia dynamiczną obserwację fagocytozy w centralnym układzie nerwowym embriów przy użyciu mikroskopii konfokalnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant reintegracyjny Marie Curie (IRG249084). Dziękujemy wszystkim członkom laboratorium Kurant. Dziękujemy również E. Suss-Toby'emu z Międzywydziałowego Ośrodka Bioobrazowania za doskonałe wsparcie techniczne.

Aby śledzić dynamikę apoptotycznego oczyszczania komórek in vivo, należy oznaczyć dwie populacje komórek: komórki fagocytarne i komórki apoptotyczne.
Aby oznaczyć populacje komórek fagocytarnych, używamy linii Drosophila zawierającej marker simu-cytGFP, który oznacza wyłącznie komórki fagocytarne w zarodku: makrofagi, glej i ektodermę8. Można użyć różnych markerów dla komórek fagocytarnych, w tym linii zawierających specyficzny dla hemocytów sterownik Gal4 (crq-Gal4) lub specyficzny dla gleju sterownik Gal4 (repo-Gal4) oraz genetycznie kodowany reporter fluorescencyjny pod kontrolą UAS (uas-GFP).
Aby monitorować komórki apoptotyczne podczas usuwania komórek apoptotycznych, używamy różnych markerów apoptozy/fagocytozy. Aneksyna V (sondy molekularne) służy jako wczesny marker komórek apoptotycznych 10; Phiphilux (OncoImmunin) jest fluorogennym substratem kaspazy-3, który jest używany jako marker późniejszej apoptozy, a LysoTracker (Molecular Probes) działa jako marker fagosomu. Odczynniki te wtryskujemy za pomocą systemu mikroiniekcji PicoPump PV 820.
1. Przygotowania
<ol>
	<li>Klej heptanowy: 
	Rozwiń taśmę dwustronną i włóż jak najwięcej do fiolki scyntylacyjnej, napełnij heptanem, zamknij fiolkę Parafilmem i kołysz przez 24 godziny. Dodaj heptan, jeśli klej jest zbyt gęsty.</li>
	<li>Pozwalamy muchom leżeć na podgrzanej płytce agarowej z sokiem winogronowym + pasta drożdżowa przez 2 godziny, a następnie przenosimy szalkę do 25 °C na 10-12 godzin (w zależności od pożądanego etapu) przed mikroiniekcją i zapisami poklatkowymi wstrzykniętych zarodków. Pobieramy zarodki z płytek agarowych utrzymywanych w temperaturze 25 °C, uzyskując w ten sposób zarodki z 15 lub 16 etapu rozwoju.</li>
	<li>Przygotowanie igły: 
	Do przygotowania igieł do wstrzykiwań używamy ściągacza igieł "Sutter instrument" oraz cienkościennych włókien szklanych (rurki kapilarne FHC). Końcówka połączonej kapilary jest złamana do średnicy 0,5-2 μm.</li>
	<li>Szkiełko nakrywkowe z klejem: 
	Za pomocą końcówki pipety rozprowadź kroplę kleju heptanowego w jednej linii na środku szkiełka nakrywkowego. Pozostaw do wyschnięcia na kilka sekund. Przygotuj kilka takich szkiełek nakrywkowych.</li>
</ol>
2. Przygotowanie zarodków
<ol>
	<li>Zbierz zarodki z płytek agarowych i przenieś je do sitka komórkowego (SPL Life Sciences) za pomocą czystego pędzla i bieżącej wody. Sitko jest trzymane nad zlewką w celu zebrania ścieków.</li>
	<li>Umyj zarodki w sitku do komórek wodą, aż cała pasta drożdżowa zostanie usunięta.</li>
	<li>Wysusz nadmiar wody, wycierając zewnętrzną część sitka za pomocą chusteczek Kimwipes.</li>
	<li>Umieść sitko do komórek na czystej szalce Petriego i dodaj tyle 50% wybielacza, aby pokryć zarodki w sitku do komórek. Dekorionację zarodków przez 2 minuty od czasu do czasu (2-3 razy) mieszając.</li>
	<li>Spłucz obficie wodą, aż zarodki stracą zapach wybielacza.</li>
	<li>Umieść sitko do komórek na czystej szalce Petriego i zalej zarodki wodą, aby zapobiec wysuszeniu.</li>
	<li>Przed rozpoczęciem zawiązywania zarodków należy załadować 1 μl pożądanego odczynnika do dwóch igieł (czasami igła może być zatkana). Potrzeba około 5 minut, aby płyn dotarł do końcówki igły.</li>
	<li>Wytnij prostokątny kawałek agaru z sokiem winogronowym i umieść go na szkiełku mikroskopowym. Przenieś zdekorionowane zarodki z płytki Petriego na kawałek agaru za pomocą czystego pędzla.</li>
	<li>Pod fluorescencyjnym mikroskopem preparacyjnym wybrać odpowiednio zaawansowane zarodki wyrażające marker GFP za pomocą mokrego pędzla i umieścić każdy zarodek blisko krawędzi kawałka agaru w rzędzie jeden po drugim (ryc. 1A). Zarodki należy umieścić brzuszną stroną do góry w celu obrazowania fagocytozy za pomocą gleju w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN).</li>
	<li>Ustaw około 10 zarodków w jednym rzędzie.</li>
	<li>Przymocuj zarodki do szkiełka nakrywkowego pokrytego pośrodku paskiem kleju heptanowego (ryc. 1B, C).</li>
	<li>Umieść szkiełko nakrywkowe w komorze odwadniającej na około 5 minut (zależy to od wilgotności w pomieszczeniu i ilości do wstrzyknięcia).</li>
	<li>Po wyschnięciu przykryj zarodki olejem halocarbon 700 (Sigma), aby uniknąć dalszego odwodnienia.</li>
	<li>Umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku mikroskopowym zarodkami skierowanymi do góry. Możesz nalać kroplę wody na szkiełko, aby zapobiec przesuwaniu się szkiełka nakrywkowego. Zarodki są teraz gotowe do wstrzyknięcia. Miejsce wstrzyknięcia znajduje się zazwyczaj po bocznej stronie w środku zarodka.</li>
</ol>
3. Wstrzyknięcie zarodka
<ol>
	<li>Przymocować igłę do mikromanipulatora.</li>
	<li>Aby złamać końcówkę igły, umieść krawędź szkiełka nakrywkowego w polu view i ustaw igłę w tej samej płaszczyźnie ogniskowej. Bardzo ostrożnie przesuwaj szkiełko nakrywkowe, aż dotknie końcówki igły i ją złamie.</li>
	<li>Skupiając się na zarodkach, umieść igłę w oleju i upewnij się, że z igły dostała się kropla płynu. Oznacza to, że końcówka igły została dobrze złamana.</li>
	<li>Nie dotykając uchwytu igły, wsunąć zarodek do igły i wstrzyknąć kroplę do zarodka. Odsuń zarodek i przejdź do następnego, aż wszystkie zarodki zostaną wstrzyknięte.</li>
</ol>
4. Obrazowanie
Obrazujemy zarodki na odwróconym mikroskopie konfokalnym z obiektywem 40X lub 100X. Szukamy ładnie ustawionego zarodka z OUN pośrodku, który wykazuje silną ekspresję GFP i dobre oznakowanie komórek apoptotycznych po wstrzyknięciu.
Do nagrań poklatkowych żywych zarodków zazwyczaj wybieramy 5 lub 6 plastrów konfokalnych (każdy o grubości 2 μm). Następnie wykonujemy rzut 3 plastrów (o grubości 6 μm) w celu obserwacji całych komórek.
Używamy markerów dla komórek apoptotycznych, które są stabilne i nie blakną łatwo. Aby uniknąć wybielania GFP, wykonujemy nagrania w odstępach 60 sek.
W niektórych przypadkach zarodki mogą zacząć się toczyć podczas nagrywania wideo. Dlatego raz na jakiś czas zaglądamy do nagrania, aby w razie potrzeby zatrzymać się i zacząć od nowa.

<ol><li>Kinchen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+to+die+for%3A+signaling+to+apoptotic+cell+removal+in+worm%2C+fly+and+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">A model to die for: signaling to apoptotic cell removal in worm, fly and mouse.</a> Apoptosis. 15, 998-1006 (2010).</li>
<li>Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosome+maturation%3A+going+through+the+acid+test%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagosome maturation: going through the acid test.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 781-795 (2008).</li>
<li>Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytic+signaling%3A+you+can+touch%2C+but+you+can%27t+eat%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagocytic signaling: you can touch, but you can't eat.</a> Curr. Biol. 18, 521-524 (2008).</li>
<li>Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+elegant+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: elegant complexity.</a> Immunity. 22, 539-550 (2005).</li>
<li>Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+apoptotic+cells%3A+getting+rid+of+the+corpses%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses.</a> Mol. Cell. 14, 277-287 (2004).</li>
<li>Henson, P. M., Hume, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cell+removal+in+development+and+tissue+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cell removal in development and tissue homeostasis.</a> Trends Immunol. 27, 244-250 (2006).</li>
<li>Kurant, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keeping+the+CNS+clear%3A+glial+phagocytic+functions+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Keeping the CNS clear: glial phagocytic functions in Drosophila.</a> Glia. 59, 1304-1311 (2011).</li>
<li>Kurant, E., Axelrod, S., Leaman, D., Gaul, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Six-microns-under+acts+upstream+of+Draper+in+the+glial+phagocytosis+of+apoptotic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Six-microns-under acts upstream of Draper in the glial phagocytosis of apoptotic neurons.</a> Cell. 133, 498-509 (2008).</li>
<li>Mergliano, J., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-independent+cell+engulfment+mirrors+cell+death+pattern+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Caspase-independent cell engulfment mirrors cell death pattern in Drosophila embryos.</a> Development. 130, 5779-5789 (2003).</li>
<li>van den Eijnde, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+exposure+of+phosphatidylserine+during+apoptosis+is+phylogenetically+conserved%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Cell surface exposure of phosphatidylserine during apoptosis is phylogenetically conserved.</a> Apoptosis. 3, 9-16 (1998).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Apoptotyczny klirens komórek jest krytycznym ostatnim etapem apoptozy, która jest bardzo dynamiczna. Dlatego badania procesu w czasie rzeczywistym mają ogromne znaczenie. W tym miejscu opisujemy protokół, który umożliwia monitorowanie apoptotycznego klirensu komórek u żywych, rozwijających się zarodków Drosophila . W tej procedurze dwie populacje komórek muszą być oznaczone za pomocą określonych markerów: komórek apoptotycznych i fagocytów. Reporter simu-cytGFP nadaje się do jednoczesnego monitorowania ...

Właściwa eliminacja niechcianych lub nieprawidłowych komórek poprzez apoptozę i późniejszą fagocytozę jest kluczowa dla rozwoju embrionalnego, jak również dla homeostazy tkanek u osoby dorosłej. Fagocytoza komórek apoptotycznych lub apoptotyczny klirens komórek jest wysoce dynamicznym procesem, który przebiega w czterech etapach: (1) rekrutacja fagocytów do komórki apoptotycznej ("znajdź mnie"), (2) rozpoznanie komórki jako celu fagocytozy ("zjedz mnie") i (3) pochłonięcie, a następnie (4) dojrzewanie fagosomu i degradacja cząstki apoptotycznej1-5. Istnieją dwa typy fagocytów: "profesjonalne" makrofagi i niedojrzałe komórki dendrytyczne oraz "nieprofesjonalne" sąsiednie komórki rezydujące w tkankach, które mają kluczowe znaczenie dla apoptotycznego usuwania komórek podczas rozwoju metazoanu6,7 .
W rozwoju Drosophila, eliminacja zbędnych komórek poprzez apoptozę zachodzi w trzech głównych fazach, najpierw w połowie do późnej zarodka, następnie w środkowej poczwarce i ponownie we wczesnej dorosłej osobie. Podczas embriogenezy cząstki apoptotyczne są usuwane przez "profesjonalne" fagocyty, makrofagi oraz przez "nieprofesjonalną" ektodermę i glej8,9 .
W naszej poprzedniej pracy zidentyfikowaliśmy receptor fagocytarny, Six-microns-under (SIMU), który ulega ekspresji wyłącznie w komórkach fagocytarnych podczas embriogenezy. Korzystając z promotora simu, wygenerowaliśmy specyficzny marker dla populacji komórek fagocytarnych (simu-cytGFP), który umożliwia nam jednoczesne monitorowanie makrofagów, ektodermy i gleju w żywym, rozwijającym się zarodku8. Ponadto, stosując specyficzne markery dla komórek apoptotycznych w różnych stadiach apoptozy, jesteśmy w stanie śledzić dynamikę apoptotycznego klirensu komórek in vivo.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Odczynnik</td></tr><tr><td>Annexin V </td><td>Sondy molekularne</td><td>A35108</td><td></td></tr><tr><td>PhiPhiLux G2D2</td><td>OncoImmunin</td><td>A304R2G-5</td><td></td></tr><tr><td>Sondy molekularne</td><td>LysoTracker</td><td>L-7528</td><td></td></tr><tr><td>Olej halowęglowy 700</td><td>Sigma</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">< mocny>Materiał< / mocny></td></tr><tr><td>rurka kapilarna</td><td>FHC</td><td>30-30-0</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek</td><td>SPL</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>Pędzel</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie na żywo apoptotycznego usuwania komórek podczas embriogenezy drosophila

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Właściwa eliminacja niechcianych lub nieprawidłowych komórek poprzez apoptozę i późniejszą fagocytozę (apoptotyczne usuwanie komórek) jest kluczowa dla prawidłowego rozwoju we wszystkich organizmach metazoan. Apoptotyczny klirens komórek jest wysoce dynamicznym procesem ściśle związanym ze śmiercią komórki; Niepochłonięte komórki apoptotyczne są ledwo widoczne in vivo w normalnych warunkach. Aby zrozumieć różne etapy apoptotycznego usuwania komórek i porównać "profesjonalne" fagocyty - makrofagi i komórki dendrytyczne z "nieprofesjonalnymi" - sąsiadującymi komórkami rezydującymi w tkankach, niezwykle cenne jest obrazowanie tego procesu na żywo in vivo. Tutaj opisujemy protokół badania apoptotycznego klirensu komórek w żywych zarodkach Drosophila. Aby śledzić dynamikę różnych etapów fagocytozy, używamy specyficznych markerów dla komórek apoptotycznych i fagocytów. Ponadto możemy równolegle monitorować dwa systemy fagocytów: "profesjonalne" makrofagi i "półprofesjonalne" komórki glejowe w rozwijającym się ośrodkowym układzie nerwowym (OUN). Opisana tutaj metoda wykorzystuje zarodek Drosophila jako doskonały model do badań w czasie rzeczywistym nad apoptotycznym usuwaniem komórek.

Reprezentatywne klatki z filmu, na którym komórki apoptotyczne są znakowane Aneksyną V, a glej, ektoderma i makrofagi są znakowane simu-cytGFP, przedstawiono na Rysunku 2. Każda klatka jest projekcją 3 warstw o grubości 2 μm każda.
Zarodek w stadium 15 jest odpowiednio ustawiony, ukazując embrionalny OUN w środku z wyraźnie oznakowaną gleją (g). Makrofagi (m), znajdujące się głównie poza OUN, wykazują silną cytoplazmatyczną ekspresję GFP. Komórki ektodermalne są równi...

Tutaj opisujemy skuteczną metodę badania dynamiki apoptotycznego oczyszczania komórek in vivo. Metoda ta wykorzystuje żywe zarodki Drosophila jako potężny model do monitorowania fagocytozy komórek apoptotycznych przy użyciu specyficznego znakowania komórek apoptotycznych i fagocytów.

Obrazowanie na żywo apoptotycznego usuwania komórek podczas embriogenezy Drosophila

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest śledzenie dynamiki usuwania apoptotycznych komórek w zarodku drosofilem. Jest to realizowane przy użyciu much transgenicznych zawierających cytoplazmatyczny marker GFP, który znakuje populacje komórek fagocytarnych; zarodki z markerem Simio GFP są zbierane, płukane i powlekane. Następnie zarodki są ustawiane do iniekcji, po czym następuje monitorowanie OUN.Trzecim krokiem jest znakowanie komórek apoptotycznych poprzez wstrzyknięcie do embrionów specyficznych markerów fagocytozy apoptozy, takich jak X in five; ostatnim krokiem jest wykonanie nagrań time-lapse ośrodkowego układu nerwowego embrionu przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Ostatecznie wyniki mogą wykazać lokalizację i zachowanie komórek apoptotycznych oraz fagocytów podczas różnych etapów usuwania komórek apoptotycznych za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak immunohistochemia na utrwalonych embrionach, jest możliwość śledzenia dynamiki usuwania komórek apoptotycznych.Usuwanie komórek apoptotycznych jest wysoce dynamicznym procesem obejmującym różnorodne etapy. Technika ta pozwala na śledzenie poszczególnych kroków przy użyciu specyficznych markerów dla komórek apoptotycznych i fagocytów. Protokół rozpoczyna się od przygotowania kleju z konwencjonalnych odczynników – należy rozwinąć dwustronną taśmę klejącą, a następnie zwinąć ją ponownie tak, aby zmieściła się w fiolce scyntylacyjnej.Napełnij fiolkę heptanem i zamknij ją za pomocą param. Następnie przymocuj fiolkę do rotatora i delikatnie kołysz przez 24 godziny. Następnego dnia, w temperaturze pokojowej, przygotowany klej przenosi się do nowej fiolki.Za pomocą szklanej pipety przenieś przygotowany klej do nowej probówki. Po przygotowaniu użyj końcówki do pipety, aby nanieść klej na szkiełka nakrywkowe. Rozprowadź kroplę kleju heptanowego w linii wzdłuż środka szkiełka nakrywkowego.Pozostaw klej do wyschnięcia przez kilka sekund. Przygotowane szkiełka przykrywowe można następnie przechowywać w temperaturze pokojowej w zamkniętym pudełku do jednego miesiąca. Po znieczuleniu much dwutlenkiem węgla, zgromadź około 400 much w pojemniku kolekcjonerskim z podgrzaną płytką do składania jaj z sokiem winogronowym, pozostawionym w temperaturze 25 °C przez dwie godziny. Wyjmij płytkę z sokiem winogronowym i przykryj pojemnik nową płytką, aby zapewnić odpowiednie warunki bytowania much.Zebrana płytka zawiera embriony w wieku od zero do dwóch godzin. Należy przenieść zebraną płytkę z sokiem z winogron z embrionami do inkubatora w temperaturze 25 stopni Celsius, aż osiągną one pożądany punkt czasowy rozwoju. W tym przykładzie embriony są inkubowane przez okres od 10 do 12 godzin, tak aby po tym czasie osiągnęły stadium 15 lub 16.Użyj wody z kranu i czystego pędzla, aby przenieść zarodki z płytki do sitka komórkowego. Trzymaj sitko nad pojemnikiem, aby można było odzyskać zarodki, które mogą przez nie wypaść. Płucz zebrane zarodki, aż do całkowitego usunięcia pasty drożdżowej.Następnie osusz nadmiar wody, wycierając zewnętrzną stronę sitka. Umieść sitko komórkowe w czystej szalce Petriego, aby usunąć chorion. Dolej 50% bleach w ilości wystarczającej do przykrycia embrionów w sitku komórkowym i odczekaj dwie minuty, mieszając je dwa do trzech razy.Następnie płucz zarodki, aż przestaną pachnieć wybielaczem. Przenieś zarodki z pojemnika na komórki do czystej szalki Petriego i przykryj je wodą, aby zapobiec ich wysychaniu. Do iniekcji zarodków.Przygotuj wcześniej igły do iniekcji, korzystając z wyciągacza igieł i cienkościennych włókien szklanych. Napełnij dwa igły jednym mikrolitrem pożądanego odczynnika, przy czym jedna igła powinna służyć jako zapasowa. Dobrym odczynnikiem jest stabilny marker, który nie ulega łatwo wymyciu, np. X w five.Następnie umieść prostokątny fragment agaru z sokiem z winogron na mikroskopie. Przesuń i przenieś embriony z sitka na agar. Używając czystego pędzla pod fluorescencyjnym mikroskopem sekcyjnym, wybierz embriony na odpowiednim etapie rozwoju do iniekcji, posługując się markerem GFP.Za pomocą wilgotnego pędzla przenieś wybrane embriony, układając je w rzędzie po 10 sztuk, stroną brzuszną do góry. Umieść rząd na krawędzi bloku agarowego. GFP można zaobserwować w ośrodkowym układzie nerwowym embrionu.Teraz przymocuj zarodki do szkiełka nakrywkowe za pomocą paska kleju heptanowego. Prawidłowe ułożenie zarodków jest kluczowe dla powodzenia iniekcji. Działaj powoli i upewnij się, że zarodki są precyzyjnie wyrównane w odpowiedniej orientacji.Następnie umieść szkiełko podstawowe w komorze odwadniającej na około pięć minut. Po osuszeniu embrionów pokryj je olejem węglowym Hello carbon oil 700, aby zapobiec dalszemu odwodnieniu. Na koniec nanieś kroplę wody na przedmiotowe szkiełko mikroskopowe.Następnie połóż krawędź przykrywki z zarodkami skierowaną do góry na wilgotnym szkiełku mikroskopowym. Zarodki są teraz gotowe do iniekcji. Rozpocznij od przymocowania igły do mikromanipulatora i pikopompy.Pompa kontroluje ilość wstrzykiwanego płynu poprzez tłoczenie azotu do igły. Pedał steruje dozowaniem azotu pod mikroskopem. Należy skupić się na czubku igły i bardzo ostrożnie ustawić go w pobliżu krawędzi szkiełka nakrywki, dbając o to, aby zarówno czubek igły, jak i szkiełko nakrywki znajdowały się w ostrości.Przesuwaj szkiełko nakrywkowe, aż uderzy ono w końcówkę igły i ją przełamie. Średnica otworu powinna wynosić od 0,5 do 2 µm. Teraz ustaw ostrość na embriony.Zanurz igłę w oleju. Jeśli końcówka igły została prawidłowo złamana, do oleju powinna wyciekać kropla cieczy. Naciskając pedał bez dotykania uchwytu igły, przesuń stolik tak, aby igła przebiła boczny brzeg embrionu.Szybko wstrzyknij kroplę roztworu do zarodka. Odsuń zarodek i przejdź do następnego, aż wszystkie 10 zarodków zostanie poddanych iniekcji. Wykonaj obrazowanie zarodków przy użyciu odwróconego mikroskopu konfokalnego z obiektywem 40 x lub 100 x.Należy wyszukać odpowiednio ustawiony embrion z OUN w centrum, wykazujący silną ekspresję GFP oraz oznakowanie komórek apoptotycznych. Aby wykonać nagrania time-lapse, należy wybrać pięć lub sześć przekrojów konfokalnych w tych lokalizacjach i ustawić dla nich tzw. micron sticks. Skanowanie powinno odbywać się co 60 sekund – przy takim odstępie czasu blaknięcie GFP nie powinno stanowić problemu.Następnie wykonaj projekcję trzech przekrojów o grubości 6 µm, aby zaobserwować całe komórki. W niektórych przypadkach zarodek może zacząć się obracać w czasie nagrywania wideo. Należy zatem monitorować nagranie, aby nie tracić czasu na poruszające się zarodki.Prawidłowo ustawiony embrion w stadium 15 wykazuje obecność embrionalnego OUN w środku z wyraźnie znakowaną gleją oznaczoną jako g; makrofagi M, znajdujące się głównie poza OUN, wykazują silną cytoplazmatyczną ekspresję GFP. Komórki ektodermalne E są również znakowane cytoplazmatycznym GFP.Klatki te przedstawiają komórki apoptotyczne znakowane an ex in five oraz ektodermę i makrofagi znakowane cite GFP. Każda klatka jest projekcją trzech warstw, a każda warstwa ma grubość dwóch mikronów. Wiele komórek wykazujących pozytywny wynik dla an ex in five znajduje się wewnątrz i na zewnątrz OUN.W ramce przedstawiono zdarzenie, w którym komórka glejowa pochłania cząsteczkę apoptotyczną. Należy zwrócić uwagę na zachowanie badawcze komórki glejowej. Dotyka ona cząsteczki apoptotycznej kilka razy, zanim przystąpi do pochłonięcia komórki apoptotycznej po jej rozwoju.Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny usuwania komórek apoptotycznych do badania fagocytozy komórek apoptotycznych podczas rozwoju. Dzięki zastosowaniu tej metody możemy badać wysoce dynamiczny przebieg procesu usuwania komórek apoptotycznych.

live-imaging-apoptotic-cell-clearance-during-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Obrazowanie na żywo usuwania komórek ulegających apoptozie podczas embriogenezy Drosophila

Drosophila hemocyty rozprzestrzeniają się po całym rozwijającym się embrionie. Niniejszy protokół demonstruje sposób montowania i obrazowania tych migracji z wykorzystaniem embrionów z hemocytami znakowanymi fluorescencyjnie.

Obrazowanie na żywo migracji hemocytów embrionalnych Drosophila melanogaster

Ten film demonstruje technikę barwienia immunologicznego, aby uwidocznić pochłanianie komórek apoptotycznych w homogenizowanych komórkach embrionalnych Drosophila melanogaster. Metoda ta zapewnia wgląd w fizjologię komórkową poprzez określenie zakresu apoptotycznego pochłaniania komórek.

Test fagocytozy: technika barwienia immunologicznego do wizualizacji pochłaniania komórek apoptotycznych w komórkach embrionalnych Drosophila melanogaster

Ten artykuł demonstruje użycie szybkiego skaningowego mikroskopu konfokalnego do obrazowania zachowania komórek bezpośrednio przez poczwarkę. Pozostawiając nienaruszoną obudowę poczwarki, metoda ta umożliwia obserwację i pomiar dynamicznych procesów komórkowych na etapie rozwoju Drosophila, który jest trudny do bezpośredniego zbadania.

Obrazowanie przez poczwarkę Drosophila melanogaster

Ten protokół szczegółowo opisuje uproszczoną metodę używaną do przeprowadzania obrazowania żywych komórek w kontekście nienaruszonego mózgu larwy. Metody obrazowania żywych komórek są nieocenione w badaniu asymetrycznych podziałów nerwowych komórek macierzystych, a także innych procesów neurogennych i rozwojowych, konsekwentnie odkrywając mechanizmy, które wcześniej były pomijane.

Obrazowanie na żywo neuroblastów larw Drosophila

Ten protokół przedstawia skuteczną metodę obrazowania żywego nabłonka oka poczwarki Drosophila. Metoda ta kompensuje ruch tkanek i nierówną topologię, poprawia wizualizację granic komórek dzięki zastosowaniu wielu białek połączeniowych znakowanych GFP i wykorzystuje łatwe w montażu urządzenie do obrazowania.

Obrazowanie na żywo oka poczwarki Drosophila

Aby wykryć zdrowe komórki u całych zwierząt, które zawierają niski poziom aktywności kaspazy, dla Drosophila wygenerowano wysoce czuły biosensor o nazwie CaspaseTracker. Aktywność biosensora zależna od kaspazy jest wykrywana w długowiecznych zdrowych komórkach w narządach wewnętrznych dorosłych zwierząt hodowanych w zoptymalizowanych warunkach przy braku bodźców śmierci.

In vivo (in vivo) Biosensor śledzi nieapoptotyczną aktywność kaspazy u Drosophila

Opisujemy tutaj test fagocytozy z wykorzystaniem rozproszonych komórek embrionalnych Drosophila. Umożliwia nam łatwe i precyzyjne ilościowe określenie poziomów fagocytozy in vivo oraz identyfikację nowych cząsteczek wymaganych do fagocytozy komórek apoptotycznych.

Test fagocytozy na obecność komórek apoptotycznych w zarodkach Drosophila

Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji i jednoczesnego obrazowania wielu zarodków Drosophila podczas rozwoju embrionalnego za pomocą obrazowania o wysokiej zawartości na płytce.

Przygotowanie zarodków Drosophila i mikroiniekcja do mikroskopii żywych komórek wykonana przy użyciu automatycznego analizatora o wysokiej zawartości

Mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszach świetlnych jest najcenniejszym narzędziem w biologii rozwoju. Głównym problemem w badaniach porównawczych jest wariancja otoczenia. Nasz protokół opisuje eksperymentalne ramy do jednoczesnego obrazowania na żywo wielu próbek i dlatego aktywnie rozwiązuje ten problem.

Jednoczesne obrazowanie na żywo wielu zarodków owadów w mikroskopach fluorescencyjnych z arkuszami świetlnymi w komorze na próbki

Ten protokół opisuje spersonalizowane znakowanie fluorescencyjne oparte na przeciwciałach i wstrzykiwanie do wczesnych zarodków Drosophila, aby umożliwić obrazowanie na żywo białek o niskiej obfitości lub modyfikacji potranslacyjnych, które są trudne do wykrycia przy użyciu tradycyjnych metod GFP/mCherry-tag.

Wizualizacja białek o niskiej liczebności i modyfikacji potranslacyjnych w żywych zarodkach Drosophila poprzez wstrzyknięcie przeciwciał fluorescencyjnych

Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół do wykonywania na żywo obrazowania asymetrycznego podziału komórek macierzystych linii zarodkowej (GSC) w niszy jajnikowej Drosophila. Używamy linii transgenicznej, która wszechobecnie ulega ekspresji fuzji białka zielonej fluorescencji (GFP) białka spektrosomu Par-1.

Rozszerzone obrazowanie na żywo nisz komórek macierzystych linii zarodkowej Drosophila melanogaster

Poznaj metodę obrazowania na żywo apoptotycznego usuwania komórek w embriogenetyce Drosophila. Technika umożliwia dynamiczną obserwację fagocytozy w centralnym układzie nerwowym embriów przy użyciu mikroskopii konfokalnej.

Obrazowanie na żywo apoptotycznego usuwania komórek podczas embriogenezy Drosophila

Przeglądaj więcej filmów